一种中药组合物、制备方法及其在制备治疗肝损伤的药物中的应用

1.本发明涉及中药技术领域，尤其涉及一种中药组合物、制备方法及其在制备治疗肝损伤的药物中的应用。


背景技术：

2.胆汁淤积性肝病是由各种原因引起的胆汁生成、分泌和排泄障碍，不能主动经胆小管排至肠腔，在肝内淤积，反流入血，而引起的一系列器质性损害、代谢失调和功能紊乱的肝胆系统疾病。胆汁淤积包括胆红素、胆汁酸盐及其他成分分泌和排泄障碍。病因主要包括遗传、免疫、变性、感染、结石及肿瘤等。本病可累及从两个相邻肝细胞形成的胆小管到十二指肠壶腹之间整个胆道系统的任何部分，可分为肝内胆汁淤积和肝外胆汁淤积。肝内胆汁淤积常见原因有病毒性肝炎、药物性肝病和原发性胆汁性肝硬化、原发性硬化性胆管炎等。肝外胆汁淤积由胆道的机械性梗阻引起，常见原因有胆总管结石、胆囊癌、胆管细胞癌等。
3.内镜、放射介入和手术是目前治疗肝外胆汁淤积性疾病的有效方法，但治疗过程会使患者感到不适；目前存在少数药剂与治疗肝外胆汁淤积性疾病有关，但是需要其他手段配合治疗，且效果较差。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种中药组合物、制备方法及其在制备治疗肝损伤的药物中的应用，对胆汁淤积性肝病具有显著疗效。
5.为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
6.本发明提供了一种中药组合物，由包含如下质量份数的原料制备得到：
7.醋鳖甲12～16份、佛手柑8～12份、桑葚13～16份、三七4～6份、黄连5～7份、黄芩8～12份、虎杖8～12份、白花蛇舌草13～18份、石斛4～6份、大黄4～6份。
8.优选的，醋鳖甲13～15份、佛手柑9～11份、桑葚14～15份、三七4.5～5.5份、黄连5.5～6.5份、黄芩9～11份、虎杖9～11份、白花蛇舌草14～17份、石斛4.5～5.5份、大黄4.5～5.5份。
9.本发明还提供了一种中药组合物的制备方法，其特征在于，包含如下步骤：
10.(1)将所有原料混合，进行第一水提处理，得到一次提取液以及一次药渣；
11.(2)将所得一次药渣进行第二水提处理，得到二次提取液以及二次药渣；
12.(3)将所得二次药渣进行第三水提处理，得到三次提取液以及三次药渣；
13.(4)将所得一次提取液、二次提取液和三次提取液合并浓缩，得到浓缩液；
14.(5)将所得浓缩液与无水乙醇混合离心，得到上清液；
15.(6)蒸发所得上清液中的无水乙醇得到药液，调节药液浓度至0.5～1.5g/ml。
16.优选的，所述第一水提处理、第二水提处理和第三水提处理独立的采用8～12倍原
料重量的水煎煮0.5～1.5h。
17.优选的，步骤4中所述浓缩液的浓度为0.5～1.5g/ml。
18.优选的，步骤5中所述浓缩液与无水乙醇的体积比为1∶2～4。
19.优选的，步骤5中所述浓缩液与无水乙醇混合后进行磁力搅拌10～14h。
20.优选的，步骤5中所述离心的离心力为20000～30000g，离心时间为10～30min。
21.本发明还提供了一种中药组合物在制备治疗肝损伤的药物中的应用。
22.本发明的技术效果和优点：
23.本发明通过将特定比例的醋鳖甲、佛手柑、桑葚、三七、黄连、黄芩、虎杖、白花蛇舌草、石斛、大黄进行合理配伍，可有效的治疗肝损伤，通过本发明药方治疗后肝细胞排列较为整齐，微脂肪变性和炎症细胞浸润较未治疗组得到显著减轻，且对肝功能具有保护作用，alt、ast含量与未治疗组相比均有统计学差异。代谢分析表明本药方通过abc转运蛋白、初级胆汁酸生物合成等通路实现对肝损伤的治疗。通过本发明中药组合物治疗之后，mda的活性显著降低，而sod的活性明显增高，表明本发明中药组合物对胆汁淤积性肝损伤的保护作用与抗氧化有关。
附图说明
24.图1为组织学观察结果；
25.图2为肝组织样品中差异代谢物kegg通路富集气泡图；
26.图3为治疗前后患者血清mda、sod含量。
具体实施方式
27.本发明提供了一种中药组合物，由包含如下质量份数的原料制备得到：
28.醋鳖甲12～16份、佛手柑8～12份、桑葚13～16份、三七4～6份、黄连5～7份、黄芩8～12份、虎杖8～12份、白花蛇舌草13～18份、石斛4～6份、大黄4～6份。
29.本发明提供的中药组合物的制备原料包含醋鳖甲12～16份，优选为13.5～15.5份，进一步优选为14.5～15份。
30.本发明提供的中药组合物的制备原料包含佛手柑8～12份，优选为8.5～11.5份，进一步优选为9.5～10.5份。
31.本发明提供的中药组合物的制备原料包含桑葚13～16份，优选为13.5～15.5份，进一步优选为14.5～15份。
32.本发明提供的中药组合物的制备原料包含三七4～6份，优选为4.5～5.5份，进一步优选为4.8～5.2份。
33.本发明提供的中药组合物的制备原料包含黄连5～7份，优选为5.5～6.5份，进一步优选为5.9～6.1份。
34.本发明提供的中药组合物的制备原料包含黄芩8～12份，优选为9～11.5份，进一步优选为10.5～11份。
35.本发明提供的中药组合物的制备原料包含虎杖8～12份，优选为8.5～11份，进一步优选为9～10.5份。
36.本发明提供的中药组合物的制备原料包含白花蛇舌草13～18份，优选为12.5～
17.5份，进一步优选为14.5～16份。
37.本发明提供的中药组合物的制备原料包含石斛4～6份，优选为4.5～5.5份，进一步优选为4.7～5.2份。
38.本发明提供的中药组合物的制备原料包含大黄4～6份，优选为4.1～5.8份，进一步优选为5.2～5.6份。
39.在本发明中，对制备原料的炮制方法没有特殊要求，采用常规炮制方式即可。
40.本发明还提供了一种中药组合物的制备方法，包含如下步骤：
41.(1)将所有原料混合，进行第一水提处理，得到一次提取液以及一次药渣；
42.(2)将所得一次药渣进行第二水提处理，得到二次提取液以及二次药渣；
43.(3)将所得二次药渣进行第三水提处理，得到三次提取液以及三次药渣；
44.(4)将所得一次提取液、二次提取液和三次提取液合并浓缩，得到浓缩液；
45.(5)将所得浓缩液与无水乙醇混合离心，得到上清液；
46.(6)蒸发所得上清液中的无水乙醇得到药液，调节药液浓度至0.5～1.5g/ml。
47.在本发明中，所述第一水提处理、第二水提处理和第三水提处理优选为独立的采用8～12倍原料重量的水煎煮0.5～1.5h，本发明中所述水的用量优选为原料重量的8～12倍，进一步优选为9～11倍，所述煎煮的时间优选为0.5～1.5h，进一步优选为0.8～1.2h。
48.在本发明中，步骤(4)所述浓缩优选采用微火进行，所述浓缩液的浓度优选为0.5～1.5g/ml，进一步优选为0.8～1.2g/ml。所述浓缩之后还优选包括冷却至室温。
49.在本发明中，步骤(5)所述浓缩液与无水乙醇的体积比优选为1∶2～4，进一步优选为1∶2.5～3.5。本发明所述浓缩液与无水乙醇混合后还优选包括进行磁力搅拌，所述磁力搅拌的时间优选为10～14h，进一步优选为11～13h，还优选为11.5～12.5h。本发明所述离心的离心力优选为20000～30000g，进一步优选为22000～28000g，还优选为24000～26000g，离心的时间优选为10～30min，进一步优选为15～25min。
50.在本发明中，步骤6所述的蒸发优选为恒温蒸发；所述调节药液浓度优选采用蒸馏水进行调节；本发明所述调节药液浓度之后还优选包括将药液高压灭菌后-20℃冰箱保存。
51.本发明还提供了一种中药组合物在制备治疗肝损伤的药物中的应用，所述肝损伤优选为胆汁淤积性肝损伤；所述药物优选的以本发明中药组合物为唯一活性成分；所述药物优选的还包括辅料，本发明对所述辅料的种类没有特殊限定，采用本领域常规的药物辅料即可；本发明所述的药物剂型优选为散剂、片剂、颗粒剂、胶囊剂、溶液剂、乳剂、混悬剂、注射剂、喷雾剂、气雾剂或粉雾剂等。在本发明中，所述药物包括载体，所述载体优选为口服制剂用的粘合剂、润滑剂、崩解剂、助溶剂、稀释剂、稳定剂、悬浮剂、无色素、矫味剂等；可注射制剂用的防腐剂、加溶剂、稳定剂等；局部制剂用的基质、稀释剂、润滑剂、防腐剂等。
52.本发明实施例中用到的实验动物、试剂来源如下：
53.icr小鼠60只，雌雄各半，体重18～22g，由郑州大学动物实验中心提供；
54.谷丙转氨酶(alt)、谷草转氨酶(ast)，超氧化物歧化酶(sod)和丙二醛(mda)等购试剂盒自南京建成生物工程研究所；
55.代谢组测序交由广州基迪奥科技有限公司完成；
56.胆汁淤积性肝炎患者为河南中医药大学第三附属医院确诊病例。
57.下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解
为对本发明保护范围的限定。
58.实施例1
59.取醋鳖甲15g、佛手柑10g、桑葚15g、三七5g、黄连6g、黄芩10g、虎杖10g、白花蛇舌草15g、石斛5g、大黄5g，用10倍体积水煎1小时，滤取上清，重复水煎过滤3次。合并3次所得药汁，微火浓缩至1g/ml，冷却后加入无水乙醇使其达到总体积的75％，磁力搅拌过夜，25000g离心20分钟，取上清，恒温蒸发尽乙醇，用蒸馏水调药液浓度至1g/ml，高压灭菌后-20℃冰箱保存。
60.实施例2
61.取醋鳖甲12g、佛手柑11g、桑葚14g、三七4.5g、黄连6.5g、黄芩9g、虎杖11g、白花蛇舌草14g、石斛4.5g、大黄5g，用9倍体积水煎1.2小时，滤取上清，重复水煎过滤3次。合并3次所得药汁，微火浓缩至1.2g/ml，冷却后加入无水乙醇使其达到总体积的80％，磁力搅拌过夜，22000g离心15分钟，取上清，恒温蒸发尽乙醇，用蒸馏水调药液浓度至0.7g/ml，高压灭菌后-20℃冰箱保存。
62.实施例3
63.取醋鳖甲15g、佛手柑10g、桑葚15g、三七5g、黄连6g、黄芩10g、虎杖10g、白花蛇舌草15g、石斛5g、大黄5g，用10倍体积水煎1小时，滤取上清，再加10倍体积水煎1小时，重复3次。合并3次所得药汁，微火浓缩至0.8g/ml，冷却后加入无水乙醇使其达到总体积的75％，磁力搅拌过夜，28000g离心25分钟，取上清，恒温蒸发尽乙醇，用蒸馏水调药液浓度至1.2g/ml，高压灭菌后-20℃冰箱保存。
64.实验例1治疗肝损伤作用研究
65.造模实验给药情况、造模次数和时间、剂量等如表1所示：
66.肝纤维化组(a组)：造模型时间为7周，每周周二、周六造模给药各1次。
67.肝硬化组(b组)：造模时间为11周，每周周二、周六造模给药各1次。
68.表1慢性肝损伤造模
[0069][0070]
注：每周两次时间为每周的周二和周六。
[0071]
本发明中药复方干预实验情况如表2所示：按照实施例1中的原料配比后打粉，然后用0.5％cmc(0.5％羧甲基纤维素钠)与中药粉充分混匀制成100mg/ml混悬液，灌胃给药治疗。
[0072]
肝纤维化组(a组)：治疗时间为2周，每日给药1次。
[0073]
肝硬化组(b组)：治疗时间为4周，每日给药1次。
[0074]
表2中药复方干预慢性肝损伤
[0075][0076]
小鼠处死后，取小鼠左侧肝组织用10％福尔马林固定。按4μm厚度切片，切片用苏木精伊红染色用于组织学观察，对照组于饲养7周、11周时进行观察，模型组在造模结束后进行观察，治疗组治疗结束后进行观察。
[0077]
结果如图1所示，对照组(a-c/b-c)小鼠肝组织结构及形态正常，视野内肝细胞排列整齐，中央静脉呈放射状排列，肝细胞胞浆丰富、无水样变性和脂肪变性；
[0078]
模型组(a-m/b-m)肝组织破坏严重，视野内中央静脉周围多有炎症细胞浸润，肝细胞出现点状坏死，胆管周围出现严重胆汁淤积，多现核固缩和点状坏死，形成嗜酸性颗粒，有假小叶形成，大量炎性细胞浸润在小叶内和小叶间，小叶结构已受破坏，肝细胞排列紊乱，出现脂肪变性和水样变性，造模11周(b-m)更为严重；
[0079]
治疗组(a-t/b-t)肝细胞排列较为整齐，微脂肪变性和炎症细胞浸润较模型组(a-m/b-m)减轻。
[0080]
实验例2对肝功能保护作用研究
[0081]
造模、中药复方干预实验组与实验例1相同，造模及治疗结束后，a、b组小鼠分别于最后一次治疗结束24小时后取眼眶血，在4℃条件下4000rpm离心15分钟，取上清液，使用丙氨酸氨基转移酶(alt)，天冬氨酸氨基转移酶(ast)试剂盒检测。
[0082]
采用spss 19.0软件进行数据统计，结果用表示，组内比较采用单因素方差分析(analysis ofvariance，anova)，组间比较采用t检验。p《0.05代表差异有统计学意义，p《0.01代表差异有显著性。
[0083]
治疗轻度肝损伤小鼠结果如表3所示：
[0084]
表3治疗轻度肝损伤小鼠外周血alt、ast含量(卡门氏单位)
[0085][0086]
注:与空白组比较，*p《0.01；与模型组比较，
δ
p《0.01。
[0087]
从表3可知各组间小鼠外周血中alt、ast含量均有统计学差异。模型组、治疗组外周血中alt、ast含量与空白组相比均有统计学差异(p《0.01)；治疗组alt、ast含量与模型组相比亦均有统计学差异(p《0.01)。
[0088]
治疗重度肝损伤小鼠结果如表4所示：
[0089]
表4治疗重度肝损伤小鼠外周血alt、ast含量(卡门氏单位)
[0090][0091]
注:与空白组比较，*p《0.01；与模型组比较，
δ
p《0.01。
[0092]
从表4可知各组间小鼠外周血中alt、ast含量均有统计学差异。模型组、治疗组外周血中alt、ast含量与对照组相比均有统计学差异(p《0.01)；治疗组alt、ast含量与模型组相比亦均有统计学差异(p《0.01)。
[0093]
实验例3治疗肝损伤机制研究
[0094]
造模、中药复方干预实验组与实验例1相同，肝纤维化组和肝硬化组分别于最后一次治疗结束24小时，取眼眶血后，脱臼法处死小鼠。取肝组织快速冻存于液氮，防止样品降解，进行代谢组学研究。利用lc-ms技术研究本发明中药组合物对其代谢组干预作用，具体步骤如下：
[0095]
1.称取50mg上述肝组织样品，加入1000μl提取液(甲醇︰乙晴︰水＝2︰2︰1，v/v，含内标1μg/ml)，涡旋混匀时间30s；
[0096]
2.加入钢珠，45hz研磨处理4min，于冰水浴中使用超声提取5min；
[0097]
3.对步骤2重复3次；
[0098]
4.静置-20℃环境中1h；
[0099]
5.将样品静置后，低温离心(4℃)，转速12000rpm，时间15min；
[0100]
6.取其上清液200μl加入2ml进样瓶，用lc-ms进行分析。
[0101]
为检验分析样本在相同处理方法下的可重复性和稳定性，由同一样本提取物等量
混合制备质控样本(qc)。每检测3个分析样本插入1个质控样本，以监测分析过程的可重复性和稳定性。
[0102]
lc-ms分析的仪器平台由agilent1290超高效液相色谱串联qexactiveorbitrap(thermofisherscientific)高分辨质谱仪组成。所用色谱柱为uplchsst3色谱柱(1.7μm，2.1
×
100mm，waters)。流动相条件：正模式：流动相a：0.1％甲酸水溶液；流动相b：乙腈；负模式：流动相a：5mm醋酸铵水溶液(用氨水调节ph值至9.0)；流动相b：乙腈。洗脱梯度的设置如下：0min，1％b；1min，1％b；8min，99％b；10min，99％b；10.1min，1％b；12min，1％b。流速为0.5ml/min。进样量为2μl。在lc/ms分析中，qe质谱仪用于根据信息依赖性基础(ida)获取ms/ms光谱。在这种模式下，采集软件(xcalibur4.0.27，thermo)在收集和触发基于预选标准的ms/ms光谱采集时持续评估全扫描测量ms数据。esi源条件为：鞘气体流量为45arb，aux气体流量为15arb，毛细管温度为320℃，ms分辨率为70000，ms/ms分辨率为17500，nce模型中碰撞能量为20/40/60ev，喷雾电压为3.8kv(正)或-3.1kv(负)。
[0103]
在正负离子模式下，共分析15238个代谢物，如表5所示：
[0104]
表5各组间检测到代谢物的数量
[0105][0106]
通过差异代谢物的筛选，对这些发病和药物干预相关的代谢物进一步分析，这些差异代谢物富集的前20条通路包括abc转运蛋白、初级胆汁酸生物合成等通路，如图2所示，其中abc转运蛋白有传输牛磺胆酸的作用，其作用失调将导致牛磺胆酸累积，在胆汁中淤积。
[0107]
实验例4与抗氧化相关性研究
[0108]
通过本发明实施例1所得药液对胆汁淤积性肝损伤患者进行治疗，一日一剂，早晚分服。采集治疗前后患者的空腹静脉血，分别利用生化试剂盒和荧光定量pcr检测患者血清mda、sod含量。结果如图3所示，通过本发明中药组合物治疗之后，mda的活性显著降低，而sod的活性明显增高表明本发明中药组合物对胆汁淤积性肝损伤的保护作用与抗氧化有关。
[0109]
由以上实施例可知，本发明提供了一种中药组合物、制备方法及其在制备治疗肝损伤的药物中的应用，对胆汁淤积性肝病具有显著疗效，通过将特定比例的醋鳖甲、佛手柑、桑葚、三七、黄连、黄芩、虎杖、白花蛇舌草、石斛、大黄进行合理配伍，可有效的治疗肝损伤，通过本发明药方治疗后肝细胞排列较为整齐，微脂肪变性和炎症细胞浸润较未治疗组得到显著减轻，且对肝功能具有保护作用，alt、ast含量与未治疗组相比均有统计学差异。代谢分析表明本药方通过abc转运蛋白、初级胆汁酸生物合成等通路实现对肝损伤的治疗。通过本发明中药组合物治疗之后，mda的活性显著降低，而sod的活性明显增高，表明本发明中药组合物对胆汁淤积性肝损伤的保护作用与抗氧化有关。
[0110]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。