用于放射治疗的预防性皮肤治疗

用于放射治疗的预防性皮肤治疗
相关申请的交叉引用
1.本技术要求于2019年11月20日提交的美国申请号62/938,209的权益，其通过引用整体并入本文。援引并入
2.本说明书中提及的所有出版物和专利申请均通过引用整体并入本文，其程度犹如指出每个单独的出版物或专利申请具体地且单独地通过引用并入。关于联邦资助研究的声明
3.本发明是根据由美国国立卫生研究院(the national institutes of health)颁发的协议de 026914在政府支持下完成的。政府享有本发明的一定权利。


背景技术：

4.仅次于心脏病，癌症仍然是美国的主要死因，2017年诊断出估计160万新癌症病例，并且推算有60万癌症相关死亡。然而，近年来，医疗保健取得了实质性进展，手术、化学治疗和放射治疗增加了癌症生存者的数量和生存时间。随着这种改进，与癌症治疗相关的长期问题(例如放射治疗)变得越来越明显，并且已证明对生活质量产生深远的影响。放射引起的软组织损伤是放疗最常见的副作用之一，影响超过90％的患者，由此产生的软组织萎缩和纤维化可导致严重的容貌损害和长期功能障碍。
5.放射治疗是治疗多种恶性肿瘤的主要手段。然而，放射治疗可对周围组织造成附带损伤，从而导致血管不足、纤维化和萎缩，并且受损组织难以重建。放射治疗(radiation therapy，rt)不可避免地与进行性皮肤纤维化的病理水平相关。
6.美国每年进行超过560万次软组织重建手术，其中大部分与肿瘤切除和辅助放射治疗后遗症有关。即使有完整的上皮，底层软组织不足也会导致明显的不对称和轮廓畸形，并且还可导致伤口不稳定以及对包括骨骼、植入硬件和大血管在内的关键器官和结构的保护不足。尽管已证明放射治疗在降低各种肿瘤的局部复发风险方面非常有效，对邻近软组织的附带损伤导致微血管闭塞和纤维化可使重建策略显著复杂化。
7.慢性放射损伤的特点是表皮变薄、真皮胶原的嗜酸性均质硬化(eosinophilic homogenized sclerosis)、分散的大而不规则的成纤维细胞和深血管管腔闭塞的纤维化增厚。认为血管损伤和纤维化的发展是由放射引起的细胞因子表达、活性氧物质的产生和细胞凋亡引起的，而这些不利部位的软组织重建仍然极具挑战性。尽管自体脂肪移植以解决放射后软组织缺陷变得越来越流行，但是纤维炎症变化和血管不足与脂肪移植结果较差有关。细胞辅助脂肪转移术已注意到改善的保留，但用于丰富脂肪组织抽吸物(lipoaspirate)的基质细胞之间的功能异质性以及对肿瘤后局部区域复发的担忧，限制了该策略的广泛采用。去铁胺(deferoxamine，dfo)是经fda批准的用于治疗急性铁中毒和表现为血管生成增加的慢性铁超负荷的铁螯合药物。已证明dfo可增加缺氧诱导因子-1α(hif-lα)的活性并提高血管生成生长因子的表达。研究还表明，局部注射dfo可提高小鼠和猪模型的缺血性皮瓣存活率，在dfo治疗的动物中发现皮瓣血液灌注和毛细血管密度增加。
此外，在辐照骨的情况下，多份报告发现dfo通过增强血管分布促进牵张成骨后的骨再生。
8.还研究了dfo作为血管生成剂和抗氧化剂潜在的改善健康受试者脂肪移植物存活率的潜力，并提出了将其用于提高整形手术脂肪移植物的活力。重要的是，近期表明dfo在大鼠模型中促进脂肪移植物的活力。然而，在dfo注射的脂肪移植物中注意到更多的炎症和纤维化，尽管观察到细胞凋亡没有变化。每次注射对脂肪移植物的重复操作可能促成了这一观察结果。此外，据称保留基质细胞的脂肪形成分化有助于脂肪移植物的长期保留，而dfo直接暴露于脂肪移植物可能不利于这一过程。研究表明，通过施用dfo导致细胞内缺铁使脂肪细胞分化严重减弱。因此，这些发现降低了将dfo直接注射到脂肪移植物中的积极性。
9.目前用于放射诱导纤维化(radiation-induced fibrosis，rif)的治疗选择是有限的。先前已显示，在脂肪移植前将铁螯合剂去铁胺(dfo)注射到经辐照的组织中，可改善皮肤血管化。申请人描述了在辐照之前局部递送以及在放射之后立即局部递送dfo的方法，所述方法可减轻辐照对皮肤的损伤的慢性影响。


技术实现要素：

10.提供了一种减少辐照引起的纤维化的方法，该方法包括：在放射治疗之前的第一时间段内，将有效量的dfo施用于受试者治疗部位处的皮肤区域；在第二时间段内，将有效量的dfo施用于所述皮肤区域；在第二时间段内，对所述皮肤区域施用辐照；以及在放射治疗后的第三时间段内，将有效量的dfo施用于所述皮肤区域。
11.在一些变体中，将有效量的dfo施用于皮肤区域可包括经皮递送dfo。将有效量的dfo施用于皮肤区域可包括将经皮递送装置应用到治疗部位处皮肤区域的表面。在一些变体(variation)中，经皮递送系统可包括封装在反胶束中的dfo。
12.在一些变体中，将经皮递送装置应用到治疗部位处皮肤区域的表面还可包括在第一、第二和第三时间段的每一个期间以选定的时间间隔应用新的经皮递送装置。所述选定的时间间隔可为约12小时至约36小时。在一些变体中，所述选定的时间间隔为每天。在一些变体中，第一时间段可为约3天至约21天。在一些变体中，第二时间段可为约5天至约10周。在一些变体中，第三时间段可为约2周至约8周或更长。
13.在一些变体中，在第二时间段内施用辐照还包括在第二时间段的第一部分施用辐照以及随后在第二时间段的第二部分不施用辐照的模式来施用辐照。在一些变体中，施用辐照以及随后不施用辐照的模式可在第二时间段内重复3至10次。在一些变体中，第二时间段的第一部分时间为约3天至约7天，第二部分时间为约4天至约10天。
附图说明
14.本发明的新颖特征在随附的权利要求书中具体阐述。通过参考以下阐述说明性实施方案和附图的详细描述，将获得对本发明的特征和优点的更好理解，其中所述实施方案运用了本发明的原理，其中附图为：
15.图1显示了根据本发明的经辐照组织治疗的示意图。
16.图2a显示了辐照前、辐照后以及用生理盐水(saline)或dfo治疗后的小鼠头皮(scalp)热图(heat map)的代表性照片。较暗的区域代表较低的灌注，较亮的区域代表较高
的灌注(perfusion)。
17.图2b显示了来自经辐照小鼠头皮的激光多普勒灌注指数的量化。与生理盐水注射相比，dfo治疗(t)在4次治疗(t4)后导致灌注显著增加，并在5次治疗(t5)后达到稳定水平(*p《0.05)。
18.图3a-b是在dfo(图3a)或生理盐水(图3b)中预处理经辐照头皮八周后，脂肪移植物的代表性三维重建。
19.图3c显示脂肪移植物体积的量化，显示了在六周和八周后，与生理盐水处理的头皮(下方的线)相比，放置在dfo处理的头皮(上方的线)的脂肪移植物的保留显著增加(*p《0.05)。
20.图4a-e显示了经辐照头皮血管分布(vascularity)的组织学评估，其中代表性的图像在20倍放大的头皮皮肤下拍摄，其中cd31的免疫荧光染色显示了dfo预处理后血管分布增加。比例尺代表100μm。
21.图5显示了cd31免疫荧光染色的量化在辐照后显示出显著下降。注意到dfo处理显著改善，脂肪移植进一步增强了血管分布(*p《0.05)。
22.图6显示了脂肪移植后的激光多普勒分析(laser doppler analysis)。图6a显示了脂肪移植后，生理盐水(上方的图)和dfo(下方的图)处理的组织头皮的代表性lda图像。较暗的区域代表较低的灌注，较亮的区域代表较高的灌注。在图6b中，激光多普勒灌注指数的量化表明脂肪移植后两周，dfo处理的头皮(上方的线)的灌注显著高于生理盐水处理的头皮(下方的线)(*p《0.05)。两组在脂肪移植后在2周之后均表现出灌注增加，无显著差异。
23.图7-10显示了脂肪移植后经辐照头皮组织学的评估。图7a-e显示了代表性的h&e染色切片，放大倍数为10倍，未辐照的健康皮肤、生理盐水或dfo处理后的辐照皮肤以及生理盐水或dfo处理和脂肪移植后的辐照皮肤。比例尺代表200μm。图8显示了真皮厚度的量化表明辐照后显著增加，生理盐水或dfo处理的皮肤之间没有差异。两个处理组都表现出脂肪移植后显著减少(*p《0.05)。图9a-e显示了代表性的天狼猩红(picrosirius red)染色切片，放大倍数为20倍，显示在辐照和生理盐水或dfo预处理接着脂肪移植后阳性染色胶原蛋白的密度。比例尺代表100μm。图10显示了胶原蛋白含量的量化在辐照后胶原蛋白显示出显著增加，与生理盐水或dfo处理无关。两组在脂肪移植后均表现出显著减少(*p《0.05)。
24.图11显示了激光多普勒灌注指数的量化表明在脂肪移植一周后，用dfo经皮递送系统预处理的头皮(上方的线)的灌注显著高于用缺乏dfo的经皮递送系统预处理的头皮(下方的线)(*p《0.05)。
25.图12显示了小鼠头皮的代表性lda图像显示出在放射治疗前小鼠中的灌注(最左侧图像)、在停止放射治疗后立即使用和一周后使用经皮递送装置递送的dfo预处理的实验组中的灌注(上方两张图像)，以及在停止放射治疗后立即使用和一周后使用不含dfo的经皮递送装置预处理的对照组中的灌注(下方两张图像)。
26.图13显示了脂肪移植体积的量化显示出在1周和2周后，与对照组(无dfo)处理的头皮(下方的线)相比，放置在dfo处理的头皮(上方的线)中的脂肪移植物的保留显著增加。
27.图14显示了在dfo(上)或对照(下)预处理经辐照头皮中两周后，脂肪移植物的代表性3d重建。
28.图15a-c和图16显示了健康小鼠、用经皮dfo递送装置处理的小鼠和用不含dfo的
经皮递送装置预处理的小鼠的皮肤硬度数据。
29.图17a显示了如何通过经皮递送系统(tdds)局部递送dfo的示意图。dfo包含在分散于可生物降解聚合物的单层(monolithic layer)中，并与pvp络合以稳定其无定形形式并且在24小时内促进组织渗透(箭头)。图17b是在示出预防性施用dfo的实验中，四个实验组和时间线的示意图。第1组小鼠(图17b的第1行)接受：单独辐照(ir，无dfo)。第2组小鼠(图17b的第2行)：辐照，然后是dfo处理(ir tx dfo)。第3组小鼠(图17b的第3行)：在dfo处理之前和之后接受辐照(ir ppx dfo)。第4组小鼠(图4的第4行)：无辐照且无dfo(无ir)。(n＝4/组)。图17c是固定dfo贴片的小鼠的照片展示。dfo tdds粘附在白胶带(leukotape)上，并在头端和尾端使用强力胶薄条以及3条锚定缝线稳定在小鼠头皮上。原位dfo tdds显示俯视图(aerial view)(左)和侧视图(profile view)(右)。图17a-17b中的缩写如下：dfo-去铁胺、gy-戈瑞、ir-辐照、ppx-预防、tx-处理(treatment)。
30.图18a是制备用于激光多普勒分析(laser doppler analysis，lda)的cd1裸鼠的照片展示，其中感兴趣区域(region of interest，roi)由叠加在其上的白框(white box)表示。经辐照小鼠头皮的激光多普勒分析(lda)。图18b是小鼠头皮的代表性热图的展示，显示了辐照后即刻的灌注(左；不含dfo[上]和含dfo[下]的预防性dfo tdds处理)和辐照后6周的灌注(右)。黑色/深蓝色代表较低的灌注，并且黄色/红色代表较高的灌注。图18c和图18d显示了辐照后即刻(18c)和辐照后6周(18d)的激光多普勒灌注指数的量化。图18a-18c中的缩写如下：dfo-去铁胺、gy-戈瑞、ir-辐照、ppx-预防、tx-处理。
[0031]
图19a是免疫组织化学染色的照片展示，显示了所有四组小鼠中的血管密度。内皮细胞用cd31染色(pecam，红色)，细胞核用dapi染色(蓝色)。比例尺100μm。图19b是所有四组小鼠中cd31阳性的平均像素的量化的图示。与未接受dfo处理(****p《0.0001)和仅接受辐照后dfo处理(***p《0.001)的经辐照小鼠的皮肤相比，未辐照小鼠的皮肤的血管化程度明显更高。接受连续dfo处理的小鼠皮肤的血管化程度明显高于未接受dfo的辐照小鼠皮肤(*p《0.05)。图19a-19b中的缩写如下：dfo-去铁胺、ir-辐照、ppx-预防、tx-处理。
[0032]
图20a是染色的皮肤切片的照片展示，包括苏木精(hematoxylin)和曙红(eosin)染色的(顶行)和天狼星红染色的组织切片，显示了所有四个处理组小鼠中的组织学结构和胶原纤维网络。误差条：100μm(顶行)、50μm(底行)。黑色虚线示出了真皮厚度。图20b是所有四个处理组小鼠真皮厚度量化的图示。未经辐照的皮肤比经辐照的皮肤更薄(所有****p《0.0001)，并且dfo处理倾向于减少真皮厚度，与仅辐照后dfo处理的小鼠相比，在接受连续dfo处理的小鼠中观察到最大的益处。图20c是t分布随机邻域嵌入(tsne)图的图示，代表所有四种条件下小鼠中胶原纤维网络参数的分组。接受连续dfo治疗('ir ppx dfo'；红色)的小鼠皮肤中的胶原纤维在tsne图的最右侧出现最明显并聚集在一起。图20a-20c中使用的缩写如下：dfo-去铁胺、h&e-苏木精和曙红、ir-辐照、ppx-预防、tx-处理。
具体实施方式
[0033]
预计到2019年，美国将有200万新患者被诊断患有癌症，并且超过一半的这些患者最终将接受放射治疗(rt)。随着生存率的提高，癌症治疗的晚期效应正在变得更明显。纤维化皮肤损伤是rt施用中最重要的剂量限制因素。皮肤对rt极为敏感，超过95％的患者会出现急性皮肤反应。急性皮肤损伤不可避免地在数周到数年内发展为辐照引发的皮肤纤维化
(radiation-induced skin fibrosis，rif)，其特征是皮肤硬化和微血管增厚，导致灌注不足和缺氧。当rif严重时，可导致显著的容貌和功能后果，这些后果会严重影响生活质量，包括运动范围和肌肉力量的丧失。rif的发病机制是多因素的，目前尚不完全清楚。导致过度软组织纤维化的关键因素包括自由基的产生、成纤维细胞的活化和微血管内皮细胞的损伤。
[0034]
目前对rif的治疗是有限的，其中在精心设计的临床试验中很少显示出显著的益处，没有有效的预防方案来减轻这种并发症。己酮可可碱(pentoxifylline)是一种甲基黄嘌呤衍生物，最初开发用于改善心血管患者的血流，11还降低rif并改善组织功能，尤其是与维生素e联合使用时。己酮可可碱的有益作用被认为主要是由于它能够增强局部血流、降低血液粘度和全身血管阻力，从而减少组织缺氧。尽管报道了这种益处，但大量患者经历了严重的副作用，并且差的耐受性和依从性显著限制了己酮可可碱在临床上的使用。
[0035]
本发明提供了一种方法，所述方法通过施用去铁胺，在进行癌症放射治疗(radiotherapy，rt)的患者中，预防性地减少皮肤纤维化的长期发展、从而导致的疤痕和身体功能缺陷。在一些变体中，该方法可与自体脂肪移植结合进行。
[0036]
已经证明，在脂肪移植之前皮下注射去铁胺(dfo)可增强软组织血管分布和随后在先前辐照部位处的移植物保留。dfo是美国食品和药物管理局(united states food and drug administration，fda)批准的药物，通常用于治疗与铁超负荷相关的病症。通过其铁螯合机制，dfo稳定缺氧诱导因子1α(hypoxia-inducible factor-1alpha，hif1α)，所述缺氧诱导因子1α易位到细胞核并作为多种有效的促血管生成基因的转录因子，包括血管内皮生长因子(vegf)和内皮一氧化氮合酶。下游结果是改善了组织血管化。大量研究发现，dfo治疗改善组织缺氧状态下的血管形成，包括与皮瓣(skin flap)、辐照骨和糖尿病足溃疡相关的那些。皮肤中的辐照损伤是缓慢的渐进过程，其完成后特别难以逆转。因此，理想的治疗方案要么本质上是预防性的，要么针对该病理过程的最早期。在辐照前使用和辐照后立即使用新型经皮递送系统(transdermal drug delivery system，tdds)进行局部dfo治疗可改善组织血管分布并减轻皮肤内晚期慢性rif的下游严重程度。
[0037]
皮肤纤维化及其长期后遗症在大多数接受rt治疗的患者中是常见的，并且往往是不可避免的副作用。除了审美问题，这还可显著改变组织形式和功能，对患者的生活质量产生深远影响。rif是一种进行性疾病，在放射治疗后数月和数年内恶化。因此，在rt之前预防rif或针对其发展的最早期治疗可预防稍后的下游放大，从而提供最大的治疗益处。申请人发现，局部施用dfo可增加皮肤血管化和灌注，从而减轻rif的一个关键方面。在本文所述的用于在辐照之前、期间和之后施用的预防性dfo治疗的方法中可获得最有益的效果。
[0038]
rif在皮肤中显现的主要机制是通过对辐照微血管的损伤。在rt后的前24小时内，白细胞浸润血管，并且纤维蛋白栓形成。排列在血管内的内皮细胞随后膨胀并发生增生，导致血管周围纤维化、小血管闭塞、灌注不足，最终导致组织缺氧。低氧张力条件刺激1型胶原蛋白α1(collagen type 1alpha 1，col1a1)的表达增加并促进组织纤维化的发展。在除cd31染色以示出辐照显著降低了皮肤血流量之外，激光多普勒成像还可用作血管密度的替代测量。先前已经表明，在脂肪移植之前将dfo皮下注射到受辐照的组织中可增加上覆皮肤的灌注，从而减轻rt的纤维化作用。申请人在此首次展示，当在rt之前进行皮肤调理时，通过新型tdds进行局部dfo施用时可带来显著的益处。
[0039]
dfo的保护作用可能与其下游的促血管生成作用有关。dfo是一种fda批准的铁螯合剂，其最近在缺血和经辐照组织中显示出益处。dfo螯合铁导致hif1α升高，从而提高多种有效的促血管生成基因(如vegf)的表达。用dfo预防性治疗患者可在rt后即刻时期产生头皮灌注的显著改善。此外，预防性治疗可比单独的放射后治疗显著更有效。由于rt是一种选择性治疗，通常提前数周或数月计划，因此在这个早期窗口期间靶向皮肤在临床上是可行的，即使是适度缓解皮肤纤维化也可对癌症患者产生深远的转化医学益处。
[0040]
因此，本文提供了一种减少辐照引起的纤维化的方法，所述方法包括：在辐照治疗之前的第一时间段内，将有效量的dfo施用于受试者治疗部位处的皮肤区域；在第二时间段内，将有效量的dfo施用于所述皮肤区域；在第二时间段内，对所述皮肤区域施用辐照；以及在放射治疗后的第三时间段内，将有效量的dfo施用于所述皮肤区域。
[0041]
将有效量的dfo施用于皮肤区域可包括经皮递送dfo。将有效量的dfo施用于皮肤区域可包括将经皮递送装置应用到治疗部位处皮肤区域的表面。在一些变体中，施用有效量的dfo可包括治疗部位处皮肤区域周围的皮肤区域。周围皮肤区域的面积可为治疗部位处皮肤区域面积的约5％、10％、25％、50％或更多。在一些变体中，经皮递送系统可包括封装在反胶束(reverse micelle)中的dfo。
[0042]
将经皮递送装置应用到治疗部位处皮肤区域的表面还可包括在第一、第二和第三时间段的每一个期间以选定的时间间隔应用新的经皮递送装置。所述选定的时间间隔可为约12小时、约14小时、约16小时、约18小时、约20小时、约24小时、约28小时、约32小时、约36小时、约48小时或它们之间的任何小时数。在一些变体中，选定的时间间隔为每天。在一些变体中，第一时间段可为约3天、约5天、约7天、约10天、约14天、约18天、约21天或它们之间的任何天数。在一些变体中，第二时间段可为约5天至约10周。在一些变体中，第三时间段可为约2周、约3周、约4周、约6周、约8周或更长。
[0043]
在一些变体中，在第二时间段内施用辐照还包括在第二时间段的第一部分施用辐照以及随后在第二时间段的第二部分不施用辐照的模式来施用辐照。在一些变体中，施用辐照以及随后不施用辐照的模式可在第二时间段内重复约3次、约4次、约5次、约6次、约7次、约8次、约9次、约10次或更多次。在一些变体中，第二时间段的第一部分时间为约3天、约4天、约5天、约6天或约7天，并且第二部分时间为约4天、约5天天、约6天、约7天、约8天、约9天、约10天或更长时间。
[0044]
本发明的另一个方面提供了一种在植入脂肪移植物之前用dfo预处理辐照软组织部位以增强血管分布的方法。hif-lα通常被含有脯氨酰羟化酶结构域的蛋白2(prolyl hydroxylase domain-containing protein 2，phd2)降解。已证明通过螯合用于phd2活性的铁辅因子，dfo可稳定hif-lα，导致下游血管生成因子的增加和内皮祖细胞的募集。这是dfo被认为可促进缺血性皮瓣的血管再生、促进糖尿病小鼠的伤口愈合以及增加辐照骨损伤部位的愈伤组织大小、矿化和机械强度的机制。此外，在下颌骨牵引成骨期间，dfo治疗也可逆转辐照引起的血管不足。所有这些发现都支持dfo的潜力，通过稳定hif-lα和增加血管生成基因表达，为随后的脂肪移植预处理受辐照的受体部位。
[0045]
在植入脂肪移植物之前用dfo对脂肪移植部位的经辐照组织进行预处理有助于脂肪移植物的早期血管再生。当脂肪移植物被放置到dfo预处理的受体部位时，根据这种方法对经处理的皮肤的组织学分析显示出血管分布增加，这转化为增强的体积保留。有趣的是，
向经dfo处理的经辐照组织加入脂肪移植物可进一步改善血管分布，尽管dfo相关作用可在四次治疗后趋于平稳。这表明，转移的脂肪细胞和相关的基质细胞也可采用替代机制来改善脂肪移植后的血管分布。最后，与脂肪移植后真皮厚度和胶原蛋白含量降低相比，dfo治疗对皮肤血管分布的作用与真皮厚度和胶原蛋白含量无关。在真皮中观察到的结构变化以及继发于脂肪转移的胶原蛋白减少可能不一定是由于仅改善血管分布。
[0046]
在患有放射性纤维化和软组织萎缩的患者中，在脂肪移植之前连续注射dfo在实施上可能是困难的，并且患者不能很好地耐受。在脂肪移植物植入之前和/或之后将dfo经皮递送至受辐照的组织可用作通过直接注射递送dfo的替代方案。这种方法还可在进行脂肪移植的预处理经辐照组织中有效，并且患者可能更耐受。可替代地，还开发了dfo的纳米颗粒制剂，并且dfo的可控释放可类似地用于改善受辐照皮肤的血管分布。这些纳米颗粒还直接注入脂肪移植物，以促进早期血管再生。
[0047]
由于dfo通过稳定hif-1α促进多种血管生成因子的表达，因此还可对其在辐照的肿瘤切除后部位中的使用产生担忧。据我们所知，尽管没有研究表明局部施用dfo后癌症复发的风险增加，有几份报告表明具有抗肿瘤作用。铁是氧气运输、细胞代谢和生长所必需的，对生长活跃的细胞尤为重要。毫不意外地，已发现诸如dfo等铁螯合剂减少肝纤维化，其对铁代谢的作用已显示出在临床上减少肝细胞癌的进展。还报道了在人表皮生长因子受体2阳性乳腺癌细胞中也有铁依赖性，并且已证明多种乳腺癌细胞系易受铁螯合。因此，这些报告表明，局部dfo应用可能与癌症复发风险的增加无关。
[0048]
dfo治疗可改善辐照引起的血管不足，并且这种增强的灌注可改善脂肪移植受体部位的质量。dfo治疗后，注射到辐照部位的脂肪移植物的长期保留显著改善。
[0049]
由于受辐照引起的受体床改变，受辐照组织的重建仍然具有挑战性。纤维炎症改变和血管不足显示出影响脂肪移植物保留，并且尽管已证明基于细胞的策略可改善结果，但迄今为止，监管和安全问题限制了它们的转化潜力。作为替代方法，用去铁胺预处理经辐照组织改善局部灌注，这与改善放射摄影学和组织学脂肪移植结果有关。因此，在脂肪移植前用去铁胺进行预处理有望增强经辐照组织的重建结果。实验实施例1
[0050]
本研究中使用成年60日龄雄性crl:nu-foxl
nu
免疫功能低下的小鼠进行实验。12只小鼠接受了总共30gy外辐照(external beam radiation)，分6次分次剂量，每次5gy，持续12天，然后恢复5周。另外的六只未辐照的小鼠用作激光多普勒分析(lda)和皮肤分析的健康对照。将受辐照的小鼠分为两个治疗组：dfo实验组和生理盐水对照组。恢复后，小鼠每隔一天在真皮下单独注射dfo(1mg于100μl生理盐水中)或100μl生理盐水，共7次处理。图1显示了这种经辐照头皮治疗的示意图。
[0051]
辐照后，对经辐照的小鼠进行脂肪移植。在获得知情同意后，从三名年龄分别为45岁、49岁和51岁的健康女性捐献者身上获取脂肪抽吸物，这些捐献者没有根据经批准的irb协议#2188的其他医学共病。脂肪抽吸物静置15分钟，通过重力沉降分离层，然后通过真空抽吸去除油层和血液层。将剩余的脂肪层在4℃下以1300相对离心力(rcf)离心3分钟。再次去除任何剩余的油和血液，并将剩余的脂肪转移到保护注射器(lee syringe)中，通过14号针进行注射。通过
用针创建皮下通道，在头皮下方进行脂肪移植，然后在拔出针的同时以逆行方式注射200μl脂肪抽吸物。
[0052]
使用perimed pim 3激光多普勒灌注成像仪(datavagen,瑞典(sweden))进行激光多普勒分析(“lda”)，以测量辐照部位的灌注。lda产生的信号——激光多普勒灌注指数(laser doppler perfusion index，ldpi)——用于比较目的。ldpi是血细胞速度和浓度的乘积，并通过色谱表示，其中黑色/深蓝色代表低灌注，红色代表高灌注。lda在辐照前、辐照和恢复完成后、然后在用dfo或生理盐水的每次处理后24小时进行。lda在脂肪移植后每两周进行一次。
[0053]
每只小鼠拍摄五张图像，并且记录了五张图像的平均ldpi。图2a显示了辐照前、辐照后以及用生理盐水或dfo处理后的小鼠头皮热图的代表性照片。较暗的区域代表较低的灌注，较亮的区域代表较高的灌注。图2b显示了激光多普勒灌注指数的量化表明辐照后灌注显著降低。激光多普勒分析显示出用dfo治疗改善了辐照组织的灌注。激光多普勒分析允许通过移动的红细胞散射的光的频移来估计微循环中体内局部血液灌注。这有助于在每次用dfo治疗后对同一动物进行纵向测量。与生理盐水注射(图2b中下方的线)相比，dfo治疗(t)(图2b中上方的线)在4次治疗(t4)后导致灌注显著上升，并且5次治疗(t5)后趋于稳定(*p《0.05)。
[0054]
还使用micro cat-11体内x射线微型ct扫描仪(imtek,inc.；田纳西州诺克斯维尔(knoxville,tn))在脂肪移植注射两天后对小鼠进行成像，用于基线体积测量。然后使用微型计算机断层摄影术在总共8周内每两周一次分析脂肪移植物的体积保留，并通过三次样条插值法将图像重建为三维表面。所有重建均由一名研究人员进行，以避免观察者之间的差异。
[0055]
对于皮肤分析，在完成放射后以及在脂肪移植后8周，从两个治疗组采集头皮皮肤活体组织检查。样本在4％多聚甲醛中固定，处理，并包埋在石蜡中，进行切片。对于真皮厚度测量，切片用苏木精和曙红(h&e)染色，并使用leica dm5000b光学显微镜(徕卡显微系统(leica microsystems)；伊利诺伊州布法罗市(buffalo grove,il))在20倍物镜下成像。对每个样品的十个染色切片进行真皮测量。还进行了天狼星红染色以测定胶原含量。用cd31免疫荧光染色(1:100ab28364；abeam；马萨诸塞州剑桥(cambridge,ma)和1:200af547；赛默飞世尔科技(thermo fisher scientific)；美国马萨诸塞州沃尔瑟姆(waltham,ma))和dapi复染以使细胞核可视化来测定血管分布。使用x-cite120荧光照明系统(lumen dynamics group,inc.；安大略(ontario),加拿大)在20倍物镜下获得荧光图像。使用imagej(美国国立卫生研究院(national institutes of health)；马里兰州贝塞斯达(bethesda,md))进行cd31染色的量化，其中测量每个高倍视野的像素阳性面积以确定血管密度(11)。还对未辐照的皮肤进行了真皮厚度和cd31免疫荧光染色的比较。
[0056]
在完成辐照和五周恢复后，观察到头皮的灌注从265.23
±
7.01ldpi(辐照前基线)显著下降至176.70
±
2.59ldpi(图2b)。然而，辐照恢复后每隔一天用1mg dfo治疗头皮导致ldpi增加，在四次治疗后变得显著(205.08
±
2.30ldpi)(*p《0.05)。然而，在四次治疗后没有观察到ldpi测量值的增加，因为另外的三次dfo处理并没有导致灌注的任何显著增加。相反，在整个治疗过程中，单独注射生理盐水不会导致ldpi测量值发生变化，如图2b中下方的线所示。
[0057]
对于统计分析，数据表示为平均值
±
se。双尾学生t检验(two-tailed student’s t-test)用于两组之间的比较，使用图基(tukey)事后检验的方差分析用于多组比较。所有分析均使用statplus软件(analyst-soft,inc.,弗吉尼亚州亚州亚历山大市(alexandria,va.))进行。认为值*p《0.05是显著的。
[0058]
脂肪移植物的体内放射摄影术分析显示，两周后，与注射生理盐水的对照小鼠(74.03+7.91)相比，经dfo预处理的辐照小鼠(89.24％+1.69)保留了更多的脂肪体积(图3a-c)。与生理盐水对照小鼠(图3c中下方的线)相比，dfo治疗的小鼠(图3c中的上线)的脂肪移植物体积保留率始终更高，并且在第6周和第8周，这些差异具有统计学意义(第6周：73.17％
±
4.26dfo对(vs.)52.40％
±
4.83生理盐水处理的，第8周：71.75％
±
3.70dfo对(vs.)49.47％+4.62生理盐水处理的；*p《0.05)。
[0059]
经辐照和生理盐水对照处理后，发现皮肤活体组织检查中的血管分布(如cd31染色所示)显著低于未辐照的健康皮肤(*p《0.05)(图4a-e和图5)。然而，用dfo处理经辐照的皮肤导致cd31染色增加，如图4a所示，尽管这没有达到健康皮肤水平。正如脂肪移植后预期的那样，8周后获得的皮肤活体组织检查也显示出与对照、注射生理盐水的经辐照皮肤相比，cd31染色增加。有趣的是，与生理盐水对照脂肪移植小鼠相比，也观察到dfo预处理小鼠在脂肪移植后cd31染色略多，尽管该差异并不显著。
[0060]
还通过lda测量了脂肪移植后皮肤的灌注，发现ldpi值低于完成dfo或生理盐水预处理后即刻的ldpi值，因为脂肪放置后感兴趣区域的三维结构发生了变化。然而，在注射脂肪移植物两周后，在dfo预处理的小鼠中仍然观察到显著更多的灌注(86.33
±
2.00对(vs.)65.72
±
2.02ldpi生理盐水对照；*p《0.05)(图5)。脂肪移植后dfo预处理小鼠的灌注也继续增加(图6b中上方的线)，但在脂肪移植后注射生理盐水的对照小鼠中灌注同样增加(图6b中下方的线)，并且在第2周后，两组之间没有观察到lda的显著差异(移植后8周dfo和生理盐水处理的小鼠的ldpi分别为127.78
±
2.29和119.18
±
4.09；p》0,05)(图6a-b)。
[0061]
最后，生理盐水处理后辐照皮肤的真皮厚度显著大于健康的未辐照皮肤(*p《0.05)(图7-图8)。与注射生理盐水的小鼠(256.71
±
16.76pm)相比，dfo处理辐照皮肤导致真皮厚度轻微减小(242.09
±
7.22pm)，但并没有明显减小。然而，无论是移植到生理盐水还是dfo预处理部位的脂肪移植都发现真皮厚度显著减小，尽管在比较这两组时没有显著差异(p》0.05)。与这些发现相类似地，天狼星红染色显示辐照和生理盐水处理后胶原蛋白含量显著增加(*p《0.05)。dfo处理辐照皮肤导致胶原蛋白含量略有下降，但没有统计学意义。与我们对真皮厚度的观察结果相似，无论是移植到生理盐水还是dfo预处理部位的脂肪移植都发现显著降低胶原蛋白含量(*p《0.05)(图9-10)。
[0062]
因此，将dfo局部注射到受辐照的血管不足的皮肤中改善了灌注，如通过激光多普勒分析所测量的。激光多普勒分析允许通过移动的红细胞散射的光的频移来估计微循环中体内局部血液灌注。这有助于在每次用dfo处理后对同一动物进行纵向测量。经处理的皮肤组织学分析还揭示了在dfo处理后通过cd31染色增加的血管分布。当脂肪移植物被放置到dfo预处理的受体部位时，这转化为提高的体积保留。有趣的是，向经dfo处理的辐照组织添加脂肪移植物使得进一步改善血管分布，尽管发现在四次治疗后dfo相关作用趋于稳定。这表明，转移的脂肪细胞和相关的基质细胞还可采用替代机制来改善脂肪移植后的血管分布。最后，未发现dfo治疗对皮肤血管分布的作用与真皮厚度和胶原蛋白含量的显著变化有
关。实施例2
[0063]
本研究中使用成年60日龄雄性crl:nu-foxl
nu
免疫功能低下的小鼠进行实验。12只小鼠接受了总共30gy外辐照，分6次分次剂量，每次5gy，持续12天每隔一天一次，然后恢复1个月。另外的六只未辐照的小鼠用作激光多普勒分析(lda)和皮肤分析的健康对照。将受辐照的小鼠分为两个治疗组：dfo实验组和对照组。恢复后，我们将经皮递送系统应用于dfo实验组的经辐照的头皮皮肤，所述经皮递送系统包含干膜(dry film)，所述干膜的dfo浓度为13.4％重量/重量％，所述dfo封装在反胶束中，其中非离子表面活性剂由聚乙烯吡咯烷(pvp)稳定于乙基纤维素基质中，切成5/8英寸的圆形并用相同尺寸的硅片(silicon sheet)覆盖。相同的经皮递送装置——不同之处在于缺省了dfo——应用于对照组小鼠的经辐照的头皮皮肤。将经皮递送系统放置两天，然后更换新装置。在辐照和七次更换经皮递送装置的治疗后，对经辐照的小鼠进行脂肪移植，如上文实施例1所述。
[0064]
在脂肪移植之前和之后进行激光多普勒分析(“lda”)以测量辐照部位的灌注，如上文实施例1所述。图11和图12显示，与使用不含dfo的经皮递送装置处理的小鼠相比，dfo经皮递送贴片的小鼠(图11中上方的线)的血流显著改善(*p《0.05)。图11显示，激光多普勒灌注指数的量化表明，在脂肪移植一周后，用dfo经皮递送系统预处理的头皮(上方的线)的灌注显著高于使用缺乏dfo的经皮递送系统预处理的头皮(下方的线)(*p《0.05)。图12显示了小鼠头皮的代表性lda图像显示出在放射治疗前小鼠中的灌注(最左侧图像)、在停止放射治疗后立即使用和一周后使用经皮递送装置递送的dfo预处理的实验组中的灌注(上方两张图像)，以及在停止放射治疗后立即使用和一周后使用不含dfo的经皮递送装置预处理的对照组中的灌注(下方两张图像)。较暗的区域代表较低的灌注，较亮的区域代表较高的灌注。
[0065]
脂肪移植物的体内放射摄影术分析显示，与对照小鼠相比，经dfo预处理的经辐照小鼠在两周后保留了更多的脂肪体积(图13-图14)。与缺乏dfo的经皮递送装置的对照小鼠(图13中下方的线)相比，经皮施用dfo处理的小鼠(图13中上方的线)的脂肪移植物体积保留率始终更高。图14显示了在dfo(上方)或对照(下方)预处理的经辐照头皮中两周后脂肪移植物的代表性三维重建。
[0066]
对于皮肤分析，在脂肪移植物放置时完成放射后，从两个治疗组通过在脂肪移植物切口部位切下一块皮肤来采集头皮皮肤活体组织检查。还从未受辐照的健康小鼠身上采集头皮。使用带有interface sm-19力传感器的mts bionix 200测量皮肤硬度。如图所示生成应力-应变曲线，然后计算杨氏模量(斜率)以计算刚度。图15a显示了未辐照的健康小鼠的应力-应变曲线，图15b显示了不含dfo的经皮递送装置治疗的经辐照小鼠的应力-应变曲线，图15c显示了通过经皮递送系统使用dfo治疗的经辐照小鼠实验组的应力-应变曲线。图16总结了这三组的杨氏模量数据。这些数据表明，放射治疗后用dfo进行皮肤治疗使得皮肤硬度降低。实施例3
[0067]
雌性成年60日龄cd-i免疫功能低下的裸鼠(crl:cdi-foxnlnu,charles river)用于实验(总n＝16)。小鼠养在斯坦福大学研究动物实验室(the stanford university research animal facility)(4只动物/笼)在无菌微型隔绝室(micro-insulator)中，并按
照斯坦福大学的指导方针给予任意水和啮齿动物食物。所有实验均按照斯坦福大学动物护理和使用委员会指南(the stanford university animal care and use committee guideline)在批准的aplac协议(aplac#31212)下进行。
[0068]
dfo tdds递送：dfo通过含有dfo的单片基质型(monolithic matrix-type)tdds局部递送，所述dfo分散在可生物降解聚合物中，如duscher等人,"transdermal deferoxamine prevents pressure-induced diabetic ulcers(透皮去铁胺可预防压力引起的糖尿病溃疡)",proceedings of the national academy of sciences(美国国家科学院院刊).2015；112(1):94-99中记载的，其通过引用整体并入本文。贴片提供活性成分的持续释放。dfo是亲水性的并与聚乙烯吡咯烷酮(pvp)络合，以稳定其无定形形式并促进在24小时内渗透到整个皮肤，dfo的浓度为100微升中1mg(图17a)。将小鼠分成四个实验组(n＝4/组)：1)单独辐照(ir，无dfo)，2)辐照后进行dfo处理(ir tx dfo)，3)在dfo处理之前和之后均进行辐照(ir ppx dfo)，以及4)无辐照且无dfo(无ir)(图17b)。治疗性dfo处理在12天30gy辐照期完成后开始，并且持续2周。在辐照开始前2周开始递送预防性dfo，并持续到完成后6周。将dfo tdds固定在白胶带上进行加固，并在两端使用强力胶粘在覆盖在颅骨上的小鼠皮肤上，用三条锚定缝线(anchoring suture)和一条白胶带固定在小鼠下颌下(图17c)。每个dfo tdds每24次更换一次。
[0069]
辐照：小鼠头皮每隔一天用6次5gy剂量递送30gy辐照，总共在12天内进行。铅屏蔽用于保护身体的其余部分。基于先前产生rif的方案选择剂量和分次方案。
[0070]
激光多普勒分析(lda)：进行激光多普勒分析(lda)以测量辐照部位的灌注。使用perimed pim 3激光多普勒灌注成像仪(j.rf.lla,sweden)。激光多普勒分析产生的信号(激光多普勒灌注指数)用于比较目的。该指数是血细胞速度和浓度的乘积，并通过色谱表示，其中黑色/深蓝色代表低灌注，红色代表高灌注。辐照后立即以及辐照后6周进行lda。将小鼠麻醉(异氟烷；2-3％诱导，1-2％维持)，并放置在加热垫上5分钟，然后在小鼠头皮上的感兴趣区域(roi)中进行测量(图18a)。对每只小鼠拍摄五张图像，并记录五张图像的平均激光多普勒灌注指数，以得到每只小鼠的单一平均值。
[0071]
组织学：辐照后六周，处死小鼠，处理头皮皮肤进行组织学分析。标本在4℃下在4％多聚甲醛(paraformaldehyde)(pfa,electron microscopy sciences(电子显微镜科学),cat#l5710)中固定18小时，处理，并包埋在石蜡中，进行切片。为了评估真皮厚度，切片用苏木精和曙红(h&e,abeam,马萨诸塞州剑桥(cambridge,mass.),ab245880)染色，并用于评估胶原纤维网络，切片使用标准方案用天狼猩红(abeam,abl50681)染色。真皮定义为从表皮基底层到下面的皮下组织的垂直距离，并在20x物镜下在每个条件下对每只小鼠随机选择的10个切片进行测量。为了评估胶原纤维网络，使用偏振光和40x物镜对天狼猩红染色的皮肤进行成像(图20a底行)(每只小鼠25个图像，每个条件总共100个图像)。使用leica dm 5000blight显微镜(leica microsystems,buffalo grove,ill.)对载玻片进行成像。为了评估血管分布，对小鼠内皮细胞进行了免疫染色。石蜡载玻片用1x powerblock(biogenex,hk083-50k)封闭，并在37℃下在0.lx中与未缀合抗小鼠cd31(pecam,abeam,ab28364)以1:100稀释液孵育1小时。样本在磷酸盐缓冲生理盐水(pbs,10010023)中洗涤，与alexa fluor647偶联二抗(abeam,ab10079)在37℃下孵育1小时，在pbs中洗涤，然后安装在载玻片上在dapi fluromount-g(southern biotech,0100-20)中。
使用lsm 880倒置共焦(airyscan,gaasp检测器,880,beckman)拍摄荧光图像，所有图像均使用标准场(1024x1024)。
[0072]
统计分析：数据在参数时以平均值和平均值的标准误差(sem)表示，在非参数时以中位数和范围表示。使用在matlab(r2018b,mathworks,马萨诸塞州纳提克(natick,ma))中运行的新算法对天狼星红染色的载玻片的图像进行颜色反卷积、转换为灰度、二值化和骨架化。24从骨架化图像中，提取13个胶原纤维参数(包括长度、宽度、分支点、亮度)并进行降维以生成二维t分布随机邻域嵌入(2dimensional t-distributed stochastic neighbor embedding，tsne)图，以可视化各组之间的胶原纤维网络模式的集体差异。使用imagej(national institutes of health,bethesda,md)对每个条件每只小鼠的三个图像进行cd31染色的量化，其中在真皮内测量每个高倍视野的像素阳性面积以测定血管密度(图20c)。曼-惠特尼检验(mann-whitney test)(非参数)用于比较两组之间的平均值，而克鲁斯卡尔-沃利斯检验(kruskal-wallis test)(非参数)用于比较三个或更多组之间的平均值，使用prism(graphpad)软件。认为值*p《0.05具有统计学意义。tsne图表明，接受连续dfo治疗的小鼠皮肤中胶原纤维表现得最明显，并且可能代表更多的辐照后重构。
[0073]
dfo预处理改善rt后的组织灌注：在rt后立即通过lda获得的组织灌注测量结果表明，使用tdds dfo进行预防性治疗显著减轻了rt对皮肤灌注的不利影响(**p《0.01)(图18b和图18c)。rt后六周，预防性dfo和治疗性dfo都倾向于改善灌注(图18b和图18d)。正如预期的那样，未接受dfo的经辐照小鼠的头皮灌注明显劣于未辐照小鼠(**p《0.01)。
[0074]
dfo增强新生血管形成：正如预期的那样，未辐照小鼠的皮肤比未处理的经辐照小鼠的皮肤血管化程度显著更高(****p《0.0001)。与未接受辐照的小鼠相比，接受预防性dfo的小鼠的皮肤血管化程度相似，并且比未接受任何dfo的经辐照小鼠的皮肤血管化程度显著更高(*p《0.05)。相比之下，辐照后仅接受dfo的小鼠皮肤的血管形成明显少于未辐照小鼠的皮肤(***p《0.001)(图19a和图19b)。
[0075]
dfo增加真皮厚度并降低总胶原蛋白含量：为了评估dfo tdds治疗是否可减轻皮肤中的rif，在辐照后六周收获小鼠头皮皮肤，用于对真皮厚度和胶原纤维网络进行组织学评估。苏木精染色皮肤的分析表明，辐照显著增加真皮厚度(所有****p《0.0001)，辐照但dfo处理的皮肤的真皮与未辐照的皮肤更相似，其中接受连续dfo处理的小鼠显示出最大的有益效果(图20a[顶行]和20b)。
[0076]
dfo治疗对胶原纤维网络重构的结果：使用天狼星红对小鼠头皮皮肤中的胶原纤维网络进行染色(图20a底行)，使用新的计算算法建模并在二维空间中使用t分布随机邻域嵌入(tsne图)表示(图20c)。tsne图表明，接受连续dfo治疗的皮肤小鼠中的胶原纤维表现最明显，这可能表明更多的辐照后重构。
[0077]
在rt后立即用dfo预防性治疗小鼠对头皮灌注产生显著益处。此外，预防性治疗明显比单独的放射后治疗更有效。
[0078]
本文中，当一个特征或要素称为“在”另一个特征或元素“上”(“on”)时，其可直接在所述另一个特征或要素上，或者还可存在中间特征和/或要素。相比之下，当一个特征或要素称为“直接在”另一个特征或要素“上”(“directly on”)时，不存在中间特征或要素。还将理解，当一个特征或要素称为“连接”、“附接”或“耦合”至另一个特征或要素时，其可直接连接、附接或耦合至另一个特征或要素，或者可存在中间特征和/或要素。相比之下，当一个
特征或要素称为“直接连接”、“直接附接”或“直接耦合”至另一个特征或要素时，不存在中间特征或要素。尽管针对一个实施方案进行描述或显示，但如此描述或显示的特征和要素可应用于其他实施方案。本领域技术人员还将理解，布置为与另一个特征“相邻”的结构或特征的参考可具有与相邻特征重叠或位于其下方的部分。
[0079]
本文使用的术语仅用于描述具体实施方案且不旨在限制本发明。例如，如本文所用，单数形式“一”(“a”)、“一个”(“an”)和“该/所述”(“the”)旨在还包括复数形式，除非上下文另有明确指出。还将理解，当在本说明书中使用时，术语“包括”和/或“包含”("comprises"and/or"comprising,")指定了所描述的特征、步骤、操作、要素和/或组分的存在，但不排除存在或添加一个或多个其他特征、步骤、操作、要素、组分，和/或它们的组合。如本文所用，术语“和/或”包括相相关列出项目的一个或多个项目的任何组合和所有组合，并且可缩写为“/”。
[0080]
为了便于描述，本文可使用诸如“在
……
下”、“下方”、“下”、“在
……
上”等空间相关术语来描述一个要素或特征与另外的要素或特征的关系，如图中所示。将理解，空间相关术语旨在涵盖装置在使用中或在除图中所示的方向之外的操作中的不同方向。例如，如果图中的装置倒置，则描述为“在”其他元件或特征“下”或“下方”的要素将被定向为“在”其他元件或特征“上”。因此，示例性术语“在
……
下”、可包括上方和下方的方向。装置可以以其他方式定向(旋转90度或其他方向)，并且相应地解释本文所用的空间相关描述语。类似地，除非另有明确说明，本文中使用的术语“向上”、“向下”、“垂直”、“水平”等仅用于解释目的。
[0081]
尽管本文中可使用术语“第一”和“第二”来描述各种特征/要素(包括步骤)，但是这些特征/要素不应限于这些术语，除非上下文另有说明。这些术语可用于将一个特征/要素与另一个特征/要素区分开来。因此，下面讨论的第一特征/要素可称为第二特征/要素，并且类似地，下面讨论的第二特征/要素可称为第一特征/要素，而不脱离本发明的教导。
[0082]
在本说明书和随后的权利要求全文中，除非上下文另有要求，否则词语“包括”("comprise")及其变体诸如“包括”和“包含”("comprises"and"comprising")意指各种组分可共同用于方法和制品(例如组合物和设备，包括装置和方法)。例如，术语“包括”将理解为暗示包括任何所描述的要素或步骤，但不排除任何其他要素或步骤。
[0083]
如本文在说明书和权利要求中使用的，包括在实施例中使用的，除非另有明确规定，否则所有数字可理解为犹如以词语“约”或“大约”为前缀，即使该术语没有明确出现。当描述数量(magnitude)和/或位置时，可使用短语“约”或“大约”来表示所描述的值和/或位置在值和/或位置的合理预期的范围内。例如，数值可具有+/-0.1％所述值(或值范围)的值、+/-1％所述值(或值范围)的值、+/-2％所述值(或值范围)的值，+/-5％所述值(或值范围)的值、+/-10％所述值(或值范围)的值等。本文给出的任何数值还应理解为包括约或大约为该值，除非上下文另有说明。例如，如果公开了值“10”，则还公开了“约10”。本文所述的任何数值范围旨在包括其中包含的所有子范围。还应理解，当公开了一个值“小于或等于”该值时，还公开了“大于或等于该值”以及值之间的可能范围，如本领域技术人员适当理解的那样。例如，如果值“x”被公开，则“小于或等于x”以及“大于或等于x”(例如，其中x是数值)也被公开。还应理解，在整个申请中，数据以多种不同格式提供，并且该数据表示端点和起点以及数据点的任意组合的范围。例如，如果公开了具体数据点“10”和具体数据点“15”被公开，应理解大于、大于或等于、小于、小于或等于、等于10和15以及10至15之间的值也视
为被公开。还应理解，还公开了两个具体单元(unit)之间的每个单元。例如，如果公开了10和15，则还公开了11、12、13和14。
[0084]
尽管上面描述了各种说明性实施方案，但是任何多种改变可用于各种实施方案，而不脱离如权利要求所述的本发明的范围。例如，在替代实施方案中，通常可改变进行各种所描述的方法步骤的顺序，并且在其他替代实施方案中，可以完全跳过一个或多个方法步骤。各种装置和系统实施方案的可选特征可以包括在一些实施方案中而不包括在其他实施方案中。因此，提供上述描述主要是为了示例性目的，而不应解释为限制如权利要求中所述的本发明的范围。
[0085]
本文中包括的实施例和说明通过说明而非限制的方式示出了可以实践本主题的具体实施方案。如所提及的，可以利用其他实施方案并从中衍生出其他实施方案，使得可作出结构和逻辑替换以及改变，而不脱离本公开的范围。本发明主题的这些实施方案可以在本文中单独地或共同地通过术语“发明”来指代，仅是为了方便并且无旨在将本技术的范围自愿限制为任何单个发明或发明构思，如果事实上公开了多于一个发明或发明构思。因此，尽管本文已经说明和描述了具体实施方案，适于实现相同目的的任何布置都可代替所示的具体实施方案。本公开旨在涵盖各种实施方案的任何和所有修改或变体。上述实施方案的组合以及本文未具体描述的其他实施方案对于本领域技术人员在阅读以上描述后将是显而易见的。