一种鹿茸醇提取物的制备方法及其应用与流程

本发明属于医药技术领域，涉及一种鹿茸醇提取物的制备方法及其应用。

背景技术：

帕金森病(pd)是一种常见的神经退行性疾病，影响了全球近1000万人。pd的特征是脑内多巴胺能神经元进行性丢失和路易小体形成，主要表现为远动迟缓、肌强直、震颤、姿势步态异常等运动障碍，常伴有嗅觉减退、睡眠障碍等多种非运动症状，患者多为散发病例，只有不到10％存在家族史。帕金森病的确切病因目前仍不清楚，遗传因素、环境因素、年龄老化、氧化应激等均可能参与pd多巴胺能神经元的变性死亡过程。虽然左旋多巴和多巴胺激动剂等药物已经暂时缓解了患者的症状，但到目前为止还没有有效的疗法或药物可以阻止或延缓pd的神经退行性进程。

鹿茸是一种传统中药，具有恢复免疫反应，改善学习和记忆，抗炎、抗应激和抗衰老等作用。鹿茸多肽通过抑制nf-κb通路调节lps诱导的原代髓核细胞的促炎细胞因子(如tnf-α和il-1β)。鹿茸水提取物(aae)通过调节胆碱能标记酶活性，恢复东莨菪碱(scop)诱导的记忆缺陷小鼠的记忆障碍。此外，鹿茸分泌的分子可影响突起的生长和轴突的生长。

技术实现要素：

为了研究鹿茸醇提取物对mptp诱导的帕金森病(pd)小鼠神经变性和神经炎症反应的疗效，本发明公开了一种鹿茸醇提取物的制备方法及其应用。

具体技术方案如下：

鹿茸醇提取物的制备方法如下：

1)将鹿茸冻干粉与无水乙醇按照1g：5ml～1g：20ml的料液比混合，经80℃提取1h，得到提取液；所述冻干粉的制备方法为：将鹿茸在-80～-60℃，0.04bar条件下冷冻干燥48h，再将冷冻后的鹿茸粉碎成鹿茸冻干粉；

2)将步骤1)得到的提取液过滤，收集上清液，残渣备用；

3)将所述残渣重复提取1-3次，对得到的提取液进行过滤，收集上清液；

4)合并步骤2)与步骤3)得到的上清液，经浓缩后干燥得到鹿茸醇提取物。

在本发明的一个实施例中，所述鹿茸冻干粉在冻干之前进行了切片处理，所得鹿茸片的厚度为2-3mm。

在本发明的一个实施例中，所述鹿茸醇提取物的制备方法，具体如下：

1)将无水乙醇与鹿茸冻干粉按照1g：5ml的料液比混合，80℃下回流1h得到提取液；

2)将步骤1)得到的提取液过滤，收集上清液，残渣备用；

3)将步骤2)得到的上清液浓缩，进行干燥，得到鹿茸醇提取物。

在本发明的一个实施例中，鹿茸醇提取物的制备方法步骤3)所述干燥为放入60℃烘箱中烘干。

在本发明的一个实施例中，鹿茸醇提取物的制备方法步骤3)所述浓缩，以每克鹿茸冻干粉质量计，浓缩至液体体积为0.5ml。

进一步地限定上述制备方法获得的鹿茸醇提取物不含有蛋白质，含有萜类化合物、苯酚、类固醇、脂肪酸、脂类和糖苷。

上述的制备方法获得的鹿茸醇提取物在制备治疗和/或预防帕金森病的产品中的应用。

进一步地限定，上述应用所述产品具有下述10种功能中的一种或两种以上：

1)改善帕金森病造成的行为缺陷；

2)增加脑黑质中th阳性神经元的数量；

3)逆转帕金森病造成的神经元丢失；

4)逆转帕金森病造成的th表达降低；

5)降低α-syn蛋白水平；

6)抑制星形胶质细胞数量增加及抑制星形胶质细胞激活；

7)抑制胶质细胞激活诱导的炎症反应；

8)保护多巴胺能神经元；

9)逆转纹状体中p-akt的增加；

10)抑制纹状体p38和p65的磷酸化。

有益效果

在1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(mptp)诱导的pd模型小鼠中，鹿茸醇提物能够改善pd模型小鼠的行为障碍，抑制纹状体中磷酸化akt、p65和p38信号通路，降低星形胶质细胞的活化，保护黑质(sn)和纹状体神经元免受损伤。综上所述，鹿茸醇提物在治疗pd和其他炎症及氧化应激相关神经元疾病方面具有广阔的应用前景，这将为鹿茸醇提取物在抗pd新药开发中的应用提供了理论依据，也为其在生物和医药领域的应用开辟了一条新的途径。

附图说明

图1.鹿茸醇提物粗分离过程；

图2.鹿茸醇提物的sds-page图；

图3.a为帕金森动物模型的建立和鹿茸醇提物给药时间图；b为mptp；诱导的pd小鼠在鹿茸醇提物治疗后的行为表现实验的结果图；

图4.a为黑质中th的免疫组织化学分析图；b为纹状体中gfap和th的免疫组织化学分析图；

图5.纹状体中α-syn和th的蛋白水平；

图6.westernblot分析纹状体中p-akt、p-p65和p-p38蛋白表达；

图7.鹿茸醇提物鹿茸醇提物对黑质和不同器官(心、肝、脾、肺和肾)的苏木素-伊红(he)染色结果图。

图3-图7中的dae-100均是指本发明中所获得的鹿茸醇提取物。

具体实施方式

以下结合具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的保护内容不局限于以下实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。实施本发明的过程、条件、试剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。

实施例1、具有预防和/或治疗帕金森病作用的鹿茸醇提取物的制备方法。

1)将无水乙醇与鹿茸冻干粉混合，提取，得到提取液；具体方法如下：

将购自吉林省左家特产研究所的新鲜梅花鹿二杠鹿茸用切片机切成2-3mm厚的片状，并将其置于在-80℃下，0.04bar条件下进行冷冻干燥48h，然后将冷冻干燥后的鹿茸片用低温研磨机粉碎成鹿茸冻干粉；将10g鹿茸冻干粉与50ml无水乙醇混合，使得到的混合物在水浴温度80℃下回流1h，得到提取液。

2)将步骤1)得到的提取液冷却后过滤，收集上清液，残渣备用；

3)用旋转蒸发器将步骤2)得到的上清液浓缩至液体体积约为5ml后，置于60℃的烘箱中烘干。

实施例2、鹿茸醇提取物的粗分离及粗组分成分鉴定

将鹿茸醇提取物与石油醚按照23.91g：1000ml的料液比进行混合，静置1天后，将其过滤，用甲醇洗涤沉淀得鹿茸无机盐组分，其含量为6.4％；剩余石油醚溶液部分通过中压制备色谱，以二氯甲烷:甲醇＝50:50(v:v)和二氯甲烷:甲醇＝0:100(v:v)为洗脱剂洗脱分别得到mes-1、mes-2和mes-3组分，含量分别为46.2％、16.7％和14.9％，分离过程如图1所示。

mes-1和mes-2通过气相色谱测定其中游离脂肪酸含量，mes-1含3.96％脂肪酸，mes-2含2.34％脂肪酸，其中十五烷酸、棕榈酸、硬脂酸、油酸、花生四烯酸含量较高(如表1所示)。

表1鹿茸粗组分脂肪酸种类和含量

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实施例3、鹿茸醇提取物化学组成分析

利用聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)检测鹿茸醇提物中是否含有蛋白质：鹿茸醇的上样量为50μg、上样体积为20μl。采用5％浓缩胶，12％分离胶，100v电压下进行sds-page电泳90min。电泳结束后，经考马斯亮蓝染色后，观察蛋白条带。如图2所示，经上述制备方法得到的鹿茸醇提物中没有蛋白质。

仪器brukerav-300光谱仪(300mhz¹h，75mhz¹³c)，通过核磁共振(nmr)对鹿茸醇提物dae-100中的化合物进行了鉴定。¹h-nmr的溶剂为dmso-d6，¹³c-nmr的溶剂为meod。¹hnmr和¹³cnmr评价鹿茸醇提物的性质。化学分析表明，鹿茸醇提物中存在萜类化合物、苯酚、类固醇、脂类和糖苷。

实施例4、鹿茸醇提取物的药效学研究

本实施例中所用到的小鼠为雄性c57bl/6小鼠，小鼠的周龄为8-10周，体重为20-24g。

1)动物造模及给药

造模前，小鼠连续3天每天进行3次10min的预训练试验。该测试仪器棒直径为3厘米，转速设为40rpm。将小鼠放在旋转杆上，记录每只小鼠在杆上保持平衡的时间。每只小鼠测试三次，间隔20min。平均时间被认为是最后的分数，仅选择行为一致的小鼠进行后续实验。小鼠称重后随机分为3组，每组6只。分为生理盐水组(saline)、模型组(30mg/kgmptp)、治疗组(mptp+30mg/kg鹿茸醇提物)。模型组腹腔注射30mg/kgmptp，每天一次，连续五天。生理盐水组小鼠每天腹腔注射相同剂量的生理盐水。治疗组(mptp+30mg/kg鹿茸醇提物)，先腹腔注射30mg/kg鹿茸醇提物，半小时后注射30mg/kgmptp，连续五天。图3中的a总结了实验方案。

转棒实验结果如图3中的b所示，盐水组小鼠在旋转棒上停留时间为918s，模型组小鼠停留时间(145s)明显缩短。经鹿茸醇提物治疗后，在旋转棒上的停留时间(776s)比mptp组长得多。治疗组小鼠的性能与盐水组小鼠大致相同，表明其pd行为有显著改善。结果表明鹿茸醇提物能够改善pd小鼠的行为缺陷。

2)免疫组化染色和westernblot分析

末次腹腔注射后，第二天将小鼠断颈，取脑，用pbs将脑组织清洗两次，并在冰上迅速从脑组织中分离出脑黑质。其中，每组6只脑组织放入事先配好的4％多聚甲醛溶液中固定24h后，进行石蜡包埋，选取纹状体区和黑质区连续做冠状切片，厚度为5μm。将制作好的切片用免疫组织化学染色、苏木素和伊红染色后，于显微镜下观察纹状体区和黑质区内神经元细胞数量和形态并拍照。另外6只小鼠的脑组织放入-80℃冰箱保存，将纹状体与ripa裂解液按照的100mg：1ml的比例进行匀浆，得到匀浆液。将匀浆液于4℃，12000rpm条件下离心10min，收集上清液，用于后续蛋白免疫印迹检测。

如图4中a所示，模型组黑质(sn)中的th阳性神经元明显减少。治疗组th阳性神经元数量明显增加。另一方面，如图4中b所示，模型组纹状体中th阳性神经元的数量明显减少，鹿茸醇提物治疗可显著抑制mptp诱导的pd模型小鼠纹状体th阳性神经元的减少。

westernblot结果表明，模型组纹状体中th的表达下调，鹿茸醇提取物逆转了纹状体中th的减少(如图5所示)。这些结果表明，将鹿茸醇提取物用于治疗pd模型小鼠，可显著逆转mptp诱导的pd模型小鼠多巴胺神经元的丢失和th表达的降低。

如图5所示，模型组mptp诱导α-syn明显上调，鹿茸醇提物治疗后α-syn蛋白水平明显下降。th的上调和α-syn的下调表明，鹿茸醇提物具有防止多巴胺神经元变性的潜力。

如图4中b所示，模型组gfap表达较高，表明星形胶质细胞数量增加，具有星形胶质细胞肥大的炎症反应特征。鹿茸醇提物治疗后，显著阻止mptp诱导的星形胶质细胞数量增加及其激活。结果表明鹿茸醇提物抑制了胶质细胞激活诱导的炎症反应，保护多巴胺能神经元。

如图6所示，mptp诱导p-akt明显上调，鹿茸醇提物逆转了纹状体中p-akt的增加。因此，鹿茸醇提物通过逆转akt信号有效治疗mptp诱导的pd小鼠模型。模型组p-p65和p-p38蛋白水平明显高于生理盐水注射的对照组小鼠。鹿茸醇提物治疗组p65和p38磷酸化明显降低。鹿茸醇提物抑制了mptp诱导的动物模型中纹状体p38和p65的磷酸化。

3)鹿茸醇提物的体内病理学评价

小鼠腹腔注射dae-100(10和30mg/kg)7天，随后组织(黑质、心、肝、脾、肺和肾)放入事先配好的4％多聚甲醛溶液固定24h，进行石蜡包埋，做冠状切片，厚度为5μm。苏木素和伊红染色分析组织病理情况。

为探讨鹿茸醇提物的体内安全性，苏木精-伊红(he)染色检测不同器官(心、肝、脾、肺和肾)和黑质(如图7中a)。和对照组相比，鹿茸醇提物(10和30mg/kg)处理组心(heart)、肝(liver)、脾(spleen)、肺(lung)、肾(kidney)和黑质(substantianigra)没有发现损伤，小鼠无明显不良反应。mptp处理的小鼠，黑质神经元和胶质细胞表现出明显的分离(如图7中b)。鹿茸醇提物(30mg/kg)治疗，病变组织正常。结果表明，鹿茸醇提物对pd的治疗有显著效果。

综合以上多个实施例可知，鹿茸醇提物中没有蛋白质或多肽成分，有萜类化合物、苯酚、类固醇、脂肪酸、脂类和糖苷。鹿茸醇提物改善了mptp诱导的c57bl/6小鼠行为异常和多巴胺能神经元丢失。因此，鹿茸醇提物有可能被开发成一种有效和有用的治疗剂，对抗pd等疾病。

以上所述仅为本申请的实施例而已，并不用于限制本申请。对于本领域技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原理之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的权利要求范围之内。