本发明属于生物技术领域，涉及一种基于硫辛酸以对因对症防治酒精损伤的复合配方。
背景技术：
乙醇中毒是世界范围内的重大公共卫生问题，世卫组织数据显示，全球15岁以上个体平均每年喝掉6.2l纯乙醇，当前我国饮酒率约在67%-84.1%之间，平均每次饮酒量折合纯乙醇41.04g，远超安全标准，因此乙醇中毒多发，占门诊急性中毒患者的49%。
乙醇在体内的代谢，由乙醇脱氢酶催化氧化为乙醛,然后被乙醛脱氢酶(aldehydedehydrogenase，aldh)氧化为乙酸,乙酸再脱羧生成水和二氧化碳。aldh是乙醇代谢的关键酶，其中位于线粒体内的aldh2的活性最强，但aldh2基因存在g1951a多态性，使位于寡聚化功能域的第504位谷氨酸变异为赖氨酸，该酶是随机组合的同四聚体，其中一个突变型亚基就可以使整个四聚体失去催化活性，因此，与纯合野生型（gg）的正常酶相比,杂合突变型（ga）酶活性仅为正常值的6.25%，饮酒后血中乙醛蓄积，浓度约为野生型的6倍；而纯合突变型（aa）酶催化能力完全丧失，饮酒后携带者体内乙醛浓度可高达野生型的19倍。全世界大约8%的人口携带这一突变，包括中国人在内的东亚黄种人是这一突变的高发区；统计显示，由于存在高频率的乙醛脱氢酶g1951a多态性，我国大约有31.7%、也就是近4.4亿人口存在饮酒后高毒性乙醛积累问题。然而，受乙醇成瘾性和传统文化习俗等影响，我国乙醇过量摄入问题的现状，在未来很长时间是难以得到根本性的控制，因此迫切需要能够预防和治疗乙醇相关损伤的有效方案。
乙醛等含醛基小分子化合物可与细胞内半胱氨酸残基的巯基形成schiff碱，产生烷化损伤，而这些含巯基分子是机体活性氧(reactiveoxygenspecies,ros)消除系统的最重要组成部分。作为细胞内含量最多的活性巯基分子，谷胱甘肽(gsh)中的自由巯基极易与醛基发生加和反应，如果短期内大量摄入乙醇将产生乙醛积累，大量消耗gsh，将引起ros消除障碍。申请人攻读硕士、博士期间曾从事丙烯醛和棉酚等醛基小分子的细胞毒性研究，发现其毒性的核心驱动机制都主要来自醛基引起的胞内巯基小分子耗竭，进而阻碍ros消除，引起ros浓度升高，产生线粒体损伤和细胞凋亡等。而且ros损伤线粒体，也可引起•o2-从线粒体中泄露，进而被sod等酶代谢，生成大量易于扩散的过氧化氢等ros进一步损伤线粒体，引起•o2-从线粒体中泄露，这一正反馈循环将引起ros的进一步积累，引起氧化应激(oxidativestress,os)状态，引起线粒体功能障碍、dna损伤和内质网应激等，最后导致细胞凋亡或坏死。
乙醛等含醛基毒素致ros损伤，包含一个对细胞命运决定最为关键的细胞应激阶段，激活应激相关的信号通路，以提高细胞对毒素的耐受阈值；但当损伤超过细胞的耐受阈值时则启动凋亡信号。因此乙醛诱导的细胞应激是解决其毒性耐受的关键切入点，值得进一步深入分析和研究其分子机理，进而针对性的系统开发缓解酒精代谢损伤的防治方案。
但目前关于酒精相关乙醛代谢损伤的毒性损伤的具体作用机制尚未完全明确，因此难以找到普适高效的预防和治疗方案。其中最主要的困难在于，乙醛分子的活泼醛基能够产生广泛的生物大分子损伤，不同研究从不同领域和研究平台出发，进而发现乙醛能够导致dna损伤、自噬、内质网应激、质膜损伤、细胞坏死、inos激活等不同结论，但是却没有更为深入的系统研究，以厘清这些损伤之间的因果关系，因而没有找到乙醛损伤的最关键起始原因，因此难以找到安全有效的防治方案。
总之，目前缓解酒精中毒预防保健方案，未系统覆盖酒精代谢乙醛损伤的主要方面，例如申请号为201210107890.7、201510918374.6和201811154744.3未完整考虑酒精代谢产物乙醛的ros细胞毒性和之后的脑损伤，另外申请号为201810072886.9、201310692332.6和201710918907.x在促进乙醛降解速度方面也未提出安全有效方案，导致防治酒精损伤效果不佳。
技术实现要素：
乙醇在体内的代谢，由乙醇脱氢酶催化氧化为乙醛,然后被乙醛脱氢酶(aldehydedehydrogenase，aldh)氧化为乙酸,乙酸再脱羧生成水和二氧化碳；这一过程中间产物乙醛是酒精代谢损伤的关键。在综合分析上述文献的基础上，参考了发明人在硕士和博士研究生阶段系统研究丙烯醛、棉酚等含醛基物质损伤的分子机制，进而利用细胞周期和凋亡检测等评估乙醛损伤的量效关系，通过dcf和dhe等探针研究乙醛诱导活性氧产生的机制、以及导致线粒体损伤与内质网应激互作的原因，并深挖相关信号通路，验证和完善上述理论框架，找到乙醛毒性的核心起始机制。进而利用细胞周期和凋亡检测等评估乙醛损伤的量效关系，并结合本发明工作发现的乙醛致细胞活性氧积累和线粒体损伤等现象，建立“酒精代谢相关乙醛诱导活性氧积累，是酒精诱导机体损伤的根本原因”这一理论框架。
发明人在这一理论指导下，针对性的筛选和验证能够抗拒乙醛毒性的特效药物，从而筛选出能拮抗乙醛毒性的特效药物，建立成熟的防治方案。发明人经过高通量筛选，发现了含巯基的硫辛酸缓解乙醛诱导细胞内氧化应激的效果最佳，因此本发明以硫辛酸为基础，开发出能够综合缓解酒精损伤的复合配方。
缓解损伤的另一个关键点就是加速乙醛降解，而机体负责降解乙醛的乙醛脱氢酶是以nadh为辅酶的含锌蛋白，因此我们补充了机体产生nadh和锌离子的原料，经过多次实验改进，本发明最终确定了烟酰胺和葡萄糖酸锌联合方案，通过提高乙醛脱氢酶活性从而加速了乙醛降解，在志愿者中试用效果显著。
另外，酒精对脑组织的损伤，将导致韦尼克脑病(wernicke′sencephalopathy)，这是慢性酒精中毒常见的由于硫胺素(维生素b1)缺乏引起的中枢神经系统的代谢性疾病。约占慢性酒精中毒性疾病的3%。因此为保护酒精摄入后的脑组织损伤，本配方专门添加了硫胺素，并在志愿者的实施例测试中取得显著效果。
基于以上研究，本发明以复合配方方案来综合矫正酒精代谢乙醛的损伤并诱导其加速降解，经过长期的细胞实验和人类志愿者随机双盲对照实验改进和验证，得出最适合防治酒精损伤的复合配方，其成分包括：硫辛酸(100-500mg/d)、硫胺素(10-30mg/d)、烟酰胺(50-400mg/d)、葡萄糖酸锌(30-200mg/d)。本配方中各组分化学结构清楚明确、理化性质较为稳定、理论推测和实验证明不存在互相干扰问题，因此对制备方法如各组分加入的先后顺序等并无特殊要求。
与现有技术相比，本发明有以下优势。
1.发明创新性强，本专利是发明人在硕士和博士研究生期间从事关于丙烯醛和棉酚此类醛基化合物的研究的基础上，深入研究了酒精代谢的关键损伤物质乙醛的毒性，建立“酒精代谢相关乙醛诱导活性氧积累，是酒精诱导机体损伤的根本原因”这一理论框架，在其指导下针对性的筛选出以硫辛酸为主要成分缓解乙醛的ros毒性的技术方案，并且加入乙醛脱氢酶的辅基合成原料烟酰胺和葡萄糖酸锌以加速乙醛代谢降解，还加入了硫胺素预防酒精诱导的韦尼克脑病，从而做到综合缓解酒精损伤的效果。
2.本发明配方各成分间存在复杂的良性相互作用，理论上能产生增效协同作用。
2.1.配方成分存在代谢协同作用：葡萄糖酸锌含有的锌离子是cu/zn-sod的重要辅基，可以协助硫辛酸清除乙醛诱导产生的ros，避免后续的自由基损伤，因此葡萄糖酸锌与硫辛酸存在协同作用。硫胺素和烟酰胺均是机体合成nadh和nadph的重要原料，后两者能协助硫辛酸清除乙醛诱导产生的ros，避免后续的自由基损伤，因此配方中硫胺素、烟酰胺与硫辛酸有协同作用。
2.2.配方成分互相维护稳定性：葡萄糖酸锌为不易氧化和热稳定性很高的的两性化合物，在配方中可以维持配方中硫辛酸、硫胺素和烟酰胺的稳定性；硫辛酸为ros清除剂，但是硫辛酸可以保护硫胺素和烟酰胺免于被氧化失活。
3.从细胞实验数据看，本发明配方效果作用明显。
详见实施例1和实施例2，本复合配方与市面上的配方b相比，在标准化的高通量细胞实验上有明显的效果优势。
4.从志愿者试用数据看，本发明配方显著强于主流防治方案。
在作用效果上，通过综合利用细胞活力实验与志愿者多中心大样本随机双盲对照等实验方法，在获取大量数据基础上统计分析，发现本配方比某些专利配方效果更为良好(见实施例3)。
5.在安全性上，本配方各组分都来自公认的低毒性的代谢调节性营养物质，并且在预实验中专门检查了配方的细胞毒性，保证使用剂量不超过毒性阈值的5%；主要通过小剂量的复合配方的方式增加效果。另外，精确探明了配方各成分的作用范围和毒性阈值，从而使各组分的使用剂量有一定的宽容度，利于产品开发上市。
6.在作用机制上，本配方区分对症与对因防治手段，通过清除ros损伤、营养脑细胞和诱导乙醛降解来对症对因治疗；多管齐下防治酒精代谢损伤，配方各个组分间在体内存在良好的代谢互作，不论从作用机制还是细胞实验又或志愿者试用实验看，整体效果都较为良好。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明的技术实施方案做进一步详细说明。
实施例1基于高通量的标准化细胞实验的配方有效性和安全性评估。
在前期工作基础上，利用高通量的标准细胞实验，筛选出配方各组分的较优剂量，组成配方a：硫辛酸(300mg/d)、硫胺素(20mg/d)、烟酰胺(200mg/d)、葡萄糖酸锌(100mg/d)。
基于本发明的前期工作，分别选定配方a中各个组分的对应比值浓度(质量浓度比值按照上述顺序为：30:2:20:10，以硫辛酸在培养液中终浓度0.1mmol/l时按照上述比例配置的配方a为1u)，利用cck8法测定细胞活力，在5次独立实验的数据基础上进行t检验分析；以p＜0.05为差异显著标准，分析出配方中该组分的起效和实效范围；为提高配方安全性，以p＞0.01的最低剂量作为该组分的毒性剂量阈值，得出配方a的终浓度数据为：最佳浓度为25u，有效范围为2-300u，毒性阈值为4000u。毒性阈值是最大有效剂量的13倍以上，说明本配方的安全性极好。
实施例2酒精诱导的肝脏细胞ros消除效果实验。
基于实施例1中的配方a的比率和终浓度单位，在25u这一最佳浓度测定ros消除和损伤效果。首先利用dcf探针测定细胞ros相对浓度，发现a预处理组比对照组低52.4%；其次利用碘化丙啶测定细胞死亡率，发现酒精处理后，配方a预处理组死亡率0.2%，阴性对照组2.4%，3次独立实验后t检验发现差异显著。以上数据说明本配方a能够缓解乙醛诱导的胞内ros产生和细胞死亡，因此可以有效保护酒精代谢过程相关的机体损伤。
实施例3本配方在较优浓度下的随机双盲对照多中心志愿者实验。
2018年5月至2019年5月，在北京、上海和咸阳三座城市，分别选取各城市经常饮酒的志愿者共150人，平均年龄45.2岁，男女比例2.92，体质指数28.10，自述平均每人每次摄入折合纯酒精92ml，平均月饮酒4.2次，抽查血液酒精浓度平均值72mg/100ml。志愿者分别每日服用外观无法分辨的实施例1所制配方a、已上市配方b和去离子水安慰剂共120天(配方a按照实施例1给出剂量，配方b按照说明书服用)，采用随机双盲对照原则进行志愿者实验。
分别测定志愿者的酒精性肝炎maddrey评分（4.6×凝血酶原延长时间+血清总胆红素，结果除以50，记为m）、饮酒后血液酒精清除速率（mg/100ml/h，结果除以100，记为v）和共济失调等级量表评分(sara，结果除以40，记为s)，设定酒精代谢损伤判别函数f=0.5*m+0.3*v+0.2*s以评估配方效果。结果显示，配方a最终能使志愿者的f值平均降低71.5%，分别是单纯使用已上市配方b和去离子水安慰剂干预效果的5.32倍和19.14倍，另外不论服用配方a、已上市配方b和去离子水安慰剂组的志愿者都未报告额外不适，血生化、血常规等复查也未发现额外的异常。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的配方范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换，也应视为本发明的保护范围。