一种骨修复用复合多孔支架材料的制备方法与流程

本发明涉及一种骨修复用复合多孔支架材料的制备方法，属于生物医用材料领域。

背景技术：

现代医药领域科学研究的一个突出范围集中在了人骨和其他类型的组织上，其目的是研发替代人体病变部位的人造材料。骨组织工程支架材料是指能与成骨细胞结合并能植入生物体的材料，它是组织工程化骨的最基本构架。植入机体后，支架材料与宿主组织接触部分发生化学结合，能长期发挥功能，而不会在界面处发生松动与破坏。

骨组织工程包括3个关键因素：生长因子、支架材料和种子细胞。其中支架材料的选择是骨及软骨组织工程的核心问题，而应用于临床是其最终目的，因此，理想的骨支架材料应具备以下条件：①良好的生物相容性，不易发生炎症反应，且利于细胞黏附；②有一定的力学强度；③良好的生物活性；④其结构有利于营养物质的输入及代谢废物的排出，从而有利于骨细胞的新陈代谢；⑤良好的生物降解性，有利于细胞增殖，且支架的降解速率应与细胞的增值速率相匹配。

目前，骨组织工程支架材料主要分为三类：生物衍生材料、无机材料和高分子材料。天然衍生材料主要有胶原、几丁质、藻酸盐、纤维蛋白等，这类材料能促进细胞黏附、增殖并分泌基质，生物相容性好，但不易大规模生产并缺乏强度。无机材料主要是生物陶瓷类和生物活性玻璃。生物陶瓷主要有硫酸钙陶瓷、碳酸钙陶瓷、磷酸钙陶瓷及其同分异构体。以羟基磷灰石为代表的磷酸钙陶瓷是广泛应用的骨替代材料之一，它们都具有良好的生物相容性、生物降解性、骨传导性。但存在脆性大，柔韧性不够，在体内降解困难，影响了新骨的长入和后期改建等问题。以聚乳酸、聚羟基乙酸及其共聚物等为代表的高分子材料应用非常广泛。这类生物高分子材料具有良好的生物可降解性、生物相容性、安全无毒性及一定的力学性能，通过模塑、挤压、溶剂浇铸等技术可加工成各种结构形状。可根据需要制成纤维支架、多孔泡沫及管状结构等，从而使新生的骨组织具有理想的形态。然而，目前骨组织工程支架材料众多，每种支架材料各有其优缺点，现有的支架材料仅能达到理想支架材料要求的一部分，随着研究的不断深入，复合支架材料成为目前的研究热点之一。

胶原蛋白是人体内所含的各种胶原蛋白中最丰富的一种，存在于肌肉、皮肤、动脉壁、纤维软骨中，可以从动物组织中提取。胶原蛋白具有优良的生物学性质，如低抗原性、凝血作用以及可调节细胞的粘附、增殖、分化等行为。因此，胶原蛋白常用于制备组织工程支架。而胶原蛋白支架在体内会经过胶原蛋白酶或金属蛋白酶的作用，降解为相应的小分子多肽和氨基酸，进入血液循环过程或经细胞吞噬并进一步分解吸收，因此胶原蛋白作为体内移植材料时，极易被人体吸收。

纳米二氧化钛是一种光催化剂，在光照下可以对细菌的生长有很好的抑制作用，对有机物亦有很好的催化分解和清洁作用。

技术实现要素：

本发明提供一种骨修复用复合多孔支架材料的制备方法，通过静电纺丝将胶原蛋白与人工合成纳米二氧化钛复合，得到的纳米纤维支架材料，该材料无细胞毒性，成骨细胞基因表达良好，能够作为一种骨修复材料。

一种骨修复用复合多孔支架材料的制备方法，具体包括如下步骤：

（1）在室温下，按照钛酸丁酯、乙醇、乙酸的质量体积比g:ml:ml为10-20:100:25的比例，将三者混合，磁力搅拌3-5h，形成钛醇液；

（2）将聚乙烯吡咯烷酮与步骤（1）的钛醇液以质量体积比8-9:10的比例混合，并超声分散20-50min，磁力搅拌1-2h，得到分散钛液；

（3）将步骤（2）的分散钛液加入至电纺丝装置内进行静电纺丝，得到纳米纤维膜；

（4）将步骤（3）的纳米纤维膜放置在空气气氛电阻炉中，加热至500℃，保温2-5h，得到纳米二氧化钛；

（5）在室温下，按照胶原与六氟异丙醇的质量体积比g:ml为7-12:100的比例，将胶原加入六氟异丙醇溶液中，磁力搅拌1-2h得到胶原溶液，胶原为ⅰ型胶原蛋白；

（6）将步骤（4）得到的纳米二氧化钛加入步骤（5）的胶原溶液中，超声分散5-10min，得到纺丝原液；

（7）采用平板接收器，电源正极接针头处，负极接钢板，将步骤（6）所得的纺丝液进行静电纺丝得到纺丝纤维，将纺丝纤维采用交联剂进行交联；

（8）将步骤（7）交联后的材料进行冷冻干燥48h，得到骨修复用复合多孔支架材料。

步骤（1）中磁力搅拌的速率为100-400r/min。

步骤（2）中超声分散的超声频率为20-40khz，温度为40-50℃。

步骤（2）中磁力搅拌的速率为100-400r/min。

步骤（3）中静电纺丝的电压为16-20kv，推进速度为0.1-0.2mm/min，接收距离为15-25cm，所用针头为17-20号。

步骤（5）中磁力搅拌的速率为100-200r/min。

步骤（6）中纳米二氧化钛与胶原溶液的质量体积比g:ml为0.1-0.5:100。

步骤（6）中超声分散的超声频率为10-20khz。

步骤（7）中静电纺丝的电压为13-25kv，推进速度为0.1-0.2mm/min，接收距离为15-25cm，所用针头为17-20号。

步骤（8）中交联剂为1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺与n-羟基硫代琥珀酰亚胺(edc/nhs)质量比为6:1混合的混合物、戊二醛或柠檬酸，交联时间为24-36h。

本发明的有益效果：

（1）本发明使用的胶原和纳米二氧化钛均无细胞毒性，具有良好的生物相容性。

（2）本发明通过改变静电纺丝相关参数，能较好地控制纤维质量及纤维直径分布，且该结构适合细胞黏附生长以及营养物质运输。

（3）本发明通过调节纺丝时间即可实现得到的骨修复支架厚度可调。

（4）本发明解决了二氧化钛粉体活性差的问题，静电纺丝制备的纳米二氧化钛催化活性更高。

附图说明

图1是本发明实施例1得到的纳米二氧化钛的sem图；

图2是本发明实施例1得到的纳米二氧化钛的xrd图谱；

图3是本发明实施例1得到的骨修复用复合多孔支架材料的sem图；

图4是本发明实施例2得到的骨修复用复合多孔支架材料的sem图；

图5是本发明实施例3得到的骨修复用复合多孔支架材料的sem图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明的保护范围并不限于所述内容。

实施例1

一种骨修复用复合多孔支架材料的制备方法，具体包括以下步骤：

（1）在室温下，将1g钛酸丁酯、10ml乙醇、2.5ml乙酸，充分混合，以100r/min的速率磁力搅拌3h，形成钛醇液；

（2）取8g聚乙烯吡咯烷酮加入至10ml钛醇液中，以20khz的频率、50℃下超声分散20min，以400r/min的速率磁力搅拌1h，得到分散钛液；

（3）采用17号针头，设定正电压为16kv，负电压为-3.5kv，纺丝液的推注速度为0.1mm/min，针头与接收装置的距离为15cm，电源正极接针头处，负极接钢板，将步骤（2）得到的分散钛液进行静电纺丝得到纳米纤维膜；

（4）将得到纳米纤维膜放置在电阻炉中，在空气气氛下，加热至500℃，保温2h，得到纳米二氧化钛；

（5）在室温下，将7g胶原溶于100ml六氟异丙醇中，以200r/min的速率磁力搅拌1h，得到胶原溶液，胶原为ⅰ型胶原蛋白；

（6）将纳米二氧化钛加入胶原溶液中，10khz超声分散10min，得到纺丝原液中，纳米二氧化钛与胶原溶液的质量体积比g:ml为0.1:100；

（7）采用17号针头，设定正电压为13kv，负电压为-3.5kv，纺丝液的推注速度为0.1mm/min，针头与接收装置的距离为15cm，电源正极接针头处，负极接钢板，将上述纺丝原液进行静电纺丝得到纺丝纤维，将纺丝纤维采用戊二醛进行交联24h；

（8）将交联后的材料进行冷冻干燥48h，得到骨修复用复合多孔支架材料。

图1是本实施例步骤（4）得到的纳米二氧化钛的sem图；从图中可知得到的纳米二氧化钛有较为良好的尺寸和结构，相比粉体拥有更好的的催化活性。

图2是本实施例得到的纳米二氧化钛的xrd图谱；从图中对比标准二氧化钛的晶面衍射特征峰，可以看出，成功制备出了锐钛矿型和金红石型二氧化钛，且结晶度较好。

图3为本实施例最后制得的骨修复用多孔材料的sem图，从图中可知，得到的多孔纤维材料，其纤维直径分布在800-900nm，纤维直径均匀，纤维表面光滑，纤维之间形成的多孔结构也易于细胞的生长和粘附。

本实施例得到骨修复用复合多孔支架材料的拉伸强度为5.2mpa，细胞毒性为0级，即无细胞毒性。

实施例2

一种骨修复用复合多孔支架材料的制备方法，具体包括以下步骤：

（1）在室温下，将1.5g钛酸丁酯与10ml乙醇，2.5ml乙酸，充分混合，以200r/min的速率磁力搅拌4h；形成钛醇液；

（2）取8.5g聚乙烯吡咯烷酮加入至10ml钛醇液中，以30khz的频率、45℃下超声分散35min，以200r/min的速率磁力搅拌1.5h，得到分散钛液；

（3）采用19号针头，设定正电压为18kv，负电压为-3.5kv，纺丝液的推注速度为0.15mm/min，针头与接收装置的距离为20cm，电源正极接针头处，负极接钢板，将上述分散钛液进行静电纺丝得到纳米纤维膜；

（4）将得到纳米纤维膜放置在电阻炉中，在空气气氛下，加热至500℃，保温3h，得到纳米二氧化钛；

（5）在室温下，将10g胶原溶于100ml六氟异丙醇中，以150r/min的速率磁力搅拌1.5h，得到胶原溶液，胶原为ⅰ型胶原蛋白；

（6）将纳米二氧化钛加入胶原溶液中，15khz超声分散7min，得到纺丝原液中，纳米二氧化钛与胶原溶液的质量体积比g:ml为0.3:100；

（7）采用19号针头，设定正电压为18kv，负电压为-3.5kv，纺丝液的推注速度为0.15mm/min，针头与接收装置的距离为20cm，电源正极接针头处，负极接钢板，将上述纺丝原液进行静电纺丝得到纺丝纤维，将纺丝纤维采用柠檬酸进行交联30h；

（8）将交联后的材料进行冷冻干燥48h，得到骨修复用复合多孔支架材料。

图4为本实施例最后制得的骨修复用多孔材料的sem图，从图中可知，得到的多孔纤维材料，其纤维直径分布在500-700nm，纤维直径均匀，纤维表面光滑，纤维之间形成的多孔结构也易于细胞的生长和粘附。

本实施例得到骨修复用复合多孔支架材料的拉伸强度为4.9mpa，细胞毒性为0级，即无细胞毒性。

实施例3

一种骨修复用复合多孔支架材料的制备方法，具体包括以下步骤：

（1）在室温下，将2g钛酸丁酯与10ml乙醇，2.5ml乙酸，充分混合，以100r/min的速率磁力搅拌5h；形成钛醇液；

（2）取9g聚乙烯吡咯烷酮加入至10ml钛醇液中，以40khz的频率、40℃下超声分散50min，以100r/min的速率磁力搅拌2h，得到分散钛液；

（3）采用20号针头，设定正电压为20kv，负电压为-3.5kv，纺丝液的推注速度为0.2mm/min，针头与接收装置的距离为25cm，电源正极接针头处，负极接钢板，将上述分散钛液进行静电纺丝得到纳米纤维膜；

（4）将得到纳米纤维膜放置在电阻炉中，在空气气氛下，加热至500℃，保温5h，得到纳米二氧化钛；

（5）在室温下，将12g胶原溶于100ml六氟异丙醇中，以100r/min的速率磁力搅拌2h，得到胶原溶液，胶原为ⅰ型胶原蛋白；

（6）将纳米二氧化钛加入胶原溶液中，20khz超声分散5min，得到纺丝原液中，纳米二氧化钛与胶原溶液的质量体积比g:ml为0.5:100；

（7）采用20号针头，设定正电压为25kv，负电压为-3.5kv，纺丝液的推注速度为0.2mm/min，针头与接收装置的距离为25cm，电源正极接针头处，负极接钢板，将上述纺丝原液进行静电纺丝得到纺丝纤维，将纺丝纤维采用交联剂为1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺与n-羟基硫代琥珀酰亚胺(edc/nhs)质量比为6:1混合的混合物进行交联36h；

（8）将交联后的材料进行冷冻干燥48h，得到骨修复用复合多孔支架材料。

图5为本实施例最后制得的骨修复用多孔材料的sem图，从图中可知，得到的多孔纤维材料，其纤维直径分布在200-400nm，纤维直径均匀，纤维表面光滑，纤维之间形成的多孔结构也易于细胞的生长和粘附。

本实施例得到骨修复用复合多孔支架材料的拉伸强度为4.7mpa，细胞毒性为0级，即无细胞毒性。

本发明制备的骨修复用复合多孔支架材料，有丰富的孔洞结构，易于细胞的生长和增殖，通过细胞实验，结果表明该材料有良好的生物活性和生物相容性，也拥有良好的力学性能，能够作为骨组织工程支架，在骨修复领域得到应用。