miR-16拮抗剂在制备抑制非酒精性脂肪性肝病药物中的应用的制作方法

本发明涉及mir-16的抑制剂在制备抑制非酒精性脂肪性肝病药物中的应用。

背景技术：

非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholicfattyliverdisease，nafld)是指除外酒精和其他明确的损肝因素所致的，以弥漫性肝细胞大泡性脂肪变为主要特征的临床病理综合征，包括单纯性脂肪肝以及由其演变的nash，ir和遗传易感性与其发病关系密切。随着生活水平的提高，nafld的患病率逐年增高，构成日益严重的公共卫生问题。

尽管单纯性脂变是一个良性疾病，预后良好，但是少部分nash却可以向肝纤维化、肝硬化甚至hcc进展。因此，对nafld各个阶段疾病发病机制的研究已经成为当前的热点之一。nafld可以增加心血管疾病、2型糖尿病和ms的风险。现有的分子生物学研究已经表明nafld的发生发展是一个涉及多基因、多环节、多途径的变化过程，其中许多基因发生了改变。目前对nafld发病机制的认识仍基于“二次打击”假说，其具体机理尚不明确。

而随着分子生物学技术的发展，nafld发生的分子机制逐渐为人们所认识。mirna则是新近发现的在脂质代谢过程中起重要作用的分子。mirna作为一类长约22个核苷酸的非编码小分子rna，广泛存在于真核生物中。其表达具有高度组织特异性、保守性和时序性。mirna通过与靶mrna3’-utr互补配对，降解mrna或阻遏基因翻译，从而对基因转录后调控发挥重要的作用。mirna在生命活动中具有广泛的调节功能，与生物的发育进程、细胞生长分化、凋亡和器官形成等生命活动过程密切相关。

作为一类重要的内源性调控分子，mirna是否在nafld中发挥调节作用目前尚未完全明确。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供mir-16拮抗剂在制备用于抑制非酒精性脂肪性肝病的药物中的应用。所述的应用为抑制非酒精性脂肪性肝病提供了一个新的途径，并改善了效果。mir-16的序列为：agcagcauuguacagggcuauga(seqidno.1)。

所述mir-16拮抗剂选自能降低mir-16拮抗剂表达含量的小干扰rna、dsrna、shrna、微小rna、反义核昔酸：或者能表达或形成所述小干扰rna、dsrna、shrna、微小rna、反义核昔酸的构建物。

具体的，本发明提供一种拮抗剂，其具有序列：ucauagcccuguacaaugcugcu(seqidno.2)。

本发明人通过大量的实验证明，细胞中高表达的mir-16与nafld发生相关，抑制mir-16水平可显著降低nafld模型细胞病理相关分子表达；mir-16调控nafld细胞模型中脂代谢合成与分解通路关键酶的表达，抑制mirna-16可缓解脂肪肝病理变化；而mir-16antagomir作为microrna-16的一种抑制剂，特异性抑制microrna-16的表达，均可显著抑制nafld。

附图说明

图1：下调mir-16可抑制nafld模型细胞中脂滴蓄积。a.qrt-pcr检测mir-16含量；b.油红o染色检测结果；数据采用单因素方差分析进行统计，误差线表示sd。*表示p<0.05，**表示p<0.01。

图2：抑制mir-16表达可显著降低nafld模型细胞病理相关分子表达。数据采用单因素方差分析进行统计，误差线表示sd。*表示p<0.05，**表示p<0.01。

图3：mir-16antagomir调控nafld细胞脂代谢相关酶的表达。a，westernblot检测脂代谢相关蛋白fasn、acsl1、acox1表达情况；b，qrt-pcr检测脂代谢相关基因fasn、acsl1、acox1mrna水平；数据采用单因素方差分析进行统计，误差线表示sd。*表示p<0.05，**表示p<0.01。

图4：nafld模型动物肝组织中mir-16高表达，mir-16antagomir有效抑制组织mir-16水平。qrt-pcr检测mir-16含量；数据采用单因素方差分析进行统计，误差线表示sd。**表示p<0.01。

图5：抑制mirna-16的表达，可缓解nafld模型小鼠肝组织病理改变。a.油红o染色结果；b.he染色结果。

图6：抑制mir-16表达可显著缓解nafld模型动物血清中病理相关分子表达。数据采用单因素方差分析进行统计，误差线表示sd。*表示p<0.05，**表示p<0.01。

图7：mir-16调控nafld动物模型肝脏组织中脂代谢通路关键酶的表达。a.westernblot检测脂代谢关键酶fasn、acsl1、acox1表达情况；b.qrt-pcr检测脂代谢关键酶fasn、acsl1、acox1mrna表达情况；数据采用单因素方差分析进行统计，误差线表示sd。**表示p<0.01。

具体实施方式

1.实验方法

1.1细胞实验

实验细胞：正常人肝细胞株l02购自上海复祥生物科技有限公司。用含有10％fbs(gibcono.16000-044)的dmem养基在37℃，5％co2条件下培养，并维持2×10⁵/ml的浓度。

细胞模型构建与分组

1)l02细胞；

2)l02细胞模型组；

3)l02细胞模型组+antagomirnc；

4)l02细胞模型组+mir-16antagomir。

采用ffa诱导正常人肝细胞株l02细胞建立nafld细胞模型，具体方案为：正常人肝细胞株l02细胞用含有10％fbs的dmem培养基传代培养，直至细胞达到80-100％融合度。1mmffa软脂酸处理48h建模成功。建模成功后，3和4组分别采用antagomirnc和mir-16antagomir转染处理细胞72h。

细胞转染：

细胞汇合度在70％左右，转染前2h，换成无血清deem培养基；每个转染样品，均按下面的方法准备：用100μl无血清dmem培养基分别稀释mir-16antagomir(hsa-mir-16a-3pantagomir：ucauagcccuguacaaugcugcu，吉玛基因，不带荧光)和antagomirnc(mir-16antagomircontrol：caguacuuuuguguaguacaa，吉玛基因，不带荧光)，并轻轻混匀，室温下静置5min；同样用100μl无血清dmem培养基分别稀释3μllipofectamine^tm2000，室温下静置5min。混合lipofectamine^tm2000和mir-16antagomir或antagomirnc的稀释液(总体积为200μl)，室温下静置20min；分别加入培养皿中，前后轻轻摇动细胞培养板使混合液与培养板中培养液混匀；细胞于37℃co2培养箱中培养，6h后更换新的完全培养基；72h收细胞检测。

rna提取和qrt-pcr

首先，收取适量细胞，根据rneasyminikit(qiagenno.74106)试剂盒说明书提取rna并采用dnase进行消化(rnase-freednaseset,qiagenno.79254)。cdna合成使用大容量cdna反转录试剂盒(appliedbiosystemsno.4368813)；qrt-pcr实验利用sybrgerren实验方法(appliedbiosystems)中steponeplusreal-timepcr系统进行，利用比较ct值(δδ^ct)以及用u6或gapdh归一标准化的方法测定不同样品中基因的相对表达量。pcr引物序列及相关引物(均由上海生工合成)序列如下：

chart1引物序列信息

反义通用引物：5’-ctcaagtgtcgtggagtcggcaa-3’

chart2引物序列信息

油红o染色:

细胞爬片经固定15min后，蒸馏水洗；60％异丙醇浸洗，油红o染液(sigma，slbp5248v)染10min；60％异丙醇(国药集团，80109218)分色至背景无色，蒸馏水洗；mayer苏木素(sigma，h9627)复染数分钟，自来水洗(蓝化)1-3min；蒸馏水洗后水溶性封片剂封片。拍照。结果：组织细胞中脂滴呈橘红色，核呈蓝色。

westernblot

细胞用含有pmsf(南京沃宏，329-98-6)的裂解液进行裂解(碧云天，p0013b)。蛋白裂解液浓度利用bradford法进行测量(bio-rad，5000006)。30μg从细胞中获得的细胞裂解液与5×样品缓冲液(15gsds，15.6ml2mtrisph6.8，57.5gglycerol，16.6mlβ-mercaptoethanol)混合后，将样品上样至10％的聚丙烯酰胺凝胶中，sds-page分离并转移至pvdf膜上(bio-rad，162-0177)。用含0.1％tween-20的4％牛奶进行封闭后，加入以下抗体，4℃孵育过夜：fasnantibody(1:500，proteintech，10624-2-ap)，acsl1antibody(1:1000，affinity，df9605)，acox1antibody(1:1000，affinity，df12046)，gapdhantibody(1:2500，abcam，ab9485)。用含0.1％tween-20的pbs溶液将膜洗3遍后，加入含0.1％tween-20的4％牛奶以及hrp二抗(1:4000，dianova，hamburg)在室温条件下孵育2h。取出膜，含0.1％tween-20的pbs溶液将膜洗3遍后，在膜上滴加ecl显影液(bio-rad，170-5060)并放入geldoc成像系统(bio-rad)进行拍照。imagej软件进行光密度分析。

血脂相关因子含量检测

收集各处理组细胞，采用0.25％胰蛋白酶-edta消化液进行消化，37℃孵育10min，加入血清终止消化，多步骤洗涤离心后，取上清，采用甘油三酯(tg)测定试剂盒(南京建成，a110-1)、谷丙转氨酶(alt)测定试剂盒(南京建成，c009-2)、谷草转氨酶(ast/got)测定试剂盒(南京建成，c101-2)、过氧化氢(h2o2)测试试剂盒(南京建成，a064-1)、atp含量测试试剂盒试剂盒(南京建成，a095)进行检测，具体步骤参考附件1。

1.2动物实验

实验动物：c57bl/6小鼠购自辽宁长生生物技术有限公司。

动物模型构建及分组

1)正常组；

2)nafld组；

3)nafld组+antagomirnc；

4)nafld组+mir-16antagomir。

nafld模型建立：

将8周龄的c57bl/6小鼠适应性饲养1周后，按照体重随机分成2组，对照组用基础饲料喂养(3只)，nafld模型组用高脂饲料(80.5％普通饲料，2％胆固醇，7％猪油，10％蛋黄粉及0.5％胆盐)喂养(9只)。饲养环境条件：温度范围20-22℃，湿度范围50-55％，明暗各12h。实验动物自由进食和饮水，3只一笼饲养。后面两组按分组处理后4周，尾静脉注射mir-16antagomircontrol或antagomirnc(无需载体，可直接注射)，剂量15mg/kgin0.2mlpbs，2周后补充一次，于实验开始后的8周处死各组小鼠(每组6只)。

油红o染色

动物麻醉后，采用生理盐水去除血液后，使用4％多聚甲醛关注，迅速取出肝组织，4％多聚甲醛继续后固定，随后采用30％蔗糖脱水，oct包埋剂进行组织包埋，随后采用冰冻切片机进行切片制备，黏附于载玻片上。冰冻切片用甲醛-钙固定10min，蒸馏水洗；60％异丙醇浸洗，油红o染液染10min；60％异丙醇分色至背景无色，蒸馏水洗；mayer苏木素复染数分钟，自来水洗(蓝化)1-3min；蒸馏水洗后水溶性封片剂封片拍照。

rna提取和qrt-pcr

首先，收取适量剪碎的组织，根据rneasyminikit(qiagenno.74106)试剂盒说明书提取rna并采用dnase进行消化(rnase-freednaseset,qiagenno.79254)。cdna合成使用大容量cdna反转录试剂盒(appliedbiosystemsno.4368813)(备注：mrna只用olidodt逆转，mirna还用特异的loop引物逆转)；qrt-pcr实验利用sybrgerren实验方法(appliedbiosystems)中steponeplusreal-timepcr系统进行，利用比较ct值(δδ^ct)以及用gapdh/u6归一标准化的方法测定不同样品中基因的相对表达量。pcr引物序列及相关引物(均由上海生工合成)序列如下：

chart1引物序列信息

chart2mirna-16引物序列信息

反义通用引物：5’-ctcaagtgtcgtggagtcggcaa-3’

westernblot

组织块建成小块，用含有pmsf(南京沃宏，329-98-6)的裂解液进行裂解(碧云天，p0013b)。

蛋白裂解液浓度利用bradford法进行测量(bio-rad，5000006)。30μg从细胞中获得的细胞裂解液与5×样品缓冲液(15gsds，15.6ml2mtrisph6.8，57.5gglycerol，16.6mlβ-mercaptoethanol)混合后，将样品上样至10％的聚丙烯酰胺凝胶中，sds-page分离并转移至pvdf膜上(bio-rad，162-0177)。用含0.1％tween-20的4％牛奶进行封闭后，加入以下抗体，4℃孵育过夜：fasnantibody(1:500，proteintech，10624-2-ap)，acsl1antibody(1:1000；，affinity，df9605)，acox1antibody(1:1000，affinity，df12046)，gapdhantibody(1:2500，abcam，ab9485)。用含0.1％tween-20的pbs溶液将膜洗3遍后，加入含0.1％tween-20的4％牛奶以及hrp二抗(1:4000，dianova，hamburg)在室温条件下孵育1h。取出膜，含0.1％tween-20的pbs溶液将膜洗3遍后，在膜上滴加ecl显影液(bio-rad，170-5060)并放入geldoc成像系统(bio-rad)进行扫描拍摄。

血脂相关因子含量检测

按上述分组处理小鼠，眼球动脉取血，采用甘油三酯(tg)测定试剂盒(南京建成，a110-1)、谷丙转氨酶(alt)测定试剂盒(南京建成，c009-2)、谷草转氨酶(ast/got)测定试剂盒(南京建成，c101-2)、过氧化氢(h2o2)测试试剂盒(南京建成，a064-1)、atp含量测试试剂盒试剂盒(南京建成，a095)检测小鼠血清中生化指标h2o2、atp、tg、alt、ast的含量；具体步骤参考附件1。

he染色

取实验小鼠，脊椎脱臼处理，在腹部取出所需组织块，放置1×pbs中，然后将组织转移至冰1×pbs中，4％多聚甲醛固定过夜，1×pbs洗三次，10min/次，之后过30％、50％及70％ethanol，每次20min。处理好的组织采用二甲苯处理时间30min，制备蜡块，随后进行切片制备。切片入mayer氏苏木素染液染色5-7min，自来水洗浸洗返蓝；入1％的盐酸酒精分化2-5s(镜检若过染有背景则需此步骤来分化，若背景干净则不需此步骤)，自来水洗浸洗返蓝。无水乙醇i5min；无水乙醇ⅱ5min；二甲苯i5min；二甲苯ⅱ5min；风干后中性树胶封片，最后镜检。

2.实验结果及分析

2.1下调mir-16可抑制nafld模型细胞中脂滴蓄积；

l02细胞用软脂酸(ffa,1mm)处理48h以构建nafld细胞模型，qrt-pcr检测显示nafld细胞mir-16含量显著升高(p<0.05)(图1a)；同时油红o染色结果显示与对照组相比nafld组细胞出现明显的脂滴蓄积(图1b)；说明ffa处理成功构建了nafld细胞模型，且mir-16在nafld细胞中高表达。

采用mir-16antagomir有效降低nafld细胞中mir-16含量(图1a)，同时显著缓解nafld细胞脂滴蓄积的现象(图1b)。

以上结果说明，细胞中高表达的mir-16与nafld发生相关。

2.2抑制mir-16表达可显著降低nafld模型细胞病理相关分子表达；

生化检测结果显示，与对照组相比nafld组细胞过氧化氢(h2o2)、甘油三酯(tg)、谷丙转氨酶(alt)、谷草转氨酶(ast)含量显著升高，atp含量显著降低；nafld模型细胞同时加入mir-16antagomir处理抑制mir-16表达，可见相较于antagomirnc组，细胞h2o2、tg、alt、ast含量显著降低，atp含量显著升高(图2)。

以上结果说明，抑制mir-16水平可显著降低nafld模型细胞病理相关分子表达。可见mir-16拮抗剂可实现非酒精性脂肪性肝病的抑制。

2.3mir-16调控nafld模型细胞中脂代谢通路关键酶的表达；

westernblot检测结果显示，nafld模型细胞中脂肪酸合成关键酶fasn、acsl1mrna水平和蛋白水平均显著升高，脂肪酸氧化分解关键酶acox1mrna水平和蛋白水平显著降低；nafld模型细胞同时用mir-16antagomir处理抑制mir-16表达水平，细胞fasn、acsl1表达水平显著降低，acox1表达水平显著升高(图3)。

以上结果说明mir-16调控nafld细胞模型中脂代谢合成与分解通路关键酶的表达。

2.4nafld组小鼠肝细胞mir-16高表达，抑制mirna-16可缓解脂肪肝病理变化；

为了在整体动物水平验证mir-16与脂肪肝发生的相关性，用高脂饲料饲养8周构建小鼠nafld模型，并采用mir-16antagomir进行尾静脉注射干预mir-16表达水平。qrt-pcr结果显示，nafld模型小鼠肝组织中mir-16高表达；mir-16antagomir尾静脉注射有效下调了nafld模型小鼠肝组织中mir-16水平(图4)。

油红o染色结果显示，对照组小鼠肝细胞排列整齐，细胞内未观察到橘红色脂滴；nafld模型组和nafld+antagomirnc组小鼠肝组织中可见大量的红染脂滴；nafld+mirna-16antagomir组小鼠肝组织红染脂滴数量明显降低(图5a)。

he染色结果显示，正常组肝细胞排列整齐，无明显病变；nafld模型组和nafld+antagomirnc组小鼠肝组织可见明显的弥散性脂肪小泡，肝细胞有气球样变性，且细胞核被挤压变形，肝细胞索紊乱，肝窦变窄或消失；nafld+mirna-16antagomir组小鼠肝组织病变程度有所减轻(图5b)。

综上，nafld模型小鼠肝组织中mir-16高表达，mirna-16antagomir可显著抑制mir-16水平，改善脂肪肝组织病理改变，说明mir-16参与促进脂肪肝发生。

2.5抑制mir-16表达可显著缓解nafld模型动物血清中病理相关分子表达

血清生化检测结果显示：与对照组相比，nafld组小鼠血清h2o2、tg、alt、ast含量显著升高，atp含量显著降低；mir-16antagomir处理组血清中h2o2、tg、alt、ast含量显著降低，atp含量显著升高(图6)。

以上结果显示，nafld组小鼠肝组织病理相关分子表达异常，通过mir-16拮抗剂抑制mirna-16的表达，可缓解模型中病理相关分子的表达。

2.6mir-16调控nafld动物模型肝脏组织中脂代谢通路关键酶的表达

westernblot检测结果显示(图7)，nafld模型动物肝组织中脂肪酸合成关键酶fasn、acsl1mrna水平和蛋白水平均显著提升，脂肪酸氧化分解关键酶acox1mrna水平和蛋白水平显著降低；mir-16antagomir处理组肝组织fasn、acsl1表达水平显著降低，acox1表达水平显著升高。

以上结果与细胞实验完全一致，说明mir-16调控nafld动物模型肝脏组织中脂代谢通路关键酶的表达。

序列表

<110>杭州市第一人民医院

<120>mir-16拮抗剂在制备抑制非酒精性脂肪性肝病药物中的应用

<160>2

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>18

<212>rna

<213>未知(unknown)

<400>1

agcagcagacagggcaga18

<210>2

<211>23

<212>rna

<213>未知(unknown)

<400>2

ucauagcccuguacaaugcugcu23