基于过度自噬损伤的改善卵巢功能的保护剂及其应用

预防和/或改善卵巢功能的药物用于临床，提高临床妊娠率。本发明的目的在于提供了 一种基于过度自噬损伤的改善卵巢功能的保护剂及其应用。
8.本发明中褪黑素对基于自噬损伤的卵巢cho细胞的保护作用评价指标客观，评价 体系比较系统，可重复性好。
9.为解决上述技术问题，本发明采用的第一个技术方案是：提供一种基于过度自噬损 伤的改善卵巢功能的保护剂，包括褪黑素。
10.在本发明一个较佳实施例中，所述褪黑素的浓度为10
‑9m。
11.为解决上述技术问题，本发明采用的第二个技术方案是：提供一种如上所述的保护 剂在改善过度自噬损伤引起的cho细胞线粒体功能降低上的应用。
12.在本发明一个较佳实施例中，所述线粒体功能包括线粒体表达水平、线粒体膜电位、 线粒体融合相关蛋白、呼吸链相关蛋白表达的影响。
13.为解决上述技术问题，本发明采用的第三个技术方案是：提供一种如上所述的保护 剂在改善过度自噬损伤引起的cho细胞线粒体氧化应激水平升高上的应用。
14.在本发明一个较佳实施例中，改善过度自噬损伤引起的cho细胞线粒体氧化应激 水平升高的检测方法包括利用mitosox染色或从cho细胞中提取抗氧化酶sod2蛋 白，利用western blot检测各组cho细胞中抗氧化酶sod2的表达。
15.为解决上述技术问题，本发明采用的第四个技术方案是：提供一种如上所述的保护 剂在改善过度自噬损伤引起的细胞周期阻滞上的应用。
16.在本发明一个较佳实施例中，改善过度自噬损伤引起的细胞周期阻滞的检测方法包 括从cho细胞中提取cdc2和cdk6细胞周期相关蛋白，利用western blot检测褪黑 素对过度自噬损伤引起的cho细胞的细胞周期相关蛋白cdc2和cdk6表达的影响。
17.为解决上述技术问题，本发明采用的第五个技术方案是：提供一种如上所述的保护 剂在改善过度自噬损伤引起的cho细胞卵巢储备功能降低上的应用。
18.在本发明一个较佳实施例中，改善过度自噬损伤引起的cho细胞卵巢储备功能降 低的检测方法包括从cho细胞中提取抗苗勒管激素蛋白，利用western blot检测褪黑 素对过度自噬损伤引起的cho细胞的卵巢储备功能的影响。
19.本发明的有益效果是：本发明以自噬为靶点，利用过度自噬诱导的卵巢cho细胞 损伤模型，系统地研究和验证了褪黑素对基于自噬损伤的卵巢cho细胞的保护功能。 褪黑素不仅可以改善过度自噬损伤引起的cho细胞线粒体表达水平、线粒体膜电位、 线粒体融合相关蛋白、呼吸链相关蛋白等线粒体功能相关指标表达的降低，而且可以改 善过度自噬损伤引起的cho细胞线粒体氧化应激水平的升高和细胞周期阻滞，同时褪 黑素还能改善过度自噬损伤引起的cho细胞卵巢储备功能降低。另外，褪黑素对基于 自噬损伤的卵巢cho细胞的保护作用也为poi或卵巢功能低下患者的临床药物筛选提 供了一个借鉴，用于药物研发筛选。
附图说明
20.图1是利用western blot检测10
‑9m褪黑素(mt)抑制了仓鼠卵巢上皮细胞cho 的过度自噬，图a是转染了n1
‑
egfp(对照组cho
‑
n1)、lc3
‑
egfp(自噬过表达 组cho
‑
lc3)、和10
‑9m褪黑素处理组(mt+cho
‑
lc3)的cho细胞中lc3表达的 western blot结果图，图b是各组细胞
的lc3ii/i表达的相对定量图。
21.图2是利用mitrotracker red染色检测10
‑9m褪黑素(mt)改善过度表达自噬对 cho细胞的线粒体表达水平的降低，图2a是cho
‑
n1、cho
‑
lc3、和mt+cho
‑
lc3 各组细胞中mitrotracker red染色结果图，图2b是各组的mitrotracker red染色平均荧 光强度。
22.图3是利用tmre染色检测10
‑9m褪黑素(mt)改善过度表达自噬对cho细胞 的线粒体膜电位水平的降低，图3a是cho
‑
n1、cho
‑
lc3、和mt+cho
‑
lc3各组细 胞中tmre染色结果图，图3b是各组的tmre染色平均荧光强度。
23.图4是利用western blot检测10
‑9m褪黑素(mt)改善过度表达自噬对cho细胞 的线粒体融合相关蛋白mitofusin
‑
2表达水平的降低，图4a是cho
‑
n1、cho
‑
lc3、 和mt+cho
‑
lc3各组细胞中mitofusin
‑
2表达的western blot结果图，图4b是各组细 胞中mitofusin
‑
2表达水平的相对定量图。
24.图5是利用western blot检测10
‑9m褪黑素(mt)改善过度表达自噬对cho细胞 的线粒体呼吸链相关蛋白sdha表达水平的降低，图5a是cho
‑
n1、cho
‑
lc3、和 mt+cho
‑
lc3各组细胞中sdha表达的western blot结果图，图5b是各组细胞中 sdha表达水平的相对定量图。
25.图6是利用mitosox染色检测10
‑9m褪黑素(mt)改善过度表达自噬对cho细 胞中线粒体氧化应激水平的降低，图6a是cho
‑
n1、cho
‑
lc3、和mt+cho
‑
lc3各 组细胞中mitosox染色结果图，图6b是各组的mitosox染色平均荧光强度。
26.图7是利用western blot检测10
‑9m褪黑素(mt)改善过度表达自噬对cho细胞 的抗氧化酶sod2表达水平的降低，图7a是cho
‑
n1、cho
‑
lc3、和mt+cho
‑
lc3 各组细胞中sod2表达的western blot结果图，图7b是各组细胞中sod2表达水平的 相对定量图。
27.图8是利用western blot检测10
‑9m褪黑素(mt)改善过度表达自噬对cho细胞 的细胞周期相关蛋白(cdc2，cdk6)表达水平的影响，图8a是cho
‑
n1、cho
‑
lc3、 和mt+cho
‑
lc3各组细胞中cdc2表达的western blot结果图，图8b是各组细胞中 cdc2表达水平的相对定量图，图8c是cho
‑
n1、cho
‑
lc3、和mt+cho
‑
lc3各组 细胞中cdk6表达的westernblot结果图，图8d是各组细胞中cdk6表达水平的相对 定量图。
28.图9是利用western blot检测10
‑9m褪黑素(mt)改善过度表达自噬对cho细胞 的卵巢储备功能指标抗苗勒氏管激素(amh)表达水平的降低，图9a是cho
‑
n1、 cho
‑
lc3、和mt+cho
‑
lc3各组细胞中amh表达的western blot结果图，图9b是 各组细胞中amh表达水平的相对定量图。
具体实施方式
29.下面结合附图对本发明的较佳实施例进行详细阐述，以使本发明的优点和特征能更 易于被本领域技术人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。
30.实施例1：褪黑素(mt)抑制了仓鼠卵巢上皮细胞cho的过度自噬
31.1)lc3
‑
egfp转染cho细胞，并用分选流式分选出稳定表达自噬的lc3
‑
cho细 胞系；
32.卵巢上皮细胞cho细胞系购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，胰酶消 化cho细胞，接种于6孔板(3
×
105个/孔)，培养24小时后，应用转染试剂lipofectamine3000将lc3
‑
egfp和对照n1
‑
egfp分别转染到仓鼠卵巢上皮细胞cho中；48小时后， 利用分选流式细胞仪将转染成功的cho细胞分选出来；在含有600u g/ml的g418完全 培养基(包括
dubucco’s modified eagle’s medium(dmem)，10％胎牛血清(fetal bovineserum，fbs)，2mm谷氨酰胺(l
‑
glutamine)、100单位/ml青霉素(penicillin)、0.1 mg/l链霉素(streptomycin))中培养，筛选出稳定表达自噬的lc3
‑
cho细胞系。
33.2)利用western blot检测褪黑素对过度表达自噬后的cho细胞中自噬相关蛋白 lc3表达的影响，如图1所示。
34.①
从cho
‑
n1、cho
‑
lc3、和mt+cho
‑
lc3各组细胞中抽提蛋白；
35.从cho
‑
n1、cho
‑
lc3和mt+cho
‑
lc3各组细胞培养皿中小心倾去培养液。用 预冷的pbs清洗细胞2次，小心倾去pbs。细胞培养皿中加入预冷的含抑制剂的蛋白 质抽提试剂(含蛋白酶抑制剂，pmsf和磷酸酶抑制剂的混合液)，轻轻摇动1分钟。 用细胞刮将细胞刮下来，转移细胞悬浮液到离心管中，置冰上裂解15分钟。裂解液于 预冷的离心机中12，000rpm离心15分钟。弃去沉淀，cho
‑
n1、cho
‑
lc3和 mt+cho
‑
lc3各组细胞上清液(蛋白)立刻转移入新的离心管中，100℃煮10分钟，
‑
80℃ 保存待用。
36.②
利用western blot检测褪黑素对过度表达自噬后的cho细胞中自噬相关蛋白 lc3表达的影响，验证褪黑素确实能够抑制cho细胞的过度自噬水平。
37.cho
‑
n1、cho
‑
lc3和mt+cho
‑
lc3各组蛋白样品在12％的sds
‑
聚丙烯酰胺凝 胶电泳凝胶上分离，然后转移到硝酸纤维素膜上，用自噬相关蛋白lc3的抗体进行检 测。与对照组(cho
‑
n1)相比，cho
‑
lc3组细胞lc3ii/i表达量显著增加，褪黑素处 理组(mt+cho
‑
lc3)细胞lc3ii/i表达量明显降低，＊＊p<0.01，＊p<0.05。
38.实施例2：检测褪黑素改善过度自噬损伤后卵巢cho细胞线粒体功能的降低；
39.1)利用mitrotracker red染色检测10
‑9m褪黑素(mt)改善过度表达自噬对cho 细胞的线粒体表达水平的降低，如图2所示。
40.将5μm mitotracker red染料加到cho
‑
n1、cho
‑
lc3和mt+cho
‑
lc3各组细胞 培养基中，37℃孵育30分钟。各组细胞分别用pbs洗3次，后用激光共聚焦显微镜 (lsm 800,zeiss)检测荧光强度。获取图片时所用的参数保持一致。与对照组(cho
‑
n1) 相比，cho
‑
lc3组细胞mitrotracker red染色的平均荧光强度(代表线粒体的表达)显 著降低，褪黑素处理组(mt+cho
‑
lc3)细胞线粒体的表达量明显升高，＊＊＊＊p<0.0001。
41.2)是利用tmre染色检测10
‑9m褪黑素(mt)改善过度表达自噬对cho细胞的 线粒体膜电位水平的降低，如图3所示。
42.将100nm tmre染料加到cho
‑
n1、cho
‑
lc3和mt+cho
‑
lc3各组细胞培养基 中，37℃孵育20分钟。各组细胞分别用pbs洗3次，后用激光共聚焦显微镜(lsm 800, zeiss)检测荧光强度。获取图片时所用的参数保持一致。与对照组(cho
‑
n1)相比， cho
‑
lc3组细胞tmre染色的平均荧光强度(代表线粒体膜电位)显著降低，褪黑素处 理组(mt+cho
‑
lc3)细胞粒体膜电位明显升高，＊＊＊＊p<0.0001。
43.3)利用western blot检测10
‑9m褪黑素(mt)改善过度表达自噬对cho细胞的 线粒体融合相关蛋白mitofusin
‑
2表达水平的降低，如图4所示。
44.①
从cho
‑
n1、cho
‑
lc3和mt+cho
‑
lc3各组细胞中抽提蛋白(步骤同上)；
45.②
利用western blot检测mt改善过度表达自噬对cho细胞的线粒体融合相关蛋 白mitofusin
‑
2表达水平的降低。
46.cho
‑
n1、cho
‑
lc3和mt+cho
‑
lc3各组蛋白样品在12％的sds
‑
聚丙烯酰胺凝 胶电泳
凝胶上分离，然后转移到硝酸纤维素膜上，用线粒体融合相关蛋白mitofusin
‑
2 的抗体进行检测。与对照组(cho
‑
n1)相比，cho
‑
lc3组细胞mitofusin
‑
2表达量明 显降低，褪黑素处理组(mt+cho
‑
lc3)mitofusin
‑
2表达量明显升高，＊＊p<0.01。
47.4)利用western blot检测10
‑9m褪黑素(mt)改善过度表达自噬对cho细胞的 线粒体呼吸链相关蛋白sdha表达水平的降低，如图5所示。
48.①
从cho
‑
n1、cho
‑
lc3和mt+cho
‑
lc3各组细胞中抽提蛋白(步骤同上)；
49.②
利用western blot检测mt改善过度表达自噬对cho细胞的线粒体呼吸链相关 蛋白sdha表达水平的降低。
50.cho
‑
n1、cho
‑
lc3和mt+cho
‑
lc3各组蛋白样品在12％的sds
‑
聚丙烯酰胺凝 胶电泳凝胶上分离，然后转移到硝酸纤维素膜上，用线粒体呼吸链相关蛋白sdha的 抗体进行检测。与对照组(cho
‑
n1)相比，cho
‑
lc3组细胞sdha表达量明显降低， 褪黑素处理组(mt+cho
‑
lc3)sdha表达量明显升高，＊p<0.05。
51.实施例3：检测褪黑素改善过度自噬损伤后卵巢cho细胞线粒体氧化应激水平的 升高；
52.1)利用mitosox染色检测过度表达自噬对cho细胞的氧化应激水平的影响，如 图6所示；
53.将5μm mitosox染料加到cho
‑
n1、cho
‑
lc3和mt+cho
‑
lc3各组细胞培养基 中，37℃孵育10分钟。各组细胞分别用pbs洗3次，后用激光共聚焦显微镜(lsm 800, zeiss)检测荧光强度。获取图片时所用的参数保持一致。与对照组(cho
‑
n1)相比， cho
‑
lc3组细胞mitosox染色的平均荧光强度(代表线粒体氧化应激水平)显著升高， 褪黑素处理组(mt+cho
‑
lc3)线粒体氧化应激水平显著降低，＊＊＊＊p<0.0001。
54.2)利用western blot检测10
‑9m褪黑素(mt)改善过度表达自噬对cho细胞的 抗氧化酶sod2表达水平的降低，如图7所示；
55.①
从cho
‑
n1、cho
‑
lc3和mt+cho
‑
lc3各组细胞中抽提蛋白(步骤同上)；
56.②
利用western blot检测mt改善过度表达自噬对cho细胞的抗氧化酶sod2表 达水平的降低。
57.cho
‑
n1、cho
‑
lc3和mt+cho
‑
lc3各组蛋白样品在12％的sds
‑
聚丙烯酰胺凝 胶电泳凝胶上分离，然后转移到硝酸纤维素膜上，用抗氧化酶超氧化物歧化酶2 (superoxide
‑
dimutase
‑
2，sod2)的抗体进行检测。与对照组(cho
‑
n1)相比，cho
‑
lc3 组细胞sod2表达量明显降低，褪黑素处理组(mt+cho
‑
lc3)sod2表达量明显升 高，＊p<0.05，＊＊p<0.01。
58.实施例4：利用western blot检测10
‑9m褪黑素(mt)改善过度表达自噬对cho 细胞的细胞周期相关蛋白(cdc2，cdk6)表达水平的影响，如图8所示；
59.1)从cho
‑
n1、cho
‑
lc3和mt+cho
‑
lc3各组细胞中抽提蛋白(步骤同上)；
60.2)利用western blot检测mt改善过度表达自噬对cho细胞的细胞周期相关蛋 白(cdc2，cdk6)表达水平的影响。
61.cho
‑
n1、cho
‑
lc3和mt+cho
‑
lc3各组蛋白样品在12％的sds
‑
聚丙烯酰胺凝 胶电泳凝胶上分离，然后转移到硝酸纤维素膜上，用细胞分裂周期2(cell division cycle 2，cdc2)和周期蛋白依赖激酶6(cyclin
‑
dependent kinases 6，cdk6)的抗体进行检测。 与对照组(cho
‑
n1)相比，cho
‑
lc3组细胞cdc2表达量明显降低，褪黑素处理组 (mt+cho
‑
lc3)
cdc2表达量明显升高(＊p<0.05，＊＊＊p<0.0001)。与对照组(cho
‑
n1) 相比，cho
‑
lc3组和褪黑素处理组(mt+cho
‑
lc3)细胞cdk6表达量没有改变。
62.实施例5：利用western blot检测10
‑9m褪黑素(mt)改善过度表达自噬对cho 细胞的卵巢储备功能指标抗苗勒氏管激素(amh)表达水平的降低，如图9所示；
63.1)从cho
‑
n1、cho
‑
lc3和mt+cho
‑
lc3各组细胞中抽提蛋白(步骤同上)；
64.2)利用western blot检测mt改善过度表达自噬对cho细胞amh表达水平的降 低。
65.cho
‑
n1、cho
‑
lc3和mt+cho
‑
lc3各组蛋白样品在12％的sds
‑
聚丙烯酰胺凝 胶电泳凝胶上分离，然后转移到硝酸纤维素膜上，用细胞分裂周期2(cell division cycle 2，cdc2)和周期蛋白依赖激酶6(cyclin
‑
dependent kinases 6，cdk6)的抗体进行检测。
66.与对照组(cho
‑
n1)相比，cho
‑
lc3组细胞cdc2表达量明显降低，褪黑素处 理组(mt+cho
‑
lc3)cdc2表达量明显升高(＊p<0.05，＊＊＊p<0.0001)。与对照组 (cho
‑
n1)相比，cho
‑
lc3组和褪黑素处理组(mt+cho
‑
lc3)细胞cdk6表达量 均没有改变。
67.应当理解本文所述的例子和实施方式仅为了说明，并不用于限制本发明，本领域技 术人员可根据它做出各种修改或变化，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、 等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。