miRNA-328a-3p在制备血管损伤修复或血管生长调控药物中的应用的制作方法

本发明涉及生物医药领域，特别涉及mirna-328a-3p在制备血管损伤修复或血管生长调控药物中的应用。

背景技术：

人体神经系统损伤修复属于世界性重大医学难题。脑、脊髓损伤及周围神经损伤已经是全球范围内严重的公共卫生和社会经济问题。流行病学调查显示，在发达国家，每年有约23万人因创伤性脑损伤入院，其中有5万人因其死亡；我国创伤性脑损伤的发病率成逐年上升趋势，脊髓损伤每年新增10万，而周围神经损伤病人高达30万例，并且部分或全部丧失神经功能，这严重影响了患者的生活质量，并造成巨大的经济损失和社会负担。因此，对周围神经损伤后细胞过程的研究是非常重要的。施万细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、成纤维细胞和内皮细胞构成周围神经损伤处的主要细胞群。周围神经损伤后，施万细胞去分化，增殖并迁移到损伤部位，吞噬和消化轴突和髓鞘碎片，形成büngner带，然后在再生轴突周围重新分化形成髓鞘。除了施万细胞介导的轴突生长外，内皮细胞介导的血管生成对器官生长和组织再生也至关重要。血管生成和血运重建与神经组织重塑密切相关，对神经再生和重支配至关重要，因为充分的血管化有助于维持细胞存活并避免中心坏死。近期研究表明，血管先于施万细胞在桥内形成，并引导施万细胞迁移至靶器官。因此，促进血管形成不仅可以促进血液供应，而且可以促进施万细胞迁移，进一步促进周围神经再生。

微小rna(microrna，mirna)是一类长度约20-24nt的具有进化保守性的非编码小分子rna，研究表明，mirna无论在正常生理过程还是在疾病过程中都是重要的调节因子，在组织细胞的生长发育、增殖、分化、及肿瘤的发生发展中发挥重要的调控作用。越来越多的证据表明mirna在神经发育、神经退行性变以及神经再生中起着重要的调节作用，可作为临床潜在的治疗靶标。

根据mirbase数据库(http://mirbase.org/)，mir-328a-3p先前被命名为mir-328或mir-328a。mir-328参与了多种生物学活动，如细胞凋亡，棕色脂肪组织分化和葡萄糖摄取等。新的研究表明，mir-328与多种疾病相关联，包括白血病、房颤、椎间盘退变和肝细胞癌。

技术实现要素：

本发明首次揭示了mir-328a-3p与内皮细胞的迁移和血管形成之间的关系，证明了mir-328a-3p调节剂能够调控血管的形成。

本发明具体技术方案如下：

mir-328a-3p在制备血管损伤修复和血管生长调控药物中的应用。

mir-328a-3p在人和大鼠间高度保守，本发明所述mir-328a-3p核苷酸序列为5’cuggcccucucugcccuuccgu3’(seqidno:1)。

本发明所述的应用，mir-328a-3p作为活性物质，或者作为药物设计靶点设计mir-328a-3p的抑制剂或增效剂，mir-328a-3p或其mir-328a-3p增效剂能够促进内皮细胞的迁移和血管形成，所述mir-328a-3p抑制剂能够抑制内皮细胞的迁移和血管形成。

本发明一个示例，所述抑制剂是mir-328a-3p的反义核酸或mir-328a-3p反义核酸的表达载体，所述增效剂是mir-328a-3p模拟核酸。

mirna的模拟核酸是模拟生物体内源的mirna，运用化学合成的方法合成，能增强内源性mirna的功能。而mirna抑制核酸是化学修饰的专门针对细胞中特异性的靶mirna的抑制剂，在本发明中使用了原rna序列的反义序列。本发明另一目的在于提供一种mir-328a-3p抑制剂，具体为mir-328a-3p的反义核酸或mir-328a-3p反义核酸的表达载体，优选的，所述反义核酸的正义链序列如seqidno:2所示。

本发明另一目的在于提供上述mir-328a-3p抑制剂在制备治疗肿瘤及血管增生性疾病药物中的应用。所述血管增生性疾病包括角膜血管增生及其引发的视力障碍(包括视网膜病变、视网膜病变和视网膜静脉阻塞引起的黄斑水肿、血管性青光眼)、血管错构瘤、血管畸形、血管扩张、血管增生、良性血管肿瘤、恶性血管肿瘤和血管周细胞瘤。

血管生成对肿瘤的生长和转移起着关键作用，抑制肿瘤血管生成，是控制肿瘤生长的有效治疗手段。角膜炎引发的血管增生会遮挡视力，严重可导致失明，抑制血管增生也是这类疾病治疗的关键。

本发明另一目的在于提供一种mir-328a-3p增效剂，具体为mir-328a-3p模拟核酸，优选的，所述mir-328a-3p模拟核酸序列如seqidno:6所示。

本发明另一目的在于提供上述mir-328a-3p增效剂在制备血管损伤修复、血管再生药物以及治疗神经再生相关疾病药物中的应用。

血管是人体的重要支持系统，血管系统遍布全身并将营养物质、氧气交换到细胞群同时带走代谢废物，血管损伤或缺失可见于组织损伤与缺血性疾病，严重威胁人类健康。此外，再生的组织器官存活和生理功能重建与能否迅速生成可灌注血管有密切关系。在神经再生相关疾病中，新生微血管能分泌生长因子和细胞因子,它们能为维持神经元存活提供营养，促进神经再生。

本发明所述的血管损伤修复、血管再生药物包括治疗冠心病、外周动脉阻塞性疾病以及皮肤伤口修复的药物。所述神经再生的相关疾病是指周围神经损伤和中枢神经损伤疾病。

为了评价mir-328a-3p在内皮细胞中的生物学功能，在人脐静脉内皮细胞(humanumbilicalveinendothelialcells,huvecs)中转染mir-328a-3p及其调节剂。与模拟核酸对照组相比，mir-328a-3p模拟物组的mir-328a-3p表达量增加(图1a)。与抑制剂对照组相比，mir-328a-3p抑制剂组的mir-328a-3p表达量减少，表明细胞转染效率高(图1b)。利用transwell迁移实验和划痕愈合实验发现，mir-328a-3p促进huvecs的迁移能力(图2a-d和图3a-d)。内皮细胞的独特特征是它们能在基底膜上形成毛细血管样管，利用体外血管形成实验发现，mir-328a-3p促进huvecs的成血管能力(图4a-j)。结合转录组测序和生物信息学分析，预测mir-328a-3p可能靶向干扰基因的表达(图5a-c)。

本发明所述mir-328a-3p可以直接作为药物或者作为药物的靶点设计其抑制剂或增效剂，通过与药物的相互作用，促进或抑制机体mirna的表达，进而进一步调控机体其他因子的表达而发挥作用。

本发明的优点：本发明表明，mir-328a-3p的调节剂能够影响内皮细胞的行为，从而抑制或促进血管的生成，可以广泛用于临床上有抑制血管增生或促进血管再生需求的疾病的治疗，特别是神经再生，由于很多药物不能进入神经内发挥作用，而mirna由于分子较小，可以通过血脑和血神经屏障；另外还可以有效的避免某些促神经再生的因子直接应用而引起的副作用。

附图说明

图1为用mir-328a-3p模拟物对照(mc)和mir-328a-3p模拟物(mir-328a-3p)或抑制剂对照(ic)和mir-328a-3p抑制剂(anti-mir-328a-3p)转染的huvecs中mir-328a-3p的相对表达量。

图2为mir-328a-3p对人血管内皮细胞划痕愈合的影响。(图2a&c为模拟物对照或mir-328a-3p模拟物转染的huvecs的代表性图像和空白区域面积的统计，图2b&d为抑制剂对照或mir-328a-3p抑制剂转染的huvecs的代表性图像和空白区域面积的统计。)

图3为mir-328a-3p对人血管内皮细胞迁移的影响。(图3a&c为模拟物对照或mir-328a-3p模拟物转染的huvecs的代表性图像和迁移速率统计，图3b&d为抑制剂对照或mir-328a-3p抑制剂转染的huvecs的代表性图像和迁移速率统计。紫罗兰色代表已迁移的huvecs。)

图4为mir-328a-3p对人血管内皮细胞血管形成能力的影响。(图4a&c&e&f&g为模拟物对照或mir-328a-3p模拟物转染的huvecs的代表性图像和形成节点、网格和分支的数量，图4b&d&h&i&j为抑制剂对照或mir-328a-3p抑制剂转染的huvecs的代表性图像和形成节点、网格和分支的数量。)

图5为以mir-328a-3p为中心的cerna网络的构建。(图5a为mir-328a-3p为中心的cerna网络中lncrna，mir-328a-3p和靶标mrna的相互作用。图5b&c为神经挤压伤后0、1、4、7和14天，坐骨神经残端中以mir-328a-3p为中心的cerna网络中lncrna和mrna的时间表达模式的热图，红色表示上调，绿色表示下调。)

具体实施方式

以下通过实施例说明本发明的具体步骤，但不受实施例限制。

在本发明中所使用的术语，除非另有说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。

下面结合具体实施例并参照数据进一步详细描述本发明。应理解，该实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。

在以下实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。

下面结合具体实施例对本发明进一步说明。

实施例1mir-328a-3p的模拟物和模拟物对照、抑制剂和抑制剂对照均由广州市锐博生物科技有限公司合成。序列如下：

mir-328a-3p模拟物：5’cuggcccucucugcccuuccgu3’(seqidno:2)；

3’acggaagggcagagagggccag5’(seqidno:3)

模拟物对照：5'uuuguacuacacaaaaguacug3'(seqidno:4)

3'aaacaugauguguuuucaugac5'(seqidno:5)

mir-328a-3p抑制剂：5’acggaagggcagagagggccag3’(seqidno:6)

抑制剂对照：5’caguacuuuuguguaguacaaa3’(seqidno:7)

转染试剂lipofectaminernaimax由invitrogen公司生产。

实施例2细胞培养和转染

huvecs由南通大学沈宓博士实验室馈赠，使用含有5％胎牛血清(fbs；sciencell)，1％内皮细胞生长补充剂(ecgs；sciencell)，1％青霉素和链霉素(invitrogen,carlsbad,ca,usa)的内皮细胞培养基(ecm；sciencell,sandiego,california,usa)。37℃，5％co2细胞培养箱孵育，每两天换液一次。化学合成的mir-328a-3p模拟物、模拟对照物、mir-328a-3p抑制剂和抑制剂对照物由ribobiotechnlogy(中国广州)合成，转染使用lipofectaminernaimax试剂(invitrogen，carlsbad，ca，usa)，根据说明书操作。

实施例3mirna逆转录(rt-pcr)和real-timert-pcr(qrt-pcr)

从培养的huvecs中提取rna，采用stem-looprtprimers(ribobio)进行mirna逆转录。real-timert-pcr采用bulge-loop^tmmirnaqrt-pcrprimersets(ribobio)在appliedbiosystemssteponereal-timepcrsystem上进行操作。mir-328a-3p特异性引物序由一个rt-pcr引物和一对qrt-pcr引物组成，均由广州市锐博生物科技有限公司设计合成。qrt-pcr反应程序：95℃预变性2min；40个pcr循环(95℃，15s；60℃，1min；95℃，15s)；pcr扩增反应结束后，进行产物的溶解曲线分析，以确保pcr产物的质量。u6作为内参。利用abisteponepcr仪及软件进行分析。rna相对表达＝2^-△△ct，△ct＝目标基因ct-内参ct值，其中ct值代表每个反应管内的荧光信号达到设定阈值时所需循环数。

结果如图1所示，结果显示转染mir-328a-3p模拟物(mir-328a-3p)的huvecs中mir-328a-3p的相对表达量明显高于模拟物对照(mc)组，转染mir-328a-3p抑制剂(anti-mir-328a-3p)的huvecs中mir-328a-3p的相对表达量明显低于抑制剂对照(ic)组。结果表明本发明设计的mir-328a-3p模拟核酸能够促进mir-328a-3p的表达，而反义核酸能够抑制mir-328a-3p的表达。

实施例4细胞划痕愈合实验

分别取实施例2制得的转染mir-328a-3p模拟物和mir-328a-3p抑制剂的huvecs，调整细胞密度为2×10⁵个/ml，接种到置于6孔板中的1mm宽的模型室中。在移除模型室后的0h和12h分别拍摄相对空白区域，并采用imageproplus(mediacybernetics,rockville,md,usa)来统计相对空白区域的面积。

图2a&b为高倍显微镜下细胞划痕实验图(比例尺为100μm)，图2c为转染mir-328a-3p模拟物的huvecs的迁移速率，结果显示，转染mir-328a-3p模拟物的huvecs的迁移速率高于mc组，结果表明mir-328a-3p模拟物能提高huvecs的迁移速率。图2d为转染mir-328a-3p抑制剂的huvecs的迁移速率,结果显示，转染mir-328a-3p抑制剂的huvecs的迁移速率低于ic组，结果表明mir-328a-3p抑制剂能抑制huvecs的迁移速率。

实施例5transwell迁移实验

transwel小室的下室表面包被fibronectin，收取分别转染mir-328a-3p模拟物和mir-328a-3p抑制剂的的内皮细胞，用ecm培养基调整细胞密度为1×10⁴个/ml，在transwell上室中加入100μl细胞悬液。下室加入500μl含5％胎牛血清的完全培养基。常规培养24h后结晶紫染色，染色后leicadc300f正置显微镜进行观察和拍照，随机选取10个视野计数细胞个数。最后用33％冰醋酸将结晶紫完全洗脱下来，洗脱液可在酶标仪上570nm，测其od值，间接反映迁移细胞数。

图3a&b为高倍显微镜下细胞迁移实验图(比例尺为50μm)，图3c为转染mir-328a-3p模拟物的huvecs的迁移速率，结果显示，转染mir-328a-3p模拟物的huvecs的迁移速率高于mc组，结果表明mir-328a-3p模拟物能提高huvecs的迁移速率。图3d为转染mir-328a-3p抑制剂的huvecs的迁移速率,结果显示，转染mir-328a-3p抑制剂的huvecs的迁移速率低于ic组，结果表明mir-328a-3p抑制剂能抑制huvecs的迁移速率。

实施例6体外血管形成实验

将150ml的基质凝胶(bdbiosciences,corning,newyork,usa)添加到冰上预冷的96孔板中并聚合。以2×10⁵个/ml的密度分别将转染mir-328a-3p模拟物和mir-328a-3p抑制剂的huvecs接种到基质凝胶上，培养6小时以形成小管。采用imagej(nationalinstitutesofhealthbethesda,md,usa)软件测定形成的节点数、网格数和分支数。

图4a&b为高倍显微镜下细胞成管实验图(比例尺为200μm)。图4c&d为采用imagej软件测定形成的节点数、网格数和分支数示意图。图4e&f&g分别为为转染mir-328a-3p模拟物的huvecs成管的节点数、网格数和分支数，结果显示，转染mir-328a-3p模拟物的huvecs的成管率率高于mc组，结果表明mir-328a-3p模拟物能促进huvecs的血管形成。图4h&i&j分别为转染mir-328a-3p抑制剂huvecs成管的节点数、网格数和分支数，结果显示，转染mir-328a-3p抑制剂的huvecs的成管率低于ic组，结果表明mir-328a-3p抑制剂能抑制huvecs的血管形成。

实施例7转录组测序及mir-328a-3p为中心的cerna网络的构建

构建大鼠坐骨神经压伤模型，损伤后不同时间点(0天、1天、4天、7天、14天)获取损伤段神经进行mrna转录组测序。rna测序由genedenovo公司(中国广州)进行。mirwalk3.0，mirranda，mirdb和targetscan四种软件预测mir-328a-3p的上游调节因子和下游效应因子。热图由omicshare工具生成(http://www.omicshare.com/tools)。

图5a通过生物信息学工具分析了mir-328a-3p的上游调节因子和下游效应因子，构建以mir-328a-3p为中心的lncrna-mirna-mrna网络。通过构建大鼠坐骨神经挤压伤模型，并确定了大鼠坐骨神经残端的基因表达谱，研究了rno-mir-328a-3p的上游lncrna和下游mrna。targetscan预测显示，总共5种lncrna，xloc_097278，xloc_083369，xloc_138151，xloc_174539和xloc_053870可以与mir-328a-3p结合。mirwalk3.0，mirranda和mirdb预测揭示了mir-328a-3p的各种潜在靶基因。构建得到以mir-328a-3p为中心的cerna网络。图5b为神经挤压伤后0、1、4、7和14天，坐骨神经残端中以mir-328a-3p为中心的cerna网络中lncrna的时间表达模式的热图。图5c为神经挤压伤后0、1、4、7和14天，坐骨神经残端中以mir-328a-3p为中心的cerna网络中mrna的时间表达模式的热图。测序数据表明，神经挤压伤后坐骨神经残端中所有鉴定出的上游lncrna均上调。然而，大多数预测的潜在靶标mrna在神经损伤后被下调，而一些少数mrna，例如vsig4和prdx5，则在受伤的神经残端中表达水平升高。

序列表

<110>南通大学

<120>mirna-328a-3p在制备血管损伤修复或血管生长调控药物中的应用

<160>7

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>22

<212>rna

<213>人(human)

<400>1

cuggcccucucugcccuuccgu22

<210>2

<211>22

<212>rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

cuggcccucucugcccuuccgu22

<210>3

<211>22

<212>rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

gaccgggagagacgggaaggca22

<210>4

<211>22

<212>rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

uuuguacuacacaaaaguacug22

<210>5

<211>22

<212>rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

caguacuuuuguguaguacaaa22

<210>6

<211>22

<212>rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>6

acggaagggcagagagggccag22

<210>7

<211>22

<212>rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>7

caguacuuuuguguaguacaaa22