一种齐墩果酸纳米凝胶的制备方法及其应用

1.本发明属于生物医药领域，涉及一种齐墩果酸纳米凝胶的制备方法及其应用。


背景技术：

2.作为药物发展的起源，天然药物在药物化学中占有重要地位。存在于天然植物中的五环三萜烯齐墩果酸（oa）具有多种生物活性，例如抗肿瘤作用、抗氧化作用、增强免疫功能、肝保护作用和心脏保护作用，具有广阔的应用前景。2012年bag等人发现齐墩果酸具有手性刚性骨架，易于在溶液中聚集，通过分子间氢键、π
‑
π堆积作用及三萜骨架的聚集性质组装成纤维结构，然后形成超分子有机凝胶（b.g. bag, k. paul, vesicular and fibrillar gels by self
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assembly of nanosized oleanolic acid, asian journal of organic chemistry, 1 (2012) 150
‑
154.）。该团队虽利用齐墩果酸有机凝胶包载阿霉素，但并未对其治疗效果进行评价，并且有机凝胶毒性大，一般应用于药物载体及医用材料的超分子凝胶主要为水凝胶。
3.国家癌症中心最新统计数据显示，乳腺癌位居女性恶性肿瘤发病率的首位，已经成为全球的主要公共卫生问题。在各种类型的人类乳腺癌中，三阴性乳腺癌（tnbc）是最具侵略性的类型。肿瘤微环境（tem）由细胞外基质（ecm）、肿瘤相关成纤维细胞（cafs）、免疫细胞和血管系统组成，他们围绕着肿瘤细胞，保护肿瘤细胞免受侵犯。由成纤维细胞产生的胶原形成物理屏障，阻断药物的传递和细胞毒性t细胞的浸润。并且，cafs通过重塑ecm支持肿瘤的发展，tnbc的预后与肿瘤的中心纤维化有关，纤维化程度越高，肿瘤向远处转移的倾向越大（takai k , le a , weaver v m , et al. targeting the cancer
‑
associated fibroblasts as a treatment in triple
‑
negative breast cancer[j]. oncotarget, 2016, 7(50):82889
‑
82901.）。因此，靶向cafs和重构ecm可能是应对复杂的癌症病因学的有效策略。
[0004]
转化生长因子
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β（tgf
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β）是重塑ecm和控制caf激活的关键调节剂，可促进增生的积累和肿瘤的生长速度。tgf
‑
β通过tgf
‑
β/ smad信号传导途径驱动ecm中胶原蛋白的表达。研究表明，通过阻断tgf
‑
β，降低胶原蛋白的产生，促使血管正常化来改善药物在乳腺癌中的分布，增加肿瘤部位的免疫细胞浸润，逆转肿瘤的免疫抑制环境。齐墩果酸已被证明可以通过增加nrf2的核转运来减轻c57bl / 6小鼠的肾纤维化和胶原蛋白沉积（zhao d , luan z . oleanolic acid attenuates renal fibrosis through tgf
‑ꢀ
β /smad pathway in a rat model of unilateral ureteral obstruction[j]. 2020, 2020:1
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8.）。另外，研究人员发现齐墩果酸与tgf
‑
β1受体具有很强的结合能力，可以作为tgf
‑
β1的拮抗剂。这表明oa通过tgf
‑
β/ smad信号传导减弱纤维化是有潜力的（yoshimura h , sugawara k , saito m , et al. in vitro tgf
‑
β1 antagonistic activity of ursolic and oleanolic acids isolated from clerodendranthus spicatus[j]. planta medica, 2003, 69(7):673
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675.）。
[0005]
光引发的光热治疗（ptt）和光动力学治疗（pdt）具有高特异性，即给药后外加光源
照射肿瘤部位使其产生热或活性氧（ros），对其他组织的副作用小。但是，ptt和pdt的缺点是光穿透深度有限，因此单独使用ptt或pdt可能无法有效抑制肿瘤。超声作为一种机械波，在生物体内的良好的穿透能力，能够到达深层的肿瘤，可用于肿瘤的诊断和治疗。声敏剂在超声刺激下，产生ros，促使细胞内蛋白或dna的氧化损伤，导致细胞死亡（zhu, piao, chen, et al. nanoenzyme
‑
augmented cancer sonodynamic therapy by catalytic tumor oxygenation[j]. acs nano, 2018，12：3780
‑
3795.）。
[0006]
因此，我们通过改变乙醇比例和齐墩果酸浓度，得到一种纳米凝胶。该纳米凝胶能有效抑制乳腺癌细胞的增殖，通过降低肿瘤的纤维化程度，重塑肿瘤微环境，提高免疫细胞在肿瘤部位的比例，可用于肿瘤的化疗和免疫治疗。该纳米凝胶可用于包载光声敏化剂，得到oa/敏化剂纳米药物，用于肿瘤的光声/化学治疗。


技术实现要素：

[0007]
本发明的目的在于提供一种齐墩果酸纳米凝胶的制备方法及应用。本发明以齐墩果酸为原料，构建了一种具有调控肿瘤微环境功能的纳米凝胶，可用于肿瘤的化疗和免疫治疗。该纳米凝胶可包载光声敏化剂，得到oa/敏化剂纳米药物，用于肿瘤的光声/化学治疗。
[0008]
为达到上述目的，本发明采取了如下技术方案：一种齐墩果酸纳米凝胶的制备方法，包括如下步骤（1）将齐墩果酸溶解在乙醇或dmso中；（2） 将步骤（1）得到的溶液在涡旋状态下滴加到水溶液中，室温静置0.5～24 h，得到齐墩果酸纳米凝胶。
[0009]
所述的水溶液选自水、含药物分子的水溶液、生理盐水溶液、磷酸盐缓冲液、细胞培养基或其混合溶液。
[0010]
所述纳米凝胶中齐墩果酸的浓度为0.1～5mg/ml。
[0011]
所述的纳米凝胶中乙醇或dmso的体积浓度为10%～100%。
[0012]
齐墩果酸纳米凝胶在制备抗肿瘤药物中的应用。
[0013]
齐墩果酸纳米凝胶在抗纤维化方面的应用。
[0014]
齐墩果酸纳米凝胶在免疫治疗中的应用。
[0015]
oa/敏化剂纳米药物在光声/化学治疗中的应用。
[0016]
本发明的有益效果是：第一，本发明通过改变乙醇比例和齐墩果酸浓度，得到具有不同构造的组装体；第二，本发明得到的纳米凝胶，相比于游离药物和齐墩果酸纳米粒，抗肿瘤效果大大提升。
[0017]
第三，本发明得到的纳米凝胶，可以调控肿瘤的微环境，减弱肿瘤的纤维化程度，促进毒性t细胞的浸润，可用于肿瘤的化疗和免疫治疗。
[0018]
第四，本发明得到的oa/敏化剂纳米药物，可用于肿瘤的光声/化学治疗，抑制肿瘤的增长。
附图说明
[0019]
图1为实施例1 制备的齐墩果酸凝胶。
[0020]
图2为实施例1 制备的齐墩果酸凝胶在频率扫描下的流变学结果。
[0021]
图3为实施例2 制备的oa
‑
ng。
[0022]
图4为实施例2制备的oa
‑
ng的透射电镜图。
[0023]
图5为实施例3 制备的oa
‑
np的透射电镜图。
[0024]
图6为实施例5制备的orm的紫外光谱图。
[0025]
图7为实施例6中oa
‑
ng对4t1细胞毒性的影响。
[0026]
图8为实施例7中orm对4t1细胞毒性的影响。
[0027]
图9为实施例8中oa
‑
ng对4t1荷瘤小鼠肿瘤体积的影响。
[0028]
图10为实施例8中oa
‑
ng对肿瘤纤维化的影响。
[0029]
图11为实施例9中oa
‑
ng对4t1荷瘤小鼠肿瘤部位免疫细胞的影响。
具体实施方式
[0030]
下面结合具体实施例，对本发明进行进一步说明，有助于本领域的普通技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。
[0031]
实施例1将500 μl含有4 mg/ml齐墩果酸的乙醇溶液在涡旋状态下滴加到500 μl的水中，室温静置24 h，观察到果冻状凝胶，得到齐墩果酸凝胶，如图1所示。通过流变仪表征凝胶的流变学性质，如图2所示，g’比 g
’’
高出一个数量级，并且随着扫描频率的变化，g’基本保持恒定，满足凝胶的流变学性质。
[0032]
实施例2将150 μl含有3.33mg/ml齐墩果酸的乙醇溶液在涡旋状态下滴加到850 μl的水中，室温静置24 h，离心观察到果冻状凝胶，得到齐墩果酸纳米凝胶oa
‑
ng，如图3所示。齐墩果酸纳米凝胶的结构纳米凝胶呈边缘模糊的球体，部分小球之间存在黏连（图4）。
[0033]
实施例3将50 μl含有10 mg/ml齐墩果酸的乙醇溶液在涡旋状态下滴加到950 μl的水中，室温静置24 h，得到齐墩果酸纳米粒oa
‑
np。通过透射电镜观察发现，纳米粒呈边缘明确的球体，球体均匀分布没有黏连（图5）。
[0034]
实施例4将400 μl含有5 mg/ml齐墩果酸的dmso溶液在涡旋状态下滴加到200 μl的水中，室温静置24 h，观察到果冻状凝胶，得到齐墩果酸有机凝胶。
[0035]
实施例5将150 μl含有3.33 mg/ml齐墩果酸的乙醇溶液在涡旋状态下滴加到850 μl的含有亚甲蓝（mb）和孟加拉玫瑰红（rb）的水溶液中，室温静置24 h, 离心观察到果冻状凝胶，得到纳米凝胶orm。测定其紫外吸收，结果如图6所示，rb在565nm处有特征吸收峰，mb在667nm处有紫外吸收峰，orm在565nm和667nm处均有特征吸收峰，表明oa成功包载rb和mb。
[0036]
实施例6实施例2中的纳米凝胶oa
‑
ng对鼠源乳腺癌细胞4t1的抗肿瘤活性被mtt法测定。结
果如图7所示，相同oa （50 μg/ml）浓度下，oa
‑
np和oa
‑
ng实验组的细胞存活率比游离的oa更低，oa
‑
ng对4t1细胞的增殖抑制的作用比oa
‑
np更强。
[0037]
实施例7orm对鼠源乳腺癌细胞4t1的抗肿瘤活性被mtt法测定。结果如图8所示，orm的光声联合治疗优于单一治疗，抗肿瘤效果大大提高。
[0038]
实施例84t1原位乳腺癌小鼠模型被用于验证纳米凝胶的体内抗肿瘤活性。其中一组小鼠通过尾静脉注射实施例2中的oa
‑
ng（15 mg/kg）进行治疗，一组小鼠通过尾静脉注射实施例3中的oa
‑
np（15 mg/kg）进行治疗；一组小鼠通过尾静脉注射游离oa（15 mg/kg）进行治疗；另一组则通过静脉注射pbs作为对照。每隔一天测量肿瘤的体积，结果如图9所示，经过14天治疗后，oa
‑
ng组的肿瘤的体积明显小于游离oa组和oa
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np组。对治疗后肿瘤组织进行天狼星红染色，结果如图10所示，oa
‑
ng组胶原蛋白的表达量最少，oa
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ng抑制肿瘤纤维化的能力强于oa
‑
np。
[0039]
实施例9将实施例2中的oa
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ng（15 mg/kg）、实施例3中的oa
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np（15 mg/kg）、游离oa（15 mg/kg）分别尾静脉注射到4t1原位乳腺癌小鼠模型中，通过静脉注射pbs作为对照组，24小时后，取出肿瘤组织，通过流式细胞仪检测肿瘤中浸润的毒性t细胞的含量。结果如图11所示，小鼠经过oa
‑
ng治疗后，肿瘤部位有14.6%的cd8+t细胞浸润，oa
‑
np组有6.57%的cd8+t细胞浸润，而pbs组只有1.26%的cd8+t细胞浸润。相比于oa
‑
np和游离oa，oa
‑
ng的免疫治疗效果最好。
[0040]
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。