NLRP3炎性小体的抑制剂在制备治疗垂体腺瘤的药物中的应用及治疗垂体腺瘤的药物的制作方法

本发明涉及nlrp3炎性小体的抑制剂在制备治疗垂体腺瘤的药物中的应用及治疗垂体腺瘤的药物。

背景技术：

垂体瘤是常见的颅内良性肿瘤之一，发病率在颅内肿瘤中仅次于脑胶质细胞瘤和脑膜瘤，约占颅内肿瘤的10％，且随着诊断水平的不断提高，发病率有逐年增加趋势。随着肿瘤不断生长，可压迫蝶鞍区周围结构，如视神经、海绵窦、脑底动脉、下丘脑等，甚至累及额叶、脑干，而导致严重的功能障碍。同时，肿瘤生长还可导致垂体激素分泌紊乱。按照外周血激素水平，垂体腺瘤分为无功能型垂体腺瘤(nfpa)和功能型垂体腺瘤，包括：泌乳素腺瘤(prl)、促肾上腺皮质激素腺瘤(acth)、生长激素腺瘤(gh)、促甲状腺激素腺瘤(tsh)、促性腺激素腺瘤(pga)及混合激素分泌腺瘤等。

泌乳素腺瘤是最常见的垂体肿瘤，约占垂体腺瘤的80％～85％，是由垂体泌乳素细胞瘤分泌过量泌乳素(prolactin,prl)引起的下丘脑-垂体疾病中常见的一种疾病，典型临床表现：女性为闭经、溢乳、不育、高泌乳素血症；男性为阳痿，性功能减退，乳房发育；肿瘤压迫及侵犯周围结构所引起的症状和体征。有临床症状的泌乳素微腺瘤一般不会长成大腺瘤，部分腺瘤有侵袭性生长，出现腺瘤增大。根据2014版的《中国垂体泌乳素腺瘤诊治共识》，垂体泌乳素腺瘤治疗方案首选多巴胺受体激动剂进行药物治疗。使用多巴胺受体激动剂不仅可以降低血清prl水平，同时可以帮助恢复性腺功能并缩小肿瘤体积。

目前治疗垂体催乳素腺瘤的药物主要有以下几种：溴隐亭、卡麦角林、培高利特及喹高利特，前3种为麦角碱衍生物类多巴胺受体激动剂，喹高利特为非麦角碱衍生物类，且均为多巴胺d2受体(drd2)激动剂。甲磺酸培高利特因为增加心脏瓣膜损害的风险而自愿退市，并于2008年1月1日在中国市场撤出。

目前在临床治疗过程中，约有8％～25％的垂体泌乳素腺瘤患者经溴隐亭治疗后出现耐药现象。由于卡麦角林和喹高利特未进入国内市场，目前在国内仅有溴隐亭1种。溴隐亭为多巴胺d2受体(drd2)激动剂，治疗泌乳素腺瘤效果显著，但价格昂贵，且存在一定副作用，例如：溴隐亭对80％～90％的患者可有效降低prl、恢复性腺功能、缩小或控制肿瘤生长，其副作用主要是胃肠道反应，剂量较大时可有眩晕、体位性低血压、头痛、瞌睡与便秘等。对溴隐亭耐药或对其不良反应不耐受的患者，没有可替代治疗的药品。因此，为保证我国垂体泌乳素腺瘤患者的健康，并保障其治疗的安全性，迫切需要研究开发泌乳素腺瘤的治疗新靶点和药物。

鉴于此，特提出本发明。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供nlrp3炎性小体的抑制剂在制备治疗垂体腺瘤的药物中的应用及治疗垂体腺瘤的药物。

本发明是这样实现的：

nlrp3炎性小体的抑制剂在制备治疗垂体腺瘤的药物中的应用。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述nlrp3炎性小体抑制剂为mcc950或曲尼司特。

在实施方式中，上述nlrp3炎性小体抑制剂也可以是cy-09或inf39。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述垂体腺瘤选自泌乳素腺瘤、促肾上腺皮质激素腺瘤、生长激素腺瘤、促甲状腺激素腺瘤、促性腺激素腺瘤和混合激素分泌腺瘤中的一种。

本发明首次发现，nlrp3炎性小体可以促进垂体泌乳素腺瘤的生长，促进垂体分泌泌乳素(prl)，而nlrp3炎性小体的抑制剂可以显著抑制垂体泌乳素腺瘤的生长，抑制泌乳素(prl)的生成，因此，含有nlrp3炎性小体抑制剂的药物可以实现泌乳素腺瘤的治疗。nlrp3炎性小体抑制剂为垂体泌乳素腺瘤患者带来了福音。

经发明人实验验证发现，mcc950或曲尼司特可以作为nlrp3炎性小体抑制剂使得小鼠垂体泌乳素表达量显著减少。

但需要说明的是，本发明的nlrp3炎性小体抑制剂并不限于mcc950(cp-456773)和曲尼司特(tranilast)，本领域技术人员在本发明公开的内容基础上，容易想到使用其他的nlrp3炎性小体抑制剂制备垂体腺瘤的药物，其也是属于本发明的保护范围。nlrp3炎性小体抑制剂在筛选治疗垂体腺瘤的药物中的应用。

抑制nlrp3基因表达的抑制剂在制备治疗垂体腺瘤的药物中的应用。

nlrp3基因可以作为治疗垂体泌乳素腺瘤的药物干预靶点。通过特异性靶向抑制或敲除nlrp3基因来抑制垂体泌乳素腺瘤生长。

本发明经试验验证，通过特异性靶向抑制或敲除nlrp3基因能够显著抑制垂体泌乳素腺瘤的生长和泌乳素的生成，该原理可以将nlrp3基因作为治疗垂体泌乳素腺瘤的药物干预靶点。

nlrp3炎性小体抑制剂为mcc950或曲尼司特。

垂体腺瘤选自泌乳素腺瘤、促肾上腺皮质激素腺瘤、生长激素腺瘤、促甲状腺激素腺瘤、促性腺激素腺瘤和混合激素分泌腺瘤中的一种。

治疗垂体腺瘤的药物，其以nlrp3基因为靶点抑制其表达。

本发明具有以下有益效果：

本发明提供了nlrp3炎性小体的抑制剂在制备治疗垂体腺瘤的药物中的应用及治疗垂体腺瘤的药物，nlrp3炎性小体的活化可以促进垂体腺瘤的生长，而nlrp3炎性小体抑制剂可以抑制垂体腺瘤的生长，抑制垂体分泌激素。通过特异性抑制nlrp3基因，能够显著抑制垂体腺瘤的生长，即nlrp3基因可以作为治疗垂体腺瘤的药物干预靶点。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为实施例1中对照组和雌二醇诱导的泌乳素腺瘤大鼠垂体的核磁共振和外观图；

图2为正常对照和雌二醇诱导的泌乳素腺瘤模型大鼠垂体mrna的热图(n＝4)；

图3为正常对照和雌二醇诱导的泌乳素腺瘤模型大鼠垂体上调基因和信号通路的富集统计图；

图4为pet/ct检测的大鼠垂体炎症图像(a)和tspo表达水平(b)(箭头指示是垂体，红色区域表示炎症表达)；

图5为对照组和雌二醇诱导的泌乳素腺瘤大鼠垂体组织蛋白表达的westernblot检测图；

图6为大鼠垂体蛋白的免疫荧光检测图(prl+nlrp3)；

图7为大鼠垂体蛋白的免疫荧光检测图(prl+iba-1)；

图8为实施例2中gh3细胞裂解物的蛋白表达的westernblot检测结果图；

图9为实施例3中gh3细胞裂解物的蛋白表达的westernblot检测结果图；

图10为野生型、雌二醇诱导和雌二醇诱导的nlrp3^(-/-)小鼠垂体蛋白的westernblot检测结果图；

图11为野生型、drd2^(-/-)和drd2^(+/-)*nlrp3^(+/-)小鼠垂体蛋白的westernblot检测结果图；

图12为人垂体组织蛋白的免疫荧光检测图(prl+nlrp3)；

图13为人垂体组织蛋白的免疫荧光检测图(prl+iba-1)。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

雌二醇诱导的泌乳素腺瘤大鼠垂体nlrp3炎性小体显著活化。

1.建立大鼠泌乳素腺瘤模型。

sd大鼠购买自湖北省实验动物中心，随机将20只sd大鼠分为正常组和模型组，每组各10只。模型组大鼠腹腔注射苯甲酸雌二醇注射液(购买自四川金科药业有限责任公司，批号20170702)，剂量为20mg/kg，每5天注射一次，连续注射50天；正常组大鼠腹腔注射同剂量的生理盐水。

2.大鼠垂体的核磁共振成像检测和外观观察。

核磁共振成像检测和外观图参照图1所示，由图1可知，与正常对照组大鼠比较，雌二醇注射诱导的泌乳素腺瘤大鼠垂体体积显著增大。

3.雌二醇诱导的泌乳素腺瘤大鼠垂体的先天免疫反应显著活化大鼠垂体基因芯片检测。

正常大鼠和雌二醇诱导的泌乳素腺瘤大鼠垂体摘除后，用rna提取试剂盒提取mrna后，送至北京中康博生物科技有限公司基因芯片检测。

垂体基因芯片分析结果参照图2所示，与正常对照组大鼠比较，雌二醇诱导的泌乳素腺瘤大鼠垂体组织中先天免疫反应显著活化。正常对照和雌二醇诱导的泌乳素腺瘤模型大鼠垂体上调基因和信号通路的富集统计图参照图3所示。

4.雌二醇诱导的泌乳素腺瘤大鼠垂体的炎症显著增加。

对大鼠垂体进行pet/ct检测。

pet/ct检测移位蛋白(tspo)的表达水平用于反映大鼠的垂体炎症情况，而¹⁸f-fdpa用于tspo的小分子配体检测。

大鼠垂体的炎症表达结果参照图4所示，图4中的a图为pet/ct检测的大鼠垂体炎症图像，箭头指示是垂体，红色区域表示炎症表达；b图为tspo表达水平。

与正常对照组(controlgroup)大鼠比较，雌二醇诱导的泌乳素腺瘤大鼠(modelgroup)垂体组织中炎症表达显著升高(与对照组比较，^*p<0.05，^**p<0.01，^***p<0.001，n＝3)

5.雌二醇诱导的泌乳素腺瘤大鼠垂体组织中nlrp3炎性小体表达显著增加。

对大鼠垂体蛋白进行westernblot检测。正常对照组大鼠和模型组大鼠均摘取垂体组织，经提取蛋白后，经电泳、转膜和曝光后，检测prl和nlrp3炎性小体的表达情况。

westernblot检测结果参照图5所示，由图5可知，与正常对照组大鼠比较，雌二醇诱导的泌乳素腺瘤大鼠垂体组织中泌乳素(prl)蛋白显著增加(p<0.05)；而且，nlrp3(p<0.05),caspase-1p45(p<0.05),caspase-1p20(p<0.001),asc(p<0.05),pro-il-1β(p<0.01),il-1βp17(p<0.05)和il-18(p<0.05)蛋白均显著增加。

图5中，es为雌二醇注射，与对照组比较，^*p<0.05，^**p<0.01，^***p<0.001，n＝4。

6.雌二醇诱导的泌乳素腺瘤大鼠垂体组织中nlrp3炎性小体和prl蛋白共定位。

大鼠垂体蛋白的免疫荧光检测图(prl+nlrp3)和大鼠垂体蛋白的免疫荧光检测图(prl+iba-1)分别参照图6和图7所示，免疫荧光检测显示，与正常对照组大鼠比较，雌二醇诱导的泌乳素腺瘤大鼠垂体组织中prl、nlrp3和iba-1蛋白均显著增加。而且，对照组和泌乳素腺瘤大鼠垂体组织中prl和nlrp3蛋白出现共定位现象，prl和iba-1蛋白也出现共定位现象。

实施例2

本实施例证实垂体瘤gh3细胞中nlrp3炎性小体活化后prl表达显著增加。

gh3细胞购买自北京北纳创联生物技术研究院，lps购买自sigma公司，msu购买自sigma公司，传代后的gh3细胞融合度为70-80％时，分别种三块6孔板(重复3次)，每孔加1ml的细胞液，再加1ml的培养基，放入二氧化碳培养箱中培养24小时后，每孔吸掉1ml培养基弃去，分别加入刺激物，6孔板中刺激物加样顺序如下表1所示。

表1加样顺序。

加刺激物培养24小时后，各组gh3细胞提取细胞裂解物蛋白，供westernblot检测。

westernblot检测结果参照图8所示，westernblot检测显示，与未刺激组(un)细胞比较，加lps(p<0.01)、lps和msu(p<0.001)、lps和atp(p<0.001)、lps和尼日利亚菌素(p<0.001)的gh3细胞裂解物中prl蛋白均显著增加；而且，nlrp3(p<0.001)、caspase-1p45(p<0.05)、asc(p<0.001)和il-1β(p<0.001)蛋白也均显著增加。

实施例3

本实施例证实，nlrp3炎性小体抑制剂mcc950通过抑制nlrp3炎性小体的活化减少了gh3细胞prl的表达。mcc950购买自medchemexpress公司。

gh3细胞种板后加刺激物和mcc950。传代后的gh3细胞融合度为70-80％时，分别种三块6孔板(重复3次)，每孔加1ml的细胞液，再加1ml的培养基，放入二氧化碳培养箱中培养24小时后，每孔吸掉1ml培养基弃去，分别加入lps溶液和ni溶液，6小时后分别加入不同浓度的mcc950液，试剂加样顺序如下表2所示。

表2试剂加样顺序。

加mcc950培养24小时后，各组gh3细胞提取裂解物蛋白，供westernblot检测。

gh3细胞裂解物的westernblot检测结果参照图9所示。westernblot检测显示，与未刺激的细胞(un)比较，加lps和尼日利亚菌素(ni)(购自medchemexpress公司)的gh3细胞裂解物中prl蛋白显著增加(p<0.001)。而且，nlrp3(p<0.001)、caspase-1p45(p<0.05)、asc(p<0.001)和il-1β(p<0.001)蛋白均显著增加。与加lps和尼日利亚菌素(ni)的gh3细胞比较，加lps和尼日利亚菌素和mcc950的gh3细胞裂解物中prl(p<0.001)、nlrp3(p<0.001)、caspase-1p45(p<0.05)、asc(p<0.001)和il-1β(p<0.001)蛋白均显著减少。

实施例4

本实施例对雌二醇诱导的nlrp3敲除小鼠垂体prl表达量进行研究，结果显示雌二醇诱导的nlrp3敲除小鼠垂体prl表达显著减少。

雌二醇诱导的nlrp3敲除小鼠(nlrp3^(-/-)小鼠)由中国科技大学周荣斌教授馈赠。

随机将c57小鼠(购自湖北省实验动物中心)分为野生型和模型组，每组各10只，模型组小鼠和nlrp3^(-/-)小鼠均腹腔注射苯甲酸雌二醇注射液，剂量为20mg/kg，每5天注射一次，连续注射50天；正常组小鼠腹腔注射同剂量的生理盐水。

分别取小鼠垂体组织进行westernblot检测。westernblot检测结果参照图10所示，与野生型小鼠比较，雌二醇(es)诱导的泌乳素腺瘤小鼠垂体组织中prl蛋白显著增加(p<0.05)；而且，nlrp3(p<0.01)、caspase-1p10(p<0.05)和il-1βp17(p<0.01)蛋白均显著增加。

与雌二醇(es)诱导的野生型泌乳素腺瘤小鼠比较，雌二醇诱导的nlrp3^(-/-)小鼠垂体中prl(p<0.05)、nlrp3(p<0.01)、caspase-1p10(p<0.05)和il-1βp17(p<0.05)蛋白表达均显著降低。与野生型组比较，^*p<0.05,^**p<0.01,^***p<0.01；与雌二醇诱导组比较，^#p<0.05,^##p<0.01,^###p<0.01,n＝3。

实施例5

本实施例对nlrp3缺失的drd2敲除小鼠垂体prl表达量进行研究。结果显示nlrp3缺失的drd2敲除小鼠垂体prl表达显著减少。

drd2(－/－)小鼠和nlrp3^(－/－)小鼠均由中国科技大学周荣斌教授馈赠。将drd2(－/－)小鼠和nlrp3^(－/－)小鼠杂交繁育后，构建drd2^(+/－)＊nlrp3^(+/－)小鼠。

摘除小鼠垂体组织，进行westernblot检测。westernblot检测结果参照图11所示，与野生型小鼠比较，drd2(-/-)小鼠垂体组织中prl蛋白显著增加；而且，nlrp3(p<0.01)、caspase-1p20(p<0.01)、asc(p<0.01)和il-1βp17(p<0.01)蛋白均显著增加。

与drd2(-/-)小鼠比较，drd2^(+/-)*nlrp3^(+/-)小鼠垂体组织中prl(p<0.05)、nlrp3(p<0.05)、caspase-1p20(p<0.01)、asc(p<0.01)和il-1βp17(p<0.05)蛋白均显著减少。

与野生型组比较，^*p<0.05,^**p<0.01,^***p<0.01；与drd2(-/-)小鼠比较，^#p<0.05,^##p<0.01,^###p<0.01,n＝3。

实施例6

本实施例对垂体泌乳素腺瘤患者(来源于华中科技大学同济医学院附属武汉市中心医院)垂体中prl和nlrp3蛋白进行研究，结果出现共定位现象。

人垂体组织蛋白的免疫荧光检测图(prl+nlrp3)参照图12所示，人垂体组织蛋白的免疫荧光检测图(prl+iba-1)参照图13所示，检测显示，与垂体其他疾病的样品比较，垂体泌乳素腺瘤患者垂体中prl、nlrp3和iba-1蛋白表达均显著增加；而且，垂体泌乳素腺瘤患者垂体组织中prl和nlrp3蛋白、prl和iba-1蛋白均出现共定位现象。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。