木犀草苷在制备治疗胃癌的药物中的应用的制作方法

本发明涉及生物技术领域，具体涉及木犀草苷在制备治疗胃癌的药物中的应用。

背景技术：

胃癌(gastriccarcinoma)是起源于胃黏膜上皮的恶性肿瘤，是世界上一种重要的癌症，2018年新发病例超过100万例，估计有78.3万例死亡。在国内癌症中，胃癌的发病率位于第二位，死亡率位于第三位。胃癌一般没有典型临床表现，常见症状为胃脘胀痛、消瘦、食欲减退、乏力、反酸、黑便等。胃癌的常规治疗措施，包括手术治疗、化学药物治疗、放射治疗及中医药治疗。中医药治疗胃癌有上千年历史，具有鲜明的中国特色。随着时代的进步，人们的治疗观念也随之改变，诸多胃癌患者在接受西医综合治疗的同时，也能够接受中医药辨证论治。目前，中医药治疗胃癌已经取得相当大的成就，在胃癌的治疗方面发挥出独特的优势。

木犀草苷(cynaroside，cy)是植物中广泛存在的一种黄酮苷类化合物，因最初是从木犀草科木犀草属植物木犀草中分离而得名木犀草苷，具有许多药理活性，如其在呼吸系统，心血管以及中枢系统具有药理药效。近年木犀草苷的抗癌特性也在逐渐被开发。研究表明，木犀草苷在非小细胞肺癌和人宫颈癌中发挥着明显的抗肿瘤作用。但是，木犀草苷对胃癌的抗癌活性及其作用机制目前尚不清楚。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种木犀草苷的治疗胃癌的医药用途，为胃癌的治疗提供了新的药物，同时也拓宽了木犀草苷的医药用途。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

木犀草苷在制备治疗胃癌的药物中的应用。

进一步，木犀草苷在制备抑制胃癌细胞生长的药物中的应用。

进一步，木犀草苷在制备抑制胃癌细胞增殖的药物中的应用。

进一步，木犀草苷在制备抑制胃癌细胞体外克隆形成能力中的应用。

进一步，木犀草苷在制备抑制胃癌细胞体内成瘤能力中的应用。

进一步，木犀草苷在制备细胞周期阻滞在s期中的应用。

进一步，所述胃癌细胞为胃癌细胞hgc27，胃癌细胞mkn45或胃癌细胞sgc7901。

本发明的有益效果在于：本发明公开了木犀草苷在制备治疗胃癌的药物中的应用，通过在培养的胃癌细胞中加入木犀草苷，结果发现cy处理后胃癌细胞形态发生变化，胃癌细胞的生长、增殖、克隆形成及体内成瘤能力受到抑制，并将胃癌细胞细胞周期阻滞于s期。因此，木犀草苷可以用于治疗胃癌。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：

图1为cy处理胃癌细胞形态发生变化结果。

图2为mtt法检测cy处理胃癌细胞的生长速率。

图3为cy处理胃癌细胞增殖速率结果。

图4为平板克隆实验检测cy处理对胃癌细胞增殖速率的影响。

图5为软琼脂单克隆形成实验结果。

图6为流式周期分析胃癌细胞细胞周期。

图7为westernblot实验分析cy处理将胃癌细胞细胞周期相关蛋白。

图8为cy处理细胞成瘤能力实验结果。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

实施例1、木犀草苷(cynaroside，cy)对胃癌的影响

将胃癌细胞系hgc27,mkn45,sgc7901细胞使用rpmi-1640培养基。培养基中添加10％胎牛血清以及1％青霉素-链霉素，细胞放于37℃，含有5％co2的培养箱中进行培养。待细胞生长至70％-80％，以1:6进行细胞传代。细胞贴壁后(通常细胞细胞密度为40％-50％),先将二甲亚砜作为对照，溶于培养基中，然后在培养基中添加不同浓度的木犀草苷，换液加药。加药浓度分别为25μm、50μm、75μm、100μm，以二甲基亚砜(dmso)作为对照。药物处理48h后，显微镜下观察拍照，结果如图1所示。结果显示，cy使胃癌细胞形态发生变化。

然后使用mtt法测生长曲线，具体方法如下：

1)细胞计数

(1)从细胞培养箱中拿出所需要的细胞，在超净工作台中进行操作，将培养皿中的培养基吸除，然后用温热的1×pbs清洗两次，最后吸除pbs。

(2)向培养皿中加入1ml的胰酶，晃动培养皿将胰酶均匀覆盖到细胞上，然后放入37℃细胞培养箱。

(3)在倒置显微镜下观察细胞是否消化完成。然后将培养皿放入超净工作台中操作，终止消化，用1ml的移液枪将细胞吹散，转移到5ml的离心管。

(4)将消化好的细胞放入离心机中离心，转速为750rpm，离心5min。

(5)吸走上清，然后加入2ml的新的培养基重悬细胞，吸10μl加到血球计数板上，在倒置显微镜下进行细胞计数。

2)细胞铺板

(1)根据细胞计数的结果，将细胞稀释呈800cells/200μl。

(2)用200μl移液枪将细胞悬液加到96孔板中，每孔200μl；铺7天的细胞，每天设置3个重复，隔一天测一次。

3)od值的测定

(1)向待测的孔中加入20μl的已经配制好的mtt，置于恒温培养细胞箱中，培养条件为37℃，5％co2，孵育2h。

(2)吸干培养基，每孔加入150μldmso，后置于分光光度计中测量490nm处的吸光值，绘制生长曲线。

统计结果如图2所示。结果显示，cy处理可以明显减慢胃癌细胞的生长速率

brdu标记荧光染色实验

(1)培养正常的hgc、sgc和mkn细胞，并取处于对数期的细胞进行分盘计数处理，按每孔10000cell计算，将细胞铺在24孔板细胞培养皿上，并使其能够均匀分布，加入500μl培养基，置于37℃，5％co2培养箱过夜培养后，将相应浓度的木犀草苷加入细胞培养基中处理48小时；然后加入配好的brdu溶液，使培养基中brdu最终孵育浓度为10μg/ml，在含有5％co2，37℃的恒温细胞培养箱培养45min；

(2)等到孵育时间到后，去除24孔板中培养基，然后用冰的1×pbs清洗三次；最后按200μl/孔4％多聚甲醛溶液加入培养板中，室温下让细胞固定30min；

(3)吸走4％多聚甲醛溶液，然后用1×pbs清洗3次并在摇床上轻轻晃动，每孔加上500μl的pbs，每次清洗5min；

(4)固定完后对细胞用现配的2m盐酸打孔，分别对每孔细胞加入200μl/孔2m的盐酸溶液，在37℃恒温生化培养箱中处理20min；

(5)用0.1m的四硼酸钠/硼酸进行中和，每个空加入500μl的四硼酸钠，放在水平摇床上缓慢摇晃清洗，重复一次

(6)盐酸打孔后，去除盐酸溶液，然后用1×pbs在摇床上清洗3次，每次500μl/孔，每次清洗5min；

(7)接着用200μl/孔的0.1％triton-100溶液对细胞进行处理，在室温下处理10min；

(8)用1×pbs进行清洗，每次5min，重复三次，并将24孔板放在水平摇床上进行清洗；

(9)随后用配制为10％山羊血清，按500μl/孔加入24板中，在室温封闭2h

(10)将brdu一抗按1:200的浓度用10％的山羊血清稀释后，然后按500μl/孔加入24孔板中，并放置于4℃条件下孵育过夜；

(11)同步骤(8)；

(12)用pbs稀释荧光二抗，按1:1000的浓度稀释后，按300μl/孔加入24孔板中，同时在室温下避光孵育2h。

(13)同步骤(8)；

(14)向每个含有细胞的24孔板中的孔中加入200μl/孔的稀释的dapi染色液，室温下避光孵育15min；

(15)同步骤(8)；

(16)用用荧光显微镜观察并拍照，同时并计算细胞总数及brdu阳性细胞数，分别统计每组的brdu标记的阳性率。结果如图3所示。结果显示，cy可明显抑制胃癌细胞增殖速率。

平板克隆实验

(1)培养正常的hgc、sgc和mkn细胞，并取处于对数期的细胞进行分盘计数处理，按1000cells/孔计算，将细胞铺在6孔板细胞培养皿上，并使其能够均匀分布，加入2ml培养基，置于37℃，5％co2培养箱过夜培养后，将相应浓度的木犀草苷加入细胞培养基；

(2)再次将6孔板细胞培养皿置于37℃，5％co2培养箱，细胞培养两周左右；

(3)将6孔板细胞培养皿从培养箱中取出，吸出培养基，用pbs对细胞进行三次清洗；

(4)每孔加入1ml结晶紫，室温染色10min；

(5)染色结束后，回收结晶紫，用扫描仪对6孔板细胞培养皿进行扫描。结果如图4所示。实验结果表明，cy可明显抑制胃癌细胞增殖速率。

软琼脂单克隆形成实验

1)底层琼脂的制备

(1)将水浴锅的温度调到45℃，并将需要用的培养基和pbs在另外一个打开的37℃水浴锅中预热。

(2)等水浴锅温度升到45℃的时候，再将放在60℃烘箱中的1.2％agarose溶液放到45℃水浴锅中。

(3)将预热好的2×(1640培养基+10％fbs+1％p/s)生长培养基3.5ml与3.5ml1.2％agarose溶液迅速混匀，并加入相应浓度的木犀草苷；然后按每孔1ml的标准缓慢的将培养基加入6孔板中，加入琼脂溶液时应注意避免产生气泡。

(4)等到混合液全部加好后可以将加好的6孔板放在4℃的冰箱中静10-20min，待琼脂完全凝固。

2)上层软琼脂的制备

(1)将养好的细胞系从培养箱中拿出，放入超净工作台中，并且轻晃培养皿，用抽泵机吸走原来的培养基，再加入已经预热好的约3ml的1×pbs清洗两遍。然后吸走pbs，同时根据不同的细胞培养皿加入适量的胰酶进行消化，将细胞培养皿轻轻左右晃动，使加入的胰酶能够完全的覆盖住培养皿中的细胞，最后将培养皿放在37℃的细胞培养箱中消化1-3min(具体情况可以根据细胞的贴壁情况来进行延长或者缩短)。

(2)消化好后，加入已经预热好的相应的两倍体积的培养基(含10％fbs)终止细胞消化过程。

(3)移液器轻轻吹打细胞，使成块的细胞分散，再将其细胞悬液移入5ml离心管中，然后拿到离心机上进行离心，离心的转速约为800rpm，离心时间是5min。

(4)向离心管中加入培养基重悬细胞，并将细胞悬液稀释到适当的浓度，按每孔最终加入1000个细胞。取1.5ml2×1640生长培养基与1.5ml1.2％agarose溶液迅速混匀，再与3ml已稀释好的细胞悬液迅速混匀，按每孔1.5ml加到底层琼脂上

(5)当加完上层胶后静置30min后，等上层琼脂完全凝固，然后将6孔板放到37℃的恒温细胞培养箱中培养2周左右。

3)单克隆形成

(1)待琼脂完全凝固后，向6孔板中间的间隙加入约10ml的无菌的pbs使其一直保持一个潮湿的环境，并将六孔板置于5％co2培养箱中37℃培养。

(2)15-20天后，可以在倒置显微镜下看到一个一个的细胞单克隆群，并拍摄单个的克隆群的图像。拍完照过后再向每孔加入300μlmtt染色液，然后将六孔板放到37℃恒温培养中，计时约20min，使单克隆的细胞群落染上颜色，最后再将6孔板放在扫描仪上扫描出具体的图像。

(3)对扫描图像中克隆数目进行统计并做成统计图。

结果如图5所示。结果表明，cy可明显抑制胃癌细胞体外克隆形成能力。

细胞周期检测

(1)将需要收集蛋白的细胞从培养箱中拿出，放入超净工作台中，并且轻轻晃动培养皿，用真空抽泵机吸走旧的培养基，再加入已经预热好的约3ml的1×pbs清洗两遍。然后吸走pbs，同时根据不同的细胞培养皿加入适量的胰酶进行消化，将细胞培养皿轻轻上下左右晃动，使加入的胰酶能够完全的覆盖住培养皿中的细胞，最后将培养皿放在37℃的细胞培养箱中消化1-3min(具体情况可以根据细胞的贴壁情况来进行延长或者缩短)。

(2)当细胞培养皿底部有白色絮状物的出现，然后加入已经预热好的相应的两倍体积的培养基(含10％fbs)终止细胞消化过程。

(3)用移液抢轻轻吹打细胞，将成块的细胞分散，再将其细胞悬液移入5ml或者10ml离心管中，然后拿到离心机上进行离心，离心的转速约为850rpm，离心时间是5min。

(4)将离心管中的上清去除，然后加入1ml预冷的pbs将细胞沉淀重悬，再将离心管放到预冷后的离心机上离心，转速为800rpm，离心5min。

(5)弃上清pbs后，先用移液枪将细胞吹散、悬浮，然后再向离心管中加入1ml75％乙醇，将细胞重悬浮，并置于于4℃冰箱中固定24h或以上。

(6)细胞染色：将固定后的细胞离心收集细胞，去除酒精后，加入1ml的pbs洗细胞2次，加入200μlpbs含50ug/ml溴化乙锭(pi)，100ug/mlrnasea，0.2％tritonx-100的混合液，然后放入37℃恒温培养箱避光孵育30分钟。

(7)流式分析：以标准程序用流式细胞仪检测，一般计数约3万个细胞，结果用细胞周期拟和软件modfit分析。

结果如图6所示，结果显示，cy处理后，胃癌细胞细胞周期阻滞在s期。

westernblot检测

1.细胞收集

(1)将需要收集蛋白的细胞从培养箱中拿出，放入超净工作台中，并且轻轻晃动培养皿，用真空抽泵机吸走旧的培养基，再加入已经预热好的约3ml的1×pbs清洗两遍。然后吸走pbs，同时根据不同的细胞培养皿加入适量的胰酶进行消化，将细胞培养皿轻轻上下左右晃动，使加入的胰酶能够完全的覆盖住培养皿中的细胞，最后将培养皿放在37℃的细胞培养箱中消化3min左右(具体情况可以根据细胞的贴壁情况来进行延长或者缩短)。

(2)直到细胞培养皿底部有白色絮状物的出现，加入已经预热好的相应的两倍的培养基(含10％fbs)终止细胞消化过程。

(3)使用1ml移液器轻轻吹打已经消化好的细胞，使成块的细胞最好能分散成一个个的细胞，再将其移到5ml或者10ml离心管中，然后拿到离心机上进行离心，离心的转速约为850rpm，离心时间是5min。

(4)倒掉离心管中的上清培养基，然后加入3ml预冷的pbs将细胞沉淀重悬，转移到一新的1.5ml离心管中；再将离心管放到预冷后的离心机上离心，转速为1000rpm，离心时间是5min。

(5)尽量吸去离心管中的上清，沉淀是我们所要收集的细胞，其需马上进行下一步的实验或放在-80℃进行保存。

2.蛋白提取和蛋白浓度的测定

(1)将已收集好的细胞放在冰上或者在冰上溶解，同时根据收集细胞的多少计算将合适的碧云天ripa强裂解液和1％pmsf混合配制的裂解液；然后将配好的裂解液加到离心管中并用移液枪反复吹打充分裂解细胞，吹打均匀后置于冰上裂解30min。此时将离心机预冷温度至4℃，为下一步实验做准备。

(2)等细胞裂解结束过后，将装有蛋白的离心管放在离心机中，将离心机的转速调到13000rpm，温度是4℃，离心时间是5min，离心完成后将上清转移到新的离心管中，丢弃沉淀。

(3)将购买的碧云天的25mg/ml蛋白标准液，稀释到0.5mg/ml然后进行分装，并置于-20℃备用；同时计算样品的数量的多少，按照每孔200μl计算，按bca试剂a与试剂b体积比50:1配制工作液，将其充分混匀，放在一旁备用。

(4)在96孔板按标准液体积按0、1、2、4、8、12、16、20μl在96孔板的盖子上标记好，同时也加入相应体积的标准蛋白液，其余不足20μl的孔中加入冰的pbs补足到20μl。

(5)首先在每个96孔板的孔中加入19μl1xpbs，然后每个孔中加入1μl的裂解好的蛋白样品，每个样品要有3个重复。

(6)将蛋白样品和pbs加完过后，向每孔加入200μlbca混合液，同时将气泡弄出来；然后将96孔板放到37℃生化培养箱中放置反应30min。最后使用酶标仪测定每个孔样品的吸光值，检测的条件是560nm。根据测得的od值在excel表格中根据公式绘制标准曲线，并计算出样品的蛋白浓度。

3.样本制备和sds-page电泳

(1)根据绘制的蛋白曲线以及计算需要多少蛋白样品的上样体积，将其按照计算好的体积加到pcr管中，终体积为10μl；同时每个样品中加入2μl的5×loadingbuffer，用手指轻弹混匀，然后瞬时离心将离心管管壁上的样品离心到管底。

(2)将加好的蛋白样品放在pcr仪上，将温度调到100℃，然后煮10min，完成过后进行瞬时离心，再将样品放在一边备用。

(3)将westernblot相关的梳子、玻璃板、spacer等用洗涤剂清洗并冲洗干净，然后用双蒸水冲洗数次，冲洗干净；放到烘箱中将玻璃板子和梳子烘干，最后再将玻璃板组装好准备制胶。

(4)依据要检测的蛋白的大小再配制相应浓度的分离胶；向玻璃板之间缓慢加入已经制好的分离胶至梳齿底端下1cm处，然后快速地加入异丙醇至玻璃板顶，其目的是使分离胶能够保持在一个水平的状态，最后将其放在实验台上放置30min后即可开始下一步的实验。

(5)时间到了过后，将玻璃板之间的异丙醇倒掉，并用吸水纸将其吸取干，然后放在一边备用。

(6)按照相应的比例配制浓缩胶，混匀过后应该立即在分离胶上加入浓缩胶，然后立即将样品梳插到浓缩胶中，然后放在室温静置25min左右即可凝固。

(7)从框架上将玻璃板取下，然后和电泳槽子等组装好进行电泳，将新配号的电泳缓冲液加到槽子中，小心拔出梳子；将已准备好的样品和marker按照排好的顺序分别加入上样的孔中。

(8)电泳的电流选可以根据电泳时胶的数量来选择，一块时使用稳流8-12ma，而两块时使用20ma；当溴酚蓝跑至胶底部时，就可以关机器停止电泳。

4.转膜

(1)在sds-page电泳开始过后，将新配好的1×转膜buffer放到4℃冰箱中冷却；在电泳快要结束时，根据电泳胶的大小剪相应的pvdf膜，然后用甲醇浸泡激活pvdf膜，时间约为20s，然后再用镊子将膜拿出来放在双蒸水中备用，最后将海绵、滤纸和pvdf膜浸泡于已经预冷的转膜缓冲液中，为下一步实验做好准备。

(2)在浅盘子中倒上预冷的转膜液，然后将转膜所用的夹子放置在浅盘中，其中黑色的一面向下，然后按照海绵-滤纸-蛋白胶-pvdf膜-滤纸-海绵的顺序将其放好，转膜缓冲液转膜必须奖海绵和滤纸全部浸泡湿透，其中滤纸和膜之间应该用滚棒将气泡赶出来，最后夹上转膜夹子，将其浸泡在装有转膜液的转膜槽子中。

(3)将装好的转膜夹子按照顺序插入转膜槽中，同时将预冷的转膜缓冲液加到转膜槽中；另外在槽子中加入两个冰袋使转膜环境一直保持较低温度中，然后连接装置，转膜用的电流为260ma，恒流转膜90min-120mi(注意：具体的转膜时间应该视所需要的蛋白的大小而定)。

5.pvdf膜的封闭

(1)等到转膜完成后，将pvdf膜放在装有5％的脱脂奶粉或者5％的bsa的封闭盒子中，然后放在摇床上水平低速晃动，使封闭液能够充分覆盖住pvdf膜，室温封闭2h(注意：磷酸化蛋白使用5％的bsa封闭)。

(2)封闭完成过后，用1×tbst将膜清洗几次，然后加入3ml-5ml相应的稀释好的一抗(稀释比例按说明书推荐)，同时确保膜完全被抗体覆盖，放在4℃冰箱中置于水平摇床上孵育过夜。

(3)第二天回收一抗，然后用1×tbst洗4次，每次清洗约7min并放在水平摇床上进行清洗。

(4)清洗完成过后，加入5ml一抗所对应的二抗(稀释比例依据抗体说明书)，左右并放在水平摇床上室温孵育2h。

(5)孵育时间到了过后，丢弃或回收二抗，然后加入1×tbst洗3次，每次5min，同样也是放在水平摇床上进行清洗。

(6)将镊子、离心管、显色液和吸水纸准备好，用吸水纸吸干pvdf膜上的tbst，放置在曝光板上，均匀滴加显色液使显色液将膜覆盖住。

(7)将已准备好的膜放到wb曝光仪器上进行曝光。

结果如图7所示。westernblot实验，进一步在蛋白水平证明cy将胃癌细胞细胞周期阻滞于s期，并且周期相关蛋白减少具有剂量依赖性和时间依赖性。

小鼠体内成瘤实验

1)小鼠的饲养：购买年龄为3周左右的免疫缺陷鼠，每个培养箱中放4只小鼠，在spf级动物房中饲养一周，让小鼠适应新的环境。

2)收集细胞：将目的细胞消化离心收集细胞，分别为sgc和mkn细胞系，对所有的细胞用1×pbs洗一遍，然后分别加入1.8ml不含血清和抗生素的生长培养基重悬细胞。同时按照每个点注射1x10⁶cell，转移到1.5ml的离心管中，置于冰上备用。

3)接种小鼠

向nod/scid免疫缺陷小鼠的背部两侧，用1ml的注射器，吸取细胞悬液，注意排空气泡，将细胞注射到小鼠皮下。然后将老鼠放回到已编号培养箱中继续饲养。

4)加药处理nod/scid免疫缺陷小鼠

每天观察小鼠和注射点上的瘤子的生长情况，等可以在小鼠的皮下观察到有瘤子长出来的时候就开始每天按照一定的剂量注射木犀草苷；然后定时测量老鼠的体重和瘤子的大小，并及时的进行统计。

5)nod/scid免疫缺陷小鼠生长监测

定时观察小鼠的生长情况，待注射1-2周后肿瘤即可生长出来，然后每天测量肿瘤生长变化情况，以及小鼠重量变化指数。待肿瘤生长至一定大小后，处死小鼠，并将小鼠解剖取出肿瘤，进行拍照、称重等相关的数据的统计和计算。将肿瘤放入冻存液中，于-80℃保存备用。结果如图8所示。结果显示，cy抑制胃癌细胞体内成瘤能力。

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。