用于增强对疫苗接种的免疫反应和改善疫苗生产的组合物和方法与流程

用于增强对疫苗接种的免疫反应和改善疫苗生产的组合物和方法
1.本技术要求于2019年1月9日提交的美国临时申请号62/790,373的权益。这些和所有其他参考的外在材料通过引用以其整体并入本文。在通过引用并入的参考文献中术语的定义或使用与本文提供的该术语的定义不一致或相反的情况下，认为应当以本文提供的该术语的定义为准。
发明领域
2.本发明的领域是病毒疫苗配制剂和与疫苗配制剂一起使用的佐剂。
3.发明背景
4.背景描述包括可以用于理解本发明的信息。不承认本文提供的任何信息是现有技术或与当前要求保护的发明相关，也不承认任何明确或隐含引用的出版物是现有技术。本文中的所有出版物均通过引用并入，其程度就好像每个单独的出版物或专利申请被具体地且单独地指示为通过引用并入一样。在并入的参考文献中术语的定义或使用与本文提供的该术语的定义不一致或相反的情况下，适用本文提供的该术语的定义，而不适用参考文献中该术语的定义。
5.流感给我们的卫生服务带来了沉重的负担(centers for disease control and prevention.vaccine effectiveness-how well does the flu vaccine work？可在https://www.cdc.gov/flu/about/qa/vaccineeffect.htm获得。2018年12月8日访问；belongia ea,simpson md,king jp,sundaram me,kelley ns,osterholm mt et al.variable influenza vaccine effectiveness by subtype:a systematic review and meta-analysis of test-negative design studies.lancet infect dis 2016；16:942-51)，在老年人、非常年幼的儿童和患有慢性病的人中造成显著的发病率和死亡率。季节性、动物传染病性和大流行性流感是持续的全球威胁。世界卫生组织估计，季节性流感每年在全世界造成250,000-500,000例死亡。最近，抗原性漂移的a/switzerland/9715293/2013病毒在欧洲和北美的各个国家引起大爆发(cdc health advisory regarding the potential for circulation of drifted influenza a (h3n2)viruses(2015年5月11日访问，http://emergency.cdc.gov/han/han00374.asp；skowronski dm,drews sj,fonseca k,charest h,chambers c,sabaiduc s,el al.interim estimates of 2014/5vaccine effectiveness against influenza a (h3n2)from canada’s sentinel physician surveillance network.euro surveill 2015；20.pi:21022)。2014年10月1日至11月22日在美国收集的甲型流感(h3n2)病毒的病毒学监测显示，这些分离株中的52％从a/texas/50/2012(h3n2)疫苗病毒抗原性漂移(grohskopf la,sokolow lz,broder kr,walter eb,fry am,jernigan db.prevention and control of seasonal influenza with vaccines:recommendations of the advisory committee on immunization practices-united states,2018-19influenza season.mmwr recomm rep 2018；67:1-20)。此外，禽流感病毒如a(h5n1)和最近的a(h7n9)(航空旅行促进了从其起源地区的传播)与传统的季节
性流感相比，通常与高得多的死亡率相关。因此，基于在实际爆发之前很好地预测可能的致病毒株的免疫配制剂的保护潜力必然是有限的。
6.解决这个问题的一种方法是增加疫苗接种配制剂的复杂性。例如，引起季节性爆发的乙型流感yamagata和victoria毒株的共同传播导致呼吁常规使用四价流感疫苗。然而，此类方法使季节性流感疫苗的生产进一步复杂化，并且没有解决来自预测毒株的遗传性漂移和新流感毒株的意外引入的基本问题。
7.已发现咪喹莫特(imiquimod)(一种可用于治疗dna病毒感染的合成toll样受体7(tlr7)激动剂)在实验动物模型中改善流感疫苗免疫原性的某些方面(thomsen ll,topley p,daly mg,brett sj,tite jp.imiquimod and resiquimod in a mouse model:adjuvants for dna vaccination by particle-mediated immunotherapeutic delivery.vaccine.2004；22:1799-809；zuber ak,a,g,zuber b,ljungberg k,fredriksson m,et al.topical delivery of imiquimod to a mouse model as a novel adjuvant for human immunodeficiency virus(hiv)dna.vaccine.2004；22:1791-8；weldon wc,zarnitsyn vg,esser es,taherbhai mt,koutsonanos dg,vassilieva ev,et al.effect of adjuvants on responses to skin immunization by microneedles coated with influenza subunit vaccine.plos one.2012；7:e41501；zhang aj,li c,to kk,zhu hs,lee ac,li cg,et al.toll-like receptor 7agonist imiquimod in combination with influenza vaccine expedites and augments humoral immune responses against influenza a(h1n1)pdm09 virus infection in balb/c mice.clin vaccine immunol.2014；21:570-9)。例如，在皮内三价流感疫苗前用局部咪喹莫特治疗加速、增强和延长患有慢性病的老年受试者中对免疫流感疫苗株的免疫原性(hung if,zhang aj,to kk,chan jf,li c,zhu hs,et al.immunogenicity of intradermal trivalent influenza vaccine with topical imiquimod:a double blind randomized controlled trial.clin infect dis 2014；59:1246-55)。类似的研究已经表明，在人类和动物模型两者中，局部tlr7激动剂咪喹莫特的作用是增强对疫苗接种物质的免疫反应。在免疫衰老的老年受试者中，诱导的免疫迅速且可持续超过一年时段。与单独的疫苗相比时，还发现加咪喹莫特佐剂的(即与疫苗配制剂混合并注射)疫苗引发更高水平的igg2a抗体、hi滴度和针对免疫物质的ifn-γ细胞反应。咪喹莫特作为佐剂与dna疫苗同时皮下施用在小鼠模型中也增强了树突细胞和th1淋巴细胞对注射抗原的反应(thomsen ll,topley p,daly mg,brett sj,tite jp.imiquimod and resiquimod in a mouse model:adjuvants for dna vaccination by particle-mediated immunotherapeutic delivery.vaccine.2004；22:1799-809；zuber ak,a,g,zuber b,ljungberg k,fredriksson m,et al.topical delivery of imiquimod to a mouse model as a novel adjuvant for human immunodeficiency virus(hiv)dna.vaccine.2004；22:1791-8)。然而，此类对疫苗接种物质的增加的反应并没有解决由抗原性漂移或将疫苗接种配制剂中不存在的新流感病毒株引入群体引起的问题。
8.已经研究了其他策略以通过靶向相对保守的血凝素茎部、m2和核蛋白，或通过改变用病毒载体递送的方式来改善流感疫苗的免疫原性和广度。最近，还发现自组装合成纳
米颗粒疫苗的开发改善了流感病毒免疫的效力和广度(kanekiyo m,wei cj,yassine hm,mctamney pm,boyington jc,whittle jr,etal.self-assembling influenza nanoparticle vaccines elicit broadly neutralizing h1n1 antibodies.nature 2013；499:102-6)。尽管如此，此类策略仍仅限于细胞系或动物研究阶段。使用包括mf59或as03在内的佐剂已证明具有改善的免疫原性的抗原节约效应(antigen sparing effect)。不幸的是，频繁的局部不良事件限制了其效用(montana m,verhaeghe p,ducros c,terme t,vanelle p,rathelot p.safety review:squalene and thimerosal in vaccines.therapie 2010；65:533-41；black s,della cioppa g,malfroot a,nacci p,nicolay u,pellegrini m,et al.safety of mf59-adjuvanted versus non-adjuvanted influenza vaccines in children and adolescents:an integrated analysis.vaccine 2010；28:7331-6)。此外，对于生命早期用抗原相关病毒或疫苗引发过的个体，剂量节约效应不太明显。因此，在皮内流感疫苗接种之前应用局部咪喹莫特预处理是改善和扩大流感疫苗免疫原性的最简单且最容易获得的策略。还注意到合成的tlr4和tlr7配体的组合在与重组流感病毒血凝素共注射时可以充当佐剂，并且可以刺激小鼠中的th1和th2型免疫反应两者，从而提供针对抗原性漂移流感病毒的广泛中和抗体(mukherjee ak,gupta g,adhikari a,majumder s,kar mahapatra s,bhattacharyya majumdar s,et al.miltefosine triggers a strong proinflammatory cytokine response during visceral leishmaniasis:role of tlr4 and tlr9.int immunopharmacol 2012；12:565-72)。然而，尚不清楚此类方法在广泛的免疫工作中多么有效。
9.因此，仍然需要提供针对疫苗配制剂的增强的免疫反应和/或扩大的有效反应范围的简单、有效和耐受良好的组合物和方法。
10.发明概述
11.本发明主题提供了组合物和方法，其中利用米替福新(miltefosine)来增强对疫苗接种(例如，流感和/或冠状病毒疫苗接种)的免疫反应(例如，作为佐剂)。本发明的主题还提供了通过将大麻素受体激动剂(如methanandamide)应用于培养细胞来提高此类细胞中病毒产率的组合物和方法。此类提高的病毒产率可以用于提高病毒产量以用于疫苗配制和/或改善基于细胞的病毒测定的灵敏度。
12.发明构思的一个实施方案是用于改善对疫苗接种的免疫反应的方法，该方法通过在疫苗接种时或紧接疫苗接种之前向受试者提供包括米替福新(例如1μg至100mg米替福新)的佐剂并在疫苗接种部位处引入疫苗(其包括疫苗接种物质)。佐剂可以作为局部配制剂提供，其中选择所述佐剂以提供足以增强对疫苗接种物质的免疫反应的量的米替福新。此类免疫反应的实例包括igg滴度、igm滴度、血凝抑制滴度和微量中和滴度。当佐剂配制成局部配制剂时，可以在应用局部配制剂的部位(例如疫苗接种部位)上应用屏障。此类局部配制剂可以作为应用装置的一部分提供。该方法可应用于利用三价流感疫苗、多价流感疫苗和/或冠状病毒疫苗的免疫。
13.发明构思的另一个实施方案是米替福新在制备提供针对疫苗(例如三价流感疫苗、多价流感疫苗和/或冠状病毒疫苗)的增强反应的佐剂中的用途。此类佐剂可配制成提供1μg至100mg的米替福新，并可作为器具的一部分提供。增强的反应包括但不限于相对于在尚未用佐剂治疗的经疫苗接种的受试者中实现的疫苗接种反应，增加的igg滴度、增加的
igm滴度、增加的血凝抑制滴度和增加的微量中和滴度。
14.发明构思的另一个实施方案是用于增强针对皮内注射的疫苗(三价流感疫苗、多价流感疫苗或冠状病毒疫苗)的免疫反应的佐剂，其包括米替福新。免疫反应包括但不限于igg滴度、igm滴度、血凝抑制滴度和/或微量中和滴度。此类佐剂可以提供1μg至100mg的米替福新，并且在一些实施方案中可以配制用于局部应用。此类局部配制剂可以是应用装置的一部分。
15.发明构思的另一个实施方案是用于提供治疗性或保护性免疫力的疫苗配制剂(例如三价流感疫苗、多价流感疫苗和/或冠状病毒疫苗)，其包括免疫原性疫苗接种物质和米替福新。疫苗配制剂可以包括1μg至100mg的米替福新。
16.发明构思的另一个实施方案是增加来自细胞培养物的病毒产率的方法，该方法通过使培养中的细胞与来自病毒的遗传物质接触，并且还使细胞与无毒浓度下的大麻素受体激动剂(例如(r)-methanandamide)接触。选择大麻素受体激动剂以增加细胞的脂质含量。病毒或其一部分可以适合用作免疫原(例如冠状病毒或流感病毒)。
17.发明构思的另一个实施方案是生产疫苗配制剂的方法，该方法通过使培养中的细胞与来自病毒(例如冠状病毒和/或流感病毒)的遗传物质接触，使细胞与在无毒浓度下经选择以增加细胞脂质含量的大麻素受体激动剂(例如(r)-methanandamide)接触，在足以使细胞中的病毒复制的时间段后从培养物中收集病毒，以及在药学上可接受的载体中提供该病毒或该病毒的一部分。该病毒或其一部分适合用作免疫原。在一些实施方案中，将米替福新添加至药学上可接受的载体。
18.发明构思的另一个实施方案是用于检测病毒(例如冠状病毒或流感病毒)的方法，该方法通过获得疑似含有该病毒的样品，使培养中的细胞与样品的至少一部分或衍生自该样品的级分接触，使细胞与在无毒浓度下的经选择以增加该细胞的脂质含量的大麻素受体激动剂接触，在足以使细胞中的病毒复制的时间段后，从培养物中收集测试样品，以及确定测试样品中病毒特征性的分子的存在(例如通过核酸扩增、核酸杂交和/或免疫测定)。足以使细胞中的病毒复制的时间段是在观察到细胞病变效应之前。在一些实施方案中使用快速或即时检验(point of care test)来进行确定病毒特征性的分子的存在。
19.通过以下优选实施方案的详细描述以及附图(其中相同的数字代表相同的组分)，本发明主题的各种目的、特征、方面和优点将变得更加明显。
20.附图简述
21.图1：图1描绘了在有或没有米替福新的情况下疫苗接种后14天测量的抗体滴度。在第14天提供第二剂疫苗。圆圈表示米替福新+疫苗治疗组的数据；正方形表示来自仅疫苗治疗组的数据；三角形表示来自仅米替福新治疗组的数据；倒三角形表示来自盐水处理对照组的数据。
22.图2a-b：图2a描绘了在感染前3天用或不用米替福新接种疫苗的感染小鼠的生存率。来自0.2mg米替福新+疫苗治疗的数据由圆圈和实线的组合表示。来自用0.008mg米替福新+疫苗治疗的数据由菱形和虚线的组合表示。来自仅用0.2mg米替福新治疗的数据由虚/点线表示。来自仅用疫苗治疗的数据由正方形和实线的组合表示。来自用盐水对照处理的数据用点线表示。图2b描绘了在感染前7天用米替福新(圆圈/虚线，菱形/虚线，或黑色)或不用米替福新(正方形/实线)接种疫苗的感染小鼠的生存率。来自用1mg米替福新+疫苗治
疗的数据由三角形和实线的组合表示。来自用0.2mg米替福新+疫苗治疗的数据由圆圈和实线的组合表示。来自用0.008mg米替福新+疫苗治疗的数据由菱形和虚线的组合表示。来自仅用0.2mg米替福新治疗的数据由虚/点线表示。来自仅用疫苗治疗的数据由正方形和实线的组合表示。来自用盐水对照处理的数据用点线表示。
23.图3：图3描绘了在感染前三天用或不用腹膜内米替福新佐剂接种疫苗的感染小鼠的感染后两天、四天或六天的抗体、血凝和微量中和滴度。圆圈表示来自米替福新+疫苗治疗组的数据；正方形表示来自仅疫苗治疗组的数据；三角形表示来自仅米替福新治疗组的数据；倒三角形表示来自盐水处理对照组的数据。
24.图4：图4描绘了在第7天感染前7天腹膜内用或不用腹膜内米替福新佐剂接种疫苗的感染小鼠的脾滤泡t细胞的百分比。显示的数据表示第7天(即用米替福新和疫苗治疗后7天)但在感染前(左侧)和感染后两天(第9天，右侧)的发现。
25.图5：图5描绘了示例性大麻素受体激动剂(r)-methanandamide的结构。
26.图6：图6描绘了在存在和不存在(r)-methanandamide的情况下病毒细胞病变效应研究的结果。
27.发明详述
28.以下描述包括可以用于理解本发明的信息。不承认此处提供的任何信息是现有技术或与当前要求保护的发明相关，也不承认任何明确或隐含引用的出版物是现有技术。
29.流感疫苗的整体有效性只有大约40-60％(centers for disease control and prevention.vaccine effectiveness-how well does the flu vaccine work？可在https://www.cdc.gov/flu/about/qa/vaccineeffect.htm获得。2018年12月8日访问)。甲型流感(h3n2)的有效性特别差，合并疫苗有效性仅《35％(belongia ea,simpson md,king jp,sundaram me,kelley ns,osterholm mt,et al.variable influenza vaccine effectiveness by subtype:a systematic review and meta-analysis of test-negative design studies.lancet infect dis 2016；16:942-51)。当病毒发生重大突变时，疫苗的有效性也会降低。例如，在以抗原型漂移甲型(h3n2)病毒为主的2014-2015流感季节，疫苗有效性仅为19％(zimmerman rk,nowalk mp,chung j,jackson ml,jackson la,petrie jg,et al.2014-2015influenza vaccine effectiveness in the united states by vaccine type.clin infect dis 2016；63:1564-73)。
30.为了提高疫苗有效性，已将佐剂掺入疫苗制剂中。市售的唯一的季节性流感的加佐剂的疫苗fluad
tm
(seqirus)含有mf59，它是一种基于鲨烯的乳剂(grohskopf la,sokolow lz,broder kr,walter eb,fry am,jernigan db.prevention and control of seasonal influenza with vaccines:recommendations of the advisory committee on immunization practices-united states,2018-19influenza season.mmwr recomm rep 2018；67:1-20)。然而，加mf59佐剂的疫苗的有效性仅对于特定年龄组优于非加佐剂的疫苗(vesikari t,kirstein j,devota go g,leav b,ruzycky me,isakov l,et al.efficacy,immunogenicity,and safety evaluation of an mf59-adjuvanted quadrivalent influenza virus vaccine compared with non-adjuvanted influenza vaccine in children:a multicentre,randomised controlled,observer-blinded,phase 3trial.the lancet respiratory medicine 2018；6:345-56)。加mf59佐剂的流感疫苗的
血凝滴度仅比非加佐剂的疫苗高1.14-1.4倍(tregoning js,russell rf,kinnear e.adjuvanted influenza vaccines.hum vaccinimmunother 2018；14:550-64)。
31.过去十年对先天免疫的分子机制理解的进展为开发激活不同的受体和传感器(如toll样受体(tlr)和rig-i样受体(rlr))的新的且化学成分确定的佐剂铺平了道路(levitz sm,golenbock dt.beyond empiricism:informing vaccine development through innate immunity research.cell 2012；148:1284-92)。几种tlr激动剂现已获准用于人类使用或处于临床试验的后期阶段(saxena m,bhardwaj n.turbocharging vaccines:emerging adjuvants for dendritic cell based therapeutic cancer vaccines.curropin immunol 2017；47:35-43)。除tlr外，rlr是先天免疫中另一组重要的传感器，其检测细胞质中的病毒核酸。与在免疫细胞中表达的tlr相比，rlr普遍存在。rlr与激动剂的结合产生激活信号，其导致i型干扰素(ifn)的产生。因此，rlr激动剂是疫苗佐剂的优越的候选者(gutjahr a,tiraby g,perouzel e,verrier b,paul s.triggering intracellular receptors for vaccine adjuvantation.trends immunol 2016；37:716)。它们可以充当减毒疫苗和dna疫苗中的“内置”佐剂。
32.发明人一直在积极寻求激活天然受体和传感器的新的佐剂。一种方法是使用佐剂来加速和增强皮内流感疫苗的免疫反应。传统上，流感疫苗经由肌内途径给予。然而，已显示经由皮内施用流感疫苗可以诱导强得多(并且可能更有效)的抗体反应(hung if,levin y,to kk,chan kh,zhang aj,li p,et al.dose sparing intradermal trivalent influenza(2010/2011)vaccination overcomes reduced immunogenicity of the 2009h1n1 strain.vaccine 2012；30:6427-35)。不希望受理论束缚，从理论上讲，皮内疫苗接种所赋予的改善的反应可以主要归因于牵涉增强的朗格汉斯细胞反应(pearton m,kang sm,song jm,anstey av,ivory m,compans rw,et al.changes in human langerhans cells following intradermal injection of influenza virus-like particle vaccines.plos one 2010；5:el2410)。
33.为了进一步改善和/或增强皮内疫苗的免疫原性，需要增强皮肤免疫细胞反应的佐剂。此类佐剂可以通过任何合适的途径提供，包括腹膜内注射、皮下或皮内注射、肌内注射、口服摄入、吸入和/或局部施用于皮肤和/或粘膜。本发明人确定的一种此类佐剂是咪喹莫特，其是一种市售的fda批准的tlr7激动剂。在小鼠模型中，证明咪喹莫特可以加速和增强流感疫苗的免疫原性，并且这种改善的免疫原性与使用2009大流行甲型流感(h1n1)病毒和禽流感病毒a(h7n9)进行的致死攻击实验期间的死亡减少有关(zhang aj,li c,to kk,zhu hs,lee ac,li cg,et al.toll-like receptor 7agonist imiquimod in combination with influenza vaccine expedites and augments humoral immune responses against influenza a(hlnl)pdm09 virus infection in balb/c mice.clin vaccine immunol 2014；21:570-9；to kk,zhang aj,chan as,li c,cai jp,lau cc,et al.recombinant influenza a virus hemagglutinin ha2 subunit protects mice against influenza a(h7n9)virus infection.arch virol 2015；160:777-86)。发现咪喹莫特通过直接促进b细胞的活化和分化来改善流感疫苗的免疫原性(li c,to kkw,zhang ajx,lee acy,zhu h,mak wwn,et al.co-stimulation with tlr7 agonist imiquimod and inactivated influenza virus particles promotes mouse b cell activation,
differentiation,and accelerated antigen specific antibody production.front immunol 2018；9:2370)。基于这些动物研究的有希望的结果，进行了两项安慰剂对照的随机化对照人体研究，以评估局部咪喹莫特与流感疫苗的使用。第一项试验用老年人进行。发现与流感疫苗前用假局部水性乳膏治疗的受试者相比，在皮内注射流感疫苗之前接受咪喹莫特局部治疗的参与者具有更快速和更强大的抗体反应，以及显著更低的住院率和肺炎率(hung if,zhang aj,to kk,chan jf,li c,zhu hs,et al.immunogenicity of intradermal trivalent influenza vaccine with topical imiquimod:a double blind randomized controlled trial.clin infect dis 2014；59:1246-55)。第二项试验使用年轻人进行。局部咪喹莫特治疗组中的参与者不仅对同源病毒具有比对照组(假水性乳膏)更快且更强大的抗体反应，而且令人惊讶的是，他们还对未包括在使用的疫苗配制剂中的与过去和最近的抗原性漂移病毒在抗原性方面不同的病毒产生了强大得多的抗体反应(hung if,zhang aj,to kk,chan jf,li p,wong tl,et al.topical imiquimod before intradermal trivalent influenza vaccine for protection against heterologous non-vaccine and antigenically drifted viruses:a single-centre,double-blind,randomised,controlled phase 2b/3trial.lancet infect dis 2016；16:209-18)。这些发现促使发明人寻求使用其他药剂，包括fda批准的局部药物和疫苗病毒组分作为流感疫苗的佐剂。
34.本发明主题提供了组合物和方法，其中米替福新用作佐剂，其可以在接种疫苗接种(例如皮内流感疫苗接种)之前、基本上同时(例如在五分钟内)或者之后提供给受试者。适合的疫苗包括但不限于三价流感疫苗、多价流感疫苗和/或冠状病毒疫苗。此类疫苗接种可以是皮内和/或肌内的。在发明构思的优选实施方案中，在药学上可接受的载体中，和/或作为疫苗配制剂的一部分提供米替福新。
35.在一些实施方案中，用于描述本发明的某些实施方案和要求本发明的某些实施方案保护的表示成分的数量、特性如浓度、反应条件等的数字应理解为在一些情况下被术语“大约”修饰。因此，在一些实施方案中，在书面说明和所附权利要求中阐述的数值参数是近似值，其可以根据特定实施方案获得的期望特性而变化。在一些实施方案中，应该根据报道的有效数字的位数并通过应用普通的舍入技术来解释数值参数。尽管阐述本发明的一些实施方案的广泛范围的数值范围和参数是近似值，但尽可能精确地报告具体实施例中阐述的数值。在本发明的一些实施方案中呈现的数值可以含有由在它们各自的测试测量中发现的标准偏差必然导致的某些误差。
36.除非上下文另有明确规定，如在本文的描述中和整个随后的权利要求中所用，“一个”、“一种”和“该”的含义包括复数提及。此外，除非上下文另有明确规定，如在本文说明书中所用，“在
……
中”的含义包括“在
……
中”和“在
……
上”。
37.本文对值范围的叙述仅旨在用作单独提及落入该范围内的每个单独值的速记方法。除非在本文中另有说明，否则每个单独的值都被并入说明书中，如同它在本文中被单独叙述一样。除非本文另有说明或与上下文明显矛盾，否则本文所述的所有方法都可以以任何合适的顺序进行。关于本文中的某些实施方案提供的任何和所有示例或示例性语言(例如“诸如”)的使用仅旨在更好地阐明本发明，并且不对另外要求保护的发明的范围构成限制。说明书中的任何语言都不应被解释为表示对本发明的实践必不可少的任何未要求保护
的元素。
38.本文公开的本发明的替代元素或实施方案的分组不应被解释为限制。每个小组成员都可以单独地或者以与该组的其他成员或本文发现的其他元素的任何组合来提及和要求保护。出于方便和/或可专利性的原因，一个组的一个或多个成员可以包括在一个组中或从一个组中删除。当发生任何此类包含或删除时，说明书在本文中被视为含有修改后的组，从而满足所附权利要求中使用的所有马库什组的书面描述。
39.如上所述，在发明构思的实施方案中，米替福新可以通过任何合适的手段提供给候选者进行免疫。例如，米替福新可以在药学上可接受的载体中注射到腹腔中。或者，米替福新可以注射到皮肤层中和/或肌内注射。在一些实施方案中，米替福新可以在适于吸入的悬浮液或溶液中提供，例如用于经由鼻和/或肺膜吸收。或者，在一些实施方案中，米替福新可以经由口腔、阴道或胃肠粘膜递送至受试者。
40.在其他实施方案中，米替福新可以作为局部配制剂提供，其可以应用于皮肤表面，例如在疫苗注射部位处或附近(例如10cm内)。此类配制剂的一个实例是mitlex
tm
，其含有6％的米替福新并被批准供人类使用。在此类实施方案中，米替福新应用于注射部位和/或周围区域的皮肤。
41.此类应用可以在适于典型成人的方案中提供高达1μg、5μg、10μg、20μg、30μg、40μg、50μg、60μg、70μg、80μg、90μg、100μg、200μg、300μg、400μg、500μg、600μg、100μg、700μg、800μg、900μg、1mg、2mg、5mg、10mg、20mg、30mg、40mg、50mg、60mg、70mg、80mg、90mg或100mg(包括中间值和值的范围)的米替福新。米替福新可在紧接疫苗接种前(例如在五分钟内)应用，或者可在疫苗接种前5分钟至48小时(或任何合适的中间时间段)应用。此类米替福新配制剂可以在疫苗接种后立即(例如在五分钟内)从皮肤表面去除，或者，可替代地，在疫苗接种后保持在皮肤表面上5分钟至48小时。在一些实施方案中，可以根据正在治疗个体的年龄和/或免疫状态来修改用米替福新配制剂进行的疫苗接种前和/或疫苗接种后局部治疗的时间段。
42.在一些实施方案中，可将含米替福新的配制剂应用于疫苗接种部位处或附近(例如10cm半径内)的皮肤表面，以及用封闭敷料或类似器具覆盖的处理过的皮肤表面。在此类实施方案中，可在应用米替福新配制剂之后应用封闭敷料。或者，可以提供封闭敷料或类似器具，其在接触皮肤的表面上掺入局部米替福新配制剂，从而在应用封闭敷料的同时将米替福新配制剂应用到皮肤表面。此类封闭敷料或类似器具可以包括窗口或类似部分，其提供进入疫苗接种部位以进行注射的入口。
43.在其他实施方案中，米替福新可以以组合提供或作为疫苗接种组合物的一部分提供。此类实施方案在单次处理中方便地提供佐剂和疫苗接种物质。
44.从以下优选实施方案的详细描述连同附图，本发明主题的各种目的、特征、方面和优点将变得更加明显。
45.应当领会，所公开的技术提供了许多有利的技术效果，包括简单且方便地增强疫苗接种后的免疫反应。此类增强可以为一般群体提供改善的保护，为有风险或免疫功能低下的个体提供改善的疫苗有效性，提供针对疫苗配制剂中不存在的物质的交叉保护，和/或允许使用更少量的接种物质。
46.以下讨论提供了本发明主题的许多示例实施方案。尽管每个实施方案代表发明要
素的单个组合，但本发明主题被认为包含所公开的要素的所有可能的组合。因此，如果一个实施方案包含元素a、b和c，而第二个实施方案包含元素b和d，则即使未明确公开，本发明的主题也被认为包括a、b、c或d的其他剩余组合。
47.如本文所用，除非上下文另有说明，否则术语“偶联至”旨在包括直接偶联(其中相互偶联的两个元件彼此接触)和间接偶联(其中至少一个另外的元件位于两个元件之间)。因此，术语“偶联至”和“与
……
偶联”作为同义词使用。
48.米替福新是fda批准的抗寄生物药，其用于治疗利什曼病。米替福新的免疫调节作用包括作为tlr4和tlr9的激动剂(das s,rani m,pandey k,sahoo gc,rabidas vn,singh d,et al.combination of paromomycin and miltefosine promotes tlr4-dependent induction of antileishmanial immune response in vitro.j antimicrob chemother 2012；67:2373-8；mukherjee ak,gupta g,adhikari a,majumder s,kar mahapatra s,bhattacharyya majumdar s,et al.miltefosine triggers a strong proinflammatory cytokine response during visceral leishmaniasis:role of tlr4 and tlr9.int immunopharmacol 2012；12:565-72)，增强ifn-γ受体(wadhone p,maiti m,agarwal r,kamat v,martin s,saha b.miltefosine promotes ifn-gamma-dominated anti-leishmanial immune response.j immunol 2009；182:7146-54),促进il12依赖性th1反应(wadhone p,maiti m,agarwal r,kamat v,martin s,saha b.miltefosine promotes ifn-gamma-dominated anti-leishmanial immune response.j immunol 2009；182:7146-54)，并抑制pi3k-akt通路(lucas a,kim y,rivera-pabon o,chae s,kim dh,kim b.targeting the pi3k/akt cell survival pathway to induce cell death of hiv-1infected macrophages with alkylphospholipid compounds.plos one 2010；5)。已在乳腺癌的治疗中评估了米替福新的局部配制剂(clive s,gardiner j,leonard rc.miltefosine as a topical treatment for cutaneous metastases in breast carcinoma.cancer chemother pharmacol 1999；44suppl:s29-30)。发明人惊奇地发现米替福新可用作季节性流感疫苗的佐剂(使用鼠模型)。如图1中所示，腹膜内米替福新可以增强分裂型病毒体季节性流感疫苗的免疫原性。在图1中圆圈表示米替福新+疫苗治疗组的数据，正方形表示仅疫苗治疗组的数据，三角形表示仅米替福新治疗组的数据，且倒三角形表示盐水处理对照组的数据。如所示，使用米替福新组合流感疫苗接种在免疫后两周提供显著增加的igg滴度。血凝和微量中和滴度也得到改善，表明增强的igg反应是功能性的。还注意到，通过使用米替福新与皮内疫苗接种的组合，igg1和igg2a反应两者均得到增强。
49.在第二系列研究中，小鼠在单次流感疫苗接种后3或7天被感染。如图2a和2b中所示，与未接受佐剂的疫苗接种组相比，接受腹膜内米替福新佐剂的疫苗组显示出显著改善的生存。在图2a中，0.2mg米替福新+疫苗治疗的数据由圆圈和实线的组合表示，0.008mg米替福新+疫苗治疗的数据由菱形和虚线的组合表示，仅0.2mg米替福新治疗的数据用虚/点线表示，仅用疫苗治疗的数据用正方形和实线的组合表示，且用盐水对照处理的数据用点线表示。在图2b中，用1mg米替福新+疫苗治疗的数据用三角形和实线的组合表示，用0.2mg米替福新+疫苗治疗的数据用圆圈和实线组合表示，用0.008mg米替福新+疫苗治疗的数据用菱形和虚线的组合表示，仅用0.2mg米替福新治疗的数据用虚/点线表示，仅用疫苗处理的数据用正方形和实线的组合表示，且用盐水对照处理的数据用点线表示。
50.还发现，接受腹膜内米替福新佐剂和疫苗接种两者的小鼠在感染后4天比接受没有佐剂的疫苗的小鼠具有显著更高的hai和mn滴度，如图3中所示。在图3中，圆圈表示米替福新+疫苗治疗组的数据，正方形表示仅疫苗治疗组的数据，三角形表示仅米替福新治疗组的数据，且倒三角形表示盐水处理对照组的数据。由于hai和mn滴度是在保护方面完善建立的相关物，因此该结果与关于生存率的发现一致(参见图2a和2b)。令人惊讶的是，接受腹膜内米替福新佐剂的经疫苗接种的小鼠的igg1/igg2比率高于未接受佐剂的疫苗组的。不希望受理论束缚，发明人认为这表明腹腔内用米替福新佐剂和流感疫苗两者治疗的组相对于仅接受疫苗的动物表现出th2偏向反应。
51.发现接受腹腔内米替福新佐剂和疫苗接种两者的小鼠比接受没有佐剂的疫苗的小鼠具有显著更高百分比的脾滤泡辅助性t细胞(tfh)，如图4中所示。所示数据表示用米替福新和疫苗治疗后第7天时但在感染前(图4左侧)和感染后两天(第9天，图4右侧)的发现。不希望受理论束缚，发明人认为这表明用腹膜内米替福新佐剂和流感疫苗两者处理的组经由tfh细胞的增加引发更好的抗体反应。
52.如上所述，米替福新可以与病毒免疫原组合掺入疫苗组合物中以提供改善的疫苗配制剂。应当领会，抗病毒疫苗中利用的免疫原包括在培养细胞中生长的病毒(和/或衍生自此类病毒的产品)。因此，发明构思的另一方面包括用于增加来自此类细胞培养物的病毒繁殖和/或产率，从而降低免疫原生产的成本和复杂性的组合物和方法。发明人还认为此类方法可用于实现和/或改善病毒诊断方法的灵敏度。
53.令人惊讶的是，发明人已经发现，经选择以在用于病毒繁殖的培养细胞(例如肝细胞)中增加脂质积累且以非细胞毒性浓度应用的大麻素受体激动剂的应用可以导致对此类培养细胞的病毒感染的细胞病变作用增加。合适的大麻素受体激动剂包括花生四烯酸乙醇胺和花生四烯酸乙醇胺类似物，如(r)-methanandamide和棕榈酰乙醇酰胺(palmitylethanolamide)。此类细胞病变效应是病毒在培养细胞内成功繁殖的结果，并表明病毒复制增强。(r)-methanandamide的结构显示于图5中。
54.在一项示例性研究中，在存在或不存在(r)-methanandamide(10μm，cc
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》60μm)的情况下进行反应细胞活力的比色测定法，以测量培养细胞中在病毒感染时产生的细胞病变效应和在不存在病毒感染的情况下的细胞毒性。具体而言，使用0.1moi和mers-cov感染后24小时(huh7细胞)以及0.01moi和h1n1感染后48小时(mdck细胞)。使用mtt测定法(invitrogen)确定细胞活力。结果显示于图6中，并通过用dmso处理的病毒感染细胞的细胞活力进行标准化。实验一式三份进行。根据通过学生t检验分析，***p《0.001和n.s.表示不显著。数据表示为平均值+s.d.。
55.此类增强的病毒复制可用于改善细胞培养物中的病毒和/或病毒产物产率，从而改善病毒免疫原生产的效率。此类病毒免疫原可用于配制抗病毒疫苗(例如，预防性和/或治疗性疫苗)。在一个优选的实施方案中，此类病毒免疫原在疫苗配制剂中与米替福新组合提供。
56.发明构思的另一个实施方案是大麻素受体激动剂在针对病毒的改善测定中的用途。此类病毒测定法可以基于病毒检测、病毒遗传物质检测(例如通过pcr、rt-pcr和其他依赖特定核酸复制的方法)、病毒抗原检测(例如，通过免疫测定、western印迹、质谱法等)，和/或观察对培养细胞的细胞病变效应。在此类方法中，可在存在导致培养细胞中脂质积累
的无毒性量的大麻素受体激动剂(例如(r)-methanandamide)的情况下将获得用于分析的样品(或此类样品的含有病毒的级分)引入细胞培养物中。增强的病毒复制导致可检测的病毒标志物(遗传和/或抗原性)的产生增加，从而与不存在大麻素受体激动剂的情况相比，允许更早和/或更灵敏的检测，并且还导致可直接观察到的细胞病变效应增加。
57.此类细胞培养步骤不需要进行到细胞裂解或可观察到的细胞病变效应的点，而是可以进行足以导致细胞内病毒或可鉴定病毒组分复制的时间段。在采用此类缩短的温育时段的方法中，可以将培养中的细胞裂解(例如，通过研磨、超声处理、添加表面活性剂、渗透性休克等)以释放病毒和/或病毒产物用于随后的检测。在一些实施方案中，快速诊断方法(例如，实时定量pcr、流式免疫测定、即时检验等)可用于此类基于细胞的测定或方法，以提供具有改善的灵敏度和有利地具有改善的特异性(根据病毒与培养物之间的特异性相互作用而定)的快速诊断方法。
58.对于本领域技术人员来说显而易见的是，除了已经描述的那些之外，在不背离本文的发明构思的情况下，更多的修改是可能的。因此，本发明的主题除了所附权利要求的精神之外，不受限制。此外，在解释说明书和权利要求时，所有术语都应以与上下文一致的尽可能广泛的方式来理解。特别地，术语“包括”和“包含”应被解释为以非排他方式指代元素、组分或步骤，表明所提及的元素、组分或步骤可以存在、使用或与未明确提及的其他元素、组分或步骤组合。当说明书权利要求涉及选自由a、b、c....和n组成的组中的至少一项时，文本应解释为仅需要该组中的一个元素，而不是a加n或b加n等。