一种温控型纳米药物释放系统及其应用

1.本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及一种温控型纳米药物释放系统及其应用。


背景技术：

2.肿瘤是当今社会威胁人类健康的主要疾病之一，全世界每年都会消耗大量的人力物力用于相关的治疗研究工作。常见的浅表肿瘤(发生在身体浅表部位的肿瘤)包括黑色素瘤、乳腺癌、脂肪瘤等。浅表肿瘤的常规治疗方法是手术切除，通过直接切除肿瘤及周边组织可以快速达到疗效，但是较大范围的组织切除容易引起术后伤口感染、愈合困难等现象。
3.为避免手术治疗带来的问题，温热疗法被广泛用于治疗浅表肿瘤，温热疗法是利用正常细胞与癌细胞的耐受温度不同，通过加热病灶部位(把温度确定在对癌细胞杀伤性最强且对正常细胞损伤最弱的范围)来杀死肿瘤细胞。通常采用红外线灯、热敷、热浴等方式直接作用于皮肤表面，利用热传递效应将目标组织的温度升至42℃以上。因此，温热疗法是一种原理易懂，操作简单的治疗方法。但是，温热疗法对浅表肿瘤的治疗同样存在问题，如采用较高温度的温热疗法，高温在杀死癌细胞的同时，也会对正常组织造成损伤；而治疗温度较低，可能对癌细胞杀伤不够，达不到治疗目的。
4.因此，提高温热疗法治疗浅表肿瘤的效果，是目前肿瘤研究工作急需攻克的难题。


技术实现要素：

5.针对现有技术中存在的上述问题，本发明提供了一种温控型纳米药物释放系统及其应用，在利用温热疗法治疗浅表肿瘤时，辅以温控型纳米药物载体搭载肿瘤药物的给药方式，精准且有效的提高温热疗法治疗浅表肿瘤的效果。
6.第一方面，本发明提供了一种温控型纳米药物释放系统，所述纳米药物释放系统包括：组分a和组分b；
7.其中，所述组分a为以dna四面体结构为主体，通过连接温敏型dna茎环结构而得到的温控型纳米药物载体；所述组分b为游离dna单链。
8.优选地，所述组分a的制备方法，包括：
9.将编号分别为th-a、th-b、th-c、th-d的四条dna长链进行等比例混合，然后加入1
×
pbs溶液，混合均匀后，置于pcr仪内，经退火反应自组装制得。
10.优选地，所述四条dna长链的浓度均为1um。
11.优选地，所述1
×
pbs溶液的ph＝7.4；所述1
×
pbs溶液由136.89mm nacl、2.67mm kcl、8.1mm na2hpo4和1.76mm kh2po4混合组成。
12.优选地，所述编号为th-a的dna长链的核苷酸序列见seq id no：1；
13.所述编号为th-b的dna长链的核苷酸序列见seq id no：2；
14.所述编号为th-c的dna长链的核苷酸序列见seq id no：3；
15.所述编号为th-d的dna长链的核苷酸序列见seq id no：4。
16.优选地，所述温敏型dna茎环结构在45℃时，在所述游离dna单链的作用下，由闭合状态转变为打开状态。
17.优选地，所述游离dna单链的核苷酸序列见seq id no：5。
18.优选地，所述游离dna单链的浓度为6um。
19.第二方面，本发明提供一种温控型纳米药物释放系统的应用，所述纳米药物释放系统响应浅表肿瘤组织的温度变化，靶向释放治疗药物于所述浅表肿瘤组织处。
20.与现有技术相比，本技术包括以下优点：
21.(1)本发明提供的纳米药物释放系统利用肿瘤组织与健康组织间存在温度差异，设计使纳米药物释放系统具备响应温度变化的能力，在正常组织周围时，携带治疗药物的温敏型dna茎环结构部分处于闭合状态，在肿瘤组织环境时，携带治疗药物的温敏型dna茎环结构部分处于打开状态，使治疗药物靶向释放到肿瘤组织处，有效降低了药物对正常组织的毒副作用，进一步提高肿瘤治愈效果。
22.(2)本发明选择dna纳米材料来设计治疗浅表肿瘤的药物释放系统，其中，以dna四面体结构作为主体结构，因其具有天然的生物相容性和细胞穿透能力，可携带载药后的温敏型dna茎环结构，通过细胞内吞作用穿透细胞膜进入活细胞，使dna茎环结构顺利响应肿瘤组织与健康组织间的温度差异，完成治疗药物靶向释放到肿瘤组织处的任务。
附图说明
23.图1示出了本发明实施例提供的温控型纳米药物释放系统中，温控型纳米药物载体的结构示意图；
24.图2示出了本发明实施例提供的温控型纳米药物释放系统中，温敏型dna茎环结构靶向定位肿瘤细胞过程示意图；
25.图3示出了本发明实施例提供的温控型纳米药物释放系统中，dna茎环结构随温度变化的解链程度曲线图。
具体实施方式
26.提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。
27.实施例中未注明具体实验步骤或者条件，按照本领域内的现有技术所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂以及其他仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
28.为进一步提高非手术手段治疗浅表肿瘤的疗效，减小全身给药产生的副作用，本发明提出的技术构思为：以dna为原材料，构建一种温控型纳米药物释放系统。其中，以dna四面体连接温敏型dna茎环结构，构成药物释放系统的核心部分。该系统可根据温度变化作出自动响应(载有药物的温敏型dna茎环结构在预设温度下，自动结合游离dna单链，使茎环结构由闭合状态转变为打开状态，将适配在闭合茎环结构上的治疗药物靶向释放到具有较高温度的肿瘤组织处，从而减少药物对正常组织细胞的损伤，与温热疗法配合使用，能进一
步提高肿瘤的治疗效果。基于上述技术构思，发明人提供了一种温控型纳米药物释放系统及其应用，具体实施内容如下：
29.第一方面，本发明实施例提供了一种温控型纳米药物释放系统，该纳米药物释放系统包括：组分a和组分b；
30.其中，组分a为以dna四面体结构为主体，通过连接温敏型dna茎环结构而得到的温控型纳米药物载体；
31.组分b为游离dna单链。
32.具体实施时，发明人对肿瘤细胞的代谢过程了解后发现，肿瘤细胞的代谢过程不同于正常细胞，它既可以通过糖酵解和氧化磷酸化之间的转换来适应代谢环境的改变，也可以通过细胞分泌等作用，改变周围的环境使其有利于肿瘤的生长和发展。这些代谢途径一方面提高了肿瘤组织附近免疫反应的强度，使其产生大量热量，另一方面，肿瘤组织需要更多的营养供应，故而血管较多且分布杂乱，这导致肿瘤组织的散热性较差，使肿瘤组织附近出现“内源性”的温度偏高现象，肿瘤组织的温度高于健康组织。加之，采用温热疗法治疗浅表肿瘤时(把温度确定在对癌细胞杀伤性最强且对正常细胞损伤最弱的范围)，也会使目标组织的温度升至42℃-45℃，产生“外源性”的温度偏高现象，从而杀死肿瘤细胞。
33.此外，现有药物给药方式中，使用的纳米药物载体一般是在表面修饰特异性识别基团，识别基团会随机与正常细胞发生非特异性结合，最终导致药物载体在目标细胞附近的聚集效率不高；常规的纳米结构载体在人体可适应的温度范围内均具有结构稳定的特点，无法响应微小的体温变化，无法改变纳米载体空间构象以控制药物的释放无法对这种广泛存在的温差现象做出响应，从而限制了纳米药物载体的有效性和可靠性。
34.因此，在具体实施时，发明人希望在温热疗法的基础上再结合能够响应温度变化载体给药方式，向处于较高温度的肿瘤细胞，进行靶向释放药物，进一步提高温热疗法治疗浅表肿瘤治疗效果。
35.具体实施时，本发明提供的温控型纳米药物释放系统中，dna茎环结构具有特殊的温度敏感特性。该茎环结构是一条两端序列互补的长链，常温下，该茎环结构的两端发生配对形成一个具有闭合空腔的特殊结构，但在较高温度下时，该特殊结构会解链恢复至单链的状态。
36.具体实施时，由于单独的dna茎环结构自身粒径较小，作为载药体时，容易被代谢排除体外，难以发挥出具体的疗效。因此，发明人将粒径较小的dna茎环结构与粒径较大、稳定性更强的dna四面体结构相连接，以增加dna茎环结构的粒径和结构的稳定性，防止载药的dna茎环结构被代谢排除体外而无法到达病患处。本发明提供的温控型纳米药物释放系统中，dna四面体结构因其可通过细胞内吞作用穿透细胞膜进入活细胞，而无需使用任何配体或转染剂，具有优异的细胞膜通透性。同时，dna四面体结构以dna双链为主体，可有效抵抗核酸酶和蛋白酶的攻击而不被其水解，具有长时间保持结构完整性和稳定性的能力。因此，以dna四面体结构为主体，通过连接dna茎环结构而得到的温控型纳米药物载体，能够保证dna茎环结构的完整性和稳定性，使dna茎环结构顺利响应肿瘤组织与健康组织间的温度差异，完成治疗药物靶向释放到肿瘤组织处的任务。
37.图1示出了本发明实施例提供的温控型纳米药物释放系统中，温控型纳米药物载体的结构示意图，如图1所示，本发明借助dna四面体结构具有较好的生物相容性、易修饰、
易功能化等独特优点，在序列设计阶段，通过碱基配对方法，将温敏型dna茎环结构简单高效的连接在dna四面体结构上。其中，温度敏感型dna茎环结构在其碱基序列中预留一段区域，设置为核酸适配体的相关序列，得到温控型纳米药物载体，在其茎环结构处于打开状态时可以实现适配体的相关功能。使该温控型纳米药物载体同时具备长时间保持结构完整性和稳定性的能力和温度自适应的功能。
38.具体实施时，温控型纳米药物载体与一定浓度的游离dna单链混合即构成温度控制的智能药物释放系统，该系统可通过对体内环境温度的监测，在判定所处环境是肿瘤组织后，通过温敏型dna茎环结构的构象变化(由闭合状态转变为打开状态)，靶向结合肿瘤细胞并引发细胞内吞，完成体温变化控制的智能药物释放。
39.图2示出了本发明实施例提供的温控型纳米药物释放系统中，温敏型dna茎环结构靶向定位肿瘤细胞过程示意图。如图2所示，茎环结构由一条较长的dna单链构成，单链分为两个部分，虚线部分为功能核酸分子序列，双实线部分为与虚线部分互补配对的序列。在较低的温度环境下，长单链两端自配对，形成茎环结构。当环境温度升高时，茎环结构可以与一条特定序列的dna反应，形成一段双链结合区域，茎环结构由闭合状态转变为打开状态，功能核酸分子序列被释放，与靶标分子发生结合作用。
40.具体实施时，优选地，组分a的制备方法，包括：
41.将编号分别为th-a、th-b、th-c、th-d的四条dna长链进行等比例混合，然后加入1
×
pbs溶液，混合均匀后，置于pcr仪内，经退火反应自组装制得。
42.具体实施时，优选地，四条dna长链的浓度均为1um。
43.具体实施时，优选地，1
×
pbs溶液的ph＝7.4；1
×
pbs溶液由136.89mm nacl、2.67mm kcl、8.1mm na2hpo4和1.76mm kh2po4混合组成。
44.具体实施时，优选地，编号为th-a的dna长链的核苷酸序列见seq id no：1；
45.所述编号为th-b的dna长链的核苷酸序列见seq id no：2；
46.所述编号为th-c的dna长链的核苷酸序列见seq id no：3；
47.所述编号为th-d的dna长链的核苷酸序列见seq id no：4。
48.具体实施时，优选地，温敏型dna茎环结构在45℃时，在游离dna单链的作用下，由闭合状态转变为打开状态。
49.具体实施时，本发明提供的温控型纳米药物释放系统，在正常体温环境下药物载体处于非活跃状态，有效减少正常细胞对药物载体的内吞作用；在温度较高的肿瘤组织附近，纳米药物载体随着温度升高而被激活，通过药物载体构象的变化，完成与肿瘤组织的特异性结合。
50.具体实施时，温敏型dna茎环结构解链的温度由碱基序列所决定，不同碱基序列构成的茎环具有完全不同的温度曲线。
51.图3示出了本发明实施例提供的温控型纳米药物释放系统中，dna茎环结构随温度变化的解链程度曲线图。如图3所示，本发明提供的温控型纳米药物释放系统中，dna茎环结构经过序列的优化设计，fam荧光基团与bhq1淬灭基团分别修饰在茎环区域的两端，经dna组装而成的药物载体发生的空间构象变化可以引起荧光信号的变化：当温度低于37℃时，茎环处于闭合状态，茎环两端的荧光基团fam和猝灭基团bhq1空间距离较近，荧光信号被猝灭；当温度升高至约45℃时，游离dna单链与茎环结合，茎环处于打开状态，茎环两端的荧光
基团和猝灭基团空间距离增大，猝灭作用逐渐消失，体系产生较强的荧光信号。通过监测荧光信号的变化，可以实时反映纳米载体的药物释放情况。具体实施时，dna茎环结构在37℃时，可以控制解链百分比为24％左右，温度达到45℃时，dna茎环结构处于完全打开的状态，这样的反应温度节点与肿瘤相关的体温变化情况具有一定的相似性，即健康组织所处的正常体温37℃条件下，茎环处于闭合状态，对于肿瘤组织的内源性或外源性升温至45℃条件下，茎环处于打开状态。茎环结构的闭合与打开状态，对应不同的纳米结构构象，以此为基础，构建基于体温变化的智能控释纳米装置。
52.具体实施时，优选地，游离dna单链的核苷酸序列见seq id no：5。
53.具体实施时，优选地，游离dna单链的浓度为6um。
54.第二方面，本发明提供一种温控型纳米药物释放系统的应用，该纳米药物释放系统响应浅表肿瘤组织的温度变化，靶向释放治疗药物于浅表肿瘤组织处。
55.具体实施时，以dna四面体结构作为纳米药物载体的主体结构，以温度敏感型茎环结构作为功能元件，将两者结合能够构建具有温度变化控制的纳米药物释放系统，该纳米药物释放系统响应浅表肿瘤组织的温度变化，靶向释放治疗药物于浅表肿瘤组织处，有效降低一般纳米药物全身给药的副作用、提高对于浅表肿瘤温热疗法的治疗效果。
56.为使本领域技术人员更加清楚地理解本发明，现通过以下实施例对本发明所述方法进行详细说明。
57.实施例1：
58.(1)对订购的，编号为th-a、th-b、th-c和th-d的，干粉状态的dna单链进行溶解和浓度测量。
59.首先，将干分状的，编号为th-a的dna分子离心，具体操作为，以8000rpm的转速离心3min。离心后小心取出样品管，加入适量去离子水(添加量在包装管壁有标明)，涡旋震荡3min，使用手握式离心机将溶液收集至管底，用于测量溶解dna的浓度。
60.然后，使用thermo nanodrop微量分光光度计测量溶液o.d.值，用无水乙醇清洁样品台，滴2μl去离子水作为空白对照。测试dna分子在260nm波长处的o.d.值，并根据其分子量，计算dna分子的浓度。
61.最后，对编号为th-b、th-c和th-d的四条dna长链，使用上述对编号为t1的dna单链相同的方法进行溶解和浓度测量。
62.(2)温控型纳米药物释放系统的制备
63.将四条dna长链th-a、th-b、th-c和th-d等比例混合在1
×
pbs溶液(136.89mm nacl；2.67mm kcl；8.1mm na2hpo4；1.76mm kh2po4；ph＝7.4)中，每条链的浓度均为1um，混合物分装至pcr管(容积200μl的ep管)，按照设定变温程序完成退火。退火完成后加入dna短链cs，使其与长链浓度比为6∶1，具体序列如表1所示，其中，th-a、th-b、th-c和th-d四条长链的5’端以及中间适当位置均有fam荧光基团和bhq1猝灭基团修饰，混合溶液即得到温控型纳米药物释放系统，保存在4℃环境下。
64.表1：dna四面体序列设计
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