一种硫化砷-四氧化三铁偶联纳米复合体及其制备方法与流程

本发明涉及抗癌纳米制剂领域，尤其涉及一种硫化砷-四氧化三铁偶联纳米复合体。

背景技术：

近年来发现作为治疗急性早幼粒细胞白血病的一线治疗药物三氧化二砷和硫化砷能够促进放化疗对实体肿瘤的治疗疗效，抑制肿瘤的复发和耐药。硫化砷由于相对较低的毒副作用常作为三氧化二砷的替代品，更常被应用。然而由于硫化砷较低的水溶性和生物利用度，限制了硫化砷对实体肿瘤的治疗应用。因此，为了解决克服硫化砷的缺点，已陆续开发出了多种能够增加硫化砷水溶性的纳米试剂，越来越多的研究表明硫化砷纳米试剂对实体肿瘤的治疗具有更好的疗效及更低的毒副作用。在《arsenictrioxideenhancesthecytotoxiceffectofcisplatininheadandnecksquamouscellcarcinomacelllines》中研究发现三氧化二砷、硫化砷等砷剂能够通过促进细胞内ros(活性氧簇)的生成促进肿瘤细胞凋亡，并促进肿瘤细胞对放化疗的敏感性。

顺铂(cisplatin)是金属铂类络合物，属于细胞周期非特异性抗肿瘤药，可破坏dna，抑制肿瘤生长，具有抗菌谱广、对乏氧细胞有效的特点。它可用于小细胞及非小细胞肺癌、睾丸癌、卵巢癌、宫颈癌、子宫内膜癌、前列腺癌、膀胱癌、黑色素瘤、肉瘤、头颈部肿瘤及各种鳞状上皮癌和恶性淋巴瘤的治疗。然而顺铂容易产生耐药性，导致肿瘤的复发和不良反应。另外肿瘤化疗治疗过程中cyclind1(g1/s-特异性周期蛋白-d1),yap等肿瘤耐药相关基因的在肿瘤细胞中的上调是肿瘤细胞耐药的重要分子机制，并且硫化砷纳米颗粒可以特异降解cyclind1和yap，从而促进癌细胞对顺铂治疗的敏感性，促进药物诱导的肿瘤细胞凋亡，硫化砷纳米试剂可作为促进顺铂等化疗药物疗效的辅助药物，促进化疗的疗效，并逆转肿瘤的耐药和复发。同时，yap作为肿瘤干细相关转录因子也是肿瘤放疗耐受的重要调控基因。

四氧化三铁纳米颗粒可通过促进肿瘤组织中的巨噬细胞向th1类炎症性巨噬细胞极化，并通过与巨噬细胞释放的h2o2相互作用，促进细胞的铁死亡，从而肿瘤生长和转移。四氧化三铁纳米颗粒中的铁离子能够通过与由顺铂诱导肿瘤细胞内生成的h2o2相互作用，促进肿瘤细胞内的芬顿反应，促进细胞内ros的产生,从而显著提高四氧化三铁纳米颗粒对肿瘤细胞的铁死亡诱导能力，抑制肿瘤的生长及转移，提高抗肿瘤效果。芬顿反应如图1所示。

因此发明人在此基础上，研发了一种硫化砷-四氧化三铁偶联纳米复合体，进一步通过芬顿反应促进肿瘤细胞的铁死亡及细胞内ros的生成，增加顺铂及放疗的疗效，并通过对cyclind1，yap的特异性降解抑制实体肿瘤的耐药和复发，其对实体肿瘤的生长及侵袭转移的抑制作用显著高于单一硫化砷或四氧化三铁纳米剂型。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是提供一种能够特异性降解cyclind1，yap，具有强效抗肿瘤效果的硫化砷-四氧化三铁偶联纳米复合体。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：

一种硫化砷-四氧化三铁偶联纳米复合体，其特征在于：由谷胱甘肽-硫化砷纳米颗粒与二巯基丁二酸-四氧化三铁纳米颗粒之间通过羧基和氨基反应形成酰胺键连接。

优选地，所述硫化砷-四氧化三铁偶联纳米复合体的量子点尺寸为7-10nm，水合粒径为59.96nm，表面zeta电位为-24mv。

硫化砷-四氧化三铁偶联纳米复合体的制备方法，所述谷胱甘肽-硫化砷纳米颗粒和所述二巯基丁二酸-四氧化三铁纳米颗粒在催化剂的催化作用下得到所述硫化砷-四氧化三铁偶联纳米复合体。

优选地，所述催化剂为二氯乙烷或nhs。

优选地，所述谷胱甘肽-硫化砷纳米颗粒的制备方法包括以下步骤：将谷胱甘肽与饱和硫化砷母液混合均匀，调节ph并搅拌，得到谷胱甘肽修饰的硫化砷纳米颗粒。

优选地，将共沉淀法合成的四氧化三铁粉末溶解于二巯基丁二酸溶液中，混合，振荡，孵育，离心洗涤后重新溶解，得到所述二巯基丁二酸-四氧化三铁纳米颗粒。

优选地，所述四氧化三铁粉末溶解于二巯基丁二酸溶液中后，混合振荡12h，并持续孵育24h，超纯水离心洗涤三次后，用超纯水溶解，得到所述二巯基丁二酸-四氧化三铁纳米颗粒。

优选地，所述四氧化三铁粉末的共沉淀法合成法包括以下步骤：取适量双蒸水全程搅拌并通氩气，先通氩气除氧，加入fecl3·6h2o和feso4·7h2o，继续搅拌，水浴加热到60℃，缓慢滴加浓氨水，调节溶液的ph值，使溶液迅速由橙红色变为黑色，继续搅拌反应，后升高到80℃并停止搅拌，陈化后停止通氩气，洗涤多次，得到所述四氧化三铁粉末。

优选地，硫化砷-四氧化三铁偶联纳米复合体在制备用于治疗癌症的试剂盒或药物方面的用途。

优选地，硫化砷-四氧化三铁偶联纳米复合体和顺铂的组合在制备用于治疗癌症的试剂盒或药物方面的用途。

与现有技术相比，本发明的优点在于硫化砷-四氧化三铁偶联纳米复合体具有低毒性，低耐药性，具有强效的抗肿瘤疗效，对实体肿瘤的生长及侵袭转移的抑制作用强大；与顺铂或放疗联合用药可大幅增加顺铂及放疗的疗效；并且制备简单，对人体危害小。

附图说明

图1为铁离子的芬顿反应。

图2为实施例中硫化砷-四氧化三铁偶联纳米复合体的结构示意图。

图3为实施例中硫化砷纳米颗粒的结构示意图。

图4为实施例中四氧化三铁纳米颗粒的结构示意图。

图5为实施例中硫化砷-四氧化三铁偶联纳米复合体的量子点透射电镜图。

图6为实施例中硫化纳米颗粒的量子点透射电镜图。

图7为实施例中硫化砷-四氧化三铁偶联纳米复合体水溶液的纳米颗粒尺寸分布示意图。

图8为实施例中硫化砷-四氧化三铁偶联纳米复合体水溶液的zeta电位分布示意图。

图9为实施例中细胞ros检测实验示意图

图10为实施例中细胞凋亡染色实验示意图。

图11为实施例中细胞凋亡染色实验中各组癌细胞的早期凋亡细胞百分比对比图。

图12为实施例中细胞穿孔实验细胞染色示意图。

图13为实施例中细胞穿孔实验中各组癌细胞穿孔细胞数量统计。

图14为实施例中各组裸鼠皮下移植瘤实验的移植瘤的生长曲线示意图。

图15为实施例中第28天各组裸鼠移植肿瘤的尺寸(p＜0.05)。

图16为实施例中第28天各组裸鼠未解剖前移植肿瘤的尺寸对比图。

图17为实施例中第28天各组裸鼠解剖前移植肿瘤的尺寸对比图。

具体实施方式

以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。

本发明的一种硫化砷-四氧化三铁偶联纳米复合体(afcnc)，由硫化砷纳米颗粒与四氧化三铁纳米颗粒之间通过羧基和氨基反应形成酰胺键连接，其结构示意图如图2所示。其中，硫化砷纳米颗粒为谷胱甘肽-硫化砷纳米颗粒，其结构示意图为图3所示。四氧化三铁纳米颗粒为二巯基丁二酸-四氧化三铁纳米颗粒，其结构示意图为图4所示。

本发明的硫化砷-四氧化三铁偶联纳米复合体的量子点电镜图如图5所示，量子点尺寸约为7-10nm，相比于如图6所示的硫化砷纳米颗粒的量子点为1-2nm。硫化砷-四氧化三铁偶联纳米复合体中硫化砷与四氧化三铁纳米颗粒分布均匀，结合紧密，不易分解。

本发明的硫化砷-四氧化三铁偶联纳米复合体配制而成的1mg/ml水溶液，测量其水合粒径和表面zeta电位如图7和图8所示，结果表明，其水合粒径约为59.96nm，表面zeta电位为-24mv，表明其水溶液体系稳定，非常容易被人体吸收。

本发明的硫化砷-四氧化三铁偶联纳米复合体的制备过程如下：

1、硫化砷纳米颗粒合成

1.1粗硫化砷粉末提纯精制

称取30g的粗硫化砷粉末浸泡至0.2mol/l的稀盐酸，浸泡12h，随后用蒸馏水将其冲洗至中性，抽滤，弃滤液，将所得的滤渣置于烘干箱烘干，即得精制硫化砷粉末。

1.2硫化砷母液的制备

称取16gna2s粉末溶于100ml的蒸馏水中，配置饱和na2s溶液。将上述精制硫化砷粉末置于饱和na2s溶液中，在温度为35℃下，使用恒温磁力搅拌器搅拌直至反应完全后，用蒸馏水冲洗，调节ph至7～8，抽滤，弃渣，得澄清的黄绿色硫化砷母液，置于棕色瓶中避光保存。

1.3硫化砷纳米颗粒的制备

称取一定量的谷胱甘肽(gsh)溶于适量的超纯水，配制5mol/l的谷胱甘肽溶液，其中谷胱甘肽的结构式为取50ml谷胱甘肽溶液与上述30ml硫化砷母液混合均匀，调节ph至7～8，置于37℃磁力搅拌生长3天，得到谷胱甘肽修饰的硫化砷纳米颗粒。该谷胱甘肽修饰的硫化砷纳米颗粒具有刺鼻的气味需在去离子水中透析3天，4℃冰箱保存。

2、共沉淀法合成fe3o4纳米颗粒

2.120ml双蒸水以500r/min全程搅拌并通氩气，先通氩气除氧约20～30min，加入4mmolfecl3·6h2o和2.4mmolfeso4·7h2o，继续搅拌10min，水浴加热到60℃，缓慢滴加2.5ml浓氨水，调节溶液的ph值在9～10之间，溶液迅速由橙红色变为黑色，继续搅拌反应30min后升高到80℃并停止搅拌，陈化30min后停止通氩气。反应结束后，采用乙醇和超纯水洗涤多次，得到四氧化三铁粉末。

2.2将上述共沉淀法的四氧化三铁粉末15mg溶解于10ml2mg/ml二巯基丁二酸溶液中，混合振荡12h，并持续孵育24h，最后用超纯水离心洗涤三次后，用超纯水溶解，得到dmsa修饰的fe3o4纳米颗粒。其中二巯基丁二酸的结构式为

3、硫化砷-四氧化三铁偶联纳米复合体

3.1取上述10mgdmsa修饰的四氧化三铁纳米颗粒用pbs缓冲液调节ph至6.0，然后加入20mg谷胱甘肽修饰的硫化砷纳米颗粒，孵育30min后加入10mgedc(二氯乙烷)，室温反应24h，最后采用磁分离去除未结合的硫化砷纳米颗粒，得到硫化砷-四氧化三铁偶联纳米复合体。

综上，四氧化三铁纳米颗粒中的二巯基丁二酸与硫化砷纳米颗粒中的谷胱甘肽在edc/nhs的催化作用下形成酰胺键，其反应式如下：

硫化砷-四氧化三铁偶联纳米复合体的验证实验

下述验证实验的肿瘤细胞采用kyse-30癌细胞和kyse-450癌细胞，所采用的硫化砷纳米颗粒、四氧化三铁纳米颗粒、硫化砷-四氧化三铁偶联纳米复合体均为本发明中的制备方法制备而成的。

1、细胞ros检测实验

取4组1×105的kyse-450癌细胞，分别加入无药物、四氧化三铁纳米颗粒、硫化砷纳米颗粒、afcnc纳米颗粒处理12h，作为对照组、四氧化三铁组、硫化砷组、afcnc组。然后上述4组癌细胞均加入10μm的dcfh-da，孵育30分钟后pbs洗3遍，然后置于荧光显微镜下观察，实验结果如图9所示。

图9中的荧光强度和癌细胞产生的活性氧自由基浓度成正比，从图中可看出荧光强度afcnc组最强，四氧化三铁组和硫化砷组次之且强度相似，对照组最弱。

综上，硫化砷-四氧化三铁偶联纳米复合体能够有效诱导癌细胞产生大量的活性氧自由基，并且强于四氧化三铁纳米颗粒和硫化砷纳米颗粒。

2、细胞凋亡实验：

取4组1×10⁵的kyse-30癌细胞，并且分别加入顺铂，顺铂和硫化砷纳米颗粒，顺铂和四氧化三铁纳米颗粒，顺铂和硫化砷-四氧化三铁偶联纳米复合体，作为顺铂单独给药组、顺铂与硫化砷纳米颗粒联合给药组，顺铂与四氧化三铁纳米颗粒联合给药组，顺铂与afcnc联合给药组。上述4组使用相应药物处理后12h后，用0.25％胰酶消化细胞，并悬浮于3mlanaxinv结合缓冲液中，加入1μlfitc-anaxinv孵育20min，然后加入1μlpi孵育5min。上样，使用beckman流式分析仪分析细胞凋亡，结果如图10所示，并计算凋亡细胞百分比，结果如图11所示。

图10中横坐标代表流式分析中捕获细胞的fitc-anaxinv染色的信号强度，纵坐标为pi染色的信号强度，捕获窗口中的信号点代表fitc染色阳性pi染色阴性的早期凋亡细胞。如图10和图11可知，各组的早期凋亡率分别为顺铂单独给药组19.3％，顺铂与硫化砷纳米颗粒联合给药组40.5％，顺铂与四氧化三铁纳米颗粒联合给药组39.2％，顺铂与afcnc联合给药组69.3％。

综上，硫化砷-四氧化三铁偶联纳米复合体对促进顺铂诱导癌细胞的早期凋亡的能力显著强于硫化砷纳米颗粒和四氧化三铁纳米颗粒，能够使近70％的癌细胞凋亡。

3、细胞穿孔实验：

取24孔细胞穿孔板，选取其中4孔，分别分别作为对照组(即ctrl)，转录激活突变型yap5sa过表达组，yap5sa加verteporfin(维替泊芬，yap抑制剂)组，yap5sa加afcnc组。其中4个组的孔内分别铺30％的matri基底胶80μl，均加入kyse-450癌细胞浓度为1×10³/μl的无血清培养基100μl。然后对照组内不加入药物，其余3组孔内分别加入yap5sa，yap5sa和verteporfin，yap5sa和硫化砷-四氧化三铁偶联纳米复合体。最后4组孔内的下孔中分别加入600μl含20％fbs的细胞培养基，37℃孵育6h，取出细胞穿孔槽，用面签除去matri胶，用giemsa染色液染色，在×100放大倍数显微镜下拍照观察，结果如图12，并统计各组穿孔细胞数量，如图13所示。

通过光学细胞计数分析图12，染色细胞为癌细胞，即图中的阴影面积。结合图12和图13所示，上述4组的细胞癌细胞数量为：，yap5sa加afcnc组≈yap5sa加verteporfin组＜对照组＜转录激活突变型yap5sa过表达组。

综上，yap5sa过表达显著增加了癌细胞的侵袭转移能力，而加入yap抑制剂verteporfin或硫化砷-四氧化三铁偶联纳米复合体能够显著抑制yap5sa过表达对癌细胞侵袭转移能力的促进作用，并且硫化砷-四氧化三铁偶联纳米复合体对肿瘤的抑制效果与verteporfin相近。

4、裸鼠细胞移植瘤模型

取25只5周龄的雌性balb-cnu/nu裸小鼠，每只均皮下注射3×10⁵kyse-450癌细胞,定期测量每只裸小鼠的移植瘤直径，其平均体积超过100cm³开始进行不同治疗方案。

将上述的25只裸小鼠分为5组，分别为对照组，顺铂组，顺铂加afcnc组，放疗组，放疗加afcnc组，每组5只。其中对照组小鼠不进行药物治疗和放疗，放疗组和放疗加afcnc组中的小鼠使用sarrp小动物辐照仪按照5gy/只小鼠的剂量辐射，顺铂组，顺铂加afcnc组，放疗加afcnc组的小鼠每6天给药一次，给药组分及剂量分别为顺铂5mg/kg，顺铂5mg/kg和afcnc2.5mg/kg，afcnc2.5mg/kg，每2-3天用游标卡尺量一次裸鼠皮下移植肿瘤大小，共测量13次(计28天)，统计每组的裸鼠皮下移植肿瘤的平均体积并绘制肿瘤生长曲线如图14。然后给药第四周后处死小鼠，对移植瘤进行解剖，测量每只小鼠的移植瘤体积，并且计算其平均值，结果如图15所示。各组小鼠解剖前后的移植瘤体积对比照片如图16和图17所示。

由图14可知，加入afcnc的组别的小鼠移植肿瘤体积，即放疗加afcnc组和顺铂加afcnc组，从第3天开始低于其他组别并且随着时间差距逐渐大；同时放疗加afcnc组的小鼠移植肿瘤体积在第22天开始高于顺铂加afcnc组，但是两组的小鼠移植肿瘤体积差距并不大。对照组、放疗组和顺铂组的小鼠移植肿瘤体积在第8天开始产生差距，其中对照组的小鼠移植肿瘤体积最大，放疗组的小鼠移植肿瘤体积次之，顺铂组的小鼠移植肿瘤最小；并且放疗组和顺铂组的小鼠移植肿瘤体积的差距先增加后减小，第28天时，放疗组的小鼠移植肿瘤体积略大于顺铂组。其中第28天各组的5只小鼠移植肿瘤体积如图15所示。

由图14-17可知，给药第四周后的各组小鼠的移植肿瘤尺寸为对照组＞顺铂组＞放疗组＞放疗加afcnc组＞顺铂加afcnc组，其中放疗加afcnc组和顺铂加afcnc组的小鼠移植肿瘤尺寸相近。同时，放疗和顺铂对于小鼠移植瘤的治疗效果具有个体差异性，而加入afcnc后的放疗加afcnc组和顺铂加afcnc组在具有高效治疗效果的同时还能够保持统一。

综上，硫化砷-四氧化三铁偶联纳米复合体能够显著增大顺铂对癌细胞移植瘤的抑制作用，提高放疗和顺铂的疗效；并且硫化砷-四氧化三铁偶联纳米复合体和顺铂联合用药的治疗效果略高于硫化砷-四氧化三铁偶联纳米复合体和放疗联合用药。

综合上述验证实验可知，本发明的硫化砷-四氧化三铁偶联纳米复合体能够显著提高顺铂诱导癌细胞的凋亡作用，并且能够特异性抑制yap对肿瘤的侵袭转移能力，从而抑制癌细胞的生长繁殖，并且其治疗效果远远高于单独的硫化砷纳米颗粒和四氧化三铁纳米颗粒。

最后应说明的是，以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。