本发明涉及减轻具有通过反义效果来阻碍或抑制靶向基因的表达的活性的双链核酸的副作用的结构，更详细而言，涉及通过构成反义链的最适PS修饰模式，能够兼顾反义效果的维持和毒性等副作用降低的双链核酸。
背景技术
近年，正在进行寡核苷酸作为被称为核酸医药的医药品的开发，特别是从靶向基因的选择性的高度的观点出发，利用了反义法的核酸医药的开发在尽力地进行。反义法是通过将与靶向基因的mRNA(有义链)的部分序列互补的寡核苷酸(反义寡核苷酸(ASO))导入至细胞内，选择性地的阻碍或控制靶向基因编码的蛋白质的表达的方法。单链的反义寡核苷酸(Antisense Oligonucleotide，以下称为“ASO”)有：例如具有杂交至靶向信使RNA而形成了双链后，通过核糖核酸酶(RNase H)分解RNA链，靶向信使RNA的表达受到抑制的作用机制的核苷酸；或利用通过ASO杂交至靶向前信使RNA的外显子(编码区域)或内含子(非编码区域)，在前mRNA的加工中诱导外显子跳读，从而在正常的作用下ASO不存在的情况下，作为外显子部而被剪接，除去生成全长mRNA的部分的作用机制的核苷酸。
ASO作为核酸医药而发挥功能，因此需要提高核酸酶抗性。专利文献1中公开了通过进行将作为天然的寡核苷酸的核酸间键的磷酸二酯键的磷酸基的一个氧原子取代为硫原子的硫代磷酸酯化(PS化)，能够大幅提高核酸酶抗性。然而，已知包含数量过多的硫代磷酸酯化核酸的ASO作为核酸医药，作为不依赖于序列的副作用而显示出强的肝毒性(非专利文献1、非专利文献2)。因此，与磷酸二酯键的寡聚物相比，需要在抑制了强的肝毒性的副作用的基础上，提高核酸酶抗性，且提高与靶向mRNA的结合活性。作为解决这个问题的一个手段，提出了使ASO的核酸间键是磷酸二酯键(PO)、硫代磷酸酯键(PS)交替反复的构成的方案(专利文献1)。
另外，专利文献2公开了在由具有能够杂交至靶向信使RNA的序列的ASO和与ASO互补的核酸链构成的双链中使ASO的核酸间键是磷酸二酯键(PO)、硫代磷酸酯键(PS)交替反复的结构的核酸医药(专利文献2)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：WO00/03720 A1
专利文献2：WO2018/051762 A1
非专利文献
非专利文献1：Nucleic Acids Res.,16,pp.3209-3221(1998)
非专利文献2：Trends Biotechnol.1996Oct；14(10):376-87.
技术实现要素：
发明要解决的技术问题
本发明人等认识到异源双链核酸(Hetero-duplex Oligonucleotide)在各种脏器具有高基因表达抑制效果，但存在(1)给药急性期的出血倾向的副作用、(2)皮下给药时的低生物利用率等技术问题。
以往已知减少反义链中的PS修饰的数量时毒性等副作用减少，但PS修饰对于维持核酸的稳定性是必须的，因此减少PS的数量时异源核酸变得不稳定，有效性受到损害。
本发明的目的在于提供减少反义链中的PS修饰的数量(即降低毒性等副作用)且维持了反义效果的双链核酸复合物。
另外，本发明的目的在于提供通过以往提案的PS、PO交替重复的构成以外的结构减少反义链中的PS修饰的数量(即降低毒性等副作用)且维持了反义效果的双链核酸复合物。
用于解决技术问题的技术方案
本发明人等发现了：通过作为双链核酸复合物的第一核苷酸的反义链构成PS修饰模式，维持反义效果并降低毒性的副作用的效果，所述PS修饰模式是(POPOPS)n[PS表示被硫代磷酸酯化的PS修饰核苷酸间键，PO表示未被硫代磷酸酯化的天然的核苷酸间键，n表示自然数]，或具有从第一寡核苷酸的5’端侧向3’端连续的m个PS修饰核苷酸间键(m＝第一寡核苷酸所包含的核酸数的2/3以下，优选是1/2以下的自然数)的。
因此，本发明涉及以下内容。
1.一种双链核酸复合物，是包含第一寡核苷酸和第二寡核苷酸的核酸复合物，所述第一寡核苷酸包含由7～30的核苷酸组成的反义链，所述第二寡核苷酸具有与第一寡核苷酸互补的序列且杂交至第一寡核苷酸，第一寡核苷酸的核苷酸间键的修饰模式包含将PO、PS、POPO、PSPS、POPS及PSPO中的任意核苷酸间键追加至(POPOPS)n的模式[PS表示被硫代磷酸酯化的PS修饰核苷酸间键，PO表示未被硫代磷酸酯化的天然的核苷酸间键，n表示自然数]，或包含具有从第一寡核苷酸的5’端侧向3’端连续的m个PS修饰核苷酸间键(m＝第一寡核苷酸所包含的核酸数的2/3以下的自然数)的模式。
2.根据上述1所述的双链核酸复合物，是包含第一寡核苷酸和第二寡核苷酸的核酸复合物，所述第一寡核苷酸包含由7～30的核苷酸组成的反义链，所述第二寡核苷酸具有与第一寡核苷酸互补的序列且杂交至第一寡核苷酸，第一寡核苷酸的核苷酸间键的修饰模式包含将PO、PS、POPO、PSPS、POPS及PSPO中的任意核苷酸间键追加至(POPOPS)n的模式[PS表示被硫代磷酸酯化的PS修饰核苷酸间键，PO表示未被硫代磷酸酯化的天然的核苷酸间键，n是1～9]。
3.根据上述2所述的双链核酸复合物，第一寡核苷酸的核苷酸间键的修饰模式是以下的任一者：
POPOPS(n＝1)
POPOPSPO
POPOPSPS
POPOPSPOPO
POPOPSPSPS
POPOPSPOPS
POPOPSPSPO
POPOPSPOPOPS(n＝2)
POPOPSPOPOPSPO
POPOPSPOPOPSPS
POPOPSPOPOPSPOPO
POPOPSPOPOPSPSPS
POPOPSPOPOPSPOPS
POPOPSPOPOPSPSPO
POPOPSPOPOPSPOPOPS(n＝3)
POPOPSPOPOPSPOPOPSPO
POPOPSPOPOPSPOPOPSPS
POPOPSPOPOPSPOPOPSPOPO
POPOPSPOPOPSPOPOPSPSPS
POPOPSPOPOPSPOPOPSPOPS
POPOPSPOPOPSPOPOPSPSPO
POPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPS(n＝4)
POPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPO
POPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPS
POPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPO
POPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPSPS
POPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPS
POPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPSPO
POPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPS(n＝5)
POPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPO
POPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPS
POPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPO
POPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPSPS
POPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPS
POPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPSPO
POPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPS(n＝6)
POPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPO
POPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPS
POPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPO
POPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPSPS
POPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPS
POPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPSPO
POPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPS(n＝7)
POPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPO
POPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPS
POPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPO
POPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPSPS
POPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPS
POPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPSPO
POPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPS(n＝8)
POPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPO
POPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPS
POPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPO
POPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPSPS
POPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPS
POPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPSPO
POPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPS(n＝9)
POPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPO
POPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPS
POPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPO
POPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPSPS
POPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPS
POPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPSPO。
4.根据上述3所述的双链核酸复合物，第一寡核苷酸的核苷酸间键的修饰模式是POPOPSPOPOPSPOPOPS。
5.一种双链核酸复合物，是包含第一寡核苷酸和第二寡核苷酸的核酸复合物，所述第一寡核苷酸包含由7～30的核苷酸组成的反义链，所述第二寡核苷酸具有与第一寡核苷酸互补的序列且杂交至第一寡核苷酸，第一寡核苷酸的核苷酸间键的修饰模式包含具有从第一寡核苷酸的5’端侧向3’端连续的m个PS修饰核苷酸间键(m＝第一寡核苷酸所包含的核酸数的2/3以下的自然数)的模式。
6.一种双链核酸复合物，所述核酸复合物包含：第一寡核苷酸，包含由7～28的核苷酸组成的反义链；第二寡核苷酸，具有与第一寡核苷酸互补的序列、杂交至第一寡核苷酸，第一寡核苷酸的核苷酸间键的修饰模式包含具有从第一寡核苷酸的5’端侧向3’端连续的m个PS修饰核苷酸间键(m＝第一寡核苷酸所包含的核酸数的2/3以下的自然数，为1～13的范围)的模式。
7.根据上述6所述的双链核酸复合物，第一寡核苷酸的核苷酸间键的修饰模式是以下任一者：
PSPOPOPO
PSPOPOPOPO
PSPOPOPOPOPO
PSPOPOPOPOPOPO
PSPOPOPOPOPOPOPO
PSPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPOPO
PSPSPOPOPO
PSPSPOPOPOPO
PSPSPOPOPOPOPO
PSPSPOPOPOPOPOPO
PSPSPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPOPOPO
PSPSPSPOPOPOPO
PSPSPSPOPOPOPOPO
PSPSPSPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPOPOPOPOPOPOPO
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PSPSPSPSPSPSPSPSPSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPSPSPSPSPSPSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
8.根据上述7所述的双链核酸复合物，第一寡核苷酸的核苷酸间键的修饰模式是PsPsPsPOPOPOPOPOPO。
9.根据上述1～8的任一者所述的双链核酸复合物，第一寡核苷酸由间隙区域和位于间隙区域两端的翼区域构成，第一寡核苷酸的核苷酸间键的修饰模式是间隙区域的核苷酸间键的修饰模式。
10.根据上述1～9的任一者所述的双链核酸复合物，在第二寡核苷酸结合有配体。
11.根据上述1～10的任一者所述的双链核酸复合物，第一寡核苷酸的翼区域由1～4个核酸构成。
12.根据上述1～11的任一者所述的双链核酸复合物，第一寡核苷酸具有由(第一翼区域)r-(间隙区域)s-(第二翼区域)r表示的结构，r是1～10，s是4～28。
13.根据上述1～12的任一者所述的双链核酸复合物，其特征在于，第一寡核苷酸的翼区域包含1个以上的PS修饰核苷酸间键。
14.根据上述1～12的任一者所述的双链核酸复合物，第一寡核苷酸的翼区域的所有核苷酸间键是PS修饰核苷酸间键。
15.根据上述1～12的任一者所述的双链核酸复合物，第一寡核苷酸的第一翼区域的5’末端侧的核苷酸间键及第二翼区域的3’末端侧的核苷酸间键是PS修饰核苷酸间键。
16.根据上述1～15的任一者所述的双链核酸复合物，第一寡核苷酸的间隙区域由DNA或DNA修饰核苷酸构成，第二寡核苷酸由RNA或RNA修饰核苷酸构成。
本说明书包含作为本申请的优先权基础的日本专利申请第2019-030635号的公开内容。
发明效果
在双链核酸复合物中，通过作为第一寡核苷酸的反义链具有PS修饰模式，能够得到维持了反义效果且降低毒性的副作用的效果，所述PS修饰模式是(POPOPS)n[PS表示被硫代磷酸酯化的PS修饰核苷酸间键，PO表示未被硫代磷酸酯化的天然的核苷酸间键，n表示自然数]、或具有从第一寡核苷酸的5’端侧向3’端连续的m个PS修饰核苷酸间键(m＝第一寡核苷酸所包含的核酸数的2/3以下，优选是1/2以下的自然数)。
另外，根据本发明，能够回避给药急性期的出血倾向的副作用，另外，也能够达成皮下给药时的生物利用率的提高。
附图说明
图1是示出将反义链的PS修饰模式不同的七种PTEN HDO(14mer)给药至小鼠时的肝脏中的敲除作用的比较(n＝4)的图。
图2是示出将反义链的PS修饰模式不同的七种PTEN HDO(14mer)给药时的小鼠肝重量的变化(n＝4)的图。
图3是示出将反义链的PS修饰模式不同的七种PTEN HDO(14mer)给药至小鼠时的血中ALT活性的变化(n＝4)的图。
图4是示出基于PS修饰模式不同的两种类的MALAT1 HDO(16mer)的小鼠肝脏中的敲除作用的比较结果的图。
图5是示出将PS修饰数不同的MALAT1 HDO给药时血中ALT活性的变化的图。
图6是示出基于PS修饰模式不同的两种类的MALAT1 HDO(16mer)的小鼠肝脏中浓度敲除作用的比较结果的图。
图7是示出将PS修饰数不同的ApoB HDO给药时血中ALT活性的变化的图。
具体实施方式
本发明是包含第一寡核苷酸和具有与第一寡核苷酸互补的序列的第二寡核苷酸，且第一寡核苷酸和第二寡核苷酸杂交的核酸复合物，是第一寡核苷酸序列是(POPOPS)n(n＝自然数)或具有从第一寡核苷酸的5’端侧向3’端连续的m个PS修饰核苷(m＝第一寡核苷酸所包含的核酸数的2/3以下，优选是1/2以下的自然数)的双链核酸复合物。
第一寡核苷酸是包含反义链的反义核酸，具有反义效果。将第一寡核苷酸称为反义链，将第二寡核苷酸称为有义链。
反义核酸是指与靶向基因的转录产物等靶向转录产物互补的核酸，具有对靶向基因的反义效果。“反义效果”是指靶向转录产物(RNA有义链)与例如与其部分序列互补的DNA链或通常为了产生反义效果而设计的链等杂交而产生的靶向基因的表达或靶向转录产物水平的抑制。在某情况下，“反义效果”是指，通过杂交产物覆盖所述转录产物而能够产生的翻译阻碍或外显子跳读等剪接功能转化效果和/或识别杂交的部分而能够产生的所述转录产物的分解从而产生的所述抑制。
作为通过反义效果而表达受到抑制的“靶向基因”或“靶向转录产物”，没有特别限制，可以列举在各种疾病中表达亢进的基因。另外“靶向基因的转录产物”是指从编码靶向基因的染色体DNA转录的mRNA，还包含未受到碱基的修饰的mRNA、未受到剪接的mRNA前体等。通常，“转录产物”通过DNA依赖性RNA聚合酶合成，可以是任意RNA。
所谓的“互补的”一词在这里是指经由氢键，能够形成所谓的沃森-克里克型碱基对(天然型碱基对)、非沃森-克里克型碱基对(胡斯坦型碱基对等)的关系。在反义链的充分数量的核酸碱基能够与靶向核酸的对应的核酸碱基形成氢键的情况下，反义链与靶向核酸是相互互补的。在反义链能够与靶向核酸特异性地杂交的条件下，能够容许反义链和靶向核酸之间的非互补的核酸碱基。进而，反义化合物能够与目标核酸的一个以上的片段杂交，由此介入或邻接的片段(例如环结构、错配或发夹结构)不参与杂交现象。
在特定的实施方式中，作为第一寡核苷酸的反义链相对于靶向核酸是80～100％、优选是90～100％、更优选是95～100％、96～100％、97～100％、98～100％、99～100％或100％互补。相对于靶向核酸的反义链的互补性的比例能够使用惯例的方法求得。
例如反义链的20个核酸碱基中的16个相对于靶向区域互补，因此特异性杂交的反义链显示出80％的互补性。在该例子中，在剩余的非互补的核酸碱基中，互补的核酸碱基能够聚集或分散，这些非互补的核酸碱基没有必要互相邻接或与互补的核酸碱基邻接。
本说明书中，“核酸”是指天然型核酸、非天然型核酸和/或核酸类似物，但“核酸”也存在指单体核苷酸的情况，也存在指由多个单体构成的寡核苷酸、聚核苷酸的情况。所谓的“核酸链”一词在这里用于称呼寡核苷酸、聚核苷酸。核酸链其全部或一部分可以通过例如使用自动合成机的化学合成法而制备，也可以通过不限于聚合酶、连接酶或限制酶反应的酶处理而制备。在本发明的一个实施方式中，本发明的反义核酸中的聚核苷酸(及互补链中的聚核苷酸)是通过化学合成或酶反应人工制备的物质。
在本说明书中，“核苷酸”是指核苷的糖部分和磷酸形成酯的化合物，在此“核苷”是指，嘌呤碱基或嘧啶碱基之类的含氮的有机碱基和糖的还原基通过糖苷键而结合的糖苷化合物。
另外，“脱氧核糖核苷酸”是糖部分由D-2-脱氧核糖组成的核苷酸，也称为“DNA核苷酸”。另外，“核糖核苷酸”是糖部分由D-核糖组成的核苷酸，也称为“RNA核苷酸”。然后，“脱氧核糖核苷”是糖部分由D-2-脱氧核糖组成的核苷，也称为“DNA核苷”。另外，“核糖核苷”是糖部分由D-核糖组成的核苷，也称为“RNA核苷”。
“寡核苷酸”是指，以核苷酸为基本单位，磷酸在各核苷酸之间在糖的3’和5’位碳之间形成二酯键的桥而连结的多个核苷酸聚合的链状物质。有时也将寡核苷酸称为聚核苷酸。需要说明的是，本说明书中，有时也将这种寡核苷酸所包含的作为其构成单位的核苷酸(处于聚合的状态)同样称为“核苷酸”。
在本说明书中，“天然型核酸”是指，以核苷酸为基本单位，磷酸在各核苷酸之间在糖的3’和5’位碳之间形成二酯键的桥而连结并聚合的存在于自然界的聚核苷酸。通常指具有腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶及尿嘧啶的任意碱基的核糖核苷酸连结的RNA和/或具有腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶及胸腺嘧啶的任意碱基的脱氧核糖核苷酸连结的DNA。需要说明的是，本说明书中，也将上述的各核苷酸间的键称为“核酸间键”。
在本说明书中，“非天然型核酸”是指包含非天然型核苷酸或由其组成的核酸。在此“非天然型核苷酸”是指人工构建或人工化学修饰的不存在于自然界的核苷酸，是指具有与所述天然存在的核苷酸类似的性质和/或结构的核苷酸、或包含具有与天然存在的核苷或者碱基类似的性质和/或结构的核苷或者碱基的核苷酸。例如可以列举去碱基核苷、阿拉伯核苷、2’-脱氧尿苷、α-脱氧核糖核苷、β-L-脱氧核糖核苷、具有其他的糖修饰的核苷酸。进而包含取代五碳糖(2’-O-甲基核糖、2’-脱氧-2’-氟核糖、3’-O-甲基核糖、1’,2’-脱氧核糖)、阿拉伯糖、取代阿拉伯糖；具有取代六碳糖及α端基差向异构的糖修饰的核苷酸。另外，非天然型核苷酸还包括包含人工构建的碱基类似物或人工化学修饰的碱基(修饰碱基)的核苷酸。另外，作为修饰的例子，可以列举胞嘧啶的5-甲基化、5-氟化、5-溴化、5-碘化及N4-甲基化；胸苷的5-去甲基化、5-氟化、5-溴化及5-碘化；腺嘌呤的N6-甲基化及8-溴化；鸟嘌呤的N2-甲基化及8-溴化；甲基磷酸化、甲硫基磷酸化、手性甲基磷酸化、二硫代磷酸酯化、亚硫酰胺化、2'-O-甲基化、2'-甲氧基乙基(MOE)化、2'-氨丙基(AP)化及2'-氟化等。在“碱基类似物”中，例如可以列举2-氧(1H)-吡啶-3-基、5位取代-2-氧(1H)-吡啶-3-基、2-氨基-6-(2-噻唑基)嘌呤-9-基、2-氨基-6-(2-噻唑基)嘌呤-9-基、2-氨基-6-(2-噁唑基)嘌呤-9-基等。在“修饰碱基”中，例如可以列举修饰化嘧啶(例如5-羟胞嘧啶、5-氟尿嘧啶、4-硫尿嘧啶)、修饰化嘌呤(例如6-甲基腺嘌呤、6-硫鸟甙)及其他杂环碱基等。另外，非天然型核苷酸还能够包含甲基磷酸酯型DNA/RNA、硫代磷酸酯型DNA/RNA(即，具有硫磷酸键的DNA/RNA)、亚磷酰胺型DNA/RNA、2’-O-甲基型DNA/RNA等修饰核苷酸、核酸类似物。其中，就第一寡核苷酸而言，被硫代磷酸酯化的核苷酸间键的存在具有一定的模式。对被硫代磷酸酯化的核苷酸间键的存在模式在后面说明。另外，非天然型核苷酸包含作为具有与天然型核酸类似的结构和/或性质的人工构建的化合物的核苷酸类似物。“核苷酸类似物”是通过修饰(交联基、取代基等)，增强对互补链或靶向转录产物的部分序列的亲和性和/或对核酸酶的核酸的抵抗性的任意核酸，能够包含肽核酸(PNA：Peptide Nucleic Acid)、具有磷酸基的肽核酸(PHONA)、交联化核酸(BNA/LNA：Bridged Nucleic Acid/Locked Nucleic Acid)、吗啉基核酸、己糖醇(HNA)、环己烯核酸(CeNA)、乙二醇核酸(GNA)、苏糖核酸(TNA)、三环-DNA(tcDNA)、2’-O-甲基化核酸、2’-MOE(2’-O-甲氧基乙基)化核酸、2’-AP(2’-O-氨丙基)化核酸、2’-氟化核酸、2’F-阿拉伯核酸(2'-F-ANA)、碱基性聚氨基酸(Poly L-Lys、Poly L-Arg)等。本说明书中，将这些总称为“修饰核苷酸”。修饰核苷酸及修饰核苷酸类似物不限于本说明书中示例的修饰核苷酸及修饰核苷酸类似物。
在某实施方式中，核苷酸类似物是由下述式(1)表示的LNA。
[化学式1]
(式(1)中，碱基表示可以具有取代基的芳香族杂环基或者芳香族烃环基，例如天然型核苷的碱基部位(嘌呤碱基、嘧啶碱基)或非天然型(修饰)核苷的碱基部位。需要说明的是，碱基部位的修饰例如前述。
R1、R2可以相同也可以不同，表示氢原子、核酸合成的羟基的保护基、烷基、烯基、环烷基、芳基、芳烷基、酰基、磺酰基、甲硅烷基、磷酸基、被核酸合成的保护基保护的磷酸基或-P(R4)R5，在此，R4及R5可以相同也可以不同，表示羟基、被核酸合成的保护基保护的羟基、巯基、被核酸合成的保护基保护的巯基、氨基、碳原子数1～5的烷氧基、碳原子数1～5的烷硫基、碳原子数1～6的氰基烷氧基或被碳原子数1～5的烷基取代的氨基。
需要说明的是，在所述化学式中表示的化合物是核苷，但在某实施方式中的“LNA”及通常BNA中，也包含在该核苷结合磷酸基的方式(核苷酸)。即，称为LNA的BNA作为核苷酸组合至包含双链核酸复合物的核酸链。
在特定的实施方式中，寡核苷酸包含修饰核苷酸。在某实施方式中，只要包含反义链的寡核苷酸具有被硫代磷酸酯化的核苷酸间键的一定的存在模式，寡核苷酸就可以是包含核苷酸和任意的修饰核苷酸的构成，也可以是所有修饰核苷酸。为了防止在生物体内基于酶的消化作用而导致的核酸链的切断，出于使核酸间的键比天然型核酸更牢固的目的，反义寡核苷酸可以仅在任意位置以任意数量包含修饰核苷酸。
本发明的双链核酸复合物中的第一寡核苷酸的长度没有限制，是5～100核苷酸，优选是7～50核苷酸，进而优选是7～30核苷酸，进而优选是7～25核苷酸，进而优选是7～20核苷酸。
只要与第一寡核苷酸退火，第二寡核苷酸的长度就没有限定，第二寡核苷酸和第一寡核苷酸的长度可以相同也可以不同，但优选与第一寡核苷酸相同的长度。
第一寡核苷酸优选包含间隙(Gap)区域、与该间隙区域的5’末端连结的5’翼(Wing)区域和与所述间隙区域的3’末端连结的3’翼区域。即，间隙区域的两端具有翼区域，由这些区域构成。翼区域优选配置于反义核酸的5’末端和/或3’末端。间隙区域也称为中央核苷酸区域。有时将5’翼区域称为第一翼区域，将3’翼区域称为第二翼区域。
间隙区域包含核糖核酸酶RNAse H能够识别的四个以上的连续的核苷酸或修饰核苷酸，优选包含四个以上的连续的DNA核苷酸或修饰DNA核苷酸。间隙区域的长度是4～28碱基，优选是4～20碱基，进而优选是5～16碱基，进而优选是6～16碱基。
5’翼区域及3’翼区域各自独立，可以包含至少一个修饰核苷酸。作为修饰核苷酸优选例如可以列举LNA，5’翼区域及3’翼区域的所有核苷酸也可以均是LNA。在第一寡核苷酸中，在中央配置至少4碱基以上的链长的DNA，进而通过在两端配置与RNA(即，靶向转录产物)具有强的结合能力的LNA(或其他的BNA)，这种复合链变得促进基于核糖核酸酶的靶向RNA的切断。
5’翼区域及3’翼区域的长度独立地是1～10碱基，优选是1～7碱基，进而优选是1～4碱基，进而优选是2～4碱基。或者是2～5碱基。
主要为了提高反义核酸的核酸酶抗性和对成为靶向的mRNA的该核酸的亲和性，翼区域是配置化学修饰核苷酸的片段。
在本发明的一个实施方式中，包含反义链的第一寡核苷酸具有由(第一翼区域)r-(间隙(Gap)区域)s-(第二翼区域)r表示的序列。在此，第一翼区域是5’翼区域，第二翼区域是3’翼区域。另外，r及s分别表示构成翼区域及间隙区域的碱基的数量，r＝1～10，优选是1～7，进而优选是1～4，进而优选是2～4。或是2～5或者1～4。s＝4～28，优选是4～20，进而优选是5～16，进而优选是6～16。
第二寡核苷酸是由从RNA、DNA、PNA(肽核酸)及BNA(例如LNA)组成的组选择的至少一种核酸组成的寡核苷酸。在第二寡核苷酸是RNA寡核苷酸的情况下，将双链核酸复合物称为异源双链核酸复合物。从双链核酸复合物被细胞内的核糖核酸酶识别，被第二寡核苷酸分解，从而变得易于发挥第一寡核苷酸的反义效果的观点出发，第二寡核苷酸优选是RNA，但不限定于RNA。RNA可以被修饰，可以是2’-O-甲基核糖(2’-O-甲基修饰RNA)。例如与第一寡核苷酸的5’翼区域及3’翼区域互补的核苷酸可以是2’-O-甲基修饰RNA。
将包含间隙区域、与该间隙区域的5’末端连结的5’翼区域和与所述间隙区域的3’末端连结的3’翼区域的寡核苷酸称为间隙体(Gapmer)。例如将5’翼区域的碱基是r个、间隙区域的碱基是s个、3’翼区域的碱基是r个的寡核苷酸称为具有r-s-r的间隙体结构的寡核苷酸。
在本发明的一个实施方式中，反义链包含脱氧核糖核苷酸(DNA核苷酸)或可以被化学修饰的脱氧核糖核苷酸(修饰DNA核苷酸)。可以是间隙区域的核苷酸是DNA核苷酸，也可以是所有的核苷酸是DNA核苷酸。
在本发明的一个实施方式中，具有和第一寡核苷酸互补的序列的第二寡核苷酸包含核糖核苷酸(RNA核苷酸)或可以被化学修饰的核糖核苷酸(修饰RNA核苷酸)。可以是一部分的核苷酸是RNA核苷酸，也可以所有的核苷酸是RNA核苷酸。
在本说明书中，作为修饰核苷酸的一个方式，将被施加了硫代磷酸酯化的核苷酸间键、即硫代磷酸酯型DNA/RNA(即，具有硫代磷酸酯键的DNA/RNA)称为PS修饰核苷酸间键。被施加了硫代磷酸酯化的核苷酸间键是指将具有磷酸二酯键的寡核苷酸的磷酸基的氧原子由硫原子取代的键。另外，将未被施加硫代磷酸酯化的核苷酸间键称为天然型(PO)核苷酸间键。只要是本领域技术人员，就能够根据核苷酸的种类(例如脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸)、核酸类似物的种类，适宜地分别选择并施加可能的化学修饰。
第一寡核苷酸中的PS修饰核苷酸间键，特别是第一寡核苷酸的间隙区域中的PS修饰核苷酸间键以一定的模式存在。将PS修饰核苷酸间键的模式称为PS修饰模式或简单称为修饰模式。在此，PS修饰核苷酸间键是指核苷酸和其3’侧的核苷酸之间的键被硫代磷酸酯化，将由被硫代磷酸酯化的核苷酸间键连结的两个核苷酸的5’侧的核苷酸称为PS修饰核苷酸。
第一寡核苷酸的核苷酸间键的修饰模式例如包含将PO、PS、POPO、PSPS、POPS及PSPO中的任意核苷酸间键追加至(POPOPS)n的模式。第一寡核苷酸的间隙区域的序列的核苷酸间键的修饰模式优选由例如将PO、PS、POPO、PSPS、POPS及PSPO中的任意核苷酸间键追加至(POPOPS)n的模式表示。在此，PS表示被硫代磷酸酯化的PS修饰核苷酸间键，PO表示未硫代磷酸酯化的天然的核苷酸间键，n表示自然数，优选是1～9。在第一寡核苷酸的间隙区域的序列的核苷酸间键的数量是p的情况下，第一寡核苷酸的间隙区域的碱基的数量是p+1。例如具体而言，在寡核苷酸的间隙区域的碱基的数量是10个的情况下，核苷酸间键的数量是9。另外，第一寡核苷酸包含具有从第一寡核苷酸的5’端侧向3’端连续的m个PS修饰核苷酸间键(m＝第一寡核苷酸所包含的核酸数的2/3以下，优选是1/2以下的自然数)的模式。第一寡核苷酸的间隙区域的序列的核苷酸间键优选具有如下模式：具有从第一寡核苷酸的5’端侧向3’端侧连续的m个PS修饰核苷酸间键(m＝第一寡核苷酸所包含的核酸数2/3，优选是1/2以下的自然数)。
第一寡核苷酸的5’翼区域及3’翼区域的核苷酸间键可以是PS修饰核苷酸间键，也可以是PO核苷酸间键，也可以是PS修饰核苷酸间键和PO核苷酸间键混合。例如可以包含1个以上的PS修饰核苷酸间键，也可以所有均是PS修饰核苷酸间键。另外，5’翼区域的5’末端侧的核苷酸间键及3’翼区域的3‘末端侧的核苷酸间键是PS修饰核苷酸间键。
将第一寡核苷酸的序列，优选从间隙区域的序列的5’侧的核苷酸间键的修饰模式的例子示于以下。
POPOPS(n＝1)
POPOPSPO
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POPOPSPOPS
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POPOPSPOPOPS(n＝2)
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在某实施方式中的双链核酸复合物中，可以在第二寡核苷酸结合功能性部分。第二寡核苷酸和功能性部分的结合可以是直接地结合，也可以是介由其他物质的间接地结合，在某实施方式中，优选第二寡核苷酸和功能性部分以共价键、离子键、氢键等直接地结合，从能够得到更稳定的结合的观点出发，更优选共价键。
在某实施方式中，在“功能性部分”的结构上没有特别限制，对与其结合的双链核酸复合物和/或核酸链赋予所需的功能。作为所需的功能，可以列举标识功能、纯化功能及向靶标的递送功能。作为赋予标识功能的部分的例子，可以列举荧光蛋白质、荧光素酶等化合物。作为赋予纯化功能的部分的例子，可以列举生物素、亲和素、His-tag肽、GST-tag肽、FLAG-tag肽等化合物。
另外，从将第一寡核苷酸特异性高且效率地递送至靶向部位，且通过该核酸非常有效地抑制靶向基因的观点出发，优选在第二寡核苷酸结合具有将某实施方式中的双链核酸复合物递送至靶向部位的活性的分子作为功能性部分。
作为具有“向靶标的递送功能”的部分，例如从能够特异性高且效率地将某实施方式中的双链核酸复合物递送至肝脏等的观点出发，可以列举脂质。作为这种脂质，能够示例胆固醇、脂肪酸等脂质(例如维生素E(生育酚类、生育三烯酚类)、维生素A、维生素D)、维生素K等脂溶性维生素(例如酰基肉碱)、酰基CoA(酰基辅酶A)等中间代谢物、糖脂质、甘油酯以及它们的衍生物等，但其中，从安全性更高的观点出发，优选在某实施方式中利用胆固醇、维生素E(生育酚类、生育三烯酚类)。另外，从能够特异性高且效率地将本发明的双链核酸递送至脑的观点出发，作为某实施方式中的“功能性部分”，可以列举糖(例如葡萄糖、蔗糖)。另外，从通过与各脏器的细胞表面所存在的各种蛋白质结合，能够特异性高且效率地将某实施方式中的双链核酸复合物递送至该脏器的观点出发，可以列举受体的配体、抗体和/或它们的片段等肽或蛋白质作为某实施方式中的“功能性部分”。
如后述的实施例所示，若干实施方式中的双链核酸复合物被特异性高且效率良好地递送至靶向部位，且能够非常有效地抑制靶向基因的表达或靶向转录产物水平。因此，本发明能够提供含有若干实施方式中的双链核酸复合物作为有效成分、例如用于将靶向基因的表达通过反义效果而抑制的组合物。特别而言，若干的实施方式中的双链核酸复合物能够通过低浓度的给药得到高药效，且通过抑制反义核酸的递送靶向区域以外的脏器中的分布，也能够降低副作用，因此也能够在若干的实施方式中提供用于治疗、预防代谢性疾病、肿瘤、感染症等伴随靶向基因的表达亢进的疾病的医药组合物。
包含若干的实施方式中的双链核酸复合物的组合物能够通过公知的制剂学方法进行制剂化。例如作为胶囊剂、片剂、丸剂、液剂、散剂、颗粒剂、细颗粒剂、膜包衣剂、滴剂、糖(troche)剂、舌下剂、咀嚼剂、口腔制剂、贴剂、糖浆剂、悬浮剂、酏(elixir)剂、乳剂、涂布剂、软膏剂、硬膏剂、凝胶贴膏剂、经皮吸收型制剂、洗剂、吸引剂、气雾剂、注射剂、栓剂等，能够用于经肠道(经口等)或非经肠道。
在这些制剂化中，作为药理学上或者饮食品能够允许的载体，具体而言，能够与灭菌水、生理食盐水、植物油、溶剂、基剂、乳化剂、悬浮剂、表面活性剂、pH调节剂、稳定剂、香味剂、芳香剂、赋形剂、运载物(vehicle)、防腐剂、结合剂、稀释剂、等渗剂、无痛化剂、增量剂、崩解剂、缓冲剂、包衣剂、润滑剂、着色剂、甜味剂、粘稠剂、矫味矫臭剂、溶解辅助剂或者其他添加剂等进行适宜组合。
在若干的实施方式中的双链核酸复合物中，可以使其与乳糜微粒、乳糜微粒残余等脂蛋白形成复合物。进而，从提高经肠给药的效率的观点出发，除了所述脂蛋白之外，也可以是与具有大肠粘膜上皮透过性亢进作用的物质(例如中链脂肪酸、长链不饱和脂肪酸或它们的衍生物(盐、酯体或醚体))及表面活性剂(非离子性表面活性剂、阴离子性表面活性剂)的复合物(混合微胶粒、乳剂)。
作为若干的实施方式中的组合物的优选的给药方式，没有特别限制，经肠道的(经口的等)或非经肠道的，更具体而言，可以列举静脉内给药、动脉内给药、腹腔内给药、皮下给药、皮内给药、气管内给药、直肠给药及筋肉内给药、基于输液的给药。
若干的实施方式中的组合物能够以将包含人的动物作为对象而使用，但作为人以外的动物没有特别限制，能够将各种家畜、家禽、宠物、实验用动物等作为对象。
在将若干的实施方式中的组合物给药或摄取的情况下，其给药量或摄取量能够根据对象的年龄、体重、症状、健康状态、组合物的种类(医药品、饮食品等)等而适宜选择，但某实施方式涉及的组合物的有效摄取量优选以核苷酸换算是0.001mg/kg/日～50mg/kg/日。
如后述的实施例所示，若干的实施方式中的双链核酸被特异性高且效率地递送至靶向部位，且能够非常有效地抑制靶向基因的表达或靶向转录产物水平。因此，在若干的实施方式中，能够提供对对象给药若干的实施方式中的双链核酸复合物，通过反义效果而抑制靶向基因的表达或靶向转录产物的方法。另外，也能够提供通过将若干的实施方式中的组合物给药至对象，治疗、预防伴随靶向基因的表达亢进等的各种疾病的方法。
实施例
通过以下的实施例对本发明进行具体地说明，但本发明并非由这些实施例限定的发明。
在作为由链长14mer构成的异源核酸的包含间隙体(Gapmer)结构的第一寡核苷酸的反义链中的13处核苷酸间键中的PS(硫代磷酸酯化修饰)的导入部位中，发现了两种即使使6处PS是天然型(PO)，也未减弱有效性的7处PS的导入部位的模式。由此，能够达成给药急性期的出血倾向的副作用的回避和皮下给药时的生物利用率的提高。
在本发明中，设计了从PTEN基因选择的具有2-10-2的间隙体结构、且包含PS修饰的模式不同的反义链的七种异源双链核酸(Heteroduplex oligonucleotide:HDO)。需要说明的是，使作为这些HDO的第二寡核苷酸的有义链的翼部分包含2’-O-甲基修饰RNA，且在间隙区域配置了RNA。进而，从有义链的两端在各2处核酸间键施加PS修饰，在5’末端赋予胆固醇(Chol)作为配体。寡核苷酸的合成委托了Gene Design Inc.。
[表1]
PTEN HD0的序列
小写字母表示DNA，大写字母表示RNA，N(L)表示LNA修饰[例子：A(L)、T(L)、G(L)、mC(LNA甲基胞嘧啶)表示为5(L)]、^(山形符号)表示PS修饰核苷酸间键、大写字母(M)表示2’-O-甲基修饰RNA[例子：A(M)、G(M)、C(M)、U(M)]、Chol表示胆固醇。
上述表的1～7的反义链的序列分别是序列表的序列号1～7的序列，有义链的序列是序列号8的序列。
如下述设计了七种HDO的反义链的13处核苷酸间键中的PS修饰。在本发明中，间隙区域的核苷酸间键、即下述的第3～第11的核苷酸间键的PS修饰模式是重要的。
PTEN-1 PsPs PsPsPsPsPsPsPsPsPs PsPs(Ps∶PO＝13∶0)
PTEN-2 PsPO PsPsPsPsPsPsPsPsPs POPs(Ps∶PO＝11∶2)
PTEN-3 PsPs POPOPOPOPOPOPsPsPs PsPs(Ps∶PO＝7∶6)
PTEN-4 PsPs PsPsPsPOPOPOPOPOPO PsPs(Ps∶PO＝7∶6)
PTEN-5 PsPs POPOPsPOPOPsPOPOPs PsPs(Ps∶PO＝7∶6)
PTEN-6 PsPs PsPsPOPsPsPOPsPsPO PsPs(Ps∶PO＝10∶3)
PTEN-7 PsPO PsPsPOPsPsPOPsPsPO POPs(Ps∶PO＝8∶5)
[实施例1]将反义链的PS修饰模式不同的七种PTEN HDO(14mer)给药至小鼠时的肝脏中的敲除作用的比较
调查了向c57BL/6小鼠给药反义链的PS修饰模式不同的七种PTEN HDO(14mer)时的肝脏中的敲除作用。空白对照是媒液(生理盐水)，阳性对照使用了全PS修饰的PTEN-1。PTEN HDO的给药量设定为100nmol/kg，通过小鼠的尾静脉进行了单次给药(10ml/kg)。给药3日，将小鼠在异氟醚麻醉下进行心内采血，取出了肝脏。使用SV Total RNA Isolation System(Promega)从肝组织提取总RNA(Total RNA)，使用PrimeScript(注册商标)RT Master Mix(Takara Bio)进行了逆转录反应后，使用LightCycler(注册商标)480System II(Roche)进行了定量PCR。PTEN及18SrRNA的引物、探针使用TaqMan Gene Expression Assays(Thermo Fisher Scientific)的试剂，mRNA表达量通过ΔΔCt法算出。
如图1所示，与媒液相比，从间隙区域内5’端仅3个核酸间键是PS修饰的PTEN-4(PS＝7个)示出了24％的敲除作用。另外，与媒液给药组相比，间隙区域内具有POPOPS修饰的三次重复序列的PTEN-5(PS＝7个)示出了33％的敲除作用。PTEN-5的敲除率与全PS修饰的PTEN-1(PS＝13个)是相同程度。十分有趣的是，PTEN-5比具有PSPSPO修饰模式的三次重复序列的PTEN-6、PTEN-7示出了更强的敲除活性。通过以上的结果，已知PTEN-5与PTEN-1相比，能够不降低敲除活性且减少PS修饰数。
[实施例2]将反义链的PS修饰模式不同的七种PTEN HDO(14mer)给药至小鼠时的肝重量的变化
在实施例1中PTEN-4和PTEN-5示出了敲除活性，因此以与实施例1相同的PTEN HDO的给药量：100nmol/kg确认是否示出毒性的副作用。
将施加了实施例1所述的处置的小鼠在给药3日后使用异氟醚麻醉后，使用事先施加了肝素钠处理的注射器进行了心内采血后，取出了肝脏。图2示出给药反义链的PS修饰模式不同的七种PTEN HDO(14mer)3日后的小鼠的肝脏重量的变化。与媒液给药组相比，肝脏重量在任意PS修饰模式的PTEN HDO给药组均未确认到显著差异。
[实施例3]将反义链的PS修饰模式不同的七种PTEN HDO(14mer)给药至小鼠时的血中ALT活性的变化
将施加了实施例1所述的处置的小鼠在给药3日后使用异氟醚麻醉后，使用事先施加了肝素钠处理的注射器进行了心内采血后，取出了肝脏。将血液离心分离，使用上清将血中肝脏逸脱酶(ALT)活性使用转氨酶CII-测试和光(富士胶片和光纯药)进行了计测。图3示出给药反义链的PS修饰模式不同的七种PTEN HDO(14mer)3日后的小鼠的血中ALT活性的变化。与媒液给药组相比，在任意PS修饰的PTEN HDO给药组中均未确认到血中ALT活性的显著变化。
[实施例4]与PTEN-1不同的基因及链长下的模式的有效性
在本实施例中，设计了从MALAT1及ApoB基因选择的具有3-10-3的间隙体结构、且包含PS修饰的模式不同的反义链的3种异源双链核酸(Hetero-duplex oligonucleotide:HDO)，即全PS修饰和PS修饰模式不同的两种模式：(POPOPS)n、从5’端侧连续的m个(m＝反义链的链长的2/3以下，优选是1/2以下的自然数)的PS修饰核苷酸。需要说明的是，在这些HDO的有义链的翼部分包含2’-O-甲基修饰RNA，且在间隙部分配置RNA。进而，在从有义链的两端各3处的核酸间键施加PS修饰，在5’末端赋予胆固醇(Chol)作为配体。寡核苷酸的合成委托了Gene Design Inc.。
[表2]
MALAT1及ApoB HD0的序列
表2中，n表示DNA，N表示RNA，N(L)表示LNA修饰[A(L)、T(L)、G(L)、mC表示为5(L)]，^表示PS修饰，N(M)表示2’-O-甲基修饰RNA[A(M)、G(M)、C(M)、U(M)]，Chol表示胆固醇。
将表2的MALAT1的反义链及有义链的序列分别示于序列表的序列号9及10，将ApoB的反义链及有义链的序列分别示于序列表的序列号11及12。
如下述设计了3种从MALAT1基因、ApoB基因选择的3-10-3的间隙体，HDO的反义链及单链反义寡聚物(ASO)的反义链中的PS修饰。
MALAT1(1)PsPsPs PsPsPsPsPsPsPsPsPs PsPsPs(Ps∶PO＝15∶0)
MALAT1(2)PsPsPs PsPsPsPoPoPoPoPoPo PsPsPs(Ps∶Po＝9∶6)
MALAT1(3)PsPsPs PoPoPsPoPoPsPoPoPs PsPsPs(Ps∶Po＝9∶6)
ApoB(1)PsPsPs PsPsPsPsPsPsPsPsPs PsPsPs(Ps∶PO＝15∶0)
ApoB(2)PsPsPs PsPsPsPoPoPoPoPoPo PsPsPs(Ps∶Po＝9∶6)
ApoB(3)PsPsPs PoPoPsPoPoPsPoPoPs PsPsPs(Ps∶Po＝9∶6)
[实施例5]1)MALAT1的反义链的PS修饰模式不同的两种HDO的敲除作用
使用c57BL/6小鼠，调查了MALAT1 HDO(MALAT1(2)及MALAT1(3)、16mer)的肝脏对MALAT1 mRNA的敲除作用。空白对照是媒液(生理盐水)，阳性对照使用了全PS修饰的MLAT1(1)。MALAT1 HDO的给药量设定为100nmol/kg，将小鼠使用异氟醚麻醉后，通过尾静脉进行了单次给药(10ml/kg)。在给药3日后从小鼠肝脏使用SVTotal RNA Isolation System(Promega)提取总RNA，使用PrimeScript RT Master Mix(Takara Bio)进行了逆转录反应后，使用LightCycler(注册商标)480System II(Roche)进行了定量PCR。qPCR检测用的引物、探针使用TaqMan Gene Expression Assays(Thermo Fisher Scientific)的试剂，mRNA表达量通过ΔΔCt法算出。
如图4所示，全PS修饰的MALAT1(1)(PS＝15个)示出了最强的敲除活性(93％)。与其相比，MALAT1(2)和MALAT1(3)(PS＝9个)分别将肝脏的MALAT1 mRNA表达抑制了70％、62％。
与媒液给药组相比，MALAT1 HDO给药三日后的血中ALT活性均未确认到显著变化。将ALT活性的测定结果示于图5。
[实施例6]ApoB的反义链的PS修饰模式不同的两种HDO(16mer)的敲除作用
使用c57BL/6小鼠调查了ApoB HDO(ApoB(2)及ApoB(3)、16mer)的对于肝脏ApoB mRNA表达的敲除作用。空白对照是媒液(生理盐水)，阳性对照使用了全PS修饰的ApoB(1)。ApoB HDO的给药量设定为100nmol/kg，将小鼠使用异氟醚麻醉后，通过尾静脉进行了单次给药(10ml/kg)。在给药3日后从小鼠肝脏使用SV Total RNAIsolation System(Promega)提取总RNA，使用PrimeScript RT Master Mix(Takara Bio)进行了逆转录反应后，使用LightCycler(注册商标)480System II(Roche)进行了定量PCR。qPCR检测用的引物、探针使用TaqMan Gene Expression Assays(Thermo Fisher Scientific)的试剂，mRNA表达量通过ΔΔCt法算出。
如图6所示，全PS修饰的ApoB(1)(PS＝15个)将肝脏的ApoB mRNA表达敲除了50％。与其相比，ApoB(2)和ApoB(3)(PS＝9个)将肝脏的ApoB mRNA表达分别抑制了39％、38％。
与媒液给药组相比，ApoB HDO给药三日后的血中ALT活性均未确认到显著变化。将ALT活性的测定结果示于图7。
[实施例7]PS修饰模式不同的两种HDO对于由全PS修饰寡核苷酸带来的延长血液凝固时间的缩短血液凝固时间的效果
使用活性化部分部分凝血酶原时间(Activated Partial Thromboplastin Time:APTT)调查了PS修饰寡核苷酸对给药急性期的出血倾向的影响。作为阳性对照，使用了全PS修饰的MALAT1 ASO(16mer，单链)。按照血浆样本数量准备试管，在各试管取APTT试剂0.1mL，在37℃加温1分钟。接着，分别加入并混合从正常小鼠的血浆样本及来自于给药了ASO MALAT1(1)、HDO MALAT1(1)、(2)、(3)、HDO ApoB(1)、(2)、(3)的小鼠的血浆样本各0.1mL，在37℃加温了2分钟。将接着向各试管加入事先加温至37℃的氯化钙液0.1mL而制备的血浆的活性化部分的部分凝血酶原时间(activated partial thromboplastin time；aPTT)使用自动血液凝固测定装置CA-50(希森美康公司)进行了测定。
将结果示于表3。未处理血液(正常)的APTT是24.3秒，与此相对的，全PS修饰的MALAT1 HDO的APTT是59.7秒，PS修饰少的MALAT1(2)及MALAT1(3)的APTT时间是48.6秒，缩短了约20％。全PS修饰的ApoB(1)的APTT是55.3秒，ApoB(2)及ApoB(3)的APTT时间分别是45.6秒和45.8秒，缩短了约20％。阳性对照的全PS修饰的MALAT1 ASO(1)的APTT达到75.8秒，比未处理血液(正常)的APTT的24.3秒延长了约3倍。APTT的基准值(正常值)是25.0～40.0秒，越偏离基准值，即为疑似肝功能障碍的指标。ApoB(2)及ApoB(3)的APTT时间比ApoB(1)的APTT时间缩短了，即改善了作为给药急性期的出血倾向的副作用的肝功能障碍。
[表3]
对APTT的影响
根据实施例4、5、6、7，对于作为由链长16mer构成的异源核酸的包含间隙体结构的反义链中的包含15处PS的全PS修饰模式的MALAT1(1)、ApoB(2)，发现了即使将部分PS变更为PO也不会减弱有效性且能够缩短APTT时间的两种模式：MALAT1(2)、MALAT1(3)、ApoB(2)、ApoB(3)。由此，能够达成了给药急性期的出血倾向的副作用的回避和皮下给药时的生物利用率的提高。
工业上的利用可能性
本发明的双链核酸复合物能够作为核酸医药而利用。
序列表文本
序列号1～12合成
本说明书中所引用的所有出版物、专利和专利申请通过引用直接并入本说明书。
序列表
<110> 国立大学法人东京医科齿科大学
<120> 异源核酸的最适PS修饰模式
<130> PH-8243-PCT
<150> JP 2019-030635
<151> 2019-02-22
<160> 12
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 合成的
<220>
<223> DNA/RNA 分子
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(1), (14)..(14)
<223> LNA
<220>
<221> misc_特征
<222> (2)..(2), (13)..(13)
<223> 5-甲基 胞嘧啶 LNA
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(2), (2)..(3), (3)..(4), (4)..(5), (5)..(6), (6)..(7)
<223> 硫代磷酸酯键
<220>
<221> misc_特征
<222> (7)..(8), (8)..(9), (9)..(10), (10)..(11), (11)..(12)
<223> 硫代磷酸酯键
<220>
<221> misc_特征
<222> (12)..(13), (13)..(14)
<223> 硫代磷酸酯键
<400> 1
tcatggctgc agct 14
<210> 2
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 合成的
<220>
<223> DNA/RNA 分子
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(1), (14)..(14)
<223> LNA
<220>
<221> misc_特征
<222> (2)..(2), (13)..(13)
<223> 5-甲基 胞嘧啶 LNA
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(2), (3)..(4), (4)..(5), (5)..(6), (6)..(7), (7)..(8)
<223> 硫代磷酸酯键
<220>
<221> misc_特征
<222> (8)..(9), (9)..(10), (10)..(11), (11)..(12), (13)..(14)
<223> 硫代磷酸酯键
<400> 2
tcatggctgc agct 14
<210> 3
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 合成的
<220>
<223> DNA/RNA 分子
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(1), (14)..(14)
<223> LNA
<220>
<221> misc_特征
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<223> 5-甲基 胞嘧啶 LNA
<220>
<221> misc_特征
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<220>
<221> misc_特征
<222> (2)..(2), (13)..(13)
<223> 5-甲基 胞嘧啶 LNA
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(2), (2)..(3), (5)..(6), (8)..(9), (11)..(12), (12)..(13)
<223> 硫代磷酸酯键
<220>
<221> misc_特征
<222> (13)..(14)
<223> 硫代磷酸酯键
<400> 5
tcatggctgc agct 14
<210> 6
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 合成的
<220>
<223> DNA/RNA 分子
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(1), (14)..(14)
<223> LNA
<220>
<221> misc_特征
<222> (2)..(2), (13)..(13)
<223> 5-甲基 胞嘧啶 LNA
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(2), (2)..(3), (3)..(4), (4)..(5), (6)..(7), (7)..(8)
<223> 硫代磷酸酯键
<220>
<221> misc_特征
<222> (9)..(10), (10)..(11), (12)..(13), (13)..(14)
<223> 硫代磷酸酯键
<400> 6
tcatggctgc agct 14
<210> 7
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 合成的
<220>
<223> DNA/RNA 分子
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(1), (14)..(14)
<223> LNA
<220>
<221> misc_特征
<222> (2)..(2), (13)..(13)
<223> 5-甲基 胞嘧啶 LNA
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(2), (2)..(3), (4)..(5), (6)..(7), (8)..(9), (10)..(11)
<223> 硫代磷酸酯键
<220>
<221> misc_特征
<222> (12)..(13), (13)..(14)
<223> 硫代磷酸酯键
<400> 7
tcatggctgc agct 14
<210> 8
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<212> RNA
<213> 人工的
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(1), (2)..(2), (13)..(13), (14)..(14)
<223> 2-o-Me RNA
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(2), (2)..(3), (12)..(13), (13)..(14)
<223> 硫代磷酸酯键
<400> 8
agcugcagcc auga 14
<210> 9
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<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 合成的
<220>
<223> DNA/RNA 分子
<220>
<221> misc_特征
<222> (2)..(2), (3)..(3), (14)..(14), (15)..(15)
<223> LNA
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(1), (16)..(16)
<223> 5-甲基 胞嘧啶 LNA
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(2), (2)..(3), (3)..(4), (4)..(5), (5)..(6), (6)..(7)
<223> 硫代磷酸酯键
<220>
<221> misc_特征
<222> (7)..(8), (8)..(9), (9)..(10), (10)..(11), (11)..(12)
<223> 硫代磷酸酯键
<220>
<221> misc_特征
<222> (12)..(13), (13)..(14), (14)..(15), (16)..(16)
<223> 硫代磷酸酯键
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<212> RNA
<213> 人工的
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<223> 合成的
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(1), (2)..(2), (3)..(3), (14)..(14), (15)..(15), (16)..(16)
<223> 2-o-Me RNA
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<221> misc_特征
<222> (1)..(2), (2)..(3), (3)..(4), (13)..(14), (14)..(15), (15)..(16)
<223> 硫代磷酸酯键
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gcauucagug aacuag 16
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<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 合成的
<220>
<223> DNA/RNA 分子
<220>
<221> misc_特征
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<221> misc_特征
<222> (1)..(2), (2)..(3), (3)..(4), (4)..(5), (5)..(6), (6)..(7)
<223> 硫代磷酸酯键
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<223> 硫代磷酸酯键
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<221> misc_特征
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<223> 硫代磷酸酯键
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cagcattggt attcag 16
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<213> 人工的
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<221> misc_特征
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<221> misc_特征
<222> (1)..(2), (2)..(3), (3)..(4), (13)..(14), (14)..(15), (15)..(16)
<223> 硫代磷酸酯键
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cugaauacca augcug 16