间充质干细胞上清液在制备治疗肺细胞损伤制剂中的应用的制作方法

本发明属于干细胞应用技术领域，特别涉及间充质干细胞上清液在制备治疗肺细胞损伤制剂中的应用；尤其涉及人羊膜间充质干细胞培养上清液制剂在治疗百草枯致急性肺细胞损伤中的应用。

背景技术：

百草枯(paraquat，pq)是一种快速灭生型除草剂，因其具有高效的除草效果曾被广泛应用，但由于pq对人体毒性极大，其吸收后随血液循环分布至全身各组织器官，其中绝大部分被肺组织摄取，引起广泛的肺泡细胞损伤，从而导致急性肺损伤(acutelunginjury，ali)以及其继发的纤维化，其中肺组织强烈的炎症反应是导致ali和肺纤维化的中心环节，口服中毒致死率达90％以上。我国虽已停止pq水剂在国内的销售和使用，但目前因pq中毒就诊的患者仍屡见不鲜，目前尚无特效解毒药。临床上常规的治疗措施主要包括：1、抑制毒物吸收，如清洗染毒皮肤、催吐、洗胃及导泄等；2、加速体内pq排泄，如血液灌流、血液透析等；3、药物治疗，如清除氧自由基、减少肺纤维化，以及对症支持等治疗。但抑制炎症因子、改善氧合及促进肺内液体吸收等治疗措施都未能有效地缓解百草枯中毒所致肺损伤的病程进展，死亡率居高不下。

随着干细胞相关技术迅速发展，干细胞所具有的低免疫原性和向多个胚层分化及旁分泌等特点为治疗肺损伤性疾病开创了新的思路和方法。研究发现移植骨髓间充质干细胞(bonemarrowmesenchymalstemcell，bmmscs)对pq诱导的肺损伤具有保护作用，其可以减轻肺水肿、脂质过氧化以及抑制炎症介质的释放。人脐带间充质干细胞对百草枯中毒性急慢性肺损伤有一定的治疗作用，这种作用可能是通过旁分泌机制实现的。

人羊膜间充质干细胞(humanamnion-derivedmesenchymalstemcells,had-mscs)比骨髓和脐带来源间充质干细胞具有更强的扩增能力。在特定的体外诱导培养条件下，had-mscs可分化成来自三个胚层的所有细胞，包括神经细胞、心肌细胞、成骨和软骨细胞及胰腺细胞等。作为干细胞其具有向损伤组织迁移的潜能，此外，研究发现，had-mscs具有免疫调节的特性，能够抑制损伤组织炎症反应。且had-mscs来源丰富，分离周期短，扩增能力强，性状稳定，疗效显著。所具有的这些特性使其在pq中毒所致的ali治疗中具有更大的临床应用潜能。

申请人之前研究发现had-mscs在制备治疗急性肺损伤制剂中的作用(申请号为：cn201610359976.7)，本发明是在原有研究的基础上，进一步深入研究had-mscs上清液体外对肺细胞的保护作用，探索其可能的旁分泌机制。用细胞培养上清液代替细胞产品，既能起到治疗肺细胞损伤的效果，又能减少细胞治疗带来的伦理和生物安全问题。

技术实现要素：

本发明意在提供间充质干细胞培养上清液在治疗百草枯致急性肺细胞损伤制剂中的应用。

本发明发现间充质干细胞上清液对治疗肺细胞损伤具有良好效果，间充质干细胞上清液来自于间充质干细胞的无血清培养基，不含细胞，属于非细胞上清液制剂。

采用来自于骨髓、胎盘、羊水、脐静脉内皮下层、外周血、肝脏、脂肪、肌肉、皮肤或脐带组织的间充质干细胞上清液，对治疗肺细胞损伤的效果更好。

特别是人羊膜间充质干细胞培养上清液制剂对肺细胞损伤具有较好的治疗疗效，且尤其对百草枯诱导的急性肺细胞损伤具有显著的治疗疗效，人羊膜间充质干细胞培养上清液制剂可以在百草枯诱导的急性肺细胞损伤方面实现应用。该间充质干细胞来源于产后丢弃物人胎盘组织表面的羊膜层——人羊膜间充质干细胞，该培养上清液，来自于传代培养后无血清培养基培养24h收集，并经0.22μm小滤器过滤的无细胞及其细胞碎片残留。

本发明体外培养的肺细胞，不同浓度梯度的pq染毒，立即加had-mscs-cm(人羊膜间充质干细胞上清液)干预24h后行cck-8检测其增殖活性；采用流式细胞术检测细胞凋亡率；利用电镜观察细胞及细胞器形态；荧光显微镜下观察荧光探针，检测活性氧(ros)的水平；并用westernblot法检测细胞内相关蛋白表达水平；用elisa法检测培养上清液中细胞因子的含量。

本发明具有治疗肺细胞损伤的效果，本发明作为生物制品与人羊膜间充质干细胞相比，更能减少细胞治疗带来的伦理和生物安全问题，更能安全有效的向临床治疗药物转化。

附图说明

图1为had-mscs的生长形态图；

图2为pq降低a549细胞增殖活力以及had-mscs-cm缓解了pq所致的细胞增殖下降图；

图3为had-mscs-cm降低pq所致的氧化应激及炎症介质水平图；

图4为had-mscs-cm降低pq所致的细胞凋亡图；

图5为westernblot检测细胞内chop及grp78蛋白表达情况图。

具体实施方式

had-mscs的分离、培养、扩增与鉴定：在无菌条件下，用镊子将羊膜从胎盘上剥离，用含双抗(终浓度为青霉素：100iu/ml，链霉素：0.1mg/ml，现配现用)的d-pbs液冲洗一遍后，用不含有双抗的d-pbs液反复冲洗羊膜组织，去除残留的血渍和粘液。剪碎羊膜，加入0.05％胰蛋白酶-0.02％edta-2na溶液，37℃恒温水平摇床(200rpm/min)消化30min，200目不锈钢滤网过滤，弃滤液，剩余羊膜组织碎片用d-pbs液冲洗，加入0.75mg/mlⅱ型胶原酶-0.075mg/mldnaseⅰ消化液，37℃、200rpm/min消化2～3h，至组织消化完全，200目不锈钢滤网过滤，收集细胞滤液，2400rpm/min，离心16min，弃上清，沉淀用含2mml-谷氨酰胺、10％胎牛血清和终浓度为10ng/mlbfgf的lg-dmem培养基混悬，即had-mscs悬液，2％台盼蓝染色检测细胞活力，根据细胞活力接种于25cm²培养瓶内，细胞密度按按5×10⁵/ml接种，置于37℃、5％co2，饱和湿度条件下培养，24h后更换新培养基，待贴壁细胞融合约80％～90％时，d-pbs液冲洗，加入0.25％胰蛋白酶-0.02％edta-2na消化液，37℃孵育1min，显微镜下观察消化情况，待细胞开始收缩时用含有10％fbs的培养基终止消化，收集细胞并行传代扩增培养，倒置显微镜观察细胞生长情况。

had-mscs的纯度鉴定：取第3代had-mscs，1000rpm/min离心5min，弃上清，d-pbs洗涤一次，混悬，调整细胞密度为2.0×10⁶cells/ml。取细胞悬液200μl按组合方案加10μl荧光素标记的cd44、cd73、cd90、cd105、cd34、cd45、cd14、cd19、cd80、cd86和hla-dr抗体震荡混匀，室温避光孵育30min，每管加入2ml含有0.1％bsa的d-pbs，混匀，1000rpm/min离心5min，弃上清，震荡悬浮细胞。每管加入200μl1％多聚甲醛，混匀，2～8℃避光保存，24h内用流式细胞仪检测分析。每份样品的采集细胞数均≥2×10⁴个，cellquest软件分析。同型对照抗体为相应荧光素标记的小鼠igg。

had-mscs的培养上清液收集：取3-6代had-mscs，当其铺满皿底约80-90％时，弃培养基，用d-pbs冲洗2-3遍，更换无血清l-dmem培养基，无任何添加因子成分。继续培养24h以后吸取培养基上清液，并3000rpm离心，吸取上清液，无细胞及其碎片成分，0.22μm过滤器过滤，分装于ep管，-80℃保存，得到had-mscs-cm(had-mscs培养上清液)。

急性肺细胞损伤模型制备，以a549细胞(来自人肺癌的具有ii型肺泡上皮细胞特性的连续肿瘤细胞系)为例：a549细胞培养后，加入不同浓度的pq溶液(0，250，500，750，1000μm)染毒24h(每组6个复孔)，每孔加入10μlcck-8试剂，培养箱内孵育2h，测得波长为450nm处的吸光度值；按照公式计算细胞增殖活力：细胞增殖活力(％)＝(检测孔od值-调零孔od值)/(对照组od值-调零孔od值)。按同样的方法，had-mscs-cm干预的浓度分为25％、50％、75％(含有培养基成分的体积分数)。加入的顺序依次为培养基、pq溶液、had-mscs-cm，培养24h后进行检测。

用96孔板培养a549细胞，pq染毒(本实施例中pq选用二氯百草枯)，立即加had-mscs-cm干预24h后行cck-8检测。利用6孔板培养a549细胞，干预24h后采用流式细胞术检测细胞凋亡率。利用25cm²细胞培养瓶培养a549细胞，干预24h后电镜观察细胞及细胞器形态、检测活性氧(ros)的水平，并用westernblot法检测细胞内相关蛋白表达水平，用elisa法检测培养上清液中细胞因子的含量。

定性观察细胞内活性氧(ros)：dcfh-da(2,7-dichlorofluorescindiacetate)没有荧光，进入细胞后被酯酶水解为dcfh，在活性氧存在时dcfh被氧化为不能透过细胞膜的强绿色荧光物质dcf，其荧光在激发波长502nm，发射波长530nm附近有最大波峰，强度与细胞内活性氧水平成正比。各组细胞培养24小时后，pbs冲洗1次，加入a549细胞到培养基及40μm的dcfh-da染料(按3:1体积加入)，共同孵育30min，利用荧光显微镜在绿色光源下观察各组细胞荧光显色情况。

观察细胞形态：细胞培养24小时后，利用倒置相差显微镜观察细胞形态。各组细胞用pbs冲洗2遍，消化、离心(2200×g，5min)，弃上清，加入1％锇酸固定，用不同浓度乙醇和丙酮梯度脱水，浸透、包埋、修块、切片和染色，置于透射电镜下观察组织结构变化。

检测细胞及其上清液的氧化指标和炎症因子水平：按照试剂盒说明书对各样本进行操作，分别采用黄嘌呤氧化酶法测定a549细胞内sod的活力，硫代巴比妥酸法检测a549细胞内mda的含量；采用elisa法分别检测a549细胞培养上清液中il-1β、il-6、il-10的含量。实验中均设置空白对照孔和标准品孔，选择450nm波长检测吸光度，制作标准曲线，计算出待测样品的浓度值。

annexinv-fitc/pi检测细胞凋亡水平：annexinv-fitc能与细胞凋亡过程中翻转到膜外的磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine)特异结合，在蓝色光的激发下，发出绿色荧光，以此区分出凋亡细胞与正常细胞。碘化丙啶(propidiumiodide)是一种核酸染料，不能穿透完整的细胞膜，能够穿透破损的细胞膜(包括凋亡晚期细胞和死亡细胞)，并使细胞核红染。将两者匹配使用，可以将凋亡早期和晚期的细胞区分开来。细胞培养24小时后，消化、收集细胞；用冷的pbs洗涤2次，加入bindingbuffer重悬，分装细胞悬液，分别加入annexinv-fitc、pi，混匀，避光反应5min，1h内流式细胞仪检测。

westernblot检测相关蛋白的表达：收集各组a549细胞，加人适量裂解液，4℃离心(39588×g，10min)，取上清液，用bca法测定蛋白浓度，加人loadingbuffer，100℃5min变性蛋白。每条泳道中加人20μg总蛋白的蛋白样品，进行sds-page电泳。电泳完成后，在200ma，70min条件下转膜至pvdf微孔膜，用3％bsa的tbst封闭液常温封闭2h，然后加入稀释后的一抗，4℃过夜孵育，用tbst洗涤膜3次(每次15分钟)。二抗常温振荡孵育2h，用tbst洗涤膜3次。将发光液a、b混合液均匀滴到膜上，置于bio-rad凝胶成像系统成像，western-blotting结果经imagej软件进行灰度扫描分析。

统计学方法：实验相关数据，计量资料以均数±标准差表示，采用spss17.0统计软件进行统计分析，各组间(amonggroups)比较采用单因素方差分析；有差异的两组间(between2groups)比较，采用独立样本t检验；p＜0.05为差异有统计学意义。

结果：

had-mscs的生长形态和表型特征:had-mscs具有贴壁生长的特性，原代培养时细胞贴壁较慢，培养3d左右原代细胞可融合80％以上，细胞形态具有多样性，呈多边形、梭形等(图1中a部分)。随着细胞传代纯化培养，had-mscs的形态逐渐呈梭形或纤维样，呈放射样或漩涡样生长(图1中b部分)。

a549细胞经250μm、500μm、750μm、1000μm浓度的pq染毒24h后，cck-8法测定细胞增殖活力。细胞增殖活力下降(图2a)。计算ic50的pq浓度为816μm，接近750μm，因此，我们选择750μm浓度的pq作为造模浓度，后续使用had-mscs-cm进行干预。

加入不同浓度had-mscs-cm干预，培养24h后检测细胞增殖活力，发现pq+cm组细胞增殖活力均高于pq组；不同浓度的had-mscs-cm相比，50％体积分数干预后的a549细胞增殖活力最高(图2b)。

采用dcfh-da探针检测细胞内ros的含量。control组及cm组视野内绿色荧光少，ros含量低；pq组及pq+cm组的绿色荧光多，ros含量较多，但两组相比，pq+cm组的荧光更少，ros含量更低(图3a)。

倒置显微镜观察到control组及cm组的细胞大小均一，呈铺路石样分布，且贴壁好、连接紧密；pq染毒24h后，出现细胞连接不紧密、死亡细胞增多，但pq+cm组较pq组细胞密度高、贴壁细胞多(图3b)。通过透射电镜观察到control组及cm组细胞形态规则，大小一致，细胞膜完整，细胞表面可见微绒毛，胞质均匀，各种细胞器完好，核膜完整，染色质均匀；pq染毒后，a549细胞表面的微绒毛、突起减少，细胞膜伴出芽、凋亡小体表现，内质网肿胀，自噬小体增多，线粒体等细胞器减少，核染色质分布异常；pq+cm组内质网等细胞器损伤较pq组程度减轻(图3c)。

采用mda试剂盒检测各组细胞内mda含量，pq组较control组含量升高，而pq+cm组mda含量较pq组有所降低(图3d)。检测各组细胞内sod含量，pq组较control组含量降低，而pq+cm组sod含量较pq组明显升高(图3e)。cm组同control组相比，mda及sod的含量均无明显差异。

利用elisa相关试剂盒对各组培养细胞上清液中il的含量进行检测。上清液中il-1β、il-6水平，pq组比control组的明显升高，而pq+cm组较pq组明显降低(图3f、图3g)。上清液中il-10水平，control组为基础值，与control组比较其余3组均明显升高，且以cm组最高；相比之下，pq+cm组较pq组明显升高(图3h)。

各组染毒(750μm浓度的pq)并干预(50％浓度的had-mscs-cm)24h后，利用annexinv-fitc/pi凋亡试剂盒检测各组细胞凋亡情况，检测发现pq组细胞的凋亡率较其它组高。control组、pq组、pq+cm组及cm组的早期凋亡率分别为(1.96±0.50)％、(14.16±1.15)％、(7.52±2.35)％及(1.71±0.88)％；且pq+cm组较pq组细胞的早期凋亡率减低(图4a、图4b)。

通过westernblot技术，检测细胞凋亡及内质网相关通路的蛋白表达情况，结果提示bax/bcl-2水平，pq组较control组明显增高；而pq+cm组较pq组明显下降，cm组同control组无明显差异(图4c、图4d)。

各组染毒(750μm浓度的pq)并干预(50％浓度的had-mscs-cm)24h后，通过westernblot检测发现，pq组chop及grp78蛋白的表达量较control组增加(图5a)；经50％浓度的had-mscs-cm干预后，chop蛋白的表达量明显降低(p＜0.05)(图5b)，而grp78蛋白的表达无明显变化(p＞0.05)(图5c)。

当然，以上只是本发明的具体应用范例，本发明还有其他的实施方式，如换个肺肿瘤细胞系或者肺正常细胞系，或者换个可针对肺细胞损伤的有毒物质等，凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明所要求的保护范围之内。