一种基于斑马鱼模型对莨菪类药物进行毒性评价的方法

1.本发明属于毒物分析领域，具体涉及一种基于斑马鱼模型对莨菪烷烃类药物进行毒性评价的方法。


背景技术：

2.莨菪烷类生物碱是一类具有较强生理活性的天然产物，目前在医药学上占有重要的地位。我国具有丰富的莨菪烷类生物碱的动植物资源，并且投入应用的生物碱种类数量较大，其中包括天然存在的生物碱与人工合成的衍生物。其在医疗上应用十分广泛，例如阿托品、东莨菪碱、山莨菪碱和樟柳碱等莨菪烷生物碱药品，是医疗机构最常用的药物之一，有扩瞳、解痉、抑制中枢、兴奋呼吸、活跃微循环和解磷毒等诸方面的作用。作为药物的同时，部分莨菪烷烃类生物碱的毒性较强，过量使用会出现昏迷乃至死亡的现状，甚至被应用于犯罪，中毒症状一般会出现幻觉、痉挛等，而目前中毒的鉴定以及评价技术还不成熟，对莨菪烷类生物碱对生物的负面效应同样不是很清晰，所以建立一种合理的药物毒性评价体系至关重要。


技术实现要素：

3.本发明提供了一种基于斑马鱼模型对莨菪烷烃类药物进行毒性评价的方法，该方法能够利用斑马鱼幼鱼和成鱼综合评价莨菪烷烃类药物毒性大小。
4.本发明的技术方案如下：
5.一种基于斑马鱼模型对莨菪类药物进行毒性评价的方法，包括以下步骤：
6.(1)配制莨菪类药物溶液；
7.(2)采用所述的待测样对斑马鱼胚胎、斑马鱼幼鱼和斑马鱼成鱼进行处理，并进行毒性评价；
8.所述毒性反应结果包括斑马鱼幼鱼胚胎发育毒性结果，斑马鱼幼鱼行为学毒性结果和斑马鱼成鱼行为学毒性结果；
9.(3)根据所述毒性反应结果得到莨菪类药物的毒性数据。
10.所述的毒性评价包括(a)斑马鱼幼鱼胚胎发育毒性评价；(b)斑马鱼幼鱼行为学毒性评价,采集斑马鱼幼鱼的自发运动情况，并进行行为学数据处理；(c)斑马鱼成鱼行为学毒性评价,采集斑马鱼成鱼的自发运动情况，并进行行为学数据处理。
11.作为优选，所述的斑马鱼幼鱼为鱼龄为6天的斑马鱼，斑马鱼成鱼为鱼龄为6个月的斑马鱼。
12.作为优选，步骤(1)中，待测莨菪烷烃类药物包括：(
‑
)莨菪碱、阿托品、东莨菪碱、(
‑
)东莨菪碱氢溴酸盐、消旋山莨菪碱、氢溴酸樟柳碱、α
‑
托品醇和莨菪亭。
13.作为优选，步骤(2)中，在显微镜下观察记录各实验组斑马鱼心脏、脑部、耳、下颌、眼、肝脏、肠道、躯干/尾/脊索、肌肉/体节、鳍、体长、身体着色、循环系统、身体水肿和出血等毒性反应情况，统计各实验组的毒性发生率，并对典型毒性器官进行拍照。
14.作为优选，步骤(2)中，采集斑马鱼幼鱼的自发运动情况，在全暗环境下和明暗交替环境下进行。
15.作为进一步的优选，步骤(2)中，daniovision高通量鱼类行为跟踪系统中，采用ethovision xt10.0软件追踪采集40min内斑马鱼幼鱼的自发运动情况。
16.作为优选，步骤(2)中，所述的明暗交替环境下具体为：5min全亮环境，然后5min全暗环境，重复循环2次。
17.作为优选，步骤(2)中，所述的自发运动情况包括游动轨迹、游动平均距离、游动最大速度、最大加速度、形态变化、死亡特征点。
18.作为优选，步骤(2)中，采集斑马鱼成鱼的自发运动情况，在全亮环境下进行。
19.作为进一步的优选，步骤(2)中，系统拍摄自发运动20min，采用ethovision xt10.0软件追踪采集20min内斑马鱼成鱼的自发运动情况；
20.作为优选，步骤(2)中，所述的自发运动情况包括游动轨迹、游动平均距离、游动最大速度、最大加速度、形态变化、死亡特征点。
21.作为优选，步骤(3)中，所述的莨菪类药物的毒性数据由斑马鱼幼鱼胚胎发育毒性结果、斑马鱼幼鱼行为学毒性结果和斑马鱼成鱼行为学毒性结果综合进行判断。
22.同现有技术相比，本发明的有益效果体现在：
23.本发明采用斑马鱼作为生物模型，能够利用斑马鱼幼鱼和成鱼综合评价莨菪烷烃类药物毒性大小，并且处理方法简单、快速，便于操作。
附图说明
24.表1为实施例1中莨菪烷烃类药物对斑马鱼胚胎急性毒性发生率的影响；
25.图1为实施例1中(
‑
)莨菪碱对斑马鱼行为毒性“浓度
‑
死亡率”效应曲线；
26.图2为实施例1中(
‑
)莨菪碱对斑马鱼运动功能的抑制作用；
27.图3为实施例1中明暗交替环境下不同浓度(
‑
)莨菪碱溶液对斑马鱼游动运动速度的影响；
28.图4～22为实施例2～8中不同莨菪烷烃类药物对斑马鱼行为毒性“浓度
‑
死亡率”效应曲线，对斑马鱼运动功能的抑制作用，明暗交替环境下不同莨菪烷烃类药物溶液对斑马鱼游动运动速度的影响；
29.图23为实施例1～8中不同莨菪烷烃类药物对斑马鱼幼鱼的行为抑制能力；
30.图24为实施例1～8中不同莨菪烷烃类药物对斑马鱼成鱼的行为抑制能力。
具体实施方式
31.以下通过具体实施例对本发明做进一步的描述，本发明所用的材料与设备如下。
32.实验动物：
33.本研究中所使用的亲代斑马鱼均为实验室饲养的野生型ab品系斑马鱼(wt/ab)，购自上海吉荧生物技术有限公司，实验中从国家斑马鱼中心购置补充种鱼，避免近亲繁殖。本实验所需的所有胚胎、幼鱼都采用健康6月龄种鱼产卵、孵化的方式获取。
34.斑马鱼养殖条件，水环境ph控制在7.0至8.0，水温控制在28℃左右，离子强度500
‑
1500，一天内的明暗时间比为7:5。每天用丰年虾喂食2至3次。
35.仪器与设备：
36.zw
‑
h3000显微镜(中微科创，深圳)、ethovision xt 7.0行为检测系统(诺达思，荷兰)、pacific ro超纯水机(赛默飞世尔，美国)恒温培养箱(龙跃，上海)、自动水循环养殖系统(自制)、高压灭菌锅(赛默飞世尔，美国)、电子分析天平(赛多利斯，德国)、孵化盒(海圣，上海)、移液枪(艾本德，德国)、ms1 minshaker(ika)型涡旋振荡器、bsa224s
‑
cw(sartorius)型分析天平、96孔圆孔板、96孔方孔板、培养皿、吸管等。
37.试剂：
38.e3培养液：分别称取nacl 17.2g、kcl 0.76g、cacl
2 2.91g、mgso4·
7h2o 4.9g，用双蒸水h2o溶解后配置成1l的e3培养液。
39.(1)斑马鱼胚胎急性毒性实验溶液浓度：
40.(
‑
)莨菪碱：35μg/ml(1/9mnlc)、104μg/ml(1/3mnlc)、313μg/ml(mnlc)和350μg/ml(lc10)；
41.阿托品：43μg/ml(1/9mnlc)、129μg/ml(1/3mnlc)、388μg/ml(mnlc)和411μg/ml(lc10)；
42.东莨菪碱：82μg/ml(1/9mnlc)、246μg/ml(1/3mnlc)、738μg/ml(mnlc)和762μg/ml(lc10)；
43.(
‑
)东莨菪碱氢溴酸盐：222μg/ml(1/9mnlc)、667μg/ml(1/3mnlc)和2000μg/ml(mnlc)；
44.消旋山莨菪碱：222μg/ml(1/9mnlc)、667μg/ml(1/3mnlc)和2000μg/ml(mnlc)；
45.氢溴酸樟柳碱：222μg/ml(1/9mnlc)、667μg/ml(1/3mnlc)和2000μg/ml(mnlc)；
46.α
‑
托品醇：66μg/ml(1/9mnlc)、199μg/ml(1/3mnlc)、598μg/ml(mnlc)和752μg/ml(lc10)；
47.莨菪亭：2.1μg/ml(1/9mnlc)、6.2μg/ml(1/3mnlc)、18.5μg/ml(mnlc)和25.8μg/ml(lc10)。
48.(2)斑马鱼幼鱼行为毒性实验溶液浓度：
49.莨菪烷烃类药物溶液：配制不同浓度的莨菪烷烃类药物溶液工作液。其中针对不溶于水的药物，加入dmso助溶剂，保证dmso在最终的溶液中含量为均为0.1％。
50.(3)斑马鱼成鱼行为毒性实验溶液浓度：
51.莨菪烷烃类药物溶液：配制2000mg/l的莨菪烷烃类药物溶液工作液。其中针对不溶于水的药物，加入dmso助溶剂，保证dmso在最终的溶液中含量为均为0.1％。
52.一般实验方法：
53.(1)斑马鱼胚胎急性毒性实验
54.随机选取150尾受精后2天(2dpf)野生型ab品系斑马鱼于六孔板中，每孔(实验组)30尾，分别水溶给予莨菪烷烃类药物溶液不同浓度，同时设置正常对照组(e3缓冲液处理)，每孔(实验组)容量为3ml。28℃培养箱连续孵育斑马鱼3天，每天观察统计各实验组的斑马鱼死亡数量并及时移除。实验结束后，在显微镜下观察记录各实验组斑马鱼心脏、脑部、耳、下颌、眼、肝脏、肠道、躯干/尾/脊索、肌肉/体节、鳍、体长、身体着色、循环系统、身体水肿和出血等毒性反应情况，统计各实验组的毒性发生率，并对典型毒性器官进行拍照。
55.(2)斑马鱼幼鱼行为毒性实验
56.随机选取300尾受精后5天(5dpf)野生型ab品系斑马鱼于六孔板中，每孔(实验组)30尾，分别水溶给予莨菪烷烃类药物溶液，同时设置正常对照组(e3缓冲液处理)，每孔(实验组)容量为3ml，平行一次实验。28℃培养箱孵育斑马鱼1天后，用行为分析仪分析各实验组斑马鱼在20min光暗周期刺激下(即：黑暗5min、光照5min一个周期，交替2个周期)的运动速度，以运动距离和运动速度的统计学分析结果评价莨菪烷烃类药物溶液对斑马鱼的行为毒性。
57.(3)斑马鱼成鱼行为毒性实验
58.每浓度组随机选取12尾6月龄的ab品系雄性斑马鱼成鱼，通过腹腔注射给予莨菪烷烃类药物溶液，同时设置正常对照组(e3缓冲液处理)，注射后立即放至测试缸中，拍摄20min的运动视频，用行为分析仪分析各实验组斑马鱼在20min内的运动距离以及运动速度，以运动距离和运动速度的统计学分析结果评价莨菪烷烃类药物溶液对斑马鱼的行为毒性。
59.斑马鱼幼鱼的获取：
60.斑马鱼幼鱼的观察能够实现高通量，结合相关文献报道的斑马鱼幼鱼行为学能力的发育情况，本实验使用鱼龄为6天(6dpf)的斑马鱼进行实验。斑马鱼胚胎采用种鱼产卵的方式获取。在使用斑马鱼幼鱼之前的第七天的晚上挑选6个月左右健康成熟的wt/ab系成年雌雄斑马鱼，按照雄雌比2:1放入产卵缸(雌雄斑马鱼用隔板分开)，将交配缸转移至黑暗环境中，14h后抽去隔板，将孵化盒转移到光照环境中，使雌鱼与雄鱼交配。约20min后获取胚胎并将其转移至培养皿。用e3溶液冲洗胚胎2
‑
3次，将收集好的胚胎放入28℃恒温培养箱备用。及时剔除已经发白死亡的鱼卵。
61.斑马鱼幼鱼的处理方法：
62.将96孔板置于daniovision高通量鱼类行为跟踪系统中，采用ethovision xt10.0软件追踪采集40min内斑马鱼幼鱼的自发运动情况，以此作为依据统计游动轨迹、游动平均距离、游动最大速度、最大加速度、形态变化、死亡特征点。记录死亡数量，记录异常行为，使用软件采集各组幼鱼的行动轨迹，进行行为学数据处理。
63.数据处理方法
64.实验数据运用spass 16.0软件的单因素方差进行处理，计算每种莨菪烷烃类药物造成斑马鱼行为能力显著差异的浓度。
65.实施例1
66.(1)斑马鱼胚胎急性毒性实验
67.随机选取150尾受精后2天(2dpf)野生型ab品系斑马鱼于六孔板中，每孔(实验组)30尾，分别水溶给予(
‑
)莨菪碱35、104、313和350μg/ml浓度，同时设置正常对照组(e3缓冲液处理)，每孔(实验组)容量为3ml。28℃培养箱连续孵育斑马鱼3天，每天观察统计各实验组的斑马鱼死亡数量并及时移除。实验结束后，在显微镜下观察记录各实验组斑马鱼心脏、脑部、耳、下颌、眼、肝脏、肠道、躯干/尾/脊索、肌肉/体节、鳍、体长、身体着色、循环系统、身体水肿和出血等毒性反应情况，统计各实验组的毒性发生率，并对典型毒性器官进行拍照。试验结果见图1和表1，图1为(
‑
)莨菪碱对斑马鱼行为毒性“浓度
‑
死亡率”效应曲线，表1为(
‑
)莨菪碱对斑马鱼幼鱼急性毒性发生率统计。
68.(2)斑马鱼幼鱼行为毒性实验
69.随机选取300尾受精后5天(5dpf)野生型ab品系斑马鱼于六孔板中，每孔(实验组)30尾，分别水溶给予(
‑
)莨菪碱27、82、246和298μg/ml浓度，同时设置正常对照组(e3缓冲液处理)，每孔(实验组)容量为3ml，平行一次实验。28℃培养箱孵育斑马鱼1天后，用ethovisionxt10.0软件追踪采集40min内斑马鱼幼鱼的自发运动情况，分析各实验组斑马鱼在(1)20min暗环境的运动距离；(2)20min光暗周期刺激下(即：黑暗5min、光照5min一个周期，交替2个周期)的运动速度，以此作为依据统计游动轨迹、游动平均距离、游动最大速度、最大加速度、形态变化、死亡特征点。记录死亡数量，记录异常行为，使用软件采集各组幼鱼的行动轨迹，进行行为学数据处理，试验结果见图2，图3，图2为(
‑
)莨菪碱对斑马鱼运动功能的抑制作用，图3为每个光暗周期下不同浓度(
‑
)莨菪碱溶液对斑马鱼游动运动速度的影响。
70.(3)斑马鱼成鱼行为毒性实验
71.随机选取12尾6月龄的ab品系雄性斑马鱼成鱼，通过腹腔注射给予(
‑
)莨菪碱2000μg/ml浓度，同时设置正常对照组(e3缓冲液处理)，注射后立即放至测试缸中，拍摄20min的运动视频，用行为分析仪分析各实验组斑马鱼在20min内的运动距离以及运动速度，以运动距离和运动速度的统计学分析结果评价莨菪烷烃类药物溶液对斑马鱼的行为毒性。
72.实验结果表明，根据(
‑
)莨菪碱的“浓度
‑
死亡率”原始数据，经originpro 8.0软件拟合得出(
‑
)莨菪碱的mnlc和lc10分别为246和298μg/ml。(
‑
)莨菪碱对斑马鱼的毒性靶器官为肝脏、心脏、肾脏、下颌和眼睛，主要毒性表型为肝脏变性、卵黄囊吸收延迟、心包水肿、肾性水肿、下颌异常和眼睛异常。斑马鱼幼鱼在接触(
‑
)莨菪碱溶液后，在明暗交替的检测环境下(10min亮+10min暗，重复循环2次)，呈现出浓度相关的行为学能力。在接触(
‑
)莨菪碱20
‑
40min内，我们发现结果呈现出随着浓度上升，移动距离下降的规律。当(
‑
)莨菪碱浓度超过500mg/l时，斑马鱼幼鱼的行为学能力显著下降，有统计学意义。更高浓度的(
‑
)莨菪碱溶液，斑马鱼幼鱼的行为学能力下降更明显。成鱼腹腔注射(
‑
)莨菪碱后，与正常对照组(e3缓冲液处理)相比，行为能力明显下降。
73.实施例2～8
74.本实施例操作方法与实施例1基本相同，分别采用阿托品、东莨菪碱、(
‑
)东莨菪碱氢溴酸盐溶液、消旋山莨菪碱溶液、氢溴酸樟柳碱溶液、α
‑
托品醇溶液和莨菪亭溶液作为测试药物，结果见图4～24和表1，其中，图4(
‑
)阿托品对斑马鱼行为毒性“浓度
‑
死亡率”效应曲线，图5为阿托品对斑马鱼运动功能的影响，图6为阿托品对斑马鱼每分钟运动速度的影响，图7为东莨菪碱对斑马鱼急性毒性“浓度
‑
死亡率”效应曲线，图8为东莨菪碱对斑马鱼运动功能的影响，图9为东莨菪碱对斑马鱼每分钟运动速度的影响，图10为(
‑
)东莨菪碱氢溴酸盐对斑马鱼运动功能的影响，图11为(
‑
)东莨菪碱氢溴酸盐对斑马鱼每分钟运动速度的影响，图12为消旋山莨菪碱对斑马鱼行为毒性“浓度
‑
死亡率”效应曲线，图13为消旋山莨菪碱对斑马鱼运动功能的影响，图14为消旋山莨菪碱对斑马鱼每分钟运动速度的影响，图15为氢溴酸樟柳碱对斑马鱼运动功能的影响，图16为氢溴酸樟柳碱对斑马鱼每分钟运动速度的影响，图17为α
‑
托品醇对斑马鱼急性毒性“浓度
‑
死亡率”效应曲线，图18为α
‑
托品醇对斑马鱼运动功能的影响，图19为α
‑
托品醇对斑马鱼每分钟运动速度的影响，图20为莨菪亭对斑马鱼急性毒性“浓度
‑
死亡率”效应曲线，图21为莨菪亭对斑马鱼运动功能的影响，与溶剂对照组比较，***p<0.001，图22为莨菪亭对斑马鱼每分钟运动速度的影响，图23为莨菪烷烃
类药物对斑马鱼幼鱼的行为抑制能力，图24为莨菪烷烃类药物对斑马鱼成鱼的行为抑制能力。
75.