一种可持续释放无机活性成分的大孔骨组织工程支架及其制备方法与流程

本发明涉及一种可持续释放无机活性成分的大孔骨组织工程支架及其制备方法，属于生物医用材料领域。

背景技术：

治疗由创伤，肿瘤和先天性疾病所致的临界尺寸的骨组织缺损仍然是临床的主要挑战。据估计，全世界每年需要借助临床移植手段进行骨修复的病例超过3000万例。由于良好的骨整合性、骨传导性和骨诱导性，自体/异体移植仍然是治疗这类疾病的金标准。但因移植物数量有限、损伤供体部位以及潜在的交叉感染等缺陷限制了自体/异体移植在临床上的使用。随着骨组织工程(bte)的发展，基于支架的组织工程手段为替代自体/异体移植物提供了一种选择，以满足对修复和再生骨组织的移植物日益增长的需求。通常，性能优异的骨组织工程支架应该具有优良的生物相容性、生物活性以及力学性能，并具有多孔结构以支持骨组织向内生长和整合。在各种骨组织工程支架的制造技术中，静电纺丝由于其能够将多种材料(天然和合成有机材料)转化为形态上与天然细胞外基质(ecm)的结构相似的纤维而引起了越来越多的兴趣。但是作为骨组织工程支架，仅有天然和合成有机材料制成的支架不具备促进骨组织再生的生物活性。因此，与一些无机活性成分(如羟基磷灰石，磷酸三钙)共混纺丝以制备出具有生物活性并模拟天然骨的两相结构的有机无机复合支架得到了广泛的研究。但是常规的有机无机共混纺丝使得无机活性成分被有机基体包覆，在支架植入早期无法发挥无机活性成分的特性，使得骨组织延迟愈合。其次，在植入早期有机基体降解的酸性产物无法得到很好是中和，易引起植入部位的组织炎症。因此，设计和制备出无机活性成分可持续释放的静电纺骨组织工程支架具有重要意义。

现有研究中，①公开号为cn107320787a的专利介绍了一种牙周修复用多孔纤维膜材料及其制备方法。在静电纺纤维膜的表面滴加壳聚糖与羟基磷灰石的混合溶液后，再冷冻干燥制得牙周修复复合膜材料。但该技术的工艺较为繁琐，且仍存在羟基磷灰石被壳聚糖包覆而导致早期支架生物活性不足的问题。②公开号为cn105148321b的专利介绍了一种由矿化的纳米纤维构建的仿生天然骨结构的骨替代材料及其制备方法。将经静电纺丝制备出纳米纤维纱线编织成纳米纤维织物，在置于1-1.5倍的模拟体液中矿化，在支架表面形成一层矿化层以提高支架的生物活性。但该技术的工艺较为繁琐，且一般所形成的矿化层的结晶度较低，在植入后易于溶解，会引起ca²⁺浓度过高，存在潜在“血钙”的风险。③标题为fabricationofcalciumphosphatefibresthroughelectrospinningandsinteringofhydroxyapatitenanoparticles的文章介绍了一种钙磷静电纺纤维的制备方法。将羟基磷灰石颗粒与plga共混纺丝后经过煅烧出去plga，得到纯无机的钙磷静电纺纤维。但该技术的工艺较为繁琐，耗能大，且所制备的磷静电纺纤维脆性大，力学性能不满足要求，同时，也会存在潜在“血钙”的风险。另外，上述所提到的三种方法所制备的支架都会因传统静电纺纳米或微米纤维的堆积而仅具有亚微米级的表观小孔，缺少细胞渗透和组织再生所必需的大孔。因此，设计和制备出可持续释放无机活性成分的大孔骨组织工程支架具有重要意义。

技术实现要素：

本发明所解决的技术问题是：一种可持续释放无机活性成分的大孔骨组织工程支架。

为了解决上述问题，本发明提供了一种可持续释放无机活性成分的大孔骨组织工程支架，其特征在于，由静电纺丝一步制得的微米级串珠和纳米级纤维的复合结构组成，纳米级纤维中的无机活性物质优先释放，待串珠有机基体逐步降解后，串珠中的无机活性物质随后释放。该骨组织工程支架在成分上模拟天然骨组织的两相结构，同时具备无机活性成分可持续释放功能且利于细胞渗透及组织长入的大孔结构。

优选地，所述的微米级串珠为有机/无机两相结构，串珠的直径为1-10μm；所述的纳米级纤维为有机/无机两相结构，纤维的直径为50-500nm。

优选地，所述微米级串珠/纳米级纤维中的有机材料为天然可降解材料和合成可降解材料中的至少一种；所述微米级串珠/纳米级纤维中的无机材料为无机活性成分。

更优选地，所述的天然可降解材料包括胶原、壳聚糖、明胶、丝素蛋白和透明质酸中的至少一种；所述的合成可降解材料聚合物包括pcl、pla、plla、pga、plga、pgs和phb中的至少一种；所述的无机活性成分包括羟基磷灰石、磷酸三钙、生物活性玻璃、二氧化硅和中的至少一种，根据需要包括或不包括金属氧化物，所述金属氧化物为氧化镁、氧化锌等。

本发明还提供了上述可持续释放无机活性成分的大孔骨组织工程支架的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1)：将可降解聚合物溶于溶剂中，磁力搅拌1～12h，得到聚合物溶液；

步骤2)：将无机活性成分，加入到与步骤1)相同的溶剂中，超声波分散3～6h，使得无机活性成分均匀分散；

步骤3)：将步骤2)所制得的分散液逐滴加入步骤1)所制备的聚合物溶液中，边滴加边磁力搅拌，制得含无机活性成分的静电纺丝溶液；

步骤4)：将步骤3)制得含无机活性成分的静电纺丝溶液进行静电纺丝，将得到的静电纺纤维膜真空干燥，然后进行环氧乙烷处理，最终得到富含无机活性成分且具备微米串珠及纳米纤维复合结构的大孔骨组织工程支架。

优选地，所述步骤1)中的溶剂包括去离子水、无水乙醇、二氯甲烷、三氯甲烷、四氢呋喃、六氟异丙醇、甲醇、甲酸、乙酸、二甲基亚砜、n,n-二甲基甲酰胺和丙酮中的任意一种或几种的组合。

优选地，所述步骤3)得到的静电纺丝溶液中可降解聚合物的质量百分比为10～80g/l；静电纺丝溶液中可降解聚合物和无机活性成分的质量比为(5-20)：1。

优选地，所述步骤4)中静电纺丝的工艺参数为：采用平板接收装置，纺丝电压12～16kv，接收距离10～15cm，推进速度1～2ml/h，喷丝头直径0.5～0.8mm，温度20～30℃，相对湿度30～60％。

优选地，所述步骤4)中真空干燥的时间为6～24h，温度为30～50℃；环氧乙烷的处理时间为12h或24h。

优选地，所述步骤4)得到的大孔骨组织工程支架的孔隙率为70～90％，平均孔径为5～20μm。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

(1)本发明所制备的可持续释放无机活性成分的大孔骨组织工程支架，是由微米串珠和纳米纤维组成的复合结构，在植入早期纳米级的纤维中的无机活性物质优先释放，待串珠有机基体逐步降解后，串珠中的无机活性物质随后释放,大大改善常规静电纺骨组织工程支架早期生物活性不足的问题。

(2)本发明所制备的可持续释放无机活性成分的大孔骨组织工程支架中所存在的尺寸较大的串珠，会增大支架的孔径及表面粗糙度，有利于细胞的浸润生长及成骨分化。

(3)本发明所述的可持续释放无机活性成分的大孔骨组织工程支架制备方法简单，流程短，适合大批量生产。

附图说明

图1、2为实施例1中微米串珠及纳米纤维复合结构的大孔静电纺膜不同比例的sem照片；

图3为实施例1中微米串珠的tem照片(图中颗粒为活性物质磷酸三钙)；

图4为实施例1中纳米纤维的tem照片(图中颗粒为活性物质磷酸三钙)。

具体实施方式

为使本发明更明显易懂，兹以优选实施例，并配合附图作详细说明如下。

各实施例中采用pmi型孔径测试仪(cfp-1100-ai)来测试可持续释放无机活性成分的大孔骨组织工程支架的孔径分布及孔隙率。本发明各实施例中采用共聚焦显微镜(lsm510)来测试干细胞向内生长的深度。本发明各实施例中采用电感耦合等离子体(varianvistapro)来测试可持续释放无机活性成分的大孔骨组织工程支架中活性物质的释放情况。

各实施例中采用的试剂及细胞如下：plla(sigma-aldrich764698)；pcl(国药集团化学试剂有限公司440744)；壳聚糖(国药集团化学试剂有限公司69047436)；二氯甲烷(国药集团化学试剂有限公司80047318)；三氯甲烷(国药集团化学试剂有限公司10006818)；大鼠骨髓间充质干细胞(中国科学院干细胞库scsp-402)；cck-8试剂盒(百灵威科技有限公司c2581)；dapi(sigma-aldrich32670-5mg-f)；pbs(上海易势化工有限公司e504-100ml)。

实施例1

本实施例提供了一种可持续释放无机活性成分的大孔骨组织工程支架，其特征在于，由静电纺丝一步制得的微米级串珠和纳米级纤维的复合结构组成，纳米级纤维中的无机活性物质优先释放，待串珠有机基体逐步降解后，串珠中的无机活性物质随后释放。

上述可持续释放无机活性成分的大孔骨组织工程支架的制备方法：

步骤1：将0.8gpcl(数均分子量8万)溶于8ml二氯甲烷(纯度≥99.5％)中，磁力搅拌6h，得到澄清透明的聚合物溶液。

步骤2：将0.08g磷酸三钙加入到2ml二氯甲烷(纯度≥99.5％)中，超声波分散3h，使得磷酸三钙均匀分散。

步骤3：将步骤2所制得的分散液逐滴加入步骤1所制备的聚合物溶液中，边滴加边磁力搅拌，制得含有磷酸三钙的质量浓度8％的静电纺丝溶液。

步骤4：将步骤3制得含有磷酸三钙的静电纺丝溶液进行静电纺丝，采用平板接收装置，纺丝工艺为：纺丝电压15kv，接收距离10cm，推进速度1ml/h，喷丝头直径0.5mm，温度20～30℃，相对湿度30～60％。将得到的静电纺纤维膜置于真空干燥箱中40℃干燥12h，然后进行环氧乙烷处理12h，最终得到富含磷酸三钙且具备微米串珠及纳米纤维复合结构的大孔骨组织工程支架。

最后，测得可持续释放无机活性成分的大孔骨组织工程支架的平均孔径为11.8μm及孔隙率为83.4％。在制得的可持续释放无机活性成分的大孔骨组织工程支架上种植spraguedawley(sd)大鼠骨髓间充质干细胞。种植方法：首先将可持续释放无机活性成分的大孔骨组织工程支架裁剪成直径为14mm的圆形，然后放置于24孔板孔底部。种植后培养条件：37℃，5％二氧化碳培养箱中，种植密度为2万个/孔。采用cck-8法测定细胞活性，3天后成骨细胞的细胞活性为134.9％。对培养了3天后的成骨细胞进行dapi染色，采用共聚焦显微镜测量细胞向内迁移的距离，细胞向内渗透迁移平均为33.7um。在ph＝7.2-7.4的pbs释放介质中监测每24h溶液中钙离子的浓度为13-24ppm。

实施例2

本实施例提供了一种可持续释放无机活性成分的大孔骨组织工程支架，其特征在于，由静电纺丝一步制得的微米级串珠和纳米级纤维的复合结构组成，纳米级纤维中的无机活性物质优先释放，待串珠有机基体逐步降解后，串珠中的无机活性物质随后释放。

上述可持续释放无机活性成分的大孔骨组织工程支架的制备方法：

步骤1：将0.5g壳聚糖(数均分子量5万-30万，脱乙酰度为90％)溶于5ml98wt％的乙酸溶液中，磁力搅拌12h，得到澄清透明的聚合物溶液。

步骤2：将0.04g二氧化硅加入到5ml98wt％的乙酸溶液中，超声波分散3h，使得二氧化硅均匀分散。

步骤3：将步骤2所制得的分散液逐滴加入步骤1所制备的聚合物溶液中，边滴加边磁力搅拌，制得含有二氧化硅的质量浓度5％的静电纺丝溶液。

步骤4：将步骤3制得含有二氧化硅的静电纺丝溶液进行静电纺丝，采用平板接收装置，纺丝工艺为：纺丝电压16kv，接收距离15cm，推进速度2ml/h，喷丝头直径0.8mm，温度20～30℃，相对湿度30～60％。将得到的静电纺纤维膜置于真空干燥箱中37℃干燥24h，然后进行环氧乙烷处理12h，最终得到富含二氧化硅且具备微米串珠及纳米纤维复合结构的大孔骨组织工程支架。

最后，测得可持续释放无机活性成分的大孔骨组织工程支架的平均孔径为18.7μm及孔隙率为89.1％。在制得的可持续释放无机活性成分的大孔骨组织工程支架上种植spraguedawley(sd)大鼠骨髓间充质干细胞。种植方法：首先将可持续释放无机活性成分的大孔骨组织工程支架裁剪成直径为14mm的圆形，然后放置于24孔板孔底部。种植后培养条件：37℃，5％二氧化碳培养箱中，种植密度为2万个/孔。采用cck-8法测定细胞活性，3天后成骨细胞的细胞活性为126.7％。对培养了3天后的成骨细胞进行dapi染色，采用共聚焦显微镜测量细胞向内迁移的距离，细胞向内渗透迁移平均为45.9um。在ph＝7.2-7.4的pbs释放介质中监测每24h溶液中硅离子的浓度为17-30ppm。

实施例3

本实施例提供了一种可持续释放无机活性成分的大孔骨组织工程支架，其特征在于，由静电纺丝一步制得的微米级串珠和纳米级纤维的复合结构组成，纳米级纤维中的无机活性物质优先释放，待串珠有机基体逐步降解后，串珠中的无机活性物质随后释放。

上述可持续释放无机活性成分的大孔骨组织工程支架的制备方法：

步骤1：将0.6gplla(数均分子量2万)溶于8ml三氯甲烷中，磁力搅拌12h，得到澄清透明的聚合物溶液。

步骤2：将0.1g羟基磷灰石加入到2ml三氯甲烷中，超声波分散6h，使得磷酸三钙均匀分散。

步骤3：将步骤2所制得的分散液逐滴加入步骤1所制备的聚合物溶液中，边滴加边磁力搅拌，制得含有羟基磷灰石的质量浓度6％的静电纺丝溶液。

步骤4：将步骤3制得含有羟基磷灰石的静电纺丝溶液进行静电纺丝，采用平板接收装置，纺丝工艺为：纺丝电压14kv，接收距离12cm，推进速度1.5ml/h，喷丝头直径0.7mm，温度20～30℃，相对湿度30～60％。将得到的静电纺纤维膜置于真空干燥箱中45℃干燥12h，然后进行环氧乙烷处理24h，最终得到富含羟基磷灰石且具备微米串珠及纳米纤维复合结构的大孔静电纺膜。

最后，测得可持续释放无机活性成分的大孔骨组织工程支架的平均孔径为17.1μm及孔隙率为87.6％。在制得的可持续释放无机活性成分的大孔骨组织工程支架上种植spraguedawley(sd)大鼠骨髓间充质干细胞。种植方法：首先将可持续释放无机活性成分的大孔骨组织工程支架裁剪成直径为14mm的圆形，然后放置于24孔板孔底部。种植后培养条件：37℃，5％二氧化碳培养箱中，种植密度为2万个/孔。采用cck-8法测定细胞活性，3天后成骨细胞的细胞活性为117.9％。对培养了3天后的成骨细胞进行dapi染色，采用共聚焦显微镜测量细胞向内迁移的距离，细胞向内渗透迁移平均为40.3um。在ph＝7.2-7.4的pbs释放介质中监测每24h溶液中钙离子的浓度为23-37ppm。