一种DNA编码化合物库构建中的On-DNAAldol反应方法与流程

本发明属于编码化合物库技术领域，具体涉及一种dna编码化合物库构建中的on-dnaaldol反应方法。

背景技术：

在药物研发，尤其是新药研发中，针对生物靶标的高通量筛选是快速获得先导化合物的主要手段之一。然而，基于单个分子的传统高通量筛选所需时间长、设备投入巨大、库化合物数量有限(数百万)，且化合物库的建成需要数十年的积累，限制了先导化合物的发现效率与可能性。近年来出现的dna编码化合物库技术(wo2005058479、wo2018166532、cn103882532)，结合了组合化学和分子生物学技术，在分子水平上将每个化合物加上一个dna标签，并能在极短的时间内合成高达亿级的化合物库，成为下一代化合物库筛选技术的趋势，并开始在制药行业广泛应用，产生了诸多积极的效果(accountsofchemicalresearch,2014,47,1247-1255)。

dna编码化合物库通过组合化学快速产生巨型化合物库，并且能高通量地筛选出先导化合物，使得先导化合物的筛选变得前所未有的快捷和高效。构建dna编码化合物库的挑战之一就是需要在dna上高收率地合成具有化学多样性的小分子。由于dna需要在一定的条件下(溶剂、ph、温度、离子浓度)才能维持稳定，同时应用于dna编码化合物库构建的on-dna反应还需要有较高的产率。因此dna上进行的化学反应(简称on-dna反应)的试剂种类、反应种类、反应条件直接影响到dna编码化合物库的丰富度和可选择性。从而开发能够与dna兼容的化学反应也成为目前dna编码化合物库技术的长期探索和研究方向，也直接影响了dna编码化合物库的应用及商业价值。

α,β-不饱和羰基化合物是一类重要的药物化合物骨架结构，将α,β-不饱和羰基化合物引入到dna编码化合物库中能进一步扩展化合物库的多样性，有利于提高筛选到有效化合物的概率。然而目前并没有报道通过以on-dna乙酮类化合物和醛类化合物为原料，或者以on-dna醛类化合物和乙酮类化合物为原料合成on-dnaα,β-不饱和羰基化合物的方法。因此希望开发一种新的适用于大批量多孔板操作的on-dnaα,β-不饱和羰基化合物的合成方法，以增加dna编码化合物库的多样性，进一步提升dna编码化合物库技术的应用价值。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题在于，提供一种合成on-dnaα,β-不饱和羰基化合物的方法，该方法反应条件温和、后处理简单，适合dna编码化合物库的生产，能显著提高化合物库分子的多样性。

为解决上述技术问题，按照on-dna的底物和反应组分不同分为两种类型：

第一种类型：

一种合成on-dnaα,β-不饱和羰基化合物的方法，所述方法是以on-dna酮类化合物和醛类化合物为原料，在碱的存在下反应得到on-dna产物；其中on-dna酮类化合物的结构式为醛类化合物的结构式为

其中，结构式中dna包含由人工修饰的和/或未修饰的核苷酸单体聚合得到的单链或双链的核苷酸链，该核苷酸链通过一个或多个化学键或基团与化合物中剩余部分相连；所述dna的长度为10～200bp。

其中，结构式中的dna与r1通过一个化学键或多个化学键连接。一个化学键时，是指结构式中的dna与r1直接相连；多个化学键时，指结构式中的dna与r1之间间隔多个化学键相连，比如，dna与r1之间通过一个亚甲基(-ch2-)相连，即通过两个化学键连接；或dna与r1之间通过一个羰基(-co-)连接dna的氨基，也是通过两个化学键连接；或dna与r1通过一个亚甲基羰基(-ch2co-)连接dna的氨基，也是通过三个连续的化学键连接。

r1选自分子量1000以下与dna和羰基碳原子直接相连的基团或者不存在；

r2选自分子量1000以下与醛基碳原子直接相连的基团；

r5选自氢或分子量1000以下与羰基α位碳原子直接相连的基团；

或r1与r5成环。

作为优选：所述的r1、r2分别选自烷基、取代烷基、羧基、苯胺基、5～10元芳基、取代5～10元芳基、5-10元芳杂环基、取代5-10元芳杂环基；其中，所述烷基为c1～c20烷基或c3～c8环烷基；取代烷基的取代基的数量为一个或多个；取代烷基的取代基是相互独立的选自卤素、羧基、硝基、烷氧基、卤代苯基、苯基、烷基苯基、杂环基中的一种或多种；取代5～10元芳基的取代基的数量为一个或多个，取代5～10元芳基的取代基是相互独立的选自卤素、氰基、硝基、羧基、烷氧基、c1～c20烷基、三氟甲基中的一种或多种；取代5-10元芳杂环基的取代基的数量为一个或多个，取代5-10元芳杂环基的取代基是相互独立的选自卤素、氰基、硝基、羧基、烷氧基、c1～c20烷基、三氟甲基中的一种或多种；

所述r5选自氢、c1～c20烷基；或r1与r5成环。。

进一步地：所述的r1选自苯基、噻吩基或苯胺基；

所述r2选自苯基、取代苯基、吡啶基、呋喃基；取代苯基的取代基选自c1～c6烷氧基、三氟甲基、c1～c6烷基；所述c1～c6烷基具体选自甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、戊烷基、己烷基；所述c1～c6烷氧基选自甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、异丁氧基、叔丁氧基、戊烷氧基、己烷氧基。

所述r5选自氢、c1～c6烷基；所述c1～c6烷基具体选自甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、戊烷基、己烷基；或r1与r5成环。

所述的on-dna酮类化合物具体选自：

所述的醛类化合物具体选自：

一种合成on-dnaα,β-不饱和羰基化合物的方法，所述反应的反应步骤为：向摩尔当量为1，摩尔浓度为0.5-5mm的on-dna酮类化合物溶液中，加入10-1000倍摩尔当量的醛类化合物、10-1000倍摩尔当量的碱，在10℃～100℃下反应0.5-24小时。

进一步地，所述碱选自硼酸钠、氢氧化锂、氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铯、碳酸钠、碳酸钾、碳酸铯、磷酸钠、磷酸钾、磷酸氢钠、磷酸氢钾、n-甲基吗啉、三乙胺、二异丙基乙基胺、dbu(1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯)、4-二甲氨基吡啶、2,6-二甲基吡啶或n-甲基咪唑；优选地，所述碱为氢氧化钾。

进一步地，所述反应在溶剂中进行，溶剂为水、甲醇、乙醇、乙腈、n,n-二甲基乙酰胺、二甲亚砜、无机盐缓冲液、有机酸缓冲液、有机碱缓冲液中任意一种或几种的含水混合溶剂；优选地，所述反应溶剂含有硼酸缓冲液、二甲亚砜。

更进一步地，所述硼酸缓冲液的ph为7～11；优选地，ph为9.4。

进一步地，所述反应的反应温度为10℃～100℃；优选地，反应温度为30℃。

进一步地，所述反应的反应时间为0.5～24小时；优选地，反应时间为1小时。

进一步地，所述方法中on-dna酮类化合物的摩尔当量为1，醛类化合物的摩尔当量为10～1000，碱的摩尔当量为10～1000；优选地，醛类化合物的摩尔当量为200，碱的摩尔当量为500。

进一步地，上述方法用于批量的多孔板操作。

进一步地，上述方法用于多孔板的dna编码化合物库的合成。

第二种类型：

本发明还提供一种合成on-dnaα,β-不饱和羰基化合物的方法，所述方法是以on-dna醛类化合物和酮类化合物为原料，在碱的存在下反应得到on-dna产物；其中on-dna醛类化合物的结构式为酮类化合物的结构式为

其中，结构式中dna包含由人工修饰的和/或未修饰的核苷酸单体聚合得到的单链或双链的核苷酸链，该核苷酸链通过一个或多个化学键或基团与化合物中剩余部分相连；所述dna的长度为10～200bp。

其中，结构式中的dna与r3通过一个化学键或多个化学键连接。一个化学键时，是指结构式中的dna与r3直接相连；多个化学键时，指结构式中的dna与r3之间间隔多个化学键相连，比如，dna与r3之间通过一个亚甲基(-ch2-)相连，即通过两个化学键连接；或dna与r3之间通过一个羰基(-co-)连接dna的氨基，也是通过两个化学键连接；或dna与r3通过一个亚甲基羰基(-ch2co-)连接dna的氨基，也是通过三个连续的化学键连接。

r3选自分子量1000以下与dna和醛基碳原子直接相连的基团或者不存在；

r4选自分子量1000以下与羰基碳原子直接相连的基团；

r5选自氢或分子量1000以下与羰基α位碳原子直接相连的基团；

或r4与r5成环。

作为优选：

所述的r3、r4分别选自烷基、取代烷基、羧基、苯胺基、5～10元芳基、取代5～10元芳基、5-10元芳杂环基、取代5-10元芳杂环基；其中，所述烷基为c1～c20烷基或c3～c8环烷基；取代烷基的取代基的数量为一个或多个；取代烷基的取代基是相互独立的选自卤素、羧基、硝基、烷氧基、卤代苯基、苯基、烷基苯基、杂环基中的一种或多种；取代5～10元芳基的取代基的数量为一个或多个，取代5～10元芳基的取代基是相互独立的选自卤素、氰基、硝基、羧基、烷氧基、c1～c20烷基、三氟甲基中的一种或多种；取代5-10元芳杂环基的取代基的数量为一个或多个，取代5-10元芳杂环基的取代基是相互独立的选自卤素、氰基、硝基、羧基、烷氧基、c1～c20烷基、三氟甲基中的一种或多种；

所述r5选自氢、c1～c20烷基；或r4与r5成环。

进一步地：所述的r3选自苯基、噻吩基、c1～c6烷氧基取代的苯基、吡啶基；

所述r4选自苯基、取代的苯基、c1～c6烷基、羧基；取代苯基的取代基选自羧基。

所述r5选自氢、c1～c6烷基；或r4与r5成环。

所述的on-dna醛类化合物具体选自：

所述的酮类化合物具体选自：

一种合成on-dnaα,β-不饱和羰基化合物的方法，所述反应的反应步骤为：向摩尔当量为1，摩尔浓度为0.5-5mm的on-dna醛类化合物溶液中，加入10-1000倍摩尔当量的酮类化合物、10-1000倍摩尔当量的碱，在10℃～100℃下反应0.5-24小时。

进一步地，所述碱选自硼酸钠、氢氧化锂、氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铯、碳酸钠、碳酸钾、碳酸铯、磷酸钠、磷酸钾、磷酸氢钠、磷酸氢钾、n-甲基吗啉、三乙胺、二异丙基乙基胺、dbu(1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯)、4-二甲氨基吡啶、2,6-二甲基吡啶或n-甲基咪唑；优选地，所述碱为氢氧化钾。

进一步地，所述反应在溶剂中进行，溶剂为水、甲醇、乙醇、乙腈、n,n-二甲基乙酰胺、二甲亚砜、无机盐缓冲液、有机酸缓冲液、有机碱缓冲液中任意一种或几种的含水混合溶剂；优选地，所述反应溶剂含有硼酸缓冲液、二甲亚砜。

更进一步地，所述硼酸缓冲液的ph为7～11；优选地，ph为9.4。

进一步地，所述反应的反应温度为10℃～100℃；优选地，反应温度为30℃。

进一步地，所述反应的反应时间为0.5～24小时；优选地，反应时间为1小时。

进一步地，所述方法中on-dna醛类化合物的摩尔当量为1，酮类化合物的摩尔当量为10～1000，碱的当量为10～1000；优选地，酮类化合物的摩尔当量为100，碱的摩尔当量为300。

进一步地，上述方法用于批量的多孔板操作。

进一步地，上述方法用于多孔板的dna编码化合物库的合成。

本发明方法可以实现在dna编码化合物库中通过以on-dna酮类化合物和醛类化合物为原料，或者以on-dna醛类化合物和酮类化合物为原料合成on-dnaα,β-不饱和羰基化合物，可广泛应用于各种on-dna酮或醛底物，并且能大规模引入各种取代的醛类或者酮类化合物作为合成模块。该方法收率高，产物单一，能够在有机溶剂/水相的混合水相中进行，操作简单，不引入金属类试剂，环境友好，适合使用多孔板进行的dna编码化合物库的合成。

关于本发明的使用术语的定义：除非另有说明，本文中基团或者术语提供的初始定义适用于整篇说明书的该基团或者术语；对于本文没有具体定义的术语，应该根据公开内容和上下文，给出本领域技术人员能够给予它们的含义。

“取代”是指分子中的氢原子被其它不同的原子或分子所替换。

碳氢基团中碳原子含量的最小值和最大值通过前缀表示，例如，前缀(ca～cb)烷基表明任何含“a”至“b”个碳原子的烷基。因此，例如，c1～c20烷基是指包含1～20个碳原子的直链或支链的烷基。

烷基是指烷烃分子中一个或多个h被取代而成的直链或支链的烃基，例如甲基ch3-，乙基ch3ch2-，亚甲基-ch2-。

环烷基：是指h被取代的饱和或不饱和的环烷烃；

所述卤素为氟、氯、溴或碘。

烷氧基：是指烷基与氧原子连接形成取代基，例如甲氧基为-och3。

卤代苯基：是指苯基上的h被卤素取代而形成的基团。

烷基苯基：是指苯基上的h被烷基取代而形成的基团。

5～10元芳基：是指不含杂原子，由c原子构成的芳香性单一环状或多个环状基团。

5～10元芳杂环基是指5～10个的c、o、s、n等原子构成具有芳香性的单一环状或多个环状基团。

杂环基：是携带至少一个选自o、s、n的多个原子的饱和或不饱和的单环或多环烃基。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1：本发明实施例3中得到30种on-dnaα,β-不饱和羰基化合物相应的转化率分布图。

图2：本发明实施例4中得到20种on-dnaα,β-不饱和羰基化合物相应的转化率分布图。

具体实施方式

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

本发明所用原料与设备均为已知产品，通过购买市售产品所得。

hatu:2-(7-偶氮苯并三氮唑)-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸酯；

dipea:n,n-二异丙基乙胺；

dma：二甲基乙酰胺。

本发明中dna-nh2是单链或双链dna与接头基团形成的带有-nh2接头的dna结构，例如wo2005058479中“compound1”的dna-nh2结构。也例如下述的dna结构：

其中，a为腺嘌呤，t为胸腺嘧啶，c为胞嘧啶，g为鸟嘌呤。

实施例1、on-dna乙酮类化合物合成on-dnaα,β-不饱和羰基化合物

步骤1、on-dna乙酮类化合物的合成

将dna(1)溶解到250mm,ph＝9.4的硼酸缓冲液中，配制成1mm浓度溶液(20μl，20nmol)，向对乙酰基苯甲酸(1000nmol,50当量，200mmdma)，加入hatu(1000nmol，50当量，400mmdma)，以及dipea(1000nmol，50当量，400mmdma)混合均匀，在0℃中活化5分钟，将活化液加入dna溶液中，混合均匀，在30℃反应1小时。

反应完毕后进行乙醇沉淀：向反应后的溶液中加入总体积10％的5m的氯化钠溶液，然后继续加入总体积的3倍的无水乙醇，振荡均匀后，将反应置于干冰中冷冻0.5小时，之后在12000rpm的转速下离心半个小时，倒掉上清液，余下沉淀用去离子水溶解，即得到on-dna乙酮类化合物(2)的溶液，通过酶标仪od定量后，送lcms确认反应转化率为90％。

步骤2、on-dnaα,β-不饱和羰基化合物的合成

将on-dna乙酮类化合物(2)溶解到250mm,ph＝9.4的硼酸缓冲液中，配制成1mm浓度溶液(20μl，20nmol)，向溶液中依次加入苯甲醛(4000nmol,200当量，200mmdmso)，氢氧化钾(10000nmol，500当量，500mm双蒸水)，混合均匀，30℃反应1小时。

反应完毕后进行乙醇沉淀：向反应后的溶液中加入总体积10％的5m的氯化钠溶液，然后继续加入总体积的3倍的无水乙醇，振荡均匀后，将反应置于干冰中冷冻0.5小时，之后在12000rpm的转速下离心半个小时，倒掉上清液，余下沉淀用去离子水溶解，即得到on-dnaα,β-不饱和羰基化合物(3)的溶液，通过酶标仪od定量后，送lcms确认反应转化率为90％。

实施例2、on-dna醛基化合物合成on-dnaα,β-不饱和羰基化合物

步骤1、on-dna醛基化合物的合成

将dna(1)溶解到250mm,ph＝9.4的硼酸缓冲液中，配制成1mm浓度溶液(20μl，20nmol)，向对醛基苯甲酸(1000nmol,50当量，200mmdma)，加入hatu(1000nmol，50当量，400mmdma)，以及dipea(1000nmol，50当量，400mmdma)混合均匀，在0℃中活化5分钟，将活化液加入dna溶液中，混合均匀，在30℃反应1小时。

反应完毕后进行乙醇沉淀：向反应后的溶液中加入总体积10％的5m的氯化钠溶液，然后继续加入总体积的3倍的无水乙醇，振荡均匀后，将反应置于干冰中冷冻0.5小时，之后在12000rpm的转速下离心半个小时，倒掉上清液，余下沉淀用去离子水溶解，即得到on-dna醛基化合物(2)的溶液，通过酶标仪od定量后，送lcms确认反应转化率为90％。

步骤2、on-dnaα,β-不饱和羰基化合物的合成

将on-dna醛类化合物(2)溶解到250mm,ph＝9.4的硼酸缓冲液中，配制成1mm浓度溶液(20μl，20nmol)，向溶液中依次加入苯乙酮(2000nmol,100当量，200mmdmso)，氢氧化钾(6000nmol，300当量，500mm双蒸水)，混合均匀，30℃反应1小时。

反应完毕后进行乙醇沉淀：向反应后的溶液中加入总体积10％的5m的氯化钠溶液，然后继续加入总体积的3倍的无水乙醇，振荡均匀后，将反应置于干冰中冷冻0.5小时，之后在12000rpm的转速下离心半个小时，倒掉上清液，余下沉淀用去离子水溶解，即得到on-dnaα,β-不饱和羰基化合物(3)的溶液，通过酶标仪od定量后，送lcms确认反应转化率为90％。

实施例3：on-dna酮类化合物合成on-dnaα,β-不饱和羰基化合物

将on-dna酮类化合物溶解到250mm,ph＝9.4的硼酸缓冲液中，配制成1mm浓度溶液(20μl，20nmol)，向溶液中依次加入醛类化合物(4000nmol,200当量，200mmdmso)，氢氧化钾(10000nmol，500当量，500mm双蒸水)，混合均匀，30℃反应1小时。

反应完毕后进行乙醇沉淀：向反应后的溶液中加入总体积10％的5m的氯化钠溶液，然后继续加入总体积的3倍的无水乙醇，振荡均匀后，将反应置于干冰中冷冻0.5小时，之后在12000rpm的转速下离心半个小时，倒掉上清液，余下沉淀用去离子水溶解，即得到30种on-dnaα,β-不饱和羰基化合物的溶液，通过酶标仪od定量后，送lcms确认反应转化率。

实施例4：on-dna醛基化合物合成on-dnaα,β-不饱和羰基化合物

将on-dna醛类化合物溶解到250mm,ph＝9.4的硼酸缓冲液中，配制成1mm浓度溶液(20μl，20nmol)，向溶液中依次加入酮类化合物(2000nmol,100当量，200mmdmso)，氢氧化钾(6000nmol，300当量，500mm双蒸水)，混合均匀，30℃反应1小时。

反应完毕后进行乙醇沉淀：向反应后的溶液中加入总体积10％的5m的氯化钠溶液，然后继续加入总体积的3倍的无水乙醇，振荡均匀后，将反应置于干冰中冷冻0.5小时，之后在12000rpm的转速下离心半个小时，倒掉上清液，余下沉淀用去离子水溶解，即得到20种on-dnaα,β-不饱和羰基化合物(3)的溶液，通过酶标仪od定量后，送lcms确认反应转化率。

综上所述，本发明通过控制反应时的溶剂、温度、ph等条件，在碱的存在下，由on-dna酮类化合物与醛基化合物反应或者通过on-dna醛化合物与酮类化合物反应得到on-dnaα,β-不饱和羰基化合物，该方法底物适用范围广，能够在有机溶剂/水相的混合水相中进行，操作简单，不引入金属类试剂，环境友好，适合使用多孔板进行的dna编码化合物库的合成。