含有活性云母的组合物在制备提高细胞内超氧化物歧化酶活性的药物中的应用的制作方法

[0001]
本发明属于生物大健康技术领域，具体涉及含有活性云母的组合物在制备提高细胞内超氧化物歧化酶(sod)活性的药物中的应用。


背景技术：

[0002]
有机锗等微量元素在岩石、土壤、地壳、水体中均有分布。人体中的部分酶以及大脑中的白质和灰质中都需要有机微量元素的参与。猴头、灵芝、生姜、红花、茴香、大豆等都是含有机微量元素较多的食物。有机微量元素具有抗肿瘤、消炎、清除自由基、抗脂质过氧化、抗骨质疏松、抗风湿性关节炎等生物学活性。近年来，有机微量元素合成研究逐步深入，多种相关抗癌药物问世，而富微量元素矿物、食品的研究很少，多处于实验阶段，但具有广阔的前景和价值。
[0003]
超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,sod)，是生命体中的的一种抗氧化金属酶，能够催化超氧阴离子歧化为氧和过氧化氢，能消除人体新陈代谢过程中产生的有害物质，具有抗衰老的特殊效果，与很多疾病的发生、发展密不可分。含不同金属离子的超氧化物歧化酶在功能上略有差异。kazuhiko等的研究表明mn-sod基因多态性可能是冠心病的一大诱因。lefaix和他的研究团队发现肌注cu/zn-sod能使辐射引起的皮肤纤维化衰退。适当的稳定剂及基质存在的条件下，补充外源sod可以调节人体代谢、提高免疫力，对防治某些疾病、机体损伤、延缓衰老有一定的作用。sod可被用作食品保鲜剂、抗氧化剂等，有着巨大的开发潜力。从矿物中开发富含微量元素的有机复合物具有成本低，高效快速，操作简单，原料丰富，安全且副作用小等特点；能够提高超氧化物歧化酶等金属酶活性的物质，在功能化妆品、食品及保健品的开发和应用上具有广泛的前景。然而目前，用于提高超氧化物歧化酶的物质多为有机化合物、生物肽或植物活性部位，关于有机微量元素发酵液在提高细胞内超氧化物歧化酶活性的研究几乎空缺。


技术实现要素：

[0004]
有鉴于此，本发明的目的在于提供含有活性云母的组合物在制备提高细胞内超氧化物歧化酶(sod)活性的药物中的应用，所述组合物能增加细胞内超氧化物歧化酶活性，为今后在人体清除自由基、抗衰老、美容等大健康产业中的应用提供了依据。
[0005]
本发明提供了含有活性云母的组合物在制备提高细胞内超氧化物歧化酶活性的药物中的应用。
[0006]
本发明提供了含有活性云母的组合物在制备治疗超氧化物歧化酶活性降低的疾病的药物中的应用。
[0007]
优选的，所述疾病包括炎症、肿瘤、癌症和自身免疫性疾病。
[0008]
优选的，所述癌症包括胃癌。
[0009]
本发明提供了含有活性云母的组合物在制备抗衰老或抗氧化的药物中的应用。
[0010]
本发明提供了含有活性云母的组合物在制备抗衰老的护肤品或化妆品中的应用。
[0011]
本发明提供了含有活性云母的组合物在制备延缓衰老的保健品或保健饮料中的应用。
[0012]
优选的，所述含有活性云母的组合物的制备方法包括以下步骤：
[0013]
准确称量以下重量份的组分：2～6份硅酸盐类矿物、3～8份溶剂、0.5～2份梅果；所述的溶剂选自水、醇类溶剂、醚类溶剂中的至少一种；
[0014]
将硅酸盐类矿物的粉末、溶剂、去核的梅果加入到发酵罐中，混合并发酵，发酵时间总共为130～150天，得到混合物；
[0015]
将混合物进行过滤，所得滤液即为含有活性云母的组合物。
[0016]
优选的，所述硅酸盐类矿物选自花岗岩、珍珠岩、绿柱岩、变质岩和玄武岩中的至少一种；
[0017]
优选的，所述的醇类溶剂选自甲醇、乙醇、正丙醇、正丁醇、异戊醇、乙基己醇、乙二醇和丙二醇中的至少一种；
[0018]
所述的醚类溶剂选自甲醚、乙醚、丙醚、异丙醚、丁醚、戊醚、异戊醚、己醚、乙基丁基醚、甲基叔丁基醚、乙基乙烯基醚、丁基乙烯基醚中的至少一种。
[0019]
优选的，所述的梅果选自青梅、乌梅、西梅中的至少一种。
[0020]
本发明提供了含有活性云母的组合物在制备提高细胞内超氧化物歧化酶活性的药物中的应用。在体外，用不同比例稀释的含有活性云母的组合物作用于sgc-7901细胞24h，充分裂解细胞取上清作为待测样品，采用总sod活性检测法(wst-8法)检测其超氧化物歧化酶活性，以判断其抗氧化、抗衰老性能，结果表明含有活性云母的组合物可以提高细胞内超氧化物歧化酶活性，且在一定稀释度(低于50％)条件下能维持细胞正常的生长形态。基于该结果，将含有活性云母的组合物在制备抗氧化、抗衰老的药物或化妆品中的应用，进而提供一种新的抗衰老、抗氧化的手段。
具体实施方式
[0021]
本发明提供了含有活性云母的组合物在制备提高细胞内超氧化物歧化酶活性的药物中的应用。
[0022]
在本发明中，所述含有活性云母的组合物的制备方法可参见公开号cn110628826a、发明名称为一种含有活性云母的组合物及其生物发酵制备方法的专利中公开的含有活性云母的组合物的制备方法。
[0023]
在本发明中，在体外或体内应用时，含有活性云母的组合物的稀释度优选为5％～100％，更优选为50％～80％，最优选为60％。细胞水平实验结果表明，不同稀释度的含有活性云母的组合物可以不同程度地提高细胞内超氧化物歧化酶活性，浓度为60％时活力提升最多，与对照相比可以提高sod的活性近9倍，同时含有活性云母的组合物本身不具有超氧化物歧化酶活性。
[0024]
本发明实验证明，含有活性云母的组合物可提高细胞内超氧化物歧化酶活性，基于此，本发明提供了含有活性云母的组合物在制备治疗超氧化物歧化酶活性降低的疾病的药物中的应用。所述疾病优选包括炎症、肿瘤、癌症和自身免疫性疾病。所述癌症优选包括胃癌。为了举例说明含有活性云母的组合物可提高细胞内超氧化物歧化酶活性的作用，本
发明实施例中以sgc-7901细胞(人胃癌细胞系)为材料进行处理，但这不应理解为对本发明保护范围的限制。所述sgc-7901细胞(人胃癌细胞系)由吉林大学分子酶学工程教育部重点实验室保存，也可以购自广州塞库生物技术有限公司。
[0025]
由于超氧化物歧化酶为自由基清除剂，它广泛存在于生物体的各种组织中，能清除自由基o
2
·-(超氧阴离子自由基)，而o
2
·-具有细胞毒性，可使脂质过氧化，促使机体衰老，因此，本发明提供了含有活性云母的组合物在制备抗衰老或抗氧化的药物中的应用。本发明还提供了含有活性云母的组合物在制备抗衰老的化妆品或护肤品中的应用。本发明提供了含有活性云母的组合物在制备延缓衰老的保健品或保健饮料中的应用。含有活性云母的组合物参见公开号cn 110628826a的专利，在此不做赘述。
[0026]
下面结合实施例对本发明提供的含有活性云母的组合物在制备提高细胞内超氧化物歧化酶活性的药物中的应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
[0027]
实施例1
[0028]
一种含有活性云母的组合物的制备方法，包括以下步骤：
[0029]
(1)准确称量以下重量的原料：4kg花岗岩、5kg水、1kg青梅；
[0030]
(2)将花岗岩粉碎至0.5～0.8cm并用振动机进行清洗；将梅果去核；
[0031]
(3)将花岗岩、水、青梅加入到发酵罐中，混合并在45℃条件下发酵140天，得到混合物；
[0032]
(4)将混合物进行过滤，所得滤液即为含有活性云母的组合物。
[0033]
实施例2
[0034]
一种含有活性云母的组合物的制备方法，包括以下步骤：
[0035]
(1)准确称量以下重量的原料：4kg石灰石、5kg水、1kg青梅；
[0036]
(2)将花岗岩粉碎至0.5～0.8cm并用振动机进行清洗；将梅果去核；
[0037]
(3)将花岗岩、水、青梅加入到发酵罐中，混合并在45℃条件下发酵140天，得到混合物；
[0038]
(4)将混合物进行过滤，所得滤液即为含有活性云母的组合物。
[0039]
实施例3
[0040]
一种含有活性云母的组合物的制备方法，包括以下步骤：
[0041]
(1)准确称量以下重量的原料：4kg花岗岩、5kg水、2kg青梅；
[0042]
(2)将花岗岩粉碎至0.5～0.8cm并用振动机进行清洗；将梅果去核；
[0043]
(3)将花岗岩、水、青梅加入到发酵罐中，混合并在45℃条件下发酵140天，得到混合物；
[0044]
(4)将混合物进行过滤，所得滤液即为含有活性云母的组合物。
[0045]
实施例4
[0046]
含有活性云母的组合物的浓度测定
[0047]
随机选取4支流式管，标号为1、2、3和4，并分别称重；每管内加入1ml实施例1制备的含有活性云母的组合物，电热鼓风干燥箱中充分干燥后，称取每管重量，并计算平均浓度，结果见表1。
[0048]
表1 4支流式管中含有活性云母的组合物的平均浓度
[0049][0050]
实施例5
[0051]
细胞内超氧化物歧化酶活性检测方法
[0052]
超氧化物歧化酶活性检测采用碧云天公司(beyotime biotechnology)总sod活性检测试剂盒(wst-8法)(产品编号：s0101s)完成。
[0053]
wst-8法的原理：wst-8可以和黄嘌呤氧化酶(xanthine oxidase,xo)催化产生的超氧化物阴离子(o
2
·-)反应产生水溶性的甲臜染料(formazan dye)，由于sod能催化超氧化物阴离子发生歧化作用，所以该反应步骤可以被sod所抑制，因此sod的活性与甲臜染料的生成量成负相关，从而通过对wst-8产物的比色分析即可计算sod的酶活力。
[0054]
取实施例1制备的含有活性云母的组合物过滤除菌，4℃保存备用。按照表2的稀释方法对所述组合物进行稀释，用来孵育sgc-7901细胞。
[0055]
表2不同稀释度的含有活性云母的组合物配比情况
[0056][0057][0058]
将sgc-7901细胞(人胃癌细胞系)采用含有体积分数为10％的胎牛血清、100u/ml青霉素、100μg/ml链霉素的dmem细胞培养液，在37℃，5％的co
2
条件下进行培养及传代。细胞传代至第三代时，按照2
×
10
5
个/孔的细胞密度接种于六孔板中，在相同条件下培养24h，弃去培养基，每孔用1ml pbs清洗两次后，分别加入预先稀释好的含有不同浓度的含有活性
云母的组合物的培养基2ml，继续孵育24h。孵育结束后，吸净细胞培养液，用4℃预冷的pbs洗涤一遍，弃上清后每孔加入500μl试剂盒中提供的sod样品制备液，适当吹打以充分裂解细胞。在4℃、12,000g条件下离心5min，取上清作为待测样品。为了更好的说明含有活性云母的组合物可以提高细胞内超氧化物歧化酶活性，而自身不具有超氧化物歧化酶活性，将过滤除菌后的含有活性云母的组合物也加入到待测样品中进行检测。
[0059]
按照碧云天总sod活性检测试剂盒(wst-8法)中工作液的配制方法配制工作液。
[0060]
wst-8/酶工作液的配制：按照每个反应160μl的体积配制适量的wst-8/酶工作液。均匀混合151μl sod检测缓冲液、8μlwst-8和1μl酶溶液，即可配制成160μlwst-8/酶工作液。根据待检测样品(包括标准品)的数量，配制30个样品的wst-8/酶工作液。配制好的wst-8/酶工作液冰浴保存。
[0061]
反应启动工作液的配制：把试剂盒中的反应启动液(40x)融解后混匀，按照每1μl反应启动液(40
×
)加入39μl sod检测缓冲液的比例进行稀释，混匀后即为反应启动工作液。根据待检测样品(包括标准品)的数量，配制15个样品的反应启动工作液。配制好的反应启动工作液冰浴保存。
[0062]
样品测定：按照表3所示的体积在96孔板中进行加样，每个待测样品都设置了空白对照3，反应启动工作液最后加入且加入速度要快。
[0063]
表3不同处理组的加样情况
[0064][0065]
加样后，在37℃条件下孵育30min。在450nm测定吸光度。
[0066]
吸光度检测结果如表4。
[0067]
表4不同处理组的吸光度检测值
[0068][0069][0070]
按照下面公式i计算抑制百分率。
[0071]
抑制百分率＝[(a
空白对照1
－a
空白对照2
)－(a
待测样品
－a
空白对照3
)]/(a
空白对照1
－a
空白对照2
)
×
100％
ꢀꢀ
公式i
[0072]
抑制百分率计算结果如表5。
[0073]
表5不同稀释度的含有活性云母的组合物的抑制率
[0074][0075]
sod酶活力按公式ii计算：
[0076]
待测样品中sod酶活力单位＝检测体系中sod酶活力单位＝抑制百分率/(1-抑制百分率)units
ꢀꢀꢀꢀ
公式ii
[0077]
sod酶活力计算结果见表6。
[0078]
表6不同稀释度的含有活性云母的组合物的sod酶活力
[0079]
[0080][0081]
为了减小组间误差，采用bca定量法测定蛋白浓度对样品归一化处理。标准品bsa用sod样品制备液进行溶解，bsa含量和578nm处吸光度值如表7所示。
[0082]
表7不同bsa含量在578nm处吸光度值
[0083][0084]
以578nm处吸光度值为y轴，bsa含量为x轴作图，得到标准曲线方程y＝33.584x+0.135，r
2
＝0.9965。
[0085]
待测样品在578nm处吸光度值及对应蛋白含量见表8。
[0086]
表8待测样品的吸光度值和蛋白含量
[0087]
[0088][0089]
归一化后的sod酶活力(units/mg)如表9所示。
[0090]
表9用不同稀释度的含有活性云母的组合物处理后细胞sod酶活力
[0091][0092]
由表9中数据可知，不同浓度的云母发酵液可以不同程度地提高细胞内超氧化物歧化酶活性，浓度为60％时活力提升最多，与对照相比可以提高sod的活性近9倍，而含有活性云母的组合物本身不具有超氧化物歧化酶活性。
[0093]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应
视为本发明的保护范围。