一种O型口蹄疫亚单位疫苗及其制备方法和应用与流程

本发明涉及分子生物学
技术领域：
，具体涉及一种o型口蹄疫亚单位疫苗及其制备方法和应用。
背景技术：
：口蹄疫病毒(footandmouthdiseasevirus，fmdv)属于小rna病毒科，口蹄疫病毒属，病毒粒子无囊膜，呈二十面体对称，由结构蛋白vp0、vp3和vp1组成，其中vp0蛋白由vp4和vp2组成。该病毒主要感染猪、牛、羊等偶蹄动物的世界性烈性传染病，具有复制快、高度接触感染且致病性强等特征，尤其在猪群中能引起大范围流行。口蹄疫爆发会使动物及其产品贸易受到限制，造成重大的经济损失和社会影响，世界动物卫生组织(oie)将其列为法定必报病，我国农业部也将其划定为一类动物传染病。fmdv易变异，是其自然属性，也是造成口蹄疫长期流行并难以控制和净化的主要原因。口蹄疫病毒有七个血清型(o、a、asia1、sat1、sat2、sat3和c型)，各型之间无交叉保护反应。我国口蹄疫流行历史久远，当前主要流行o型和a型，并以o型为主。据国家口蹄疫参考实验室监测，我国o型口蹄疫流行毒主要有4个谱系(lineage)，包括中国古典拓扑型(cathay)、泛亚(panasia)谱系、缅甸98(mya98)谱系和印度2001(ind-2001)谱系等，多个流行毒株同时存在，给我国口蹄疫防控带来巨大压力。在我国，采取以预防为主的综合防控策略防控口蹄疫，对口蹄疫易感动物接种灭活疫苗是最常用的免疫措施。所述的灭活疫苗是口蹄疫田间毒株经病毒培养系统大量扩增、灭活、乳化等工艺制成，为控制我国口蹄疫的大流行起到了重要作用。但是，传统的灭活疫苗存在免疫持续期短，在生产制备过程中还存在因病毒灭活不彻底而散毒的风险、生产成本较高等问题。更为重要的是，我国现有口蹄疫流行毒株复杂、多变，传统灭活疫苗难以应对。以o型mya98毒株为例，该毒株自2010年传入我国，造成我国口蹄疫大流行。o型口蹄疫疫苗代表毒株(o/mya98/by/2010)应运而生，且在田间应用近10年之久。在免疫压力、境外毒株持续传入等多重因素作用下，o型mya98病毒发生快速变异，现有o型mya98毒株与2010年初流行毒株(如疫苗株o/mya98/by/2010)的vp1核苷酸序列差异近10％，流行毒株与疫苗毒株抗原关系(r值)也呈现下降趋势，甚至发现r值低于0.3的病毒，超出了oie免疫匹配范围。面对同时存在多种流行毒株，且存在抗原变异毒株的形成和出现，致使疫苗毒株匹配性较差，无法同时对以上4个谱系o型流行变异毒株提供高效交叉保护，亟需有效解决上述问题。在病毒特性方面，与a型和asia1型相比，o型口蹄疫疫苗还存在抗原不稳定、免疫效力低的问题，如何提高o型口蹄疫疫苗的免疫效力、抗原匹配性、交叉保护性至关重要。现有文献或专利尚无对我国o型口蹄疫流行毒具有广泛交叉中和保护的疫苗报道。口蹄疫病毒结构蛋白负责组装病毒衣壳，决定抗原特异性，是病毒重要的抗原成份。与小rna病毒科的其它病毒相似，口蹄疫病毒三种结构蛋白vp0、vp3和vp1在体外混合后，一部分会自行装配形成空衣壳(病毒样颗粒)，其形态、结构与真实病毒粒子相同或相似，保有病毒粒子空间构象，但不含病毒核酸，无法进行复制，也不具有感染性。口蹄疫病毒空衣壳含有病毒的特异性抗原表位，能模拟天然病毒对宿主细胞的感染，有效刺激机体产生很强的免疫应答，是更加安全有效的疫苗候选者。通过基因工程技术制备口蹄疫病毒空衣壳已经有部分文献报道，目前常用的口蹄疫病毒空衣壳的基因工程表达系统为大肠杆菌表达系统，具有成本低、细胞生长快、可规模放大等特点，但其表达产物缺乏必要的翻译后修饰，易形成包涵体，导致生物活性较差。已有研究表明，在大肠杆菌表达系统中，通过引入小泛素样融合蛋白(sumo)，可以提高口蹄疫病毒结构蛋白的可溶性。例如专利(cn101914501b)公开了在口蹄疫结构蛋白vp0、vp1、vp3中引入sumo，并分别通过三个质粒表达，构建了asia1型口蹄疫病毒样颗粒；而专利(cn104404074b)通过引入小泛素样融合蛋白(sumo)，构建了sumo-vp0、sumo-vp1和sumo-vp3的共表达质粒，获得了asia1型口蹄疫病毒样颗粒，但是表达效率较低。通过大肠杆菌表达系统制备的纯化后的asia1型口蹄疫病毒结构蛋白，最高产量仅达到20mg/l左右，产生全保护的免疫抗原量至少需要50μg/头份，这大大限制了其商业应用的价值和前景。技术实现要素：本发明首次研制出针对我国o型口蹄疫4个主要谱系流行毒具有广泛交叉保护作用的高效口蹄疫亚单位疫苗。首先，通过血清交叉中和试验，筛选中意外地发现保藏在国家口蹄疫参考实验室的毒株o/17002对我国o型口蹄疫流行毒具有广泛交叉中和作用，并以该毒株作为疫苗抗原来源毒株；以o/17002毒株三种结构蛋白vp0、vp3和vp1的氨基酸序列为基础进行优化设计，避免了宿主细胞对病毒结构蛋白vp3的降解，同时避免了病毒结构蛋白vp1对宿主细胞天然免疫信号通路的抑制，提升了疫苗抗原的稳定性和抗原性；发明人还首次发现口蹄疫病毒毒株o/17002的三种结构蛋白在单独表达中表达效率不均一，即使将可溶性标签蛋白与结构蛋白vp0、vp3和vp1融合进行表达，三种结构蛋白vp0、vp3和vp1的表达量不均一的问题也无法得到有效改善，进而严重影响了病毒空衣壳组装效率，本发明首次解决了上述技术问题，筛选出单个质粒在大肠杆菌中同时高效、均一、可溶性表达这三种结构蛋白，纯化后目标蛋白产量最高可达150mg/l，超过现有文献报道最高产量的7倍以上；由这三种口蹄疫病毒结构蛋白配制的口蹄疫疫苗，最小全保护免疫剂量可低至20μg/头份，且对我国o型口蹄疫流行毒具有广泛交叉保护作用。具体
发明内容为：本发明的目的在于提供一种o型口蹄疫病毒株o/17002在制备o型口蹄疫亚单位疫苗中的应用，所述o/17002结构蛋白vp0的氨基酸序列如seqidno.1所示，所述o/17002结构蛋白vp3的氨基酸序列如seqidno.3所示，所述o/17002结构蛋白vp1的氨基酸序列如seqidno.5所示。本发明的另一目的在于提供一种根据o型口蹄疫病毒株o/17002的结构蛋白vp0、vp3和vp1序列制备获得的o型口蹄疫疫苗。针对现有技术中口蹄疫病毒样颗粒免疫保护性较低的技术问题，本发明的另一目的在于提供一种o型口蹄疫病毒结构蛋白组合物，所述o型口蹄疫病毒结构蛋白组合物由o型口蹄疫病毒o/17002的结构蛋白vp0、vp3和vp1组成，所述结构蛋白vp0的氨基酸序列如seqidno.1所示，所述结构蛋白vp3的氨基酸序列如seqidno.3所示，所述结构蛋白vp1的氨基酸序列如seqidno.5所示。优选地，所述编码结构蛋白vp0的核苷酸序列如seqidno.2所示，编码结构蛋白vp3的核苷酸序列如seqidno.4所示，编码结构蛋白vp1的核苷酸序列如seqidno.6所示。优选地，将所述结构蛋白vp3的118位赖氨酸突变为精氨酸，所述突变后的结构蛋白vp3的氨基酸序列如seqidno.7所示；和/或将所述结构蛋白vp1的210位赖氨酸突变为精氨酸，所述突变后的结构蛋白vp1的氨基酸序列如seqidno.9所示；将结构蛋白vp3的118位赖氨酸突变为精氨酸，和/或将结构蛋白vp1的210位赖氨酸突变为精氨酸的策略提高了口蹄疫亚单位疫苗的体内稳定性和保护效力。优选地，所述编码突变后的结构蛋白vp3的核苷酸序列如seqidno.8所示，所述编码突变后的结构蛋白vp1的核苷酸序列如seqidno.10所示。本发明的另一目的在于提供一种o型口蹄疫病毒结构蛋白组合物在制备口蹄疫疫苗中的应用。本发明的另一目的在于提供一种用于预防口蹄疫感染的疫苗，所述疫苗包括口蹄疫病毒结构蛋白组合物。优选地，所述疫苗还包括佐剂。优选地，所述佐剂为化学类免疫佐剂、微生物类免疫佐剂、植物类免疫佐剂、生化类免疫佐剂中的一种或几种。针对现有技术中口蹄疫病毒样颗粒表达效率低的技术问题，本发明提供了一种o型口蹄疫病毒结构蛋白组合物的制备方法，所述方法包括以下步骤：(1)设计编码融合标签蛋白的基因序列ths，其中t为翻译起始区核苷酸序列，h为编码含组氨酸标签的核苷酸序列，s为编码含酿酒酵母小泛素样修饰蛋白(sumo)的核苷酸序列；(2)将步骤(1)所述的编码融合标签蛋白基因序列ths分别与编码o型口蹄疫流行毒株结构蛋白vp0、vp3和vp1的基因串联，形成三段融合基因序列ths-vp0、ths-vp3和ths-vp1；用编码融合标签蛋白的基因序列ths分别与编码o型口蹄疫流行毒株结构蛋白vp0、vp3和vp1的基因串联，提高了病毒结构蛋白的表达效率；(3)通过分子克隆技术将步骤(2)所述编码三段融合目标蛋白的基因序列同时克隆入原核表达载体pet30a，获得重组表达质粒pet-fmdv-vp031；将编码o型口蹄疫流行毒株结构蛋白vp0、vp3和vp1的基因克隆入同一表达载体，可实现三种结构蛋白的等量表达、并可以在体外自组装；(4)将步骤(3)所述的重组表达质粒pet-fmdv-vp031转化大肠杆菌，获得基因工程菌，将所述基因工程菌进行发酵培养，iptg诱导表达带有融合蛋白标签的口蹄疫病毒结构蛋白vp0、vp3和vp1；(5)破碎基因工程菌菌体后，回收上清液，亲和色谱层析分离纯化获得带有融合标签蛋白的口蹄疫病毒结构蛋白vp0，vp3和vp1混合物；(6)酶切去除步骤(5)所述混合物中的融合标签蛋白后，再用亲和色谱层析分离纯化获得口蹄疫病毒结构蛋白vp0，vp3和vp1混合物。两步亲和色谱纯化避免了成本较高的分子筛色谱层析纯化，提高了抗原蛋白回收率。优选地，所述步骤(2)中结构蛋白vp0的氨基酸序列如seqidno.1所示，结构蛋白vp3的氨基酸序列如seqidno.3所示，结构蛋白vp1的氨基酸序列seqidno.5所示。优选地，所述编码结构蛋白vp0的核苷酸序列如seqidno.2所示，编码结构蛋白vp3的核苷酸序列如seqidno.4所示，编码结构蛋白vp1的核苷酸序列如seqidno.6所示。优选地，将所述结构蛋白vp3的118位赖氨酸突变为精氨酸，所述突变后的结构蛋白vp3的氨基酸序列如seqidno.7所示；和/或将所述结构蛋白vp1的210位赖氨酸突变为精氨酸，所述突变后的结构蛋白vp1的氨基酸序列如seqidno.9所示；将结构蛋白vp3的118位赖氨酸突变为精氨酸，和/或将结构蛋白vp1的210位赖氨酸突变为精氨酸的策略提高了口蹄疫基因工程疫苗的体内稳定性和保护效力。优选地，所述编码突变后的结构蛋白vp3的核苷酸序列如seqidno.8所示，所述编码突变后的结构蛋白vp1的核苷酸序列如seqidno.10所示。优选地，所述步骤(1)中ths的核苷酸序列如seqidno.11所示。本发明的有益效果是：①本发明首次提供了一种免疫效力高、抗原匹配性好、能同时对多种田间流行毒株提供有效保护的o型口蹄疫病毒株；②以编码该毒株结构蛋白基因vp0、vp3和vp1序列为基础，引入融合标签蛋白，通过单个质粒在大肠杆菌中同时高效、均一、可溶性表达三种结构蛋白；结合两步亲和层析的纯化工艺，最终获得的目的蛋白占到菌体总蛋白的约30％-35％，纯化后目的蛋白产量最高可达150mg/l，超过现有文献报道最高产量的7倍以上；③构建方法简单，避免了成本较高的分子筛色谱层析纯化，不需要使用超速离心等复杂工艺，两步亲和纯化的回收率接近60％，使得以工业化规模制备纯化口蹄疫病毒结构蛋白易于实现；④将结构蛋白vp3的118位赖氨酸突变为精氨酸，和/或将结构蛋白vp1的210位赖氨酸突变为精氨酸，避免了宿主细胞内tbk1对病毒结构蛋白vp3的降解，同时避免了病毒结构蛋白vp1对宿主细胞天然免疫信号通路的抑制，提升了疫苗稳定性和保护效力；⑤所得的口蹄疫基因工程疫苗，最小免疫剂量可低至20μg/头份，且对我国o型口蹄疫流行毒具有广泛交叉保护作用。附图说明图1：本发明所得的融合小泛素样修饰蛋白(sumo)标签的口蹄疫病毒结构蛋白，sds-page鉴定结果；其中m为分子量marker；1为诱导前全菌；2为诱导后全菌；3为诱导后全菌裂解后的上清，上样量5μl；图2：本发明所得的亲和色谱纯化的带sumo标签的口蹄疫病毒结构蛋白，经sumo酶酶切后sds-page鉴定结果；其中，m为分子量marker；1为亲和色谱纯化后的带sumo标签的口蹄疫病毒结构蛋白；2为sumo酶酶切后，不带sumo标签的口蹄疫病毒结构蛋白，上样量5μl；图3：本发明所得的不带sumo标签的口蹄疫病毒结构蛋白，经亲和色谱纯化后sds-page鉴定结果；其中，m为分子量marker；o/fmdv为纯化的o型口蹄疫病毒三种结构蛋白，上样量5μl；图4：本发明所得的口蹄疫病毒结构蛋白自组装后透射电镜观察结果；图5：口蹄疫病毒结构蛋白组合物的表达效率sds-page鉴定结果；其中，m为分子量marker；1和2为re-o/17002/vp3诱导前全菌和诱导后裂解全菌后的上清；3和4为re-o/17002/vp1诱导前全菌和诱导后裂解全菌后的上清；5和6为re-o/17002/vp3+vp1诱导前全菌和诱导后裂解全菌后的上清；7和8为o/17002诱导前全菌和诱导后裂解全菌后的上清，上样量5μl；图6：口蹄疫病毒结构蛋白优化前后基因工程疫苗免疫动物中和抗体应答结果；图7：口蹄疫病毒结构蛋白优化后的基因工程疫苗免疫猪pd50试验中和抗体应答结果。具体实施方式以下结合具体实施例对上述方案做进一步说明。应理解，这些实施例是用于说明本发明而不限于限制本发明的范围。实施例中采用的实施条件可以根据具体厂家的条件做进一步调整，未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。以下实施例中所述的实验获得生物安全许可和口蹄疫实验室活动许可：中国农业科学院兰州兽医研究所根据生物安全3级实验室(bsl-3)和口蹄疫相关生物安全的相关要求，经兰州兽医研究所生物安全委员会、实验动物伦理委员会、中国农业科学院生物安全委员会、兰州兽医研究所实验动物伦理委员会、兰州兽医研究所生物安全委员会逐级上报，获得农业部关于开展高致病性fmdv病原及动物研究许可，并已在农业农村部备案，符合国家生物安全等级的要求。口蹄疫o型流行毒by/2010(mya98)、13152(mya98)、14064(mya98)、15126(panasia)、16045(mya98)、17016(mya98)、17002(mya98)、17009(ind-2001)、17042(ind-2001)、18074(cathay)来自国家口蹄疫参考实验室。本发明中相关术语的说明及解释：术语“大肠杆菌表达系统”是指由大肠杆菌(菌株)与载体组成，其中大肠杆菌(菌株)来源于市场上可得到的，在此举例但不限于：bl21(de3)，bl21(de3)plyss，b834(de3)，blr(de3)，jm109，xl1blue，er2566，rosetta，gi698，优选bl21(de3)。术语“载体”是指可将某编码蛋白的多聚核苷酸插入其中并使蛋白获得表达的一种核酸运载工具。载体可以通过转化，转导或者转染宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。举例来说，载体包括：质粒；噬菌体；柯斯质粒等。本发明将口蹄疫病毒结构蛋白vp3，vp1，vp0(为vp4和vp2的基因融合)进行串联共表达，所述串联共表达是指把多个基因插入到同一个载体中共表达。串联共表达顺序包括但不限于vp3-vp1-vp0，可以为vp3，vp1，vp0之间的各种组合以及vp1，vp2，vp3，vp4之间的各种可能组合，例如可以是vp1-vp3-vp0的串联顺序，vp3-vp0-vp1的串联顺序，vp1-vp0-vp3的串联顺序，vp3-vp1-vp2-vp4的串联顺序，vp4-vp2-vp3-vp1的串联顺序等，优选vp3-vp1-vp0的串联顺序。术语“疫苗”是指能够在动物中提供保护性应答的生物制剂，其中所述疫苗已经被递送并且不能造成严重疾病。本发明的疫苗是遗传工程改造的由o型口蹄疫病毒株o/17002结构蛋白vp0、vp3和vp1组合的亚单位疫苗。本发明的疫苗，进一步任选地包含一种或多种佐剂，赋形剂，载体和稀释剂。佐剂可以任何合适的佐剂，化学类免疫佐剂如氢氧化铝、弗氏佐剂、矿物油、司盘等；微生物类免疫佐剂如分枝杆菌、bcc、脂多糖、胞壁酰二肽、胞肽、脂溶性蜡质d、短小棒状杆菌；植物类免疫佐剂多为从植物或大真菌中提取的多糖类，如茯苓多糖、红花多糖、中草药类等。而生化类免疫佐剂如胸腺肽、转移因子、白细胞介素等。优选的佐剂可以是纳米佐剂生物佐剂，白介素、干扰素等。本发明的疫苗也可用于联合疫苗，如与猪的其他疫苗联合，但重点在减毒活疫苗上，尤其是病毒基因的整合，如双价苗，三价苗等。联合疫苗可以包含不同基因型的多种减毒非猪瘟病毒，如此可以诱导针对多种非猪瘟病毒基因型的交叉保护性免疫应答。本发明的疫苗的施用可以采用方便的途径，例如肌内注射，鼻内，口服，皮下，透皮和阴道等途径。本发明的减毒疫苗优选采用肌肉注射。疫苗可以在初免-加强方案后施用。例如，在第一次接种后，受试者可以在一段时间(例如约7，14，21或28天)之后接受第二次加强施用。通常，加强施用的剂量相同或低于初免施用的剂量。此外，也可以进行第三次加强免疫，例如免疫后2-3个月、6个月或一年。实施例1o型口蹄疫病毒株o/17002血清交叉中和试验本发明在国家口蹄疫参考实验室(依托单位为中国农业科学院兰州兽医研究所)保藏的口蹄疫流行毒株中意外地发现了一株对我国o型口蹄疫流行毒具有广泛交叉中和作用的毒株o/17002。通过悬浮培养的bhk21细胞，将毒株o/17002进行扩增繁殖，收获病毒测定毒价后经bei灭活，与isa206佐剂乳化后配制疫苗；用该疫苗免疫猪，获得毒株o/17002的高免阳性血清。将所获得的高免血清分别与国家口蹄疫参考实验室保存的o/mya98、o/panasia、o/ind-2001和o/cathay4种主要流行变异毒株进行病毒中和试验，具体毒株包括以下10个：by/2010(mya98)、13152(mya98)、14064(mya98)、15126(panasia)、16045(mya98)、17016(mya98)、17002(mya98)、17009(ind-2001)、17042(ind-2001)、18074(cathay)，根据r值(r≤1)判断交叉中和效果，其中r值越高，交叉中和作用越好。实验结果如表1所示，通过血清交叉中和试验发现，o型口蹄疫病毒株o/17002对我国o型口蹄疫流行毒具有广泛交叉中和作用。表1o/17002血清交叉中和试验结果通过对o/17002毒株进行全基因组测序，获得o/17002毒株结构蛋白vp0、vp3和vp1的氨基酸序列和编码结构蛋白vp0、vp3和vp1的基因序列。所述o/17002毒株结构蛋白vp0的氨基酸序列如seqidno.1所示，编码结构蛋白vp0的核苷酸序列如seqidno.2所示；所述o/17002毒株结构蛋白vp3的氨基酸序列如seqidno.3所示，编码结构蛋白vp3的核苷酸序列如seqidno.4所示；所述o/17002毒株结构蛋白vp1的氨基酸序列如seqidno.5所示，编码结构蛋白vp1的核苷酸序列如seqidno.6所示。实施例2口蹄疫病毒结构蛋白组合物的制备1、口蹄疫病毒结构蛋白重组表达载体的构建(1)设计由下述原件串联组成的编码融合标签蛋白的基因序列ths，其中t为翻译起始区核苷酸序列，h为编码含组氨酸标签的核苷酸序列，s为编码含酿酒酵母小泛素样修饰蛋白(sumo)的核苷酸序列；所述ths的核苷酸序列如seqidno.11所示。(2)将上述ths基因序列分别与编码o/17002毒株结构蛋白基因vp0、vp3、vp1按顺序串联，形成三段融合基因序列ths-vp0、ths-vp3和ths-vp1。其中所述编码o/17002毒株结构蛋白基因vp0、vp3、vp1包括以下四种情况：①未经任何处理的编码o/17002毒株结构蛋白vp0、vp3、vp1的基因；②将编码o/17002毒株结构蛋白基因vp3进行突变，所述突变为：将基因vp3中编码结构蛋白vp3的118位赖氨酸的密码子突变为编码精氨酸的密码子，突变后的基因vp3的核苷酸序列如seqidno.8所示，而编码o/17002毒株结构蛋白vp0和vp1基因未经任何处理；③将编码o/17002毒株结构蛋白基因vp1进行突变，所述突变为：将基因vp1中编码结构蛋白vp1的210位赖氨酸的密码子突变为编码精氨酸的密码子，突变后的基因vp1的核苷酸序列如seqidno.10所示，而编码o/17002毒株结构蛋白vp0和vp3基因未经任何处理；④将编码o/17002毒株结构蛋白vp1和vp3基因进行突变，所述突变为：将基因vp1中编码结构蛋白vp1的210位赖氨酸的密码子突变为编码精氨酸的密码子，并将基因vp3中编码结构蛋白vp3的118位赖氨酸的密码子突变为编码精氨酸的密码子，突变后的vp3基因的核苷酸序列如seqidno.8所示，突变后的vp1基因的核苷酸序列如seqidno.10所示，而编码o/17002毒株结构蛋白基因vp0未经任何处理；(3)由华大基因生物科技有限公司合成三段优化后的融合基因片段，并通过分子克隆技术将上述片段按vp0、vp3、vp1的顺序克隆入同一个pet30a载体，鉴定序列正确后获得重组表达质粒pet-fmdv-vp031；(4)将上述pet-fmdv-vp031质粒转化至感受态大肠杆菌bl21(de3)，涂布于卡那霉素抗性的固体lb培养基，37℃静置培养10-12小时至单菌落清晰可辨。挑取单菌落至4ml含卡那霉素抗性的液体lb培养基的试管，37℃，220转/分振荡培养12小时，从中取1ml菌液于-80℃保存。2、口蹄疫病毒结构蛋白的原核表达(1)从-80℃冰箱中取出带有重组质粒pet-fmdv-vp031的大肠杆菌菌种，接入卡那霉素抗性的50ml的lb液体培养基，250rpm，37℃，培养约12小时后，转接入1llb液体培养基中，37℃培养，等od600值达到0.6-0.8后，加入终浓度为0.5mm的iptg，16℃过夜诱导蛋白表达。本发明所得的融合小泛素样修饰蛋白(sumo)标签的口蹄疫病毒结构蛋白sds-page鉴定结果如图1所示，其中m为分子量marker，1为诱导前全菌，2为诱导后全菌，3为裂解全菌后的上清，上样量5μl。实验结果显示，以上带sumo标签的口蹄疫病毒结构蛋白在大肠杆菌中可溶共表达，且目的蛋白约占菌体可溶总蛋白的30％-35％左右。(2)校正发酵罐(德国赛多利斯ct5-2发酵罐)ph电极，配制4l培养基装入发酵罐，121℃灭菌30min，校正溶氧电极，以灭菌后未通气前为零点，以发酵时通气后未接种前初始搅拌速度100rpm时为100％。(3)第二天将400ml种子液接入发酵罐中，温度37℃，ph值7.0，手动调节搅拌速度及通气量，维持溶氧在40％以上。流加补料，将50％葡萄糖按30ml/小时的速度流加培养。通过调节转速，控制发酵罐内溶氧在30％-40％。培养至菌浓度达到od600大约15左右时，将培养温度降至16℃加入终浓度0.5mm的iptg诱导培养12小时。终菌液浓度od600大约为45左右时下罐，离心收集菌体大约300g。3、带sumo标签的口蹄疫病毒结构蛋白的亲和色谱纯化按1g菌体对应10ml裂解液(20mmtris，20mm咪唑，400mmnacl，ph7.5)的比例重悬菌体，使用均质机以700bar压力破碎菌体2次。30,000g离心1h，取上清，通过12％sds-page电泳检测，上清用0.45μm孔径滤膜过滤后，用镍亲和柱(histrapff，gehealthcarelifesciences)进行纯化。缓冲液：20mmtris，0.4mnacl，ph8.0；洗脱液：20mmtris，0.4mnacl，500mm咪唑，ph8.0。样品为1.4l经过0.45μm孔径滤膜过滤后的经匀浆机破碎后的大肠杆菌菌体上清。洗脱程序为：样品流穿后，缓冲液洗脱杂蛋白，洗脱液洗脱带sumo标签的口蹄疫病毒结构蛋白(vp0，vp3，vp1)产物。取经本实施例方法纯化的样品20μl，加入5μl的5×loadingbuffer混匀，于100℃金属浴10min后取5μl于12％sds-page中电泳。随后以考马斯亮兰染色显示电泳条带，所得的亲和色谱纯化的带sumo标签的口蹄疫病毒结构蛋白，经sumo酶酶切后sds-page鉴定结果如图2所示，其中m为分子量marker，1为亲和色谱纯化后的带sumo标签的口蹄疫病毒结构蛋白，2为sumo酶酶切后不带sumo标签的口蹄疫病毒结构蛋白，上样量5μl；sds-page鉴定结果显示纯化获得了预期大小的融合目标蛋白；对该sds-page鉴定结果进行灰度扫描分析，sumovp0、sumovp3和sumovp1三者浓度比例为1：1.02：1.06，三种融合蛋白含量较为均一。4、去除sumo标签的口蹄疫病毒衣壳蛋白的亲和色谱纯化取步骤3中四种带sumo标签的口蹄疫病毒结构蛋白的洗脱样品，在4℃用sumo酶酶切12小时，将酶切后的含有口蹄疫病毒结构蛋白的溶液流穿镍柱(histrapff，gehealthcarelifesciences)，收集流穿液。sumo标签结合于镍柱，不含sumo标签的口蹄疫病毒结构蛋白vp0、vp1和vp3在流穿液中。取经本实施例方法纯化的口蹄疫结构蛋白样品20μl，加入5μl的5×loadingbuffer混匀，于100℃金属浴10min后分别取5μl于12％sds-page电泳。随后以考马斯亮兰染色显示电泳条带，电泳结果见图3，其中m为分子量marker，o/fmdv为纯化的不含融合标签的o型口蹄疫病毒结构蛋白，上样量5μl。sds-page鉴定结果显示，纯化获得了预期大小的不含融合标签目标蛋白；对该sds-page鉴定结果进行灰度扫描分析，vp0、vp3和vp1三者浓度比例约为1：1.03：1.12，三种结构蛋白含量较为均一，纯度>90％。经bca法测定，纯化后去除sumo标签的目标蛋白浓度约1.12mg/ml。采用本生产工艺，每升发酵液可获得约120mg纯化蛋白，产量达120mg/l，远高于目前文献报道纯化蛋白的产量。5、口蹄疫病毒结构蛋白自组装的形态学检测收集步骤4中含有口蹄疫病毒结构蛋白vp0、vp1和vp3的流穿液于组装缓冲液(50mmtris-hcl，500mmnacl，ph7.6)中，4℃过夜后透射电镜观察口蹄疫病毒结构蛋白的自组装，仪器为fei透射电镜。口蹄疫病毒结构蛋白组合物经亲水化处理后，1％uf染色20秒，固定于超薄炭铜网，进行电镜观察。结果如图4所示，通过透射电镜可观察到大量半径约为20nm左右的颗粒，大小均匀，呈现为空心形态，和自然的口蹄疫病毒粒子相似，病毒三种结构蛋白成功自组装，并且vp3和vp1结构蛋白的氨基酸点突变，并不影响o/17002病毒结构蛋白的自组装。制备的口蹄疫病毒结构蛋白组合物分别命名为o/17002(vp0，vp3，vp1基因均未突变)、re-o/17002/vp3(vp3基因突变)、re-o/17002/vp1(vp1基因突变)、re-o/17002/vp3+vp1(vp3和vp1基因同时突变)。实施例3口蹄疫病毒结构蛋白组合物的表达效率按照实施例2所述的方法，分别对4种口蹄疫病毒结构蛋白组合物o/17002、re/o/17002/vp3、re/o/17002/vp1、re/o/17002/vp3+vp1进行原核表达鉴定，通过sds-page分析不同口蹄疫病毒结构蛋白组合物的表达效率，实验结果如图5所示，口蹄疫病毒结构蛋白vp3或vp1的基因单突变，以及结构蛋白vp3和vp1同时突变，均不会显著影响口蹄疫病毒结构蛋白组合物的表达效率。按照实施例2所述的方法，分别对4种口蹄疫病毒结构蛋白组合物o/17002、re/o/17002/vp3、re/o/17002/vp1、re/o/17002/vp3+vp1进行纯化制备。经bca法测定不同组合物的纯化产量，结果如表2所示，4种口蹄疫病毒结构蛋白组合物的纯化产量在120-150mg/l之间，均远高于现有文献报道的最高产量。表2口蹄疫病毒结构蛋白组合物的纯化产量结构蛋白组合物o/17002re/o/17002/vp3re/o/17002/vp1re/o/17002/vp3+vp1纯化后目标蛋白产量150mg/l130mg/l125mg/l120mg/l实施例4口蹄疫亚单位疫苗免疫动物中和抗体应答检测分别将实施例3中获得的口蹄疫病毒结构蛋白组合物o/17002、re/o/17002/vp3、re/o/17002/vp1、re/o/17002/vp3+vp1以相同抗原剂量配制疫苗后进行猪体免疫，免疫后于0、7、14、21、28天分别采血，分离血清进行中和抗体滴度检测。试验结果如图6所示，以所述o/17002毒株结构蛋白基因vp0、vp3、vp1构建的o型口蹄疫病毒结构蛋白组合物o/17002、re/o/17002/vp3、re/o/17002/vp1、re/o/17002/vp3+vp1在动物免疫后均能产生较高水平的中和抗体，其中将o/17002毒株结构蛋白基因vp3和vp1分别或同时突变后构建的o型口蹄疫病毒结构蛋白组合物re/o/17002/vp3、re/o/17002/vp1、re/o/17002/vp3+vp1在动物免疫后能够产生更高水平的中和抗体，提高了o型口蹄疫基因工程疫苗的体内稳定性和保护效力。实施例5口蹄疫亚单位疫苗免疫血清交叉中和试验用re/o/17002/vp3+vp1配制的口蹄疫亚单位疫苗免疫猪，获得口蹄疫亚单位疫苗的高免阳性血清。将所获得的高免血清分别与国家口蹄疫参考实验室保存的o/mya98、o/panasia、o/ind-2001和o/cathay等4种主要流行变异毒株进行病毒中和试验，具体毒株包括以下10个：by/2010(mya98)、13152(mya98)、14064(mya98)、15126(panasia)、16045(mya98)、17016(mya98)、17002(mya98)、17009(ind-2001)、17042(ind-2001)、18074(cathay)，根据r值(r≤1)判断交叉中和效果，其中r值越高，交叉中和作用越好。试验结果如表3所示，通过血清交叉中和试验结果显示，本发明提供的o型口蹄疫亚单位疫苗对我国o型口蹄疫流行毒具有广泛交叉中和作用。表3口蹄疫亚单位疫苗血清交叉中和试验结果实施例6口蹄疫基因工程疫苗动物免疫攻毒pd50评价选择经筛选口蹄疫病毒抗体阴性的实验猪，10周龄。实施例2所制备的口蹄疫病毒结构蛋白组合物re-o/17002/vp3+vp1与等量206佐剂混合，免疫方式为肌肉注射，免疫剂量分三个梯度，分别为20、60、180μg/头份。免疫后分别于0、7、14、21、28天采颈部静脉血，分离血清，保存待检。中和抗体应答结果如图6所示，经口蹄疫病毒结构蛋白组合物re-o/17002/vp3+vp1配制的疫苗，免疫猪体后，机体产生中和抗体应答，免疫28天时达到抗体高峰；最低剂量20μg/头份免疫后，即可诱导机体产生高滴度的中和抗体，对我国o型口蹄疫代表流行毒株o/17016、5.5sid50剂量攻毒，提供全保护，证明该口蹄疫病毒结构蛋白组合物制备的基因工程疫苗具高效的免疫保护力。本发明研制的o/fmdv基因工程疫苗(口蹄疫病毒结构蛋白组合物re-o/17002/vp3+vp1与等量206佐剂混合)经猪体免疫攻毒试验评价，使用20μg/头份免疫剂量，即可诱导机体产生高滴度的中和抗体。对照组3头动物在口蹄疫o型流行毒17016攻毒后第4天，全部发病；3个不同剂量免疫组的动物在口蹄疫o型流行毒17016攻毒后，没有一头发病，实现对我国o型口蹄疫代表流行毒o/17016攻毒全保护，证明该口蹄疫病毒结构蛋白组合物具有优秀的免疫保护力，结果见表4。表4o/fmdv基因工程疫苗免疫攻毒结果表注：+：猪鼻吻部出现典型水泡样病变；左前、右后：猪左前蹄、右后蹄出现典型水泡样病变；四蹄：猪四蹄均出现典型水泡样病变。上述实例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人是能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所做的等效变换或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。序列表<110>中国农业科学院兰州兽医研究所<120>一种o型口蹄疫亚单位疫苗及其制备方法和应用<160>11<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>303<212>prt<213>口蹄疫病毒(foot-and-mouthdiseasevirus)<400>1glyalaglyglnserserproalathrglyserglnasnglnsergly151015asnthrglyserileileasnasntyrtyrmetglnglntyrglnasn202530sermetaspthrglnleuglyaspasnalaileserglyglyserasn354045gluglyserthraspthrthrserthrhisthrthrasnthrglnasn505560asnasptrppheserlysleualaserseralapheserglyleuphe65707580glyalaleuleualaasplyslysthrglugluthrthrleuleuglu859095aspargileleuthrthrargasnglyhisthrthrserthrthrgln100105110serservalglyilethrtyrglytyralathralagluasppheval115120125serglyproasnthrserglyleugluthrargvalileglnalaglu130135140argphephelysthrhisleupheasptrpvalthrseraspprophe145150155160glyargcyshisleuleugluleuprothrasphislysglyvaltyr165170175glyserleuthraspsertyralatyrmetargasnglytrpaspval180185190gluvalthralavalglyasnglnpheasnglyglycysleuleuval195200205alametvalprogluleucysserilegluargarggluleuphegln210215220leuthrleupheprohisglnpheileasnproargthrasnmetthr225230235240alahisilelysvalprophevalglyvalasnargtyraspglntyr245250255lysvalhislysprotrpthrleuvalvalmetvalvalalaproleu260265270thrvalasnthrgluglyalaproglnilelysvaltyralaasnile275280285alaprothrservalhisvalalaglyglupheproserlysglu290295300<210>2<211>909<212>dna<213>口蹄疫病毒(foot-and-mouthdiseasevirus)<400>2ggagccgggcaatccagtccggctactgggtcgcagaaccagtcaggcaacaccgggagt60atcatcaacaattactacatgcagcagtaccagaactccatggacacccaacttggtgac120aacgctatcagcggaggctccaatgagggatccacggatacaacctccacccacacaacc180aacactcagaacaatgactggttttcaaagctggccagctctgccttcagcggtcttttc240ggcgccctcctcgccgataagaaaactgaggagaccacccttctcgaagaccgcatcctc300accacccggaacggacacaccacctcgacaacccagtcgagtgttggcataacgtacggg360tacgcgacagctgaggattttgtgagcgggccaaacacttctggtcttgagaccagagtt420atccaagcggaacggttcttcaaaacccacctgttcgactgggtcaccagtgatccgttc480ggacggtgtcacttgttagagctcccgactgatcacaaaggtgtctacggcagcctgacc540gactcatacgcctacatgagaaacggttgggacgttgaggttaccgctgtggggaaccag600ttcaacggaggctgcctactagtggccatggtgcctgaactttgttccatcgagcggaga660gagctgttccagcttacgctcttcccccaccagttcatcaacccccggacgaacatgaca720gcccacatcaaggtgccctttgttggcgtcaaccgttacgatcagtacaaagtacacaag780ccgtggaccctcgtggttatggtcgtggccccactgactgtcaacaccgaaggcgctccg840cagattaaggtgtacgccaacatcgcacccaccagcgtgcacgtcgcaggtgagttccct900tccaaagag909<210>3<211>220<212>prt<213>口蹄疫病毒(foot-and-mouthdiseasevirus)<400>3glyilepheprovalalacysseraspglytyrglyglyleuvalthr151015thraspprolysthralaaspprovaltyrglylysvalpheasnpro202530proargasnmetleuproglyargphethrasnleuleuaspvalala354045glualacysprothrpheleuhispheaspglyglyvalprotyrval505560thrthrlysthraspseraspargvalleuthrglnpheaspleuser65707580leualaalalyshismetserasnthrpheleualaglyleualagln859095tyrtyrthrglntyrserglythrileasnleuhisphemetphethr100105110glyprothraspalalysalaargtyrmetilealatyralapropro115120125glymetgluproprolysthrproglualaalaalahiscysilehis130135140alaglutrpaspthrglyleuasnserlysphethrpheserilepro145150155160tyrleuseralaalaasptyralatyrthralaseraspalaalaglu165170175thrthrasnvalglnglytrpvalcysleupheglnilethrhisgly180185190lysalagluglyaspalaleuvalvalleualaseralaglylysasp195200205phegluleuargleuprovalaspalaargglngln210215220<210>4<211>660<212>dna<213>口蹄疫病毒(foot-and-mouthdiseasevirus)<400>4gggattttccctgtggcctgtagcgacggctatggcggcttggtgacaactgacccaaag60acggctgaccccgtttatggcaaagtcttcaaccctccccgcaacatgttgccggggcgg120ttcaccaacctcctggacgtggctgaggcttgtcccacgtttctgcactttgatggcggt180gtgccatatgtgaccacgaagacagactcggacagggtgctcacacagtttgacttgtct240ttggcagcaaaacacatgtcaaacaccttccttgcaggtcttgcccagtactatacgcaa300tacagcggcaccatcaacctgcacttcatgttcacaggtcccactgacgcgaaggcacgt360tacatgattgcgtatgcccctccgggcatggagccacccaaaacacctgaggctgccgct420cactgcattcacgcagagtgggacacgggtctgaactcaaagttcaccttttccatcccc480tacctctcggctgctgattacgcgtacactgcgtctgacgctgctgagaccacaaatgtt540cagggatgggtctgcttatttcaaataacacacgggaaagctgaaggcgacgctcttgtc600gtgttggccagtgctggcaaggactttgagctgcgcctgcctgtggacgctcggcaacag660<210>5<211>213<212>prt<213>口蹄疫病毒(foot-and-mouthdiseasevirus)<400>5thrthrserthrglygluseralaaspprovalthralathrvalglu151015asntyrglyglygluthrglnileglnargarghishisthraspval202530serpheileleuaspargphevallysvalthrprolysglyproile354045asnvalleuaspleumetglnalaproprohisthrleuvalglyala505560leuleuargalaalathrtyrtyrphealaaspleugluvalalaval65707580lyshisgluglyaspleuthrtrpvalproasnglyalaprogluala859095alaleuaspasnthrthrasnprothralatyrhislysalaproleu100105110thrargleualaleuprotyrthralaprohisargvalleualathr115120125valtyrasnglyasncyslystyrthrglyglyproleuproasnval130135140argglyaspleuglnvalleualaprolysalaalaargproleupro145150155160thrserpheasntyrglyalailelysalathrargvalthrgluleu165170175leutyrargmetlysargalagluthrtyrcysproargproleuleu180185190thrvalhisproserglualaarghislysglnlysilevalalapro195200205vallysglnserleu210<210>6<211>639<212>dna<213>口蹄疫病毒(foot-and-mouthdiseasevirus)<400>6accacttcgacaggcgagtccgctgaccccgtgactgccaccgttgagaactacggcggc60gagacacagatccagaggcgccaccacacagacgtctcatttatactggacagatttgtg120aaagtcacaccaaaaggcccaataaatgtactggacctgatgcaggcccccccccacact180ctagtaggggcgctcctccgcgctgccacttactatttcgctgacctagaggtggcagtg240aaacacgagggagaccttacctgggtgccaaacggcgcgcctgaagcagccttggacaac300accaccaacccaacggcgtaccataaggcgccgcttacccggctcgcattgccctacacg360gcaccacaccgtgttttggccaccgtttacaacgggaactgcaaatacaccgggggccca420ctgcccaacgtgagaggcgatctccaagtgttggcgccgaaggcggcgaggccgctgcct480acttctttcaactacggtgccatcaaagccactcgggtgacagaactgctgtaccgcatg540aagagggccgagacgtactgtcctcggcccctattgactgtccacccgagtgaggctaga600cacaaacagaaaatagtggcacctgtgaaacagtccttg639<210>7<211>220<212>prt<213>口蹄疫病毒(foot-and-mouthdiseasevirus)<400>7glyilepheprovalalacysseraspglytyrglyglyleuvalthr151015thraspprolysthralaaspprovaltyrglylysvalpheasnpro202530proargasnmetleuproglyargphethrasnleuleuaspvalala354045glualacysprothrpheleuhispheaspglyglyvalprotyrval505560thrthrlysthraspseraspargvalleuthrglnpheaspleuser65707580leualaalalyshismetserasnthrpheleualaglyleualagln859095tyrtyrthrglntyrserglythrileasnleuhisphemetphethr100105110glyprothraspalaargalaargtyrmetilealatyralapropro115120125glymetgluproprolysthrproglualaalaalahiscysilehis130135140alaglutrpaspthrglyleuasnserlysphethrpheserilepro145150155160tyrleuseralaalaasptyralatyrthralaseraspalaalaglu165170175thrthrasnvalglnglytrpvalcysleupheglnilethrhisgly180185190lysalagluglyaspalaleuvalvalleualaseralaglylysasp195200205phegluleuargleuprovalaspalaargglngln210215220<210>8<211>660<212>dna<213>口蹄疫病毒(foot-and-mouthdiseasevirus)<400>8gggattttccctgtggcctgtagcgacggctatggcggcttggtgacaactgacccaaag60acggctgaccccgtttatggcaaagtcttcaaccctccccgcaacatgttgccggggcgg120ttcaccaacctcctggacgtggctgaggcttgtcccacgtttctgcactttgatggcggt180gtgccatatgtgaccacgaagacagactcggacagggtgctcacacagtttgacttgtct240ttggcagcaaaacacatgtcaaacaccttccttgcaggtcttgcccagtactatacgcaa300tacagcggcaccatcaacctgcacttcatgttcacaggtcccactgacgcgcgcgcacgt360tacatgattgcgtatgcccctccgggcatggagccacccaaaacacctgaggctgccgct420cactgcattcacgcagagtgggacacgggtctgaactcaaagttcaccttttccatcccc480tacctctcggctgctgattacgcgtacactgcgtctgacgctgctgagaccacaaatgtt540cagggatgggtctgcttatttcaaataacacacgggaaagctgaaggcgacgctcttgtc600gtgttggccagtgctggcaaggactttgagctgcgcctgcctgtggacgctcggcaacag660<210>9<211>213<212>prt<213>口蹄疫病毒(foot-and-mouthdiseasevirus)<400>9thrthrserthrglygluseralaaspprovalthralathrvalglu151015asntyrglyglygluthrglnileglnargarghishisthraspval202530serpheileleuaspargphevallysvalthrprolysglyproile354045asnvalleuaspleumetglnalaproprohisthrleuvalglyala505560leuleuargalaalathrtyrtyrphealaaspleugluvalalaval65707580lyshisgluglyaspleuthrtrpvalproasnglyalaprogluala859095alaleuaspasnthrthrasnprothralatyrhislysalaproleu100105110thrargleualaleuprotyrthralaprohisargvalleualathr115120125valtyrasnglyasncyslystyrthrglyglyproleuproasnval130135140argglyaspleuglnvalleualaprolysalaalaargproleupro145150155160thrserpheasntyrglyalailelysalathrargvalthrgluleu165170175leutyrargmetlysargalagluthrtyrcysproargproleuleu180185190thrvalhisproserglualaarghislysglnlysilevalalapro195200205valargglnserleu210<210>10<211>639<212>dna<213>口蹄疫病毒(foot-and-mouthdiseasevirus)<400>10accacttcgacaggcgagtccgctgaccccgtgactgccaccgttgagaactacggcggc60gagacacagatccagaggcgccaccacacagacgtctcatttatactggacagatttgtg120aaagtcacaccaaaaggcccaataaatgtactggacctgatgcaggcccccccccacact180ctagtaggggcgctcctccgcgctgccacttactatttcgctgacctagaggtggcagtg240aaacacgagggagaccttacctgggtgccaaacggcgcgcctgaagcagccttggacaac300accaccaacccaacggcgtaccataaggcgccgcttacccggctcgcattgccctacacg360gcaccacaccgtgttttggccaccgtttacaacgggaactgcaaatacaccgggggccca420ctgcccaacgtgagaggcgatctccaagtgttggcgccgaaggcggcgaggccgctgcct480acttctttcaactacggtgccatcaaagccactcgggtgacagaactgctgtaccgcatg540aagagggccgagacgtactgtcctcggcccctattgactgtccacccgagtgaggctaga600cacaaacagaaaatagtggcacctgtgcgccagtccttg639<210>11<211>393<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>11aataattttgtttaactttaagaaggagatatacatatgggcagcagccatcatcatcat60catcacggcagcggcctggtgccgcgcggcagcgctagcatgtcggactcagaagtcaat120caagaagctaagccagaggtcaagccagaagtcaagcctgagactcacatcaatttaaag180gtgtccgatggatcttcagagatcttcttcaagatcaaaaagaccactcctttaagaagg240ctgatggaagcgttcgctaaaagacagggtaaggaaatggactccttaagattcttgtac300gacggtattagaattcaagctgatcagacccctgaagatttggacatggaggataacgat360attattgaggctcacagagaacagattggtggt393当前第1页12