焦白术碳点（纳米粒子）的制备及其应用1.说明书
技术领域：
：2.本发明属于医药
技术领域：
：，特别涉及焦白术碳点(纳米类成分/纳米粒子/颗粒)的制备及在医药领域的应用。
背景技术：
：：3.综观白术炮制的历史记载，白术的“火制”法应用历史悠久，其炮制方法多样，临床应用亦十分广泛。古今临床实践和现代药理学研究中已证明，火制法可增强白术“健脾和胃”功效，但其具体机理仍未被充分揭示。其中，尤其是对于“焦白术”的研究，仍沿用传统的中药物质基础研究思路，未能阐释其关键物质基础和药效作用机制，影响了临床应用的发展。4.近年来，胃溃疡的治疗虽取得一定进展，但仍面对诸多难以突破的困境，如胃溃疡复发率高，出血并发症难以控制，药物的副作用，细菌耐药性的产生等等。而中医药对于胃溃疡的治疗有着独到优势。因此，研究白术药材加工炮制后所得的新型成分药物对于胃溃疡的治疗有重要意义。技术实现要素：5.本发明首次从焦白术中提取分离出碳点(纳米类成分/纳米颗粒/纳米粒子)，并首次发现了焦白术碳点具有较强的抗胃溃疡的生物效应。6.技术方案：本发明提供了从焦白术中提取分离出碳点的方法。本发明还提供了焦白术碳点的生物活性及其在医药领域中的应用。焦白术中的纳米类成分对胃溃疡疾病有明确治疗作用，并对肠道菌群有一定调控作用。7.所述制备方法，具体包括以下步骤：马弗炉煅烧法制备焦白术，用溶剂从焦白术中提取出碳点，进一步分离纯化包括透析、超滤、离心、萃取等技术方法，得到高纯度的碳点。附图说明8.图1是焦白术中透析袋内成分的透射电镜(tem)和高分辨透射电镜(hrtem)图谱(a.焦白术透析袋内成分的tem图；b.焦白术透析袋内成分的粒径分布图；c.焦白术透析袋内成分的hrtem图；d.焦白术透析袋内成分的晶格间距测量图)。9.图2是焦白术透析袋内成分的光学和红外表征图(a.紫外光谱(uv-vis)和荧光光谱图(fl)，ex为激发光谱，em为发射光谱；b.红外光谱图(ftir)10.图3是不同条件下制备的cam-ncs对小鼠胃溃疡程度的影响a.小鼠胃黏膜损伤情况照片a.正常组(normal)；b-f组小鼠给予酒精(etoh)灌胃造模，分别为b.模型组(model)；c.250℃cam-ncs组；d.300℃cam-ncs组；e.350℃cam-ncs组；f.400℃cam-ncs组；b.小鼠胃溃疡面积比率；c.小鼠胃溃疡评分。11.图4是不同条件制备的cam-ncs对于小鼠胃组织炎症因子il-1β和tnf-α含量的影响。12.图5是cam-ncs对吲哚美辛致胃溃疡小鼠胃黏膜的影响，各组分别为正常组(normal)、模型组(model)、阳性药雷尼替丁组(control)、cam-ncs低剂量组(l)、cam-ncs中剂量组(m)和cam-ncs高剂量组(h)。a.小鼠胃黏膜损伤情况照片；b.小鼠胃黏膜体视显微镜下影像(10×)；其中a.b.中b-f.表示吲哚美辛造模小鼠；c.胃溃疡面积比率；d.胃溃疡评分。13.图6是吲哚美辛致胃溃疡小鼠胃组织中il-1β、tnf-α、nf-κb、pge2含量的影响a.白介素-1β(il-1β)；b.肿瘤坏死因子-α(tnf-α)；c.核因子-κb(nf-κb)；d.小鼠前列腺素e2(pge2)含量。各组分别为正常组(normal)、模型组(model)、阳性药对照组(control)、cam-ncs低剂量组(l)、cam-ncs中剂量组(m)和cam-ncs高剂量组(h)。具体实施方式14.实施例1：焦白术碳点(cam-ncs)的制备15.1)马弗炉煅烧16.采用购置的同一批次的白术饮片(am)进行实验，将饮片称量后装入坩埚，每个坩埚分别装100g饮片。用铝箔纸覆盖坩埚口，盖紧盖子，放于马弗炉中加热。考察温度条件为200℃、250℃、300℃、350℃、400℃、450℃。17.马弗炉升温流程如下：从室温升至70℃，升温过程时长5min，于70℃维持25min；继而从70℃升至待考察的目标温度(200℃、250℃、300℃、350℃、400℃、450℃)，升温过程时长15min，于待考察的目标温度维持1h。按照上述考察的不同温度程序加热完成后，立即打开马弗炉的炉门，温度自然冷却至室温后。将坩埚取出，坩埚中产物即为焦白术(cam)。观察药材质地状态，掰开肉眼观察内外颜色，记录炭化程度情况，并置于体视显微镜下观察拍照。对cam称量，记录不同温度下加热后制备的质量，并且计算炭化产率(炭化产率％＝炭化产物cam质量/生药am质量×100)。18.2)煎煮19.将不同条件制备的cam粉碎，粉末放入烧杯中，加入20倍量的去离子水在100℃水浴中煎煮三次，煎煮时注意搅拌。将三次的水煎液合并。先在布氏漏斗中铺双层滤纸，对合并的水煎液进行减压过滤，然后将溶液转移至溶剂过滤器，通过0.22μm微孔滤膜再次过滤。继而使用旋转蒸发仪对滤液进行浓缩，至溶液浓度为2g/ml(以cam的质量/溶液体积计算)。20.3)纯化21.使用透析和高速离心的方法进一步分离纯化cam-ncs。将过滤浓缩后的cam溶液移入截留分子量为1000da的透析袋中，透析袋是一种半透膜，可以除去cam中分子量小于1000da的小分子成分，分子量大于1000da的成分分子将被截留于袋内。将透析袋置于烧杯中，加20倍量去离子水，并放置于磁力搅拌器上透析10天，期间每天更换去离子水数次。将透析袋内的液体取出，转移至离心管，于冷冻离心机中高速离心，转速为11000r/min，保留上清液，弃去离心管底部固体。高速离心方法可去除较大颗粒成分，使纳米颗粒粒径均一、稳定。所得澄清溶液即为cam-ncs溶液，将其定容为1g/ml(按cam的质量/溶液最终体积计算)。取10ml溶液烘干，称量析出粉末的质量，计算cam-ncs产率(cam-ncs产率％＝cam-ncs质量/cam质量×100)。22.4)焦白术物理化学性质表征23.采用电镜技术(高、低分辨电镜)、光学技术(紫光可见光分析技术)表征并分析焦白术碳点的形貌特征、官能团变化等物理化学特征。24.如图1a，tem观察结果显示，焦白术有效部位即透析袋内溶液中分布近球形颗粒，溶液中颗粒在水中的分散度良好，粒径分布如图1b所示，主要分布在1-25nm之间，直径平均为15.56±2.99nm。hrtem显示(图1c、d)该纳米颗粒晶格间距为0.367nm。25.由uv-vis图谱(图2a)可见，焦白术透析袋内成分无明显紫外吸收峰；由fl图谱可得，焦白术透析袋内成分在445nm发射波长下，呈现明显的激发光谱峰(ex)，在300nm激发波长下，呈现明显的发射峰(em)。26.ftir图谱(图2b)显示，约在3433cm-1、2921cm-1、1632cm-1、和1384cm-1、1062cm-1有吸收峰。根据3433cm-1宽吸收峰是由于分子间氢键的伸缩振动产生，提示了o-h伸缩振动的存在。2921cm-1的吸收峰对应ch3-和ch2-中的c-h伸缩振动。1632cm-1处的尖峰可能是由于c＝o存在引起的。1300-1480cm-1峰为c-n的弯曲振动。1062m-1的吸收峰由c-o-c伸缩振动引起。27.实施例2.不同温度制备的焦白术碳点的抗酒精性胃溃疡作用28.1)实验动物29.本实验采用spf级昆明小鼠(北京斯贝福生物技术有限公司)，体重30±3.0g，小鼠为雄性，所有小鼠在同一条件下饲养，温度24.0±1.0℃，相对湿度55-65％，自由饮水、进食。动物实验由北京中医药大学动物实验伦理委员会批准(伦理号bucm-4-2018101601-4006)。30.2)实验动物给药、造模和取材31.将48只雄性昆明小鼠，随机分为6组：正常组(normal)、模型组(model)、250℃cam-ncs组、300℃cam-ncs组、350℃cam-ncs组、400℃cam-ncs组。小鼠适应性饲养2天后，开始连续灌胃给药5天，正常组、模型组给予去离子水，各温度条件制备的cam-ncs按焦白术的质量比小鼠体重计算，给药剂量1.5g/kg。于给药第4天后开始禁食不禁水，共禁食24h，于给药的第5天，灌胃给药2h后，对模型组和各给药组给予95％乙醇(0.1ml/10g)灌胃造模。造模1h后，将小鼠脱颈处死。沿腹中线剪开，沿小鼠胃贲门和幽门小心将胃剪下，并沿胃大弯剪开，轻轻清理胃中内容物，注意不可造成胃粘膜人为损伤，后迅速转移至4℃生理盐水中清洗残留内容物。于滤纸吸干生理盐水后，将小鼠胃置于冰上对其内表面形态拍照记录，观察胃损伤情况，并进行溃疡程度评估。拍照后，将胃组织于液氮冻存，后保存于-80℃冰箱。32.3)不同条件制备的cam-ncs对小鼠胃溃疡模型的影响33.用胃溃疡评分和借用软件识别胃溃疡面积两种不同的评估方法，对胃溃疡程度进行评价，对比各组小鼠胃溃疡情况。34.胃溃疡面积比率：采用imagej软件，统计每只小鼠的胃溃疡面积，和全胃面积，计算小鼠胃溃疡比例。小鼠胃溃疡比率(％)＝小鼠胃溃疡面积/小鼠全胃面积×100％。35.溃疡抑制率(％)＝(模型组胃溃疡面积比率-给药组胃溃疡面积比率)/模型组胃溃疡面积比例×100％36.胃溃疡指数评分：对小鼠的胃溃疡情况作分数统计，方法如下：完整的胃黏膜为0分；点状损伤计0.5分；损伤呈条索状并且长度＞1mm者，每1mm计1分；若损伤呈块状且宽度＞1mm者，按测量面积计分。累计以上评分的总数为该小鼠的溃疡指数，并按下列公式计算各给药组的抗溃疡指数。根据胃溃疡指数计算得出抗溃疡指数，方法如下：37.抗溃疡指数＝(模型组溃疡指数均值-给药组溃疡指数)/模型组溃疡指数38.4)不同条件制备的cam-ncs对小鼠胃组织炎症因子的影响39.取2中冻存备用的小鼠胃组织称重后放入ep管中，按1∶9的比例加入生理盐水，向每个离心管中加入研磨珠。使用冷冻混合球磨仪(600r/min，15min)对胃组织进行充分粉碎研磨，制备胃组织匀浆液。取出离心管后，放入离心机进行离心(3000r/min，30min)以分离匀浆液上清，弃去离心管底部固体组织残渣，将分离后的上清用pbs缓冲液稀释。40.按elisa试剂盒说明书方法，检测小鼠胃组织中肿瘤坏死因子-α(tnf-α)，白细胞介素-1β(il-1β)。41.实施例2结果分析42.1)不同条件制备的cam-ncs对小鼠胃溃疡模型的影响43.小鼠胃内表面实况拍摄照片如图3，正常组无出血，胃黏膜完整。模型组出血部位较多，出血区域呈块状或连成片，局部水肿。cam-ncs给药各组相比于模型组，出血明显减少，各组出血情况有差异，但肉眼较难衡量差异大小。需根据溃疡量化结果评价筛选药效最佳温度。44.由图3b、c及表1可知，各温度制备的cam-ncs组(250℃cam-ncs组、300℃cam-ncs组、350℃cam-ncs组、400℃cam-ncs组)胃溃疡面积比率和溃疡指数均较模型组显著降低(p＜0.001)，溃疡抑制率和抗溃疡指数显著升高(p＜0.001)。350℃cam-ncs组胃溃疡面积比率和胃溃疡评分最低，溃疡抑制率和抗溃疡指数最高，而400℃cam-ncs组溃疡抑制率和抗溃疡指数在四个温度中相对较低。故350℃可能为cam-ncs最佳制备温度，后续结合炎症因子进一步评价药效。45.表1不同条件下制备的cam-ncs对小鼠胃溃疡程度的影响46.table1.theeffectofcam-ncspreparedunderdifferentconditionsongastriculcerinmice.[0047][0048]注：与模型组比较：***p＜0.001；与正常组比较：###p＜0.001。[0049]2)不同条件制备的cam-ncs对小鼠胃组织炎症因子的影响[0050]由图4可见，模型组与正常组相比，小鼠胃组织中il-1β和tnf-α含量显著升高(p＜0.001)。与模型组比较，各温度制备的cam-ncs组(250℃cam-ncs组、300℃cam-ncs组、350℃cam-ncs组和400℃cam-ncs组)小鼠胃组织il-1β和tnf-α含量显著降低(p＜0.001)，其中350℃cam-ncs给药组il-1β和tnf-α含量最低，提示小鼠炎症反应相对较弱，推测350℃药效最好，与前所述溃疡程度结果评估一致。[0051]实施例3.焦白术碳点的抗吲哚美辛所致胃溃疡作用[0052]1)实验动物分组与给药[0053]分组将48只体重均一的雄性昆明小鼠，随机分为6组：正常组(normal)、模型组(model)、阳性药雷尼替丁组(control)、cam-ncs低剂量组(l)、cam-ncs中剂量组(m)、cam-ncs高剂量组(h)。[0054]给药小鼠适应性饲养1天后，开始连续灌胃给药5天，其中，正常组与模型组给予去离子水，阳性药组和各cam-ncs给药组分别给予相应药物溶液。其中阳性药雷尼替丁组给药量为由人体用药量按体表面积换算成小鼠等效剂量，即40mg/kg。给药组剂量由焦白术的人体用药剂量每日5g/70kg，15g/70kg，和60g/70kg分别设定为低、中、高剂量组，换算为小鼠用药剂量为：cam-ncs低剂量组(0.64g/kg，以cam的质量计算)、中剂量cam-ncs(1.92g/kg，以cam的质量计算)、高剂量cam-ncs(7.71g/kg，以cam的质量计算)。于给药第4天后开始禁食，共禁食24h，保持自由饮水。[0055]造模与取材于给药的第5天，各组灌胃给药1h后，对模型组、阳性药组和cam-ncs低、中、高剂量组进行造模，造模方法每只小鼠灌胃给予吲哚美辛0.1g/kg，8h后采用摘眼球取血方式收集小鼠血液，4℃冰箱静置备用。沿小鼠胃贲门和幽门小心将胃剪下，并沿胃大弯剪开，轻轻清理胃中内容物，注意不可造成胃粘膜人为损伤，后迅速转移至4℃生理盐水中清洗残留内容物。于滤纸吸干生理盐水后，将小鼠胃置于冰上，转移至电子体视显微镜下观察并留存影像，同时使用相机拍照记录，观察胃损伤情况，并进行溃疡程度评估。随后从胃纵切面剪取一半胃组织置于4％多聚甲醛固定液中进行固定，固定液的体积须达到胃组织体积的20倍以上，另一半胃组织置于冻存管中，放入液氮冻存。[0056]2)小鼠胃溃疡程度的评估[0057]用胃溃疡评分和借用imagej软件识别胃溃疡面积两种不同的评估方法，计算抗溃疡指数、胃溃疡比率、溃疡抑制率。评估方法同第四章第一节2.3项。[0058]3)酶联免疫吸附法检测[0059]采用酶联免疫吸附法(elisa)检测小鼠胃组织中肿瘤坏死因子-α(tnf-α)、白细胞介素-1β(il-1β)、小鼠前列腺素e2(pge2)含量、小鼠核因子κb(nf-κb)，按照各试剂盒说明书进行操作。[0060]实施例3结果分析[0061]1)小鼠胃溃疡程度评估[0062]由图5a、b可见，正常组胃粘膜完好，无损伤出血。模型组胃体痉挛，出血量多，清理内容物后，可见黏膜表面有线状、点出血区域，颜色较深。相比于模型组，各给药组胃黏膜出血情况均明显减轻。阳性药组和cam-ncs低剂量组、cam-ncs中剂量组和cam-ncs高剂量组胃中出血量减少，出血区域呈点状，几乎无线状损伤，个别无肉眼可见损伤。[0063]对胃溃疡情况进行量化和评分，评估方法分为imagej软件损伤面积识别和人工损伤指数评分两种方式进行。根据图5c、d以及表10所示，与正常组相比，模型组胃溃疡面积比率和溃疡指数有极显著的差异(p＜0.001)。与模型组相比，各给药组胃溃疡面积比率显著降低(p＜0.001)。在溃疡指数评估中，与模型组相比，阳性药组和cam-ncs低剂量组的溃疡指数降低(p＜0.05)，cam-ncs中剂量组(p＜0.001)和高剂量组(p＜0.01)的溃疡指数均显著降低。其中cam-ncs中剂量组溃疡抑制率和抗溃疡指数最高，cam-ncs高剂量组其次，是给药组中抗溃疡作用最强的两个组别。说明在合适剂量下，cam-ncs抗溃疡药效比阳性药组更强。[0064]表2cam-ncs对吲哚美辛致胃溃疡小鼠模型的影响[0065]table.effectsofcam-cdsongastricmucosainindomethacin-inducedgastriculcermice.[0066][0067]注：与模型组比较，各组数据有显著性差异的表示为：***p＜0.001，**p＜0.01，*p＜0.05；与正常组比较，模型组数据有显著性差异则表示为：###p＜0.001。[0068]2)cam-ncs对胃组织中细胞因子il-1β、tnf-α的影响[0069]如图6a所示，与正常组(80.60±9.821pg/ml)小鼠胃组织中il-1β含量相比，模型组(185.6±8.208pg/ml)显著升高(p＜0.001)。相比于模型组的il-1β含量，阳性药雷尼替丁组(131.8±8.124pg/ml)、cam-ncs低剂量组(150.2±3.970pg/ml)、cam-ncs中剂量组(138.9±8.004pg/ml)、cam-ncs高剂量组(97.48±7.019pg/ml)含量均显著降低(p＜0.001)，其中，cam-ncs高剂量组il-1β含量最接近正常组。[0070]如图6b所示，与正常组(358.7±46.88pg/ml)小鼠胃组织中tnf-α含量相比，模型组(766.7±30.52pg/ml)显著升高(p＜0.001)。相比于模型组的il-1β含量，阳性药雷尼替丁组(545.7±36.96pg/ml，p＜0.001)、cam-ncs低剂量组(586.9±92.64pg/ml，p＜0.05)、cam-ncs中剂量组(471.3±115.2pg/ml，p＜0.001)、cam-ncs高剂量组(554.7±27.07pg/ml，p＜0.001)含量均显著降低，其中，cam-ncs中剂量组tnf-α含量最接近正常组。[0071]3)cam-ncs对胃组织中nf-κb的影响[0072]如图6c所示，与正常组(737.3±81.92pg/ml)小鼠胃组织中nf-κb含量相比，模型组(1515±57.64pg/ml)显著升高(p＜0.001)。相比于模型组的il-1β含量，阳性药雷尼替丁组(1199±66.02pg/ml，p＜0.001)、cam-ncs低剂量组(1243±73.51pg/ml，p＜0.05)、cam-ncs中剂量组(893.4±65.89pg/ml，p＜0.001)、cam-ncs高剂量组(1280±47.58pg/ml，p＜0.05)含量均显著降低，其中，cam-ncs中剂量组nf-κb含量最接近正常组。[0073]4)cam-ncs对胃组织中pge2的影响[0074]如图6d所示，与正常组(720.6±17.77pg/ml)小鼠胃组织中pge2含量相比，模型组(322.9±53.57pg/ml)显著降低(p＜0.001)。相比于模型组的pge2含量，阳性药雷尼替丁组(343.3±91.34pg/ml)含量无统计学差异，而cam-ncs低剂量(500.1±30.26pg/ml，p＜0.05)、cam-ncs中剂量(663.2±40.79pg/ml，p＜0.001)、cam-ncs高剂量(469.0±45.64pg/ml，p＜0.05)组pge2含量均比模型组显著升高。各给药组中，cam-ncs高剂量组pge2含量与正常组最接近。[0075]综上，吲哚美辛对胃组织的损伤可造成模型小鼠的炎症反应，表现为胃组织中il-1β、tnf-α、nf-κb含量显著升高，而cam-ncs能够通过抑制nf-κb，显著降低模型组炎症因子水平，减轻炎症反应。同时，在模型组中，对于胃黏膜有保护作用的pge2显著降低，而三个剂量cam-ncs能够显著提高模型组pge2含量，提高胃黏膜防御能力。当前第1页12当前第1页12