本发明涉及药用天然产物领域，具体涉及一种从脉络宁注射液生产废液中提取总皂苷的方法。
背景技术：
中医药是我们民族的瑰宝，是中国文化中最具实践性和济世精神的。几千年来，中医药为中华民族的繁衍昌盛做出了巨大贡献，直至今日依然在人民健康事业中发挥重要和不可替代的作用。随着西医西药的弊端不断显现，越来越多的人们相信和使用传统的药物和治疗方法。
与丸、散、膏、丹等传统剂型相比，中药注射剂是一种独具特色的新型中药剂型，它有十分突出的优点：剂量准确，直达病所，起药效快，作用可靠，对于不宜口服给药的患者或不宜口服的药物都是一个很好的选择。我国现有中药注射剂100余种，涉及的生产企业数百家，1999年-2009年，全国中药注射剂市场的平均增长率均在30％以上，每年有3亿患者使用中药注射剂，年销售额超过150亿元人民币。
脉络宁注射液是在著名医方“四妙勇安汤”临床应用的基础上研究开发出来的、具有自立知识产权的，并于1985年正式批准生产的中药复方静脉注射剂，由中药石斛、玄参、牛膝、金银花、山银花经科学提取精制而成。具有活血化淤、行气止痛、养阴通络和补益肝肾的功效，主要用于治疗缺血性中风急性期、血栓闭塞性脉管炎、下肢深静脉血栓形成、动脉硬化性闭塞症、脑梗塞、心绞痛、心肌梗死、血液循环障碍及其后遗症等疾病，总有效率可达94.5％，与同类药品比较具有见效快、疗效高、疗程短、价格低廉、副作用少、安全性高等优点，已成为全国名特优中成药，在基层医院应用广泛。1992年被国家中医药管理局列为首批全国中医院急诊科（室）必备中成药之一以及国家中药保护品种；2000年6月被列为《国家基本医疗保险药品目录》中成药甲类药品；2009年7月入选国家新医改基本药物目录基层版307种，为仅有的3个中药注射剂品种之一，医改给脉络宁注射液带来了新的成长契机，是一个走向更广阔市场的极好机会，显示着很强的生命力和广阔的应用前景。据不完全统计，迄今该品种已累计生产近10亿支，累计销售收入近100亿元，创造了巨大的社会效益与经济效益。
但是，在创造了巨大的社会效益与经济效益的同时，脉络宁注射液生产过程中也产生了大量废弃物。脉络宁注射液生产过程主要分两个阶段，一是提取阶段，即上述五味药材经混合、沸水提取、乙醇沉淀、乙酸乙酯萃取得粗浸膏；二是制剂阶段，即粗浸膏再经水沉、过滤、配液、精滤灌装、灭菌而制成。其成品的主要成分为中等极性的小分子化合物，如绿原酸类，黄酮类、香豆素类、环烯醚萜类等等。废弃物主要是在第一个阶段产生的，包括:①经水提后的五种药材混合废渣；②醇沉工段的废渣（醇沉废渣），主要含植物多糖、植物蛋白等；③乙酸乙酯萃取后的母液废渣（酯提废渣），主要为大极性的三萜皂苷、糖类、水溶性色素等。
针对这些废弃物，金陵药业已采取各种无害化和再利用措施进行处理。其中，药材废渣转让给肥料饲料公司，加工制成各种生物有机肥、饲料添加剂、微生物培养基等，但由于附加值低，药材废渣转让并没有给企业带来经济效益。而醇沉废液和酯提废液成分复杂、有机溶剂含量大，主要通过回收溶剂后微生物降解进行无害化处理。考虑到酯提废液中含有许多原药材的有效成分如皂苷，具有广泛的生理活性，在动物实验和体外模型中显示了降低胆固醇,抗癌，抗炎和抗氧化等活性，因此开发简便、准确、环保的制备方法从脉络宁注射液生产酯提废液中提取总皂苷具有重要意义。
技术实现要素：
为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种可用于皂苷类成分的工业化生产，制备方法简单，有机溶剂用量少的从脉络宁注射液生产废液中提取总皂苷的方法。
为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：
一种从脉络宁注射液生产废液中提取总皂苷的方法，其特征在于，包括以下工艺步骤：（1）、将脉络宁注射液生产酯提废液浓缩至无酯味的流浸膏，加8~12倍体积的水溶解，过滤，除去水不溶物，得到滤液；（2）、将滤液进行减压浓缩，减压浓缩至原滤液体积的1/3~1/5；（3）、经聚酰胺吸附，随后先用水洗去水溶性杂质，再依次用浓度分别为10%、30%、50%、70%、95%的乙醇进行梯度洗脱，收集10%、30%的洗脱液；（4）、将10%、30%的醇洗脱液减压浓缩，至原醇洗脱液体积的1/3；（5）、经大孔树脂吸附，随后先用水洗去水溶性杂质，再依次用浓度分别为10%、30%、50%、70%、95%的乙醇进行梯度洗脱，收集10%、30%、50%的洗脱液；（6）、将10%、30%、50%的醇洗脱液减压浓缩，直至得到无有机溶剂气味的干固体，该干固体即为总皂苷粗提取物；（7）、将得到的总皂苷粗提取物溶于少量无水甲醇中，然后滴入乙酸乙酯，搅拌均匀，有总皂苷析出，反复处理5次，收集析出的总皂苷，最后减压浓缩至无有机溶剂气味的干固体，该干固体即为总皂苷提取物。
优选地，前述步骤（2）中，滤液在水浴中进行减压浓缩，所述水浴温度为55℃-65℃，减压至7kpa-10kpa。
再优选地，前述步骤（3）中，聚酰胺为pa6或pa66或pa1212。
更优选地，前述步骤（4）中，醇洗脱液在水浴中进行减压浓缩，所述水浴温度为65℃-75℃，减压至7kpa-10kpa。
进一步优选地，前述步骤（5）中，大孔树脂为d101或sa-3或ab-8。
再进一步优选地，前述步骤（6）中，醇洗脱液在水浴中进行减压浓缩，所述水浴温度为55℃-65℃，减压至7kpa-10kpa。
更进一步优选地，前述步骤（7）中，总皂苷在水浴中进行减压浓缩，所述水浴温度为40℃-50℃，减压至7kpa-10kpa
本发明的有益之处在于：本发明制备方法简单，原料易得，生产成本低，根据本发明得到的产品中总皂苷含量较高，质量稳定、易于控制；通过回收脉络宁注射液生产过程中产生的大量废弃物，既可以废物利用，节约资源，还可以减少废弃物的排放，保护环境。
具体实施方式
以下具体实施例对本发明作具体的介绍。
脉络宁注射液生产酯提废液中含有大量的皂苷，主要类型为常春藤型皂苷和齐墩果酸型皂苷。
若无特殊说明，所用试验方法为常规试验方法；所用试剂材料可通过商业途径获得。
实施例1
将脉络宁注射液生产酯提废液浓缩至无酯味的流浸膏10l，加80l的水溶解，过滤，除去水不溶物，得到滤液；再将滤液进行减压浓缩（仪器：büchi旋转蒸发仪r-210，水浴55℃，vacuumpumpv-700减压泵，70mbar（7kpa）），减压浓缩至约1/3体积30l；经45l聚酰胺（pa6）吸附，上样体积与聚酰胺的体积比为2：3，流速8ml/min，随后先用水洗去水溶性杂质，再依次用浓度分别为10%、30%、50%、70%、95%的乙醇进行梯度洗脱，收集10%、30%的醇洗脱液；将10%、30%的醇洗脱液减压浓缩（仪器：büchi旋转蒸发仪r-210，水浴65℃，vacuumpumpv-700减压泵，70mbar（7kpa）），减压浓缩至1/3体积；经过大孔吸附树脂d101，使浓缩液中的皂苷吸附于树脂上，弃去流出液，再用1倍柱体积的水冲洗大孔树脂柱，弃去流出液，继而分别用3倍柱体积的10%、30%、50%、70%、95%乙醇进行梯度洗脱，收集10%、30%、50%的乙醇洗脱液；将10%、30%、50%的醇洗脱液减压浓缩（仪器：büchi旋转蒸发仪r-210，水浴55℃，vacuumpumpv-700减压泵，70mbar（7kpa））至无有机溶剂味的干固体，即得总皂苷提取物；最后将得到的总皂苷粗提取物溶于少量无水甲醇中，然后滴入乙酸乙酯（体积比1：1），搅拌均匀，有总皂苷析出。反复处理5次，收集析出的总皂苷，最后减压浓缩（仪器：büchi旋转蒸发仪r-210，水浴40℃，vacuumpumpv-700减压泵，70mbar（7kpa））至无有机溶剂味的干固体，即得总皂苷提取物。
实施例2
将脉络宁注射液生产酯提废液浓缩至无酯味的流浸膏10l，加100l的水溶解，过滤，除去水不溶物，得到滤液；再将滤液进行减压浓缩（仪器：büchi旋转蒸发仪r-210，水浴60℃，vacuumpumpv-700减压泵，85mbar（8.5kpa）），减压浓缩至约1/4体积28l；经56l聚酰胺（pa66）吸附，上样体积与聚酰胺的体积比为1：2，流速10ml/min，随后先用水洗去水溶性杂质，再依次用浓度分别为10%、30%、50%、70%、95%的乙醇进行梯度洗脱，收集10%、30%的醇洗脱液；将10%、30%的醇洗脱液减压浓缩（仪器：büchi旋转蒸发仪r-210，水浴70℃，vacuumpumpv-700减压泵，85mbar（8.5kpa）），至原来体积的1/3；将浓缩液经过大孔吸附树脂sa-3，使液体中的皂苷吸附于树脂上，弃去流出液，再用1倍柱体积的蒸馏水冲洗树脂柱，弃去流出液，继而分别用2倍柱体积的10%、30%、50%、70%、95%乙醇进行梯度洗脱，收集10%、30%、50%的乙醇洗脱液；将10%、30%、50%的醇洗脱液减压浓缩（仪器：büchi旋转蒸发仪r-210，水浴60℃，vacuumpumpv-700减压泵，85mbar（8.5kpa））至无有机溶剂味的干固体，即得总皂苷粗提取物；将得到的总皂苷粗提取物溶于少量无水甲醇中，然后滴入乙酸乙酯（体积比1：0.7），搅拌均匀，有总皂苷析出，反复处理5次，收集析出的总皂苷，最后减压浓缩（仪器：büchi旋转蒸发仪r-210，水浴45℃，vacuumpumpv-700减压泵，85mbar（8.5kpa））至无有机溶剂味的干固体，即得总皂苷提取物。
实施例3
将脉络宁注射液生产酯提废液浓缩至无酯味的流浸膏10l，加120l的水溶解，过滤，除去水不溶物，得到滤液；再将滤液进行减压浓缩（仪器：büchi旋转蒸发仪r-210，水浴65℃，vacuumpumpv-700减压泵，100mbar（10kpa）），减压浓缩至约1/5体积26l；将浓缩液经过52l聚酰胺柱（pa1212）吸附，使液体中的有效成分吸附于聚酰胺树脂上，上样体积与聚酰胺的体积比为1：2，流速10ml/min，弃去流出液，再用1倍柱体积的蒸馏水冲洗树脂柱，弃去流出液，再用2倍柱体积的20%乙醇冲洗树脂柱，弃去流出液，续以10%、30%、50%、70%、90%乙醇进行梯度洗脱，收集10%、30%乙醇洗脱液；将10%、30%的醇洗脱液减压浓缩（仪器：büchi旋转蒸发仪r-210，水浴75℃，vacuumpumpv-700减压泵，100mbar（100kpa）），至原来体积的1/3；将浓缩液经过大孔吸附树脂ab-8，使液体中的皂苷吸附于树脂上，弃去流出液，再用1倍柱体积的蒸馏水冲洗树脂柱，弃去流出液，继而分别用2倍柱体积的10%、30%、50%、70%、80%、95%乙醇进行梯度洗脱，收集10%、30%、50%的乙醇洗脱液；将10%、30%、50%的醇洗脱液减压浓缩（仪器：büchi旋转蒸发仪r-210，水浴65℃，vacuumpumpv-700减压泵，100mbar（10kpa））至无有机溶剂味的干固体，即得总皂苷粗提取物；将得到的总皂苷粗提取物溶于少量无水甲醇中，然后滴入乙酸乙酯（体积比1：0.5），搅拌均匀，有总皂苷析出；反复处理5次，收集析出的总皂苷，最后减压浓缩（仪器：büchi旋转蒸发仪r-210，水浴50℃，vacuumpumpv-700减压泵，100mbar（10kpa））至无有机溶剂味的干固体，即得总皂苷提取物。
本发明用liebermann反应检测所得到的总皂苷，反应中溶液呈黄→红→蓝→紫→绿色变化，可以确定其为皂苷类化合物。总皂苷的定量测定是利用苷元与香兰素的硫酸试剂发生的显色反应，产生有色物质，分别以灰毡毛忍冬皂苷乙（化合物1）、齐墩果酸（化合物2）为标准品绘制标准曲线，利用紫外分光光度法测定总皂苷纯度。
1、仪器与试剂
高效液相色谱仪aglient1100系列，四元泵，自动进样器，检测器：alltechelsd2000(alltech,deerfield,il,usa)，色谱柱：aglientzorbaxsb-c18柱（150×4.6mm,5.0μm），乙腈为色谱纯，磷酸为分析纯。
2、色谱条件
流动相：0-10min，乙腈：0.5%磷酸溶液维持比例（30：70），11-25min，流动相比例由（30：70）线形改变到（45：55），26-30min，流动相维持比例（45：55）。elsd管温度：106℃。氮气流速：2.6l/min。
3、对照品溶液的制备
分别精密称取经五氧化二磷干燥过夜的化合物1和化合物2对照品，各加甲醇制成每1ml分别含0.05mg的溶液，作为对照溶液。
4、样品测定
精密称取总皂苷10mg，甲醇定容至100ml，各样品经hplc检测。
本发明的有益之处在于：本发明制备方法简单，原料易得，生产成本低，根据本发明得到的产品中总皂苷含量较高，质量稳定、易于控制；通过回收脉络宁注射液生产过程中产生的大量废弃物，既可以废物利用，节约资源，还可以减少废弃物的排放，保护环境。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和优点。本行业的技术人员应该了解，上述实施例不以任何形式限制本发明，凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。