青春双歧杆菌在制备脂肪吸收抑制剂中的应用的制作方法

1.本发明涉及生物医药技术领域，特别是涉及一种青春双歧杆菌在制备脂肪吸收抑制剂中的应用。


背景技术：

2.随着经济发展和生活方式的改变，肥胖患病率逐年攀升。肥胖是指一定程度的明显超重与脂肪层过厚，是体内脂肪，尤其是甘油三酯积聚过多而导致的一种状态。肥胖不是指单纯的体重增加，而是由于食物摄入过多或机体代谢的改变而导致体内脂肪积聚过多的状态。然而，肥胖是糖尿病和心血管疾病等合并症的主要危险因素，也会影响消化系统、内分泌系统的功能。因此，控制体重增加甚至减轻体内脂肪的积累十分必要。
3.目前，减重的方法有代谢手术、药物治疗以及生活方式干预。其中，代谢手术创伤大且可能发生术后并发症，药物治疗容易存在一些不良反应，因而生活方式干预为目前减重的主要方法。生活方式干预主要是通过饮食控制和运动来实现控制体重增加或减重，虽然饮食控制和运动干预能取得很好的效果，但往往不易坚持，并且饮食控制和运动对专业的依赖程度高，在没有专业人员指导下的饮食控制容易导致营养不良，错误的运动方式会对关节、韧带等造成损伤。


技术实现要素：

4.经过研究发现，青春双歧杆菌能够促进组织中血管生成素样蛋白4(angptl4)基因表达，提高肠组织和血清中血管生成素样蛋白4的含量，抑制脂肪酶的活性，从而抑制脂肪吸收，进而减少高脂饮食对体重的影响，并且青春双歧杆菌是健康肠道中正常存在的微生物，可长期摄入，安全性高。因此，将青春双歧杆菌作为脂肪吸收抑制剂，可开发出安全性高的预防或治疗肥胖的药物或保健品。
5.基于此，本发明提供了一种青春双歧杆菌在制备脂肪吸收抑制剂中的应用。
6.在其中一个实施例中，所述青春双歧杆菌为e298b(variant c)，所述青春双歧杆菌的保藏号为dsm 20086。
7.在其中一个实施例中，所述脂肪吸收抑制剂包括活性成分，所述活性成分包括所述青春双歧杆菌。
8.在其中一个实施例中，所述脂肪吸收抑制剂还包括辅料，所述辅料包括稳定剂，所述稳定剂选自焦亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、维生素c、半胱氨酸、抗坏血酸钠盐、异抗坏血酸钠盐、l-半胱氨酸盐酸盐和依地酸盐至少一种。
9.在其中一个实施例中，所述辅料还包括填充剂，所述填充剂选自微晶纤维素、乳糖、淀粉、预交化淀粉、甘露醇和山梨醇中的至少一种。
10.在其中一个实施例中，所述辅料还包括粘合剂，所述粘合剂选自羟丙纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素、聚维酮和交联聚维酮中的至少一种。
11.在其中一个实施例中，所述辅料还包括崩解剂，所述崩解剂选自羧甲基淀粉钠、低
取代羟丙基纤维素、交联聚乙烯比咯烷酮、交联羧甲基纤维素纳和干淀粉中的至少一种。
12.在其中一个实施例中，所述辅料还包括润滑剂，所述润滑剂选自硬脂酸镁、滑石粉、微粉硅胶和富马酸硬脂酸钠中的至少一种。
13.在其中一个实施例中，所述辅料还包括矫味剂，所述矫味剂选自甜味剂及芳香剂中的至少一种。
14.青春双歧杆菌在制备促进血管生成素样蛋白4生成的试剂中的应用。
附图说明
15.图1为ncd组、wd+b.a组、wd+hk-b.a组和wd组小鼠体重的统计结果；
16.图2为wd+b.a组、wd+hk-b.a组和wd组小鼠的皮下脂肪重量的统计结果；
17.图3为wd+b.a组、wd+hk-b.a组和wd组小鼠的肠系膜白色脂肪组织重量的统计结果；
18.图4为wd+b.a组、wd+hk-b.a组和wd组小鼠的肾周边白色脂肪组织重量的统计结果；
19.图5为wd+b.a组、wd+hk-b.a组和wd组小鼠的附睾白色脂肪组织重量的统计结果；
20.图6为wd+b.a组、wd+hk-b.a组和wd组小鼠的回肠组织中angptl4基因的mrna的表达情况；
21.图7为wd+b.a组、wd+hk-b.a组和wd组小鼠的回肠组织中angptl4蛋白表达的相对定量结果；
22.图8为wd+b.a组、wd+hk-b.a组和wd组小鼠的血清中血管生成素样蛋白4含量的统计结果；
23.图9为wd+b.a组、wd+hk-b.a组和wd组小鼠的回肠组织中脂肪酶的活性的统计结果；
24.图10为wd+b.a组、wd+hk-b.a组和wd组小鼠的肠道组织中甘油三酯含量的统计结果；
25.图11为wd+b.a组、wd+hk-b.a组和wd组小鼠的干粪便中甘油三酯含量的统计结果。
具体实施方式
26.为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使本发明公开内容更加透彻全面。
27.除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
28.双歧杆菌属(bifidobacterium)是一种革兰氏阳性、不运动、细胞呈杆状、一端有时呈分叉状、严格厌氧的细菌属，广泛存在于人和动物的消化道、阴道和口腔等生境中，是维持宿主健康的益生菌。目前常用于食品的双歧杆菌为：青春双歧杆菌(bifidobacterium adolescentis)、两歧双歧杆菌(bifidobacterium bifidum)、婴儿双歧杆菌(bifidobacterium infants)、长双歧杆菌(bifidobacterium longum)和短双歧杆菌
(bifidobacterium breve)。其中，青春双歧杆菌可用于治疗慢性腹泻、便秘。此外，有研究表明青春双歧杆菌还具有显著的抗衰老作用，可明显增加血中超氧化物歧化酶(sod)的活性与含量，从而减少自由基的氧化反应和对人体细胞的损伤，具有延年益寿的功效。
29.本发明经过研究发现，青春双歧杆菌能够提高肠道中血管生成素样蛋白4(angptl4)基因的表达，血管生成素样蛋白4为脂肪酶抑制剂，可以抑制脂肪酶(例如胰脂肪酶)的活性。因此，青春双歧杆菌可以通过提高体内血管生成素样蛋白4的含量，抑制脂肪酶的活性而抑制脂肪吸收，从而减少高脂饮食对体重的影响。
30.基于此，本发明一实施方式提供了一种青春双歧杆菌在制备促进血管生成素样蛋白4生成的试剂中的应用。
31.具体地，青春双歧杆菌为e298b(variant c)，该青春双歧杆菌购自于德国微生物菌种保藏中心(dsmz)，保藏号为dsm 20086。青春双歧杆菌e298b(variant c)是从健康成人的肠道中分离得到的益生菌，是健康肠道中正常存在的微生物，安全性高，可长期摄入，并且青春双歧杆菌在肠道中的定植力强。经验证，青春双歧杆菌e298b(variant c)可以提高回肠组织中血管生成素样蛋白4基因的mrna的表达量，提高血清中血管生成素样蛋白4的含量。
32.基于上述青春双歧杆菌在制备促进血管生成素样蛋白4生成的试剂中的应用，本发明一实施方式还提供了一种促进血管生成素样蛋白4生成的试剂。
33.具体地，上述促进血管生成素样蛋白4生成的试剂包括青春双歧杆菌，青春双歧杆菌作为主要的活性成分。进一步地，青春双歧杆菌为德国微生物菌种保藏中心(dsmz)的保藏号为dsm 20086的青春双歧杆菌为e298b(variant c)。
34.可以理解的是，在一些实施例中，上述促进血管生成素样蛋白4的试剂还包括辅料。例如稳定剂、填充剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂及矫味剂等。
35.在一些实施例中，辅料选自稳定剂、填充剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂及矫味剂中的至少一种。
36.具体地，稳定剂用于维持促进血管生成素样蛋白4的试剂的稳定，保持其活性成分的有效性。具体地，稳定剂选自焦亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、维生素c、半胱氨酸、抗坏血酸钠盐、异抗坏血酸钠盐、l-半胱氨酸盐酸盐和依地酸盐至少一种。在其中一个可选地具体示例中，稳定剂选自焦亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、维生素c、半胱氨酸、抗坏血酸钠盐、异抗坏血酸钠盐、l-半胱氨酸盐酸盐或依地酸盐。当然，在其他实施例中，稳定剂不限于上述，还可以是其他能够维持促进血管生成素样蛋白4的试剂稳定，使其活性有效即可。
37.具体地，填充剂用于增加促进血管生成素样蛋白4的试剂的重量，利于试剂成型。可选地，填充剂选自微晶纤维素、乳糖、淀粉、预交化淀粉、甘露醇和山梨醇中的至少一种。在一个可选地具体示例中，填充剂为微晶纤维素、乳糖、淀粉、预交化淀粉、甘露醇或山梨醇。当然，在其他实施例中，填充剂不限于上述，还可以是其他可以食用的填充剂。
38.具体地，粘合剂起粘合作用。可选地，粘合剂选自羟丙纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素、聚维酮和交联聚维酮中的至少一种。在一个具体的示例中，粘合剂为羟丙纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素、聚维酮或交联聚维酮。当然，在其他实施例中，粘合剂不限于上述，还可以是其他可食用的具有粘合作用的物质。
39.具体地，崩解剂可以使得促进血管生成素样蛋白4的试剂在胃肠液中迅速裂碎成
细小颗粒的物质，从而使活性成分迅速溶解吸收。可选地，崩解剂选自羧甲基淀粉钠、低取代羟丙基纤维素、交联聚乙烯比咯烷酮、交联羧甲基纤维素纳和干淀粉中的至少一种。可以理解的是，在其他实施例中，崩解剂不限于上述，还可以是其他可以食用的具有崩解作用的物质。
40.具体地，润滑剂具有助流、抗粘和润滑的作用，利于促进血管生成素样蛋白4的试剂的制备。可选地，润滑剂选自硬脂酸镁、滑石粉、微粉硅胶和富马酸硬脂酸钠中的至少一种。在一个具体地示例中，润滑剂为硬脂酸镁、滑石粉、微粉硅胶或富马酸硬脂酸钠。可以理解的是，在其他实施例中，润滑剂不限于上述，还可以是其他可以食用的具有润滑作用的物质。
41.具体地，矫味剂用于改善促进血管生成素样蛋白4的试剂的口感。可选地，矫味剂选自甜味剂及芳香剂中的至少一种。可选地，甜味剂选自山梨糖、木糖、木糖醇、甘油、甘草酸二钠、甘露醇、甘露糖、半乳糖、麦芽糖、乳糖、果糖、甜精、糖精钠、甜菊糖甙、甜蜜素、葡萄糖、蔗糖及阿司帕坦中的至少一种；芳香剂选自小茴香油、玫瑰油、玫瑰香精、柠檬油、柠檬香精、香草香精、香草醛、香蕉香精、菠萝香精、木瓜香精、薄荷油、橙皮油、苹果香精、橘味香精及杏味香精中的至少一种。可以理解的是，在其他实施例中，矫味剂不限于上述，还可以是其他可以具有改善口感的物质。
42.当然，上述促进血管生成素样蛋白4的试剂的剂型没有特别限制。可选地，促进血管生成素样蛋白4的试剂的剂型为颗粒剂、胶囊剂或片剂。
43.此外，本发明一实施方式还提供了一种青春双歧杆菌在制备脂肪吸收抑制剂中的应用。
44.在本实施方式中，青春双歧杆菌为e298b(variant c)，该青春双歧杆菌购自于德国微生物菌种保藏中心(dsmz)，保藏号为dsm 20086。青春双歧杆菌e298b(variant c)是健康成人的肠道中的益生菌，安全性高，可长期摄入，且在肠道中的定植力强。并且，经验证，青春双歧杆菌e298b(variant c)可同时减少皮下脂肪和腹内脂肪，对改善代谢性疾病(例如肥胖)具有重要意义，可用于预防和/或辅助治疗代谢性疾病的药物、保健品或饮食品。
45.基于上述青春双歧杆菌在制备脂肪吸收抑制剂中的应用，本发明一实施方式还提供一种脂肪吸收抑制剂。具体地，该脂肪吸收剂的活性成分包括青春双歧杆菌。进一步地，活性成分包括德国微生物菌种保藏中心(dsmz)的保藏号为dsm 20086的青春双歧杆菌为e298b(variant c)。
46.可以理解的是，在一些实施例中，上述脂肪吸收抑制剂还包括辅料。例如上文提及的稳定剂、填充剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂及矫味剂等。当然，辅料的种类不限于上述，还可以根据实际情况进行添加。
47.此外，由于青春双歧杆菌是从健康成人的肠道中分离得到的益生菌，是健康肠道中正常存在的微生物，可长期摄入，安全性高，在肠道中的定植力强。经验证，青春双歧杆菌可同时减少皮下脂肪和腹内脂肪。因此，本发明一实施方式还提供了一种青春双歧杆菌在制备预防或治疗代谢疾病的组合物的应用。具体地，代谢疾病为肥胖。
48.可选地，预防或治疗代谢疾病的组合物包括青春双歧杆菌和辅料，其中，青春双歧杆菌作为主要活性成分。具体地，辅料可以是食品或药品中常用的辅料。在一个可选地具体示例中，青春双歧杆菌为德国微生物菌种保藏中心(dsmz)的保藏号为dsm 20086的青春双
歧杆菌为e298b(variant c)。
49.具体地，以青春双歧杆菌不低于1
×
10
12
cfu/kg
·
d的剂量使用上述脂肪吸收抑制剂。进一步地，以青春双歧杆菌为1
×
10
12
cfu/kg
·
d～5
×
10
12
cfu/kg
·
d的剂量使用上述脂肪吸收抑制剂。
50.上述预防或治疗代谢疾病的组合物的安全性高，可以抑制机体对脂肪的吸收，使得机体不容易因为高脂食物的摄入而肥胖，上述预防或治疗代谢疾病的组合物可用于新食品或药品的开发。
51.具体实施例
52.以下结合具体实施例进行详细说明。以下实施例如未特殊说明，则不包括除不可避免的杂质外的其他组分。实施例中采用试剂和仪器如非特别说明，均为本领域常规选择。实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规条件，例如文献、书本中所述的条件或者生产厂家推荐的方法实现。以下实施例中使用的主要仪器包括动物天平、厌氧培养箱、离心机、罗氏lightcycler480荧光定量pcr仪、普通光学显微镜(olympus公司，日本)。以下实施例中的青春双歧杆菌e298b(variant c)购自德国微生物菌种保藏中心(dsmz)，保藏号为dsm 20086。附图中的“*”表示“p《0.05”，“**”表示“p《0.01”,“***”“p《0.001”。
53.实施例1
54.(1)青春双歧杆菌e 298b(variant c)在培养基中37℃厌氧环境下摇瓶培养24h，得青春双歧杆菌菌液；然后3500g离心30分钟，弃上清，得到青春双歧杆菌沉淀；然后将青春双歧杆菌沉淀用pbs洗涤两次后，使用含20％甘油的pbs重悬，制得青春双歧杆菌的菌悬液。其中，用于培养青春双歧杆菌e 298b(variant c)的培养基的组成成分如下：酪蛋白胨(casein peptone)10.00g、胰蛋白酶消化物(tryptic digest)10.00g、酵母提取物(yeast extract)5.00g、肉浸膏(meat extract)5.00g、大豆胨(bacto soytone)5.00g、葡萄糖10.00g、k2hpo
4 2.00g、mgso4·
7h2o 0.20g、mnso4·
h2o 0.05g、tween 80 1.00ml、nacl 5.00g、盐溶液40.00ml、刃天青(resazurin)(25mg/100ml)4.00ml、cysteine-hcl
·
h2o 0.50g和950.00ml蒸馏水。其中盐溶液的组成为：cacl2·
2h2o 0.25g、mgso4·
7h2o 0.50g、k2hpo
4 1.00g、kh2po
4 1.00g、nahco
3 10.00g、nacl 2.00g和1l蒸馏水中。培养基经高温高压灭菌后使用。
55.(2)给小鼠普通饲料或高脂饲料进行喂养。
56.将购自南京大学模式动物研究所的c57bl/j6品系小鼠(7周龄，雄性)的所有小鼠饲养于上海骏实实业公司的spf级动物房中，动物屏障内采用独立通风笼具的饲养系统，使用干燥的灭菌玉米芯垫料，每笼3只～5只，室温在20℃，相对湿度50％，每日12h光照，昼夜循环，自由进水进食。在进行了为期一周的适应性喂养后将小鼠随机分为两组并给予普通饮食(斯莱康上海普路腾生物科技有限公司，营养成分：4.7kcal/g，含20％蛋白质，35％碳水化合物)或高脂饮食(research diets，美国，4.73kcal/g，含20％蛋白质，35％碳水化合物，45％脂肪)开始造模。
57.(3)在高脂饲料喂养8周后，将高脂饲料喂养诱发的肥胖小鼠随机分为3组，分别为高脂饮食活青春双歧杆菌处理组(wd+b.a)，高脂饮食高热灭活青春双歧杆菌处理组(wd+hk-b.a)及高脂饮食普通饮水组(wd)。其中：
58.在wd+b.a组小鼠饮水中添加青春双歧杆菌活菌，wd+b.a组小鼠的具体投喂包括：
将步骤(1)收获的青春双歧杆菌重悬于20％pbs甘油后，制备细菌浓度为5
×
10
11
cfu/ml菌悬液，然后将2ml菌悬液稀释于100ml饮用水中，让小鼠只有进水进食(按照每只小鼠每日饮水8ml计算，每只小鼠每日可摄入细菌4
×
10
10
cfu)。
59.在wd+hk-b.a组小鼠饮水中添加与wd+b.a组等量的高温灭活的青春双歧杆菌，小鼠进水进食方式与wd+b.a组相同。高温灭活青春双歧杆菌由细菌浓度为5
×
10
11
cfu/ml的菌悬液经高温灭菌锅在121℃，225kpa条件下灭菌15分钟处理得到。
60.在wd组小鼠饮水中添加与wd+b.a组等量pbs，小鼠进水进食方式与wd+b.a组相同。
61.采用上述三种不同处理方式干预5周，期间定期称量体重，结果如表1和图1所示。表1和图1中的“ncd”是指普通饮食组，ncd组的饮水与wd组相同。
62.表1春双歧杆菌e298b(variant c)干预期间小鼠体重的变化
[0063][0064][0065]
由表1和图1可知，饮用水中添加pbs的高脂饮食组(wd组)的小鼠体重的明显增长，而在饮用水中添加青春双歧杆菌活菌的高脂饮食组(wd+b.a组)的小鼠的体重增加不明显，在饮用水中添加灭活青春双歧杆菌的高脂饮食组(wd+hk-b.a组)的小鼠的体重也明显增加，其中wd+hk-b.a组的小鼠的体重的平均值明显高于wd+b.a组，且wd+hk-b.a组与wd+b.a组存在显著差异。由此可知，青春双歧杆菌可以减缓由于高脂饮食引起的体重增加。
[0066]
(4)在第5周结束后，经心脏取步骤(3)中三种不同干预方式处理后的高脂饮食小鼠的空腹血，留取并称量各组小鼠的各组织的重量，经统计分析，结果如图2～图5所示。
[0067]
图2为各组小鼠皮下脂肪的重量统计结果；图3为各组小鼠肠系膜(mesentereic)白色脂肪组织(white adipose tissue，wat)的重量；图4为肾周白色脂肪组织(peri-renal wat)的重量；图5为附睾白色脂肪组织(epididymal wat)的重量。由图2～图5可知，wd+b.a组的小鼠的皮下脂肪、肠系膜白色脂肪组织、肾周白色脂肪组织和附睾白色脂肪组织的重量明显低于wd+hk-b.a组和wd组，由此说明，青春双歧杆菌可以明显降低脂肪积累。
[0068]
(5)采用trizol(invitrogen)提取步骤(4)得到的各组小鼠的肠组织的总rna，并使用improm-ii逆转录酶(promega，美国)逆转录成cdna。使用quantifast sybr green预混液(qiagen，荷兰)在light cycler 480系统(roche，美国)上进行相对定量rt-qpcr反应，测定各组小鼠肠道的angptl4基因的mrna的表达量，结果如图6所示。
[0069]
依次使用angptl4抗体(proteintech，美国)和用辣根过氧化物酶标记的二抗(dako，丹麦)对步骤(4)得到的各组小鼠回肠组织进行免疫组化标记并拍片，利用image j软件对回肠组织中angptl4蛋白的表达情况进行相对定量分析，以得到angptl4蛋白在相同大小视野的面积占比，即angptl4蛋白的相对表达情况，结果如图7所示。
[0070]
采用angptl4 elisa试剂盒(bio vendor，捷克)测定步骤(4)得到的各组小鼠的血清中angptl4的含量，结果如图8所示。
[0071]
由图6～图8可知，wd+b.a组小鼠回肠组织中的angptl4基因的表达量明显高于wd+hk-b.a组和wd组，wd+b.a组小鼠回肠组织中的angptl4蛋白的含量明显高于wd+hk-b.a组和wd组，wd+b.a组小鼠血清中的angptl4的含量明显高于wd+hk-b.a组和wd组，由此说明了青春双歧杆菌可以促进肠道中angptl4基因的表达，促进angptl4蛋白的生成。
[0072]
(6)采用lpl活性测定试剂盒(sigma，美国)测定步骤(4)得到的各组小鼠的肠道中脂蛋白脂肪酶(lpl)的活性，采用tg酶法检测试剂盒(stanbio labs，美国)测定各组小鼠的肠组织和肠腔内容物(粪便)中甘油三酯的含量，经统计分析，结果如图9～图11所示，其中：
[0073]
图9为各组小鼠回肠组织中脂肪酶的活性的测定结果。由图9可知，wd+b.a组小鼠肠腔内脂肪酶(intestinal luminal lipase)的活性明显低于wd组，说明青春双歧杆菌促进了angptl4蛋白的生成，从而抑制了脂肪酶的活性。
[0074]
图10为各组小鼠肠组织(intestine)中甘油三酯(tg)含量的测定结果；图11为各组小鼠粪便(fecal)中tg含量的测定结果。由图10和图11可知，wd+b.a组小鼠的肠中甘油三脂的含量明显低于wd+hk-b.a组和wd组，而wd+b.a组小鼠的粪便中甘油三脂的含量明显高于wd+hk-b.a组和wd组。由此说明，青春双歧杆菌可以明显抑制肠道对食物中脂肪的吸收，具有减轻体重的作用。
[0075]
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
[0076]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。