本发明属于水产领域，尤其是涉及一种抑制气单胞菌属的组合物及其制备方法与应用。
背景技术：
：我国是水产养殖大国，水产品的养殖密度和产量均较高，但由于养殖技术和设施落后，常导致鱼类细菌性疾病的频繁发生。目前以抗生素为主的药物防治是仍然是养殖生产中最有效、最直接的方法，对于防治鱼类细菌病发挥着非常重要的作用。但生产实践中长期使用抗生素，会导致短时间内耐药菌株层出不穷。技术实现要素：有鉴于此，本发明旨在克服现有技术中的缺陷，提出一种抑制气单胞菌属的组合物及其制备方法与应用。为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：一种抑制气单胞菌属的组合物，该组合物由包括如下重量份的原料制成：多西环素0.001-0.1份，鸡血藤提取物10-100份，千斤拔提取物10-100份。优选的，所述的组合物由包括如下重量份的原料制成：多西环素0.001-0.05份，鸡血藤提取物10-50份，千斤拔提取物50-100份。优选的，所述的组合物由包括如下重量份的原料制成：多西环素0.008-0.028份，鸡血藤提取物32-50份，千斤拔提取物85-100份。进一步，所述的千斤拔提取物由包括如下步骤制备得到：将千斤拔粉碎过筛后得到千斤拔粉末，将所述的千斤拔粉末加入到10-30倍量的浓度为60-70％的乙醇中，浸提1-2小时，将得到的浸提液在80-90℃下回流提取，然后浓缩后得到所述的千斤拔提取物。所述的抑制气单胞菌属的组合物的制备方法，包括如下步骤：将鸡血藤提取物与千斤拔提取物混合均匀，然后向其中加入多西环素混合均匀后即成。一种鸡血藤提取物的制备方法，包括如下步骤：(1)将鸡血藤粉碎过筛后得到鸡血藤粉末，将得到的粉末在60-90℃下加热5-30分钟；(2)然后将加热后的粉末分为三份质量相同的鸡血藤粉末，将第一份鸡血藤粉末加入到10-30倍量的浓度为40-55％的乙醇中，浸提12-24小时，得到浸提液a，将第二份鸡血藤粉末加入到10-30倍量的浓度为60-75％的乙醇中，浸提12-24小时，得到浸提液b，将第三份鸡血藤粉末加入到10-30倍量的浓度为80-95％的乙醇中，浸提24-48小时，得到浸提液c；(3)将所述的浸提液a、浸提液b与浸提液c混合均匀后过滤，将得到的滤液旋转蒸后即得。进一步，所述的步骤(1)中的加热步骤的温度为60-80℃，时间为15-30分钟；所述的步骤(2)中的第一份鸡血藤粉末加入到浓度为50-55％的乙醇中，第二份鸡血藤粉末加入到浓度为60-65％的乙醇中，第三份鸡血藤粉末加入到浓度为80-90％的乙醇中。一种鸡血藤提取物，述的提取物由所述的方法制备得到。一种抑制气单胞菌属的组合物在制备抑制气单胞菌属细菌的药物中的应用。进一步，所述的组合物包含多西环素、鸡血藤提取物和千斤拔提取物。相对于现有技术，本发明具有以下优势：本发明所述的一种抑制气单胞菌属的组合物中含有多西环素、鸡血藤提取物和千斤拔提取物，其三者的组合对气单胞菌属细菌有明显的抑制作用，该组合物可用于制备药剂与饲料添加剂。具体实施方式除有定义外，以下实施例中所用的技术术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的试验试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下面结合实施例来详细说明本发明。本发明实施例中所述的舒伯特气单胞菌菌株、嗜水气单胞菌、斑点气单胞菌由中国水产科学研究院珠江水产研究所水产病害与免疫研究室馈赠。实施例1鸡血藤提取物的制备将鸡血藤粉碎过筛后得到鸡血藤粉末，准确称量600g粉末在80℃下加热20分钟；然后将加热后的粉末分为三份质量相同的鸡血藤粉末，将第一份鸡血藤粉末加入到20倍量的浓度为50％的乙醇中，浸提12小时，得到浸提液a，将第二份鸡血藤粉末加入到20倍量的浓度为60％的乙醇中，浸提12小时，得到浸提液b，将第三份鸡血藤粉末加入到20倍量的浓度为90％的乙醇中，浸提48小时，得到浸提液c；将所述的浸提液a、浸提液b与浸提液c混合均匀后过滤，将得到的滤液旋转蒸后得到鸡血藤提取物a。将鸡血藤粉碎过筛后得到鸡血藤粉末，准确称量600g粉末在50℃下加热20分钟；然后将加热后的粉末分为三份质量相同的鸡血藤粉末，将第一份鸡血藤粉末加入到20倍量的浓度为50％的乙醇中，浸提12小时，得到浸提液a，将第二份鸡血藤粉末加入到20倍量的浓度为60％的乙醇中，浸提12小时，得到浸提液b，将第三份鸡血藤粉末加入到20倍量的浓度为90％的乙醇中，浸提48小时，得到浸提液c；将所述的浸提液a、浸提液b与浸提液c混合均匀后过滤，将得到的滤液旋转蒸后得到鸡血藤提取物b。将鸡血藤粉碎过筛后得到鸡血藤粉末，准确称量600g粉末在50℃下加热20分钟；然后将加热后的粉末分为三份质量相同的鸡血藤粉末，将第一份鸡血藤粉末加入到20倍量的浓度为35％的乙醇中，浸提12小时，得到浸提液a，将第二份鸡血藤粉末加入到20倍量的浓度为50％的乙醇中，浸提12小时，得到浸提液b，将第三份鸡血藤粉末加入到20倍量的浓度为70％的乙醇中，浸提48小时，得到浸提液c；将所述的浸提液a、浸提液b与浸提液c混合均匀后过滤，将得到的滤液旋转蒸后得到鸡血藤提取物c。将鸡血藤粉碎过筛后得到鸡血藤粉末，准确称量1500g粉末在50℃下加热20分钟；然后将加热后的粉末分为三份质量相同的鸡血藤粉末，将第一份鸡血藤粉末加入到20倍量的浓度为60％的乙醇中，浸提12小时，得到浸提液a，将第二份鸡血藤粉末加入到20倍量的浓度为80％的乙醇中，浸提12小时，得到浸提液b，将第三份鸡血藤粉末加入到20倍量的浓度为95％的乙醇中，浸提48小时，得到浸提液c；将所述的浸提液a、浸提液b与浸提液c混合均匀后过滤，将得到的滤液旋转蒸后得到鸡血藤提取物d。将千斤拔粉碎过筛后得到千斤拔粉末，准确称量1500g千斤拔粉末加入到20倍量的浓度为70％的乙醇中，浸提2小时，将得到的浸提液在80℃下回流提取，然后浓缩后得到千斤拔提取物。将48g鸡血藤提取物a与90g千斤拔提取物混合均匀，然后向其中加入20mg多西环素混合均匀后得到组合物a。将48g鸡血藤提取物b与90g千斤拔提取物混合均匀，然后向其中加入20mg多西环素混合均匀后得到组合物b。将48g鸡血藤提取物c与90g千斤拔提取物混合均匀，然后向其中加入20mg多西环素混合均匀后得到组合物c。将48g鸡血藤提取物d与90g千斤拔提取物混合均匀，然后向其中加入20mg多西环素混合均匀后得到组合物d。准确称量90g千斤拔提取物，然后向其中加入20mg多西环素混合均匀后得到组合物e。实施例2鸡血藤提取物对嗜水气单胞菌的抑菌效果1、培养基的制备bhi培养基购自美国bd公司；5％绵羊血琼脂平板、细菌生化微量鉴定管等购自广州环凯微生物有限公司。2、菌悬液的制备试验菌培养：将嗜水气单胞菌菌株活化，用接种针在固体培养基上划线，再30℃培养24h后，挑取单个菌落，接种到营养肉汤培养基上震荡培养24h。采用平板计数法将菌液稀释到合适浓度，菌液浓度为1×108cfu/ml。3、药物敏感性试验药敏试验采用琼脂扩散法，将培养至对数生长期的菌悬液稀释至浓度约为1×103cfu/ml，使用无菌棉签蘸取菌液均匀涂抹在培养基上，涂抹均匀后，在平板上均匀打孔，每个平板上打4个孔，做好标记。每孔加入100μl(1g/ml)组合物，然后将之放入30℃培养箱中培养24h；平板取出后，观察孔周围是否有抑菌圈，若有，则用游标卡尺测量抑菌圈直径。每种药物做三个重复，同时以无菌水做空白对照。结果判断标准按《中药药理学》介绍的标准：抑菌圈≥20mm，属于极敏；抑菌圈15-19mm属于高敏；抑菌圈10-14mm属于中敏；抑菌圈小于10mm，属于低敏；没有抑菌圈，属于不敏(无抑菌效果)。4、二次筛选试验用营养肉汤培养基以二倍稀释法对提取物进行梯度稀释，在每个试管中加入细菌悬液，使细菌浓度达到102cfu/ml，在不同的试管中加入组合物a、组合物b、组合物c、组合物e，不加组合物作为空白对照，不加细菌作为阴性对照，每个重复3次。置28℃摇床中震荡(180r/min)培养24h，然后取出与对照管对比观察，抑菌圈直径及抑菌等级如表1所示。表1抑菌圈直径及抑菌等级项目抑菌圈直径(mm)抑菌等级组合物a22.94±0.15+++组合物b12.35±0.55+组合物c17.26±0.28++组合物d16.63±0.41++组合物e9.26±0.42+空白对照——阴性对照——上述表中，“+++”表示极敏，“++”表示高敏，“+”表示中敏或低敏，“－”表示不敏(无抑菌效果)。由表1可知，组合物a、组合物b、组合物c、组合物d、组合物e均对嗜水气单胞菌有抑菌效果，其中组合物a的抑菌等级为极敏，组合物c和组合物d等级为高敏，组合物b、组合物e(不含鸡血藤提取物)等级为中敏或低敏，由此可见，含有鸡血藤提取物与千斤拔提取物的组合物对于嗜水气单胞菌具有显著的抑菌效果，其中组合物a的抑菌效果尤其显著，而对于组合物b，在制备鸡血藤提取物时，采用50℃的较低温度进行加热活化，无法对其中的抑菌成分充分的提取出，使其效果与组合物a相比有较大的差距，对于组合物c与组合物d，采用不同浓度梯度的乙醇进行浸提，效果与制备组合物a中浓度梯度的乙醇相比，也存在一定的差距，但不同浓度梯度的乙醇对鸡血藤提取物的抑菌效果的影响远低于活化温度的影响。由此表明，在组合物a中，鸡血藤提取物与千斤拔提取物、多西环素的结合，对嗜水气单胞菌具有显著的抑菌效果，改变加热活化的温度与乙醇的浓度梯度对于组合物对嗜水气单胞菌的抑菌效果也具有较大的影响。实施例3鸡血藤提取物与千斤拔提取物的配比对抑菌效果的影响将鸡血藤粉碎过筛后得到鸡血藤粉末，准确称量600g粉末在80℃下加热20分钟；然后将加热后的粉末分为三份质量相同的鸡血藤粉末，将第一份鸡血藤粉末加入到20倍量的浓度为50％的乙醇中，浸提12小时，得到浸提液a，将第二份鸡血藤粉末加入到20倍量的浓度为60％的乙醇中，浸提12小时，得到浸提液b，将第三份鸡血藤粉末加入到20倍量的浓度为90％的乙醇中，浸提48小时，得到浸提液c；将所述的浸提液a、浸提液b与浸提液c混合均匀后过滤，将得到的滤液旋转蒸后得到鸡血藤提取物。将千斤拔粉碎过筛后得到千斤拔粉末，准确称量1500g千斤拔粉末加入到20倍量的浓度为70％的乙醇中，浸提2小时，将得到的浸提液在80℃下回流提取，然后浓缩后得到千斤拔提取物。将48g鸡血藤提取物与90g千斤拔提取物混合均匀，然后向其中加入20mg多西环素混合均匀后得到组合物a。将5g鸡血藤提取物与90g千斤拔提取物混合均匀，然后向其中加入20mg多西环素混合均匀后得到组合物b。将48g鸡血藤提取物与150g千斤拔提取物混合均匀，然后向其中加入20mg多西环素混合均匀后得到组合物c。将5g鸡血藤提取物与150g千斤拔提取物混合均匀，然后向其中加入20mg多西环素混合均匀后得到组合物d。准确称量90g千斤拔提取物，然后向其中加入20mg多西环素混合均匀后得到组合物e。准确称量48g鸡血藤提取物，然后向其中加入20mg多西环素混合均匀后得到组合物f。准确称量20mg多西环素溶于10倍量的浓度为60％的乙醇中，混合均匀后得到组合物g。在每个试管中加入嗜水气单胞菌的细菌悬液，使细菌浓度达到102cfu/ml，在不同的试管中加入组合物a、组合物b、组合物c、组合物e、组合物f、组合物g，不加组合物作为空白对照，不加细菌作为阴性对照，每个重复3次。置30℃摇床中震荡(180r/min)培养24h，然后取出与对照管对比观察，抑菌圈直径及抑菌等级如表2所示。表2抑菌圈直径及抑菌等级项目抑菌圈直径(mm)抑菌等级组合物a22.75±0.18+++组合物b15.82±0.36++组合物c19.16±0.42++组合物d12.35±0.22+组合物e8.36±0.15+组合物f10.84±0.23+组合物g7.95±0.55+空白对照——阴性对照——上述表中，“+++”表示极敏，“++”表示高敏，“+”表示中敏或低敏，“－”表示不敏(无抑菌效果)。由表2可知，组合物a、组合物b、组合物c、组合物d、组合物e、组合物f与组合物g均对嗜水气单胞菌有抑菌效果，其中组合物a的抑菌等级为极敏，组合物b和组合物c等级为高敏，组合物d、组合物e(不含鸡血藤提取物)和组合物f(千斤拔提取物)、组合物g(多西环素)等级为中敏或低敏。由此可见，含有鸡血藤提取物与千斤拔提取物的组合物对于嗜水气单胞菌具有显著的抑菌效果，其中组合物a的抑菌效果尤其显著，而组合物b的抑菌效果与组合物a相比，有明显的差距，组合物b与组合物a的区别在于，鸡血藤提取物的添加量为5g，由此可见，过低的鸡血藤提取物的添加量会降低组合物的抑菌效果；组合物c的抑菌效果与组合物a相比，有明显的差距，但效果明显优于组合物b；组合物c与组合物a的区别在于，千斤拔提取物的添加量为150g，由此可见，过高的千斤拔提取物的添加量会降低组合物的抑菌效果，但千斤拔提取物对组合物的抑菌效果的影响小于鸡血藤提取物。组合物d与组合物a的区别在于，鸡血藤提取物的添加量为5g，千斤拔提取物的添加量为150g，其抑菌效果均不及组合物a、组合物b、组合物c，表明鸡血藤提取物与千斤拔提取物的添加量需要在一定范围内才能实现最优的抑菌效果；对于组合物e与组合物f，分别添加鸡血藤提取物或千斤拔提取物的组合物，对嗜水气单胞菌具有一定的抑菌效果，但抑菌效果与同时包含鸡血藤提取物和千斤拔提取物的组合物的抑菌效果差距显著，而对于组合物g，单独的多西环素对于嗜水气单胞菌的抑菌效果低于分别添加鸡血藤提取物或千斤拔提取物的组合物，表明同时含有多西环素、鸡血藤提取物与千斤拔提取物的组合物才能对嗜水气单胞菌实现最优的抑菌效果。实施例4含有鸡血藤提取物和千斤拔提取物的组合物对于舒伯特气单胞菌菌株、嗜水气单胞菌、斑点气单胞菌的抑菌效果将鸡血藤粉碎过筛后得到鸡血藤粉末，准确称量600g粉末在80℃下加热20分钟；然后将加热后的粉末分为三份质量相同的鸡血藤粉末，将第一份鸡血藤粉末加入到20倍量的浓度为50％的乙醇中，浸提12小时，得到浸提液a，将第二份鸡血藤粉末加入到20倍量的浓度为60％的乙醇中，浸提12小时，得到浸提液b，将第三份鸡血藤粉末加入到20倍量的浓度为90％的乙醇中，浸提48小时，得到浸提液c；将所述的浸提液a、浸提液b与浸提液c混合均匀后过滤，将得到的滤液旋转蒸后得到鸡血藤提取物；将千斤拔粉碎过筛后得到千斤拔粉末，准确称量1500g千斤拔粉末加入到20倍量的浓度为70％的乙醇中，浸提2小时，将得到的浸提液在80℃下回流提取，然后浓缩后得到千斤拔提取物；将48g鸡血藤提取物与90g千斤拔提取物混合均匀，然后向其中加入20mg多西环素混合均匀后得到组合物。在不同试管中分别加入舒伯特气单胞菌菌株、嗜水气单胞菌、斑点气单胞菌的细菌悬液，使细菌浓度达到103cfu/ml，在不同的试管中加入组合物，不加组合物作为空白对照，不加细菌作为阴性对照，每个重复3次。置28℃摇床中震荡(180r/min)培养24h，然后取出与对照管对比观察，抑菌圈直径及抑菌等级如表3所示。表3组合物对不同气单胞菌属细菌的抑菌效果上述表中，“+++”表示极敏，“++”表示高敏，“+”表示中敏或低敏，“－”表示不敏(无抑菌效果)。由表3可知，含有多西环素、鸡血藤提取物与千斤拔提取物的组合物对舒伯特气单胞菌菌株、嗜水气单胞菌、斑点气单胞菌均有显著的抑菌效果。以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。当前第1页12