一种治疗川崎病心肌损伤的药物组合物及其应用的制作方法

本发明属于药物技术领域，具体涉及一种中药单体化合物治疗川崎病心肌损伤的配伍组合物，特别涉及丹参酮ⅱa和丹酚酸b配伍在制备治疗川崎病心肌损伤药物中的作用。

背景技术：

川崎病(kawasakidisease,kd)是一种急性系统性自身免疫性血管炎，以中小血管炎症和心肌损伤为主，东北亚地区的青少年发病率较高，特别是5岁以下婴幼儿。近年来随着kd发病率的显著升高，其已经成为导致婴幼儿后天性心脏病的重要原因之一。心肌损伤为kd的主要并发症之一，有数据显示50～70％的kd患儿急性期会出现心肌炎，进而引发心肌损伤，但学者对kd诱发的心肌损伤及相关作用机理研究较少，临床上针对kd引起心肌损伤的治疗方法及用药也十分有限。

临床上西医多采用口服阿司匹林、静注丙种球蛋白及口服糖皮质激素等控制kd的炎症，降低其并发症的风险。阿司匹林与丙种球蛋白是治疗kd的常用药物组合，阿司匹林具有解热镇痛的功效，能有效抑制小儿病患体内的炎症反应，同时还具有抗血小板凝聚，预防血栓形成的作用，可以在一定程度上降低kd患儿心肌损伤和心梗等疾病的风险。丙种球蛋白内包含各种抗体，可以加强患儿机体抵抗力，抑制炎症扩散，降低机体炎症因子水平，调节机体菌落平衡，可以控制病情发展，对kd患儿有很好的免疫保护作用。但kd患儿口服阿司匹林易导致消化道出血或reye综合症等，而应用丙种球蛋白费用高昂，且10-15％患儿出现耐药，这是目前治疗kd的瓶颈。综上，目前还没有文献报道针对儿童kd引起的心肌损伤的药物研究及开发。因此，探寻防治kd心肌损伤的药物具有重要临床意义。

中医基础理论把kd归属到“温病”范畴，也有学者认为应属于“疫疹”或“斑疹”范畴。近现代众多中医学家从临床诊治kd，认为其自始至终存在着血瘀病机，所以中医药在治疗kd时，“活血化瘀”贯穿治疗的始终，这对于预防和治疗kd有着积极的指导作用。所以临床上，把丹参、赤芍、川芎、三七、桃仁和红花等具有活血化瘀功效的药物应用到治疗kd的方药当中。本研究根据中医药治疗kd临床疗效的系统评价及meta分析中的212篇文献，对处方中出现具有“活血化瘀”功效的众多中药进行排序，从中筛选出应用频率最高的丹参，作为探寻防治kd药物的研究对象。

丹参，为唇形科鼠尾草植物丹参salviamiltiorrhizbunge的干燥根及根茎，是最常用的活血化瘀中药之一，首载于《神农本草经》，被列为草部上品。其味苦，性微寒，入心、肝经，具有活血调经、祛瘀止痛、凉血消痈、清心除烦和养血安神的功效。古有“一味丹参，功同四物”的说法：补血生血，功过当归和地黄；调血敛血，力堪芍药；逐瘀生新，性倍川芎。现代医学研究表明，丹参主要化学成分为脂溶性的二萜醌类化合物和水溶性的酚酸类化合物，可有效改善血液流变学指标、降低血液黏稠度、降低血浆纤维蛋白原、抑制血小板聚集和活化、防治血栓形成和改善微循环等。

丹参酮ⅱa为丹参中脂溶性成分之一，已广泛应用于成人心脑血管疾病的治疗。丹参酮ⅱa含有邻醌结构，此化合物易被还原为二酚类衍生物，并进一步被氧化为醌。丹参酮ⅱa具有抗炎、抗血小板聚集、抗氧化、保护心肌细胞和改善冠状动脉循环等多方面的作用。可以在一定程度上降低kd患儿血清炎性细胞因子的表达，进而减轻炎症反应。目前临床也有丹参酮ⅱa治疗kd的观察研究。

丹酚酸b是丹参水溶性成分之一，含量高且生物活性极强。多项基础研究表明丹酚酸b可通过减少内皮细胞释放血浆血栓素、内皮素和no，提高内皮细胞和心肌细胞的存活率。丹酚酸b还可通过提高超氧化物歧化酶(sod)活性，以及降低乳酸脱氢酶(ldk)活性等来达到保护血管内皮的作用。既往研究还发现丹酚酸b通过降低组织氧化应激水平，对抗心梗和缺血再灌注造成的心肌损伤并抑制动脉粥样硬化板块的形成。有文献报道丹酚酸b有改善糖尿病模型小鼠诱发的心肌损伤的作用，其作用机制可能是丹酚酸b通过激活沉默调节蛋白1的表达，降低糖尿病小鼠心肌组织凋亡和氧化应激水平，从而减轻其心肌细胞损伤，发挥心肌保护作用。另外有学者研究丹酚酸b对脓毒症大鼠的心肌损伤有保护作用，其作用机制可能是通过影响自噬蛋白，降低脓毒症大鼠的氧化应激，抑制心肌细胞凋亡，从而减轻其心肌损伤。上述两种心肌损伤均可能是丹酚酸b通过调节相关氧化应激通路发挥治疗作用的，而丹酚酸b调节kd心肌损伤的作用机制可能与炎性更为相关。

技术实现要素：

kd患儿发生心肌损伤的发病机制也存在众多学说。目前比较公认的观点，kd在急性期系统性免疫存在明显的激活状态，使免疫系统失衡，kd患儿可出现冠脉、心肌、心包及心内膜等广泛炎性病变，引起心肌缺血缺氧，细胞内酸性物质堆积，导致心肌细胞能量代谢障碍，并且与扩竞争结合肌钙蛋白，破坏兴奋收缩偶联机制，导致心肌损伤。首先，由于免疫源性损伤，近年来研究发现某些细胞因子及细胞间黏附分子、某些炎性介质的介导及基因的多变性也与该病发生发展有相关联系。成人心肌损伤的致病机理也是众说纷纭，而kd的主要患者是儿童，儿童的代谢系统，尤其是肝脏功能发育不完善，目前还没有相关报道研究kd患儿的心肌损伤的发病机理与成人发病机理的相关性。

从组织病理学角度，kd心肌损伤的实质是指心肌细胞的水肿、变性、坏死，肌原纤维断裂和溶解等引起的炎性病变，严重的心肌损伤可导致心肌炎和心力衰竭。儿童的心肌结构和功能尚未成熟，心肌的代偿能力较成人差，故心肌损伤的发病率较高。心肌损伤引起心肌梗死的报道也屡见不鲜，诊断面临严重挑战。心肌损伤导致心肌细胞充血水肿、变性甚至细胞凋亡，从而引起相关生物标志物的血清水平改变。临床上诊断kd心肌损伤的常用生化指标包括血清肌酸激酶、血清肌酸激酶同工酶、血清α-羟丁酸脱氢酶、血清谷草转氨酶、tnf-α、il-6和il-1β等。本发明的治疗用途，是通过具体实验检测上述生化指标证明的。

本发明所要解决的问题，就是提出丹参酮ⅱa和丹酚酸b配伍组合制备治疗一种川崎病心肌损伤的药物中的应用，本发明通过探索丹参酮ⅱa和丹酚酸b配伍组合物，是否能改善或治疗小鼠腹腔注射10％牛血清白蛋白造成的kd心肌损伤模型，从而确定治疗kd心肌损伤的丹参酮ⅱa和丹酚酸b配伍组合物。

本发明的技术方案如下：一种治疗川崎病心肌损伤的药物组合物，包括丹参酮ⅱa和丹酚酸b，所述丹参酮ⅱa和丹酚酸b以重量比1:10～10:1的比例混合。

优选地，上述的一种治疗川崎病心肌损伤的药物组合物，所述丹参酮ⅱa和丹酚酸b的重量比1:5。

优选地，上述的一种治疗川崎病心肌损伤的药物组合物，所述丹参酮ⅱa的纯度≥98％；所述丹酚酸b的纯度≥98％。

上述的一种治疗川崎病心肌损伤的药物组合物在预防或治疗心肌损伤疾病中的应用。

优选地，上述的应用，所述的心肌损伤是川崎病引起的心肌损伤。

本发明涉及的丹参酮iia和丹酚酸b可以从市场上买到，也可以按照现有技术从中药丹参中制备。

本发明的有益效果：目前国内外还没有疗效确切的治疗kd心肌损伤的药物。当kd患儿出现心肌损伤时，主要靠磷酸肌酸钠、维生素c、复合辅酶、左卡尼汀等西药控制症状，效果不佳且副作用较大，有些患儿会出现耐药性，从而使丙种球蛋白无法应用。糖皮质激素使患儿的免疫功能降低，影响受损心肌细胞恢复及容易诱发心梗所致猝死；丙种球蛋白使血液黏稠度增加有助于血栓形成，从而加剧心肌损伤。丹参酮ⅱa和丹酚酸b两个化合物有着悠久的的药用历史，安全性高。根据丹参酮ⅱa和丹酚酸b的抗炎、抗氧化和抗心肌损伤等心血管疾病相关的生物活性，本研究将二者进行配伍组合，通过科学实验数据证明该组合物有助于预防及治疗kd心肌损伤病变。本发明配方配伍合理，针对kd患儿的心肌损伤，对症治疗，病理切片结果和生化指标均可以证明其可以显著抑制心肌损伤。同时成本低廉，易于制备kd患儿能接受的各种剂型。

附图说明

图1丹参酮ⅱa和丹酚酸b组合物对kd小鼠心肌组织形态的影响(he染色，×400)(a：空白组；b：模型组；c：阳性药组；d：丹参酮ⅱa+丹酚酸b(1:1)组；e：丹参酮ⅱa+丹酚酸b(1:5)组；f：丹参酮ⅱa+丹酚酸b(5:1)组。)

图2各组小鼠ck活性变化的差异(tan2a:丹参酮ⅱa；sanb:丹酚酸b)*p＜0.05，**p＜0.01和***p＜0.001，表示与空白组相比较；^#p＜0.05，^##p＜0.01和^###p＜0.001，表示与模型组相比较。(丹参酮ⅱa：tan2a；丹酚酸b：sanb)

图3各组小鼠ck-mb活性变化的差异(tan2a:丹参酮ⅱa；sanb:丹酚酸b)*p＜0.05，**p＜0.01和***p＜0.001，表示与空白组相比较；^#p＜0.05，^##p＜0.01和^###p＜0.001，表示与模型组相比较。

图4各组小鼠ldh活性变化的差异(tan2a:丹参酮ⅱa；sanb:丹酚酸b)*p＜0.05，**p＜0.01和***p＜0.001，表示与空白组相比较；^#p＜0.05，^##p＜0.01和^###p＜0.001，表示与模型组相比较。

图5各组小鼠α-hbdh活性变化的差异(tan2a:丹参酮ⅱa；sanb:丹酚酸b)*p＜0.05，**p＜0.01和***p＜0.001，表示与空白组相比较；^#p＜0.05，^##p＜0.01和^###p＜0.001，表示与模型组相比较。

图6各组小鼠ast活性变化的差异(tan2a:丹参酮ⅱa；sanb:丹酚酸b)*p＜0.05，**p＜0.01和***p＜0.001，表示与空白组相比较；^#p＜0.05，^##p＜0.01和^###p＜0.001，表示与模型组相比较。

图7各组小鼠tnf-α变化的差异(tan2a:丹参酮ⅱa；sanb:丹酚酸b)*p＜0.05，**p＜0.01和***p＜0.001，表示与空白组相比较；^#p＜0.05，^##p＜0.01和^###p＜0.001，表示与模型组相比较。

图8各组小鼠il-6变化的差异(tan2a:丹参酮ⅱa；sanb:丹酚酸b)*p＜0.05，**p＜0.01和***p＜0.001，表示与空白组相比较；^#p＜0.05，^##p＜0.01和^###p＜0.001，表示与模型组相比较。

图9各组小鼠il-1β变化的差异(tan2a:丹参酮ⅱa；sanb:丹酚酸b)*p＜0.05，**p＜0.01和***p＜0.001，表示与空白组相比较；^#p＜0.05，^##p＜0.01和^###p＜0.001，表示与模型组相比较。

具体实施方式

1.实验材料

1.1实验动物

5～6周龄，spf级雄性balb/c小鼠60只，体健，体重16～25克。随机分为6组，每组12只，分笼喂养，自主进食，状态良好，活动正常，温度(22±2)℃，湿度(45％～55％)，通风，12小时明暗光交替，适应性喂养观察一周。

1.2主要实验药品

1.3主要试剂

1.3.1elisa试剂盒的组成(以tnf-α为例)

(1)微孔酶标板：96孔1块(已包被抗小鼠tnf-α单抗)；(2)标准品：6瓶，0.3ml(浓度分别为640pg/ml、320pg/ml、160pg/ml、80pg/ml、40pg/ml、20pg/ml)；(3)空白对照：1瓶，1.0ml；(4)标准品稀释缓冲液：1瓶，5ml；(5)生物标记的抗tnf-α抗体：1瓶，6ml；(6)链霉亲和素-hrp：1瓶，10ml；(7)20×洗涤缓冲液：25ml；(8)样本稀释液：6ml；(9)底物a：6ml；(10)底物b：6ml；(11)终止液：6ml；(12)塑料膜板盖：1块。

1.3.2主要试剂的配制

10％牛血清白蛋白：以生理盐水为溶剂，每10g加100ml生理盐水，充分溶解，配制成为10％牛血清白蛋白，分装后-20℃保存。0.5％羟甲基纤维素钠：以生理盐水为溶剂，每0.5g加100ml生理盐水，生理盐水分3次加入，同时进行搅拌，配制成为0.5％羟甲基纤维素钠用于均匀混悬液。

2.实验方法

2.1实验动物饲养、分组及造模

将小鼠随机分成6组，分别为空白对照组、模型组、阳性药组、丹参酮ⅱa+丹酚酸b组(1:1)、丹参酮ⅱa+丹酚酸b组(1:5)、丹参酮ⅱa+丹酚酸b组(5:1)，每组10只。除空白对照组外，其余各组分别在第1、3、5、7、9、11天以腹腔注射2.5g/kg牛血清白蛋白的方法进行kd心肌损伤的造模，同时予空白对照组分别在第1、3、5、7、9、11天以生理盐水2.5g/kg腹腔注射，观察小鼠活动、食欲、反应等变化。

2.2动物给药

造模结束后进行各组给药。阳性药组阿司匹林分别制备成10mg/ml、1mg/ml，前3天以455mg/(kg·d)剂量灌胃，后7天以45.5mg/(kg·d)剂量灌胃，每日1次。分别应用0.5％的质量体积比的羟甲基纤维素钠水溶液，分别配置浓度均为1mg/ml的丹参酮ⅱa和丹酚酸b溶液，然后按照体积比配置组合物：丹参酮ⅱa+丹酚酸b组(1:1)、丹参酮ⅱa+丹酚酸b组(1:5)、丹参酮ⅱa+丹酚酸b组(5:1)。以上三组配伍组合物均按照40mg/(kg·d)剂量，分别灌胃给予实验小鼠10天，每日1次。空白对照组和模型组分别给予等量生理盐水灌胃10天，每日1次。

2.3标本采集

最后一次给药24h后，各组随机留下两只小鼠灌流取心脏组织用于制作组织病理he染色切片，各组剩余小鼠进行眼球取血。

心脏组织采集：用于组织病理学检查的各组小鼠腹腔注射10％水合氯醛麻醉，将小鼠仰卧位固定于无菌操作台上，以酒精消毒其胸腔处皮肤，以无菌专用器械进行操作，打开胸腔，将连接生理盐水的输液器针头刺入左心室，同时剪开右心耳，使血液流出，约10min后，观察小鼠肝脏变白后拔出针头，迅速摘取心脏，置于4％多聚甲醛溶液中固定12h。

血液采集：左手拇指、食指抓取小鼠的耳后及颈部皮肤，小指和无名指固定尾巴。轻压取血侧眼部皮肤，使眼球充血突出。用弯头镊子夹取眼球，根据需要捻转拇指和食指的方向，使血液从眼眶内以不同速度垂直流入ep管中。当血液滴入速度变慢时可轻按小鼠心脏部位，以加快心脏泵血速度从而获取更多的血液。取出的全血置于1.5ml离心管中，于4℃环境下静置过夜后，用离心机以3000r/min,10min离心所取的全部全血，离心后，取透明的上清液即血清于新的离心管中，置于-80℃环境下保存，用于检测血清中的各种指标。

2.4指标检测

2.4.1病理学检测

(1)冲洗：将固定好的组织用蒸馏水进行冲洗。(2)取材：取左室部分心肌组织及部分冠状动脉。

(3)脱水：采用乙醇脱水方法。依次使用体积分数为70％，80％，90％，95％的无水乙醇对小鼠心肌组织进行梯度脱水，每次脱水约30min。(4)透明：采用二甲苯进行透明。二甲苯ⅰ透明15min、二甲苯ⅱ透明15min。(5)浸蜡、石蜡包埋：将透明后的组织移入熔化的石蜡内浸渍，用石蜡包埋机进行包埋。(6)切片：用石蜡切片机对包埋后的组织进行切片，切片机切片厚度约为4μm。

(7)展片、贴片、烘片：在恒温水浴箱中进行展片，用载玻片捞起展开的切片于1/3处，载玻片插入切片架放入温箱中烘片。(8)脱蜡：从温箱中取出烤干的切片，使用二甲苯进行脱蜡。依次放入二甲苯ⅰ10min、二甲苯ⅱ10min。(9)水化：将切片依次放于100％乙醇ⅰ10min、100％乙醇ⅱ10min、95％乙醇5min、90％乙醇5min、80％乙醇3min、70％乙醇3min、蒸馏水5min。(10)染色：采用苏木精-伊红染色法。将切片依次放入苏木精溶液8min，自来水冲洗5min，1％盐酸乙醇分化15s，自来水冲洗至切片恢复蓝色，再依次放入70％乙醇3min，80％乙醇3min，90％乙醇5min，95％乙醇5min，0.5％伊红溶液5min，95％乙醇ⅰ5min，95％乙醇ⅰ5min，100％乙醇ⅱ5min，100％乙醇ⅱ5min。

(11)透明：将切片依次放入二甲苯ⅰ5min，二甲苯ⅱ5min。(12)封片：使用中性树胶进行封片。将中性树胶滴于载玻片组织上，将盖玻片从一侧缓慢盖下，防止出现气泡。(13)观察：使用显微镜观察小鼠冠状动脉及心肌组织形态。

2.4.2elisa检测

采用酶联免疫吸附实验(enzyme-linkedimmunosorbentassay，elisa)对各组小鼠血清中ck、ck-mb、ldh、α-hbdh、ast的活性以及tnf-α、il-6、il-1β水平进行测定，严格按照试剂盒说明书具体步骤进行操作(以tnf-α为例)。试剂配制：洗涤缓冲液：蒸馏水1:20稀释，即1份20×洗涤缓冲液加19份蒸馏水。

操作步骤：

(1)标准品的加样：设置6个标准品孔，分别加入不同浓度的标准品50μl；(浓度依次为640pg/ml、320pg/ml、160pg/ml、80pg/ml、40pg/ml、20pg/ml)

(2)加样：分别设空白孔、待测样品孔，空白孔不加样品及酶标试剂。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl(样品最终稀释度为5倍)。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。除空白孔外，标准品孔及样品孔每孔加入50μl生物素标记的tnf-α抗体；

(3)温育：用膜板盖封板后，轻轻震荡混匀，置于37℃温育1小时；

(4)洗涤：小心揭掉膜板盖，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，震荡30秒，弃去洗涤液，用吸水纸拍干，共重复3次；

(5)每孔加入80μl链霉亲和素-hrp，轻轻震荡混匀；

(6)温育：再次用膜板盖封板后置于37℃温育30分钟；

(7)洗涤：再次揭掉膜板盖，弃去液体甩干，每孔加满洗涤液，震荡30秒，弃去洗涤液，用吸水纸拍干，重复3次；

(8)显色：每孔先加入底物a、底物b各50μl，轻轻震荡混匀，于37℃避光显色10分钟；

(9)终止：取出酶标板，迅速于每孔加终止液50μl混匀，终止反应；

(10)测定：加终止液后15分钟以内以空白孔调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度(od值)。

(11)以所测标准品的od值为横坐标(x)，标准品的浓度值为纵坐标(y)，用相关软件绘制标准曲线，并得到直线回归方程，将样品的od值代入方程，计算出样品的浓度。

2.5统计学方法

采用spss25.0软件对各组实验结果进行处理分析，数据均用平均数±标准差(mean±sd)表示，多样本间比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用tukey法进行，p＜0.05表示具有显著性差异，p＜0.001表示具有极显著性差异，具有统计学意义。

3.实验结果

3.1小鼠一般状态

造模及治疗过程中，空白对照组小鼠活动度正常，对刺激反应灵敏，皮毛光泽度正常，进食及饮水量正常。小鼠腹腔注射牛血清白蛋白后活动明显减少，对刺激反应较差，皮毛较前紊乱，光泽度变差，进食及饮水量减少，小鼠眼球发红，鼻部及口周出现红肿表现。治疗过程中，模型组小鼠进食及饮水略增加，皮毛仍无光泽，各治疗组在治疗10天后，上述症状均出现明显改善。

3.2小鼠心脏组织形态学变化(he×400)

如图1中a-f所示，空白组，心肌纤维光滑完整，细胞排列整齐；与空白组相比，模型组小鼠心肌组织出现炎性细胞浸润，同时伴有大面积的心肌断裂；与模型组相比，阳性药组小鼠出现了局部心肌断裂，症状不明显；与模型组相比，丹参酮ⅱa+丹酚酸b(1:1)组小鼠偶见局部心肌断裂；与模型组相比，丹参酮ⅱa+丹酚酸b(1:5)组小鼠心肌组织基本无异常，结构排列有序、紧密，纤维断裂情况得到显著缓解；丹参酮ⅱa+丹酚酸b(5:1)组小鼠心肌断裂较为明显，几乎无改善。

3.3各组小鼠血清肌酸激酶(ck)活性

各组ck活性检测结果见图2，与空白对照组相比，模型组、阳性药组、丹参酮ⅱa+丹酚酸b组(1:1)、丹参酮ⅱa+丹酚酸b组(5:1)明显升高，差异均具有统计学意义(p＜0.05)，丹参酮ⅱa+丹酚酸b组(1:5)与空白对照组比较差异无统计学意义(p＞0.05)；与模型组相比，阳性药组、丹参酮ⅱa+丹酚酸b组(1:1)、丹参酮ⅱa+丹酚酸b组(1:5)、丹参酮ⅱa+丹酚酸b组(5:1)明显下降，差异均具有统计学意义(p＜0.05)；与阳性药组相比，丹参酮ⅱa+丹酚酸b组(1:5)显著下降，差异均具有统计学意义(p＜0.05)。

3.4各组小鼠血清肌酸激酶同工酶(ck-mb)活性

各组ck-mb活性检测结果图3，与空白对照组相比，模型组、丹参酮ⅱa+丹酚酸b组(1:1)、丹参酮ⅱa+丹酚酸b组(1:5)、丹参酮ⅱa+丹酚酸b组(5:1)明显升高，差异均具有统计学意义(p＜0.05)，阳性药组与空白对照组比较差异无统计学意义(p＞0.05)；与模型组相比，阳性药组、丹参酮ⅱa+丹酚酸b组(1:1)、丹参酮ⅱa+丹酚酸b组(1:5)明显下降，差异均具有统计学意义(p＜0.05)，丹参酮ⅱa+丹酚酸b组(5:1)与模型组比较差异无统计学意义(p＞0.05)；与阳性药组相比，丹参酮ⅱa+丹酚酸b组(1:1)、丹参酮ⅱa+丹酚酸b组(1:5)、丹参酮ⅱa+丹酚酸b组(5:1)差异均无统计学意义(p＞0.05)。

3.5各组小鼠血清乳酸脱氢酶(ldh)活性

各组ldh活性检测结果图4，与空白对照组相比，模型组明显升高，差异均具有统计学意义(p＜0.05)，阳性药组、丹参酮ⅱa+丹酚酸b组(1:1)、丹参酮ⅱa+丹酚酸b组(1:5)、丹参酮ⅱa+丹酚酸b组(5:1)与空白对照组比较差异均无统计学意义(p＞0.05)；与模型组相比，阳性药组、丹参酮ⅱa+丹酚酸b组(1:1)、丹参酮ⅱa+丹酚酸b组(1:5)、丹参酮ⅱa+丹酚酸b组(5:1)明显下降，差异均具有统计学意义(p＜0.05)；与阳性药组相比，丹参酮ⅱa+丹酚酸b组(1:1)、丹参酮ⅱa+丹酚酸b组(1:5)、丹参酮ⅱa+丹酚酸b组(5:1)差异均无统计学意义(p＞0.05)。

3.6各组小鼠血清α-羟丁酸脱氢酶(α-hbdh)活性

各组α-hbdh活性检测结果见图5，与空白对照组相比，模型组明显升高，差异均具有统计学意义(p＜0.05)，阳性药组、丹参酮ⅱa+丹酚酸b组(1:1)、丹参酮ⅱa+丹酚酸b组(1:5)、丹参酮ⅱa+丹酚酸b组(5:1)与空白对照组比较差异均无统计学意义(p＞0.05)；与模型组相比，阳性药组、丹参酮ⅱa+丹酚酸b组(1:1)、丹参酮ⅱa+丹酚酸b组(1:5)、丹参酮ⅱa+丹酚酸b组(5:1)明显下降，差异具有统计学意义(p＜0.05)；与阳性药组相比，丹参酮ⅱa+丹酚酸b组(1:1)、丹参酮ⅱa+丹酚酸b组(1:5)、丹参酮ⅱa+丹酚酸b组(5:1)差异均无统计学意义(p＞0.05)

3.7各组小鼠血清谷草转氨酶(ast)

各组ast活性检测结果见图6，与空白对照组相比，模型组、阳性药组、丹参酮ⅱa+丹酚酸b组(1:1)、丹参酮ⅱa+丹酚酸b组(5:1)明显升高，差异均具有统计学意义(p＜0.05)，丹参酮ⅱa+丹酚酸b组(1:5)与空白对照组比较差异无统计学意义(p＞0.05)；与模型组相比，阳性药组、丹参酮ⅱa+丹酚酸b组(1:1)、丹参酮ⅱa+丹酚酸b组(1:5)明显下降，差异均具有统计学意义(p＜0.05)，丹参酮ⅱa+丹酚酸b组(5:1)与模型组比较差异无统计学意义(p＞0.05)；与阳性药组相比，丹参酮ⅱa+丹酚酸b组(1:5)明显下降，差异具有统计学意义(p＜0.05)。

3.8各组小鼠血清肿瘤坏死因子α(tnf-α)水平

各组tnf-α水平检测结果见图7，与空白对照组相比，模型组、丹参酮ⅱa+丹酚酸b组(1:1)、丹参酮ⅱa+丹酚酸b组(5:1)水平较高，差异均具有统计学意义(p＜0.05)，阳性药组、丹参酮ⅱa+丹酚酸b组(1:5)与空白对照组比较差异无统计学意义(p＞0.05)；与模型组相比，阳性药组、丹参酮ⅱa+丹酚酸b组(1:5)水平较低，差异均具有统计学意义(p＜0.05)，丹参酮ⅱa+丹酚酸b组(1:1)、丹参酮ⅱa+丹酚酸b组(5:1)与模型组比较差异无统计学意义(p＞0.05)；与阳性药组相比，丹参酮ⅱa+丹酚酸b组(1:1)、丹参酮ⅱa+丹酚酸b组(1:5)、丹参酮ⅱa+丹酚酸b组(5:1)差异无统计学意义(p＞0.05)。

3.9各组小鼠白细胞介素6(il-6)水平

各组il-6水平检测结果图8，与空白对照组相比，模型组、丹参酮ⅱa+丹酚酸b组(1:1)、丹参酮ⅱa+丹酚酸b组(1:5)、丹参酮ⅱa+丹酚酸b组(5:1)水平较高，差异均具有统计学意义(p＜0.05)，而阳性药组与空白对照组比较差异无统计学意义(p＞0.05)；与模型组相比，阳性药组、丹参酮ⅱa+丹酚酸b组(1:5)、丹参酮ⅱa+丹酚酸b组(5:1)水平较低，差异均具有统计学意义(p＜0.05)，丹参酮ⅱa+丹酚酸b组(1:1)与模型组比较差异无统计学意义(p＞0.05)；与阳性药组相比，丹参酮ⅱa+丹酚酸b组(1:1)、丹参酮ⅱa+丹酚酸b组(5:1)水平较高，差异具有统计学意义(p＜0.05)，丹参酮ⅱa+丹酚酸b组(1:5)与阳性药组相比较差异无统计学意义(p＞0.05)。

3.10各组小鼠白细胞介素1β(il-1β)水平

各组il-1β水平检测结果见图9，与空白对照组相比，模型组、丹参酮ⅱa+丹酚酸b组(1:1)、丹参酮ⅱa+丹酚酸b组(1:5)、丹参酮ⅱa+丹酚酸b组(5:1)水平较高，差异均具有统计学意义(p＜0.05)，阳性药组与空白对照组比较差异无统计学意义(p＞0.05)；与模型组相比，阳性药组、丹参酮ⅱa+丹酚酸b组(1:5)、丹参酮ⅱa+丹酚酸b组(5:1)水平较低，差异均具有统计学意义(p＜0.05)，丹参酮ⅱa+丹酚酸b组(1:1)与模型组比较差异无统计学意义(p＞0.05)；与阳性药组相比，丹参酮ⅱa+丹酚酸b组(1:1)、丹参酮ⅱa+丹酚酸b组(5:1)水平较高，差异具有统计学意义(p＜0.05)，丹参酮ⅱa+丹酚酸b组(1:5)与阳性药组比较差异无统计学意义(p＞0.05)。

4.结论

4.1心肌酶

心肌酶是临床上评价患者心肌受损程度较为重要的证据，常见检测指标包括肌酸激酶(ck)、肌酸激酶同工酶(ck-mb)、乳酸脱氢酶(ldh)、a-羟丁酸脱氢酶(α-hbdh)、血清谷草转氨酶(ast)等。上述心肌酶类主要分布于骨骼肌、心肌和平滑肌等。肌肉的病变可导致诸多心肌酶活性的增强，特别是炎症性肌病，通常被用作判断心肌及骨骼肌疾病的指标。因此，血清中心肌酶的增加，通常表明含ck的组织细胞的通透性增加或细胞破坏，特别是肌纤维的膜通透性异常或受损的可能性，因其多存在于心肌细胞中，能够代表心肌细胞的受损程度。实验结果显示，与模型组和阳性药组相比，丹参酮ⅱa+丹酚酸b组(1:5)配伍组合物，均能使ck、ck-mb、ldh、α-hbdh和ast的活性显著下降，差异具有统计学意义(p＜0.05)，提示丹参酮ⅱa+丹酚酸b组(1:5)配伍组合物能够下调心肌酶谱活性，显著改善kd小鼠心肌组织的损伤情况。

4.2tnf-α、il-6和il-1β

tnf-α是一种主要由活化的巨噬细胞分泌的一种多效性炎症细胞因子，在机体防御、感染和免疫反应中起着重要作用。在健康个体中，通常无法检测到tnf-α，而在感染和炎性条件下可检测到该蛋白在血清和组织水平中的升高，感染的严重程度与tnf-α血清水平相关。tnf-α参与多种心血管疾病的病理生理过程，如心肌梗塞、心力衰竭等，同时也被证明是能够诱发儿童kd的一种重要的细胞因子，其水平在kd的急性期显著增加。

il-6和il-1β均为具有功能性、多效性的典型细胞因子，对炎症、免疫反应、造血功能等均有作用。感染或组织损伤发生时，单核细胞和巨噬细胞通过刺激模式识别受体立即产生il-6和il-1β等，并通过激活急性期和免疫反应，有助去除感染源并恢复受损组织。有研究同样证实了il-6水平在kd急性期显著增加，特别是在不完全性kd或ivig抗性的kd患者中其水平明显升高，认为il-6水平可能是预测kd和ivig抗性kd患者的候选生物标志物。

本实验结果显示模型组小鼠的tnf-α、il-6、il-1β水平均较空白对照组高，提示kd小鼠心肌损伤的发病机制可能与这三种炎症因子有关，而给予丹参酮ⅱa+丹酚酸b组(1:5)配伍组合物后，tnf-α、il-6和il-1β水平均显著低于模型组，差异均具有统计学意义(p＜0.05)。特别是心肌组织病理切片结果提示，心肌断裂程度较模型组比明显减轻，提示丹参酮ⅱa+丹酚酸b组(1:5)配伍组合物治疗kd小鼠心肌损伤的机制，可能与下调tnf-α、il-6、il-1β水平有关。