个体化治疗性抗癌疫苗的制作方法

个体化治疗性抗癌疫苗
发明领域
1.本发明涉及个体化治疗性抗癌疫苗、使用这种抗癌疫苗的癌症治疗方法以及生产该疫苗的方法。
2.发明背景
3.尽管癌症的治疗在过去几十年中得到了改善，尤其是早期检测和诊断显著提高了生存率，但仍只有约60％被诊断患有癌症的患者在诊断后存活5年。使用的癌症治疗大多数是外科手术、放射和细胞毒性化学治疗，但它们都有严重的副作用。在过去数年中，在患者自身免疫系统的帮助下靶向癌细胞的癌症免疫治疗(即抗癌疫苗)引起了人们的兴趣，因为此类治疗可以减少或甚至消除传统癌症治疗中所见的一些副作用。
4.免疫学的基础是基于自我-非我的辨别(self-non-self-discrimination)。大多数引起感染性疾病的病原体均含有可以被宿主识别并触发免疫应答的分子标识(molecular signature)。然而，肿瘤细胞来源于正常细胞，并且通常不表达任何分子标识，使其更难以与正常细胞区分开。然而，大多数肿瘤细胞表达不同类型的肿瘤抗原。这些可以是共有的肿瘤抗原，即在多个个体中由相同种类的肿瘤表达的抗原，或在多个个体中由多种肿瘤表达的抗原，或在特定患者中发现的患者特异性抗原。
5.共有的肿瘤抗原包括过表达或异常表达的细胞蛋白、癌基因或肿瘤抑制基因中的突变和病毒抗原。患者特异性肿瘤抗原产生的原因可能是由于肿瘤基因组中的一个或多个突变导致相关蛋白的氨基酸序列发生变化。这些包括非同义突变、移框突变、融合抗原和内含子保留抗原。


技术实现要素：

6.本发明人已经认识到，个体化抗癌疫苗产生了针对患者中存在的共有肿瘤抗原(疫苗针对其设计和制造)的免疫应答，和除此以外任选地针对患者特异性肿瘤抗原的免疫应答，改善了控制或抑制肿瘤细胞生长所必需的抗癌免疫应答。
7.定义
8.在本文中，肿瘤既指实体肿瘤，也指在体液如血液中发现的肿瘤细胞。
9.患者特异性肿瘤抗原、患者特异性癌症抗原和患者特异性抗原在本文中可互换地用于指在特定个体/患者中发现的肿瘤抗原，其中所述肿瘤抗原包含在肿瘤细胞中发现的相对于患者的正常细胞的一个或多个突变。
10.患者特异性肿瘤表位、患者特异性癌症表位、患者特异性表位和新表位(neoepitope)在本文中可互换地用于指包含在患者特异性肿瘤抗原中的肽，该肽包含一个或多个免疫原性突变。
11.患者特异性肿瘤表位序列、患者特异性癌症表位序列、患者特异性表位序列和新表位序列在本文中可互换使用，描述编码表位/新表位的核酸序列或包含表位/新表位的氨基酸序列。
12.共有的肿瘤抗原、共有的癌症抗原和共有抗原在本文中可互换使用，描述由多个
个体中的同种肿瘤表达的肿瘤抗原或由多个个体中的多种肿瘤表达的肿瘤抗原。
13.共有的肿瘤抗原序列、共有的癌症抗原序列和共有抗原序列在本文中可互换使用，描述编码共有抗原的一部分或全部的核酸序列或包含共有抗原的一部分或全部的氨基酸序列。
14.患者存在的共有肿瘤抗原、患者存在的共有癌症抗原和患者存在的共有抗原(patient-present shared antigen)在本文中可互换使用，描述在所述患者中存在或已被鉴定为存在的共有肿瘤抗原。
15.患者存在的共有肿瘤抗原序列、患者存在的共有癌症抗原序列和患者存在的共有抗原序列在本文中可互换使用，描述编码患者存在的共有抗原的一部分或全部的核酸序列或包含患者存在的共有抗原的一部分或全部的氨基酸序列。
16.个体化治疗性抗癌疫苗用于描述为特定个体/患者设计和制造的疫苗，其旨在刺激能够识别个体中已经存在的肿瘤细胞并控制或抑制此类肿瘤细胞生长的免疫应答。
17.个体和患者在本文中可互换使用，表示患有癌症或怀疑患有癌症的特定人。
18.发明详述
19.癌症是由于一个或多个细胞因突变而开始异常的不受控制的细胞增殖而从患者的正常组织发展而来。尽管癌细胞发生了突变，但大部分基因组是完整的，并且与患者体内其余的细胞相同。攻击肿瘤的一种方法是基于个体/患者中的任何肿瘤都是独特的这一认知：患者特异性突变导致患者特异性突变蛋白(肿瘤特异性抗原)的表达，这对于该患者来说是独特的。这些肿瘤特异性和患者特异性抗原不同于患者正常细胞中的任何蛋白。因此，此类患者特异性抗原应当是专门为相关患者制造的治疗性抗癌疫苗(即个体化治疗性抗癌疫苗)的合适靶标。这种类型的抗癌疫苗面临的挑战是，尽管根据患者特异性抗原的预测治疗功效而选择将其包含在疫苗中，但患者特异性抗原中仅有一些而并非全部在临床环境中显示出预测的治疗功效。需要对此改进。
20.已发现共有肿瘤抗原由许多肿瘤表达，无论是在具有相同癌症类型的患者中，还是在不同患者和不同癌症类型之间。一个实例是hpv16抗原，这是一种病毒抗原，在全部头颈部鳞状细胞癌(scchn)患者中约50％有表达，但也在具有不同癌症如宫颈癌和外阴鳞状细胞癌(vscc)的患者中表达。这些共有抗原中的许多先前已被表征为具有免疫原性和/或在特定的hla i类或ii类等位基因上呈递。共有抗原可包含在现成的治疗性抗癌疫苗中，用于许多患者(参见例如wo 2013/092875)。然而，这种类型的抗癌疫苗虽然在一些患者中显示出临床功效，但在其他患者中没有或几乎没有治疗功效。
21.t细胞应答取决于每个患者hla分子上癌症表位的加工和呈递。由于hla i类和hla ii类分子的多样性，用于很多患者的现成疫苗都通常包括大的全长抗原，以使抗原包含大量hla分子上存在的表位的机率最大。然而，患者仅需要包括与该具体患者的hla分子匹配的那些表位的较短的抗原序列。因此，不可能设计和生产覆盖每个患者中的所有肿瘤抗原的现成抗癌疫苗。
22.此外，仅靶向一种肿瘤抗原的现成的治疗性抗癌疫苗确实忽略了肿瘤中常见的肿瘤异质性，并且针对该一种抗原的免疫压力可能导致具有不同突变的肿瘤克隆。
23.本发明提供了个体化的治疗性抗癌疫苗，其靶向患者存在的共有抗原，任选的除此之外的患者特异性抗原。与仅包含患者特异性抗原的抗癌疫苗或包含共有抗原的现成抗
癌疫苗相比，这会提高治疗效果。
24.包含在本发明疫苗中的患者存在的共有抗原可以具有已知的免疫原性、已知的表达谱图和已知的与特定hla i类和/或ii类分子的结合。对患者存在的共有抗原特异的t细胞可以移动至肿瘤并影响肿瘤微环境，从而增加额外的肿瘤特异性t细胞能够攻击肿瘤细胞的可能性。肿瘤具有不同程度的异质性，因此可由表达疫苗中所包含的不同亚群的患者存在的共有抗原的肿瘤细胞。在本发明的个体化疫苗中包括患者存在的共有抗原和任选的患者特异性抗原增加了识别和杀伤多个或所有肿瘤细胞的机率，这是由于当达到激活的t细胞运输至肿瘤的阈值时免疫微环境中的转变。
25.本发明的疫苗使用正常的适应性免疫系统来产生针对肿瘤细胞的免疫。适应性免疫系统的特异性在于，在所谓抗原呈递的过程中通过对特定抗原的识别，每种抗原均引发特异性针对所述抗原的免疫应答。适应性免疫系统的细胞是淋巴细胞，尤其是b细胞和t细胞。b细胞参与体液免疫应答，而t细胞参与细胞介导的免疫应答。
26.特别地，本发明的疫苗被设计用于通过激活针对肿瘤抗原的t细胞来引发细胞介导的免疫应答。t细胞在表位已被加工并呈递为与如下所述的mhc分子的复合物时识别表位。
27.包括在本发明的疫苗中的患者存在的共有抗原序列和任选的共有抗原的患者特异性抗原序列和任选的患者特异性抗原经设计在mhc分子的肽结合沟槽中以mhc-肽复合物呈递。主要组织相容性复合体(mhc)分子主要分为两类，mhc i和mhc ii。术语mhc i(类)和mhc ii(类)在本文中可与hla i(类)和hla ii(类)互换使用。人类白细胞抗原(hla)是人类中的主要组织相容性复合物。
28.mhc i存在于体内所有有核细胞的细胞表面。mhc i的一个功能是将细胞内的非自身蛋白肽展示给细胞毒性t细胞。mhc i肽复合物被插入细胞的质膜中，将肽呈递给细胞毒性t细胞，由此触发针对该特定mhc-肽复合物的细胞毒性t细胞的激活。肽被定位于mhc i分子的沟槽中，允许肽的长度为约8至10个氨基酸。
29.mhc ii分子是通常仅在抗原呈递细胞(如树突细胞、单核吞噬细胞、一些内皮细胞、胸腺上皮细胞和b细胞)上发现的分子家族。
30.与mhc i不同，mhc ii类分子呈递的抗原来源于细胞外蛋白。细胞外蛋白被内吞，在溶酶体中消化，产生的肽被加载到mhc ii类分子上，然后呈递在细胞表面。mhc ii类分子的抗原结合沟槽两端开放，能够呈递更长的肽，通常在15至24个氨基酸残基之间。
31.mhc i类分子由t细胞上(通常称为cd8+t细胞(或cd8+细胞))的cd8和共同受体识别，而mhc ii类分子由t细胞上(通常称为cd4+t细胞(或cd4+细胞))的cd4和共同受体识别。
32.本发明的个体化抗癌疫苗包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽包含三个单元，即靶向单元、二聚化单元和抗原单元。由于二聚化单元，多肽形成二聚体蛋白，即所谓的疫苗体(vaccibody)。
33.编码所述三个单元的基因被基因工程化为一个基因而表达。当在体内表达时，多肽/二聚体蛋白靶向抗原呈递细胞(apc)，这导致与相同的非靶向抗原相比疫苗效力增强。
34.在第一个方面，本发明涉及包含编码靶向单元、二聚化单元和抗原单元的核苷酸序列的多核苷酸，其中所述抗原单元包含至少一个患者存在的共有抗原序列或其一个或多个部分，和任选的一个或多个患者特异性抗原序列或其一个或多个部分。
35.在第二个方面，本发明涉及由多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸包含编码靶向单元、二聚化单元和抗原单元的核苷酸序列，其中所述抗原单元包含至少一个患者存在的共有抗原序列或其一个或多个部分，和任选的一个或多个患者特异性抗原序列或其一个或多个部分。
36.在第三个方面，本发明涉及两个由多核苷酸编码的多肽组成的二聚体蛋白，所述多核苷酸包含编码靶向单元、二聚化单元和抗原单元的核苷酸序列，其中所述抗原单元包含至少一个患者存在的共有抗原序列或其一个或多个部分，和任选的一个或多个患者特异性抗原序列或其一个或多个部分。
37.在第四个方面，本发明涉及个体化治疗性抗癌疫苗，其包含免疫有效量的：
38.(i)包含编码靶向单元、二聚化单元和抗原单元的核苷酸序列的多核苷酸，其中所述抗原单元包含至少一个患者存在的共有抗原序列或其一个或多个部分，和任选的一个或多个患者特异性抗原序列或其一个或多个部分；或
39.(ii)由(i)中定义的多核苷酸编码的多肽；或
40.(iii)由两个如(i)中定义的多核苷酸编码的多肽组成的二聚体蛋白；和
41.药学上可接受的载体。
42.在一个实施方案中，本发明涉及个体化治疗性抗癌疫苗，其包含免疫有效量的：
43.(a)包含编码靶向单元、二聚化单元和抗原单元的核苷酸序列的多核苷酸，其中所述抗原单元包含至少一个患者存在的共有抗原序列或其一个或多个部分，和任选的一个或多个患者特异性抗原序列或其一个或多个部分；和
44.(b)药学上可接受的载体。
45.在另一个实施方案中，本发明涉及个体化治疗性抗癌疫苗，其包含免疫有效量的
46.(a)由包含编码靶向单元、二聚化单元和抗原单元的核苷酸序列的多核苷酸编码的二聚体蛋白或多肽，其中所述抗原单元包含至少一个患者存在的共有抗原序列或其一个或多个部分，和任选的一个或多个患者特异性抗原序列或其一个或多个部分；和
47.(b)药学上可接受的载体。
48.包含在本发明的多核苷酸、多肽、二聚体蛋白和个体化治疗性抗癌疫苗中的抗原单元包含至少一个患者存在的共有抗原序列或其一个或多个部分。在一个实施方案中，患者存在的共有抗原是选自以下的共有抗原：过表达的细胞蛋白、异常表达的细胞蛋白、癌睾丸抗原、病毒抗原、分化抗原、突变的癌基因、突变的肿瘤抑制基因、癌胚抗原、共有融合抗原、共有内含子保留抗原、暗物质抗原(dark mass antigen)、由剪接体突变引起的共有抗原和由移框突变引起的共有抗原。
49.在一个实施方案中，患者存在的共有抗原是过表达或异常表达的人细胞蛋白，即与正常健康细胞和组织相比发现在肿瘤中的水平升高的细胞蛋白。此类过表达或异常表达的细胞蛋白的实例包括肿瘤蛋白d52、her-2/neu、htert(端粒酶)和存活蛋白(survivin)。在另一个实施方案中，患者存在的共有抗原是癌睾丸抗原，其表达发生在人类恶性肿瘤以及正常睾丸组织中。癌睾丸抗原的实例包括mage-a、mage-b、gage、page-1、ssx、hom-mel-40(ssx2)、ny-eso-1、lage-1和scp-1。在另一个实施方案中，患者存在的共有抗原是分化抗原，例如酪氨酸酶和trp-2。在另一个实施方案中，患者存在的共有抗原是病毒抗原。病毒抗原的实例包括人乳头瘤病毒(hpv)、乙型肝炎病毒(hbv)、爱泼斯坦-巴尔病毒(ebv)、卡波西
肉瘤相关疱疹病毒(kshv)、默克尔细胞多瘤病毒(mcv或mcpyv)、人巨细胞病毒(hcmv)和人t淋巴细胞病毒(htlv)。在另一个实施方案中，患者存在的共有抗原是突变的癌基因。突变的癌基因的实例包括ras突变，包括kras、pik3ca突变和egfr突变。在另一个实施方案中，患者存在的共有抗原是突变的肿瘤抑制基因。实例包括突变的p53、突变的prb、突变的bcl2和突变的swi/snf。在另一个实施方案中，患者存在的共有抗原是癌胚抗原，例如甲胎蛋白或癌胚抗原。在另一个实施方案中，患者存在的共有抗原是共有内含子保留抗原或由移框突变引起的共有抗原，例如cdx2或calr。在另一个实施方案中，患者存在的共有抗原是由剪接体突变引起的共有抗原。实例是由sf3b1 mut等突变引起的抗原。
50.对于任何癌症抗原，当患者出现癌症时，都可能发生免疫耐受。抗癌疫苗应当特异性触发对并入疫苗中的抗原的免疫应答。对选定抗原的外周免疫耐受可能弱或强。患者更有可能对在正常组织中也表达的共有抗原(即人细胞蛋白，例如过表达抗原和分化抗原)建立中枢免疫耐受。通过将此类共有抗原序列或其部分并入抗原单元(单独或与其他患者存在的共有抗原序列和任选的患者特异性抗原序列一起)，包含抗原单元的本发明的疫苗可以引发免疫应答，这种免疫应答足够强大和广泛以影响肿瘤微环境，并将患者对肿瘤的免疫应答从抑制/耐受型改变为促炎型免疫应答。这可能有助于打破对数种其他抗原的耐受，从而为患者带来可观的临床益处。上述概念可称为倾覆癌症免疫设定点。
51.因此，在一个实施方案中，所述至少一个患者存在的共有抗原序列是其为人细胞蛋白，优选过表达或异常表达的人细胞蛋白或分化抗原的共有抗原。
52.可以通过本领域已知的方法在患者的组织或体液中检测所述至少一个患者存在的共有抗原，所述方法包括：
53.·
对患者的基因组或外显子组进行测序，和任选地通过定制软件在全基因组/外显子组数据中搜索以例如鉴定突变的癌基因或突变的肿瘤抑制基因；
54.·
对患者肿瘤组织进行免疫组织化学，以检测突变蛋白的存在；
55.·
进行rt-pcr以检测病毒抗原或癌基因中已知突变的存在；
56.·
使用针对突变肿瘤蛋白的抗体在血清样品中进行elisa；
57.·
对肿瘤组织进行rna测序，并与健康组织比较，以检测共有抗原的表达/过表达；
58.·
通过定制软件在原始rna序列数据中搜索，以鉴定内含子保留抗原；
59.·
通过定制软件在全基因组测序数据中进行搜索，以鉴定转座元件，这些转座元件是暗物质抗原的元件；
60.·
检测原始全外显子组/rna序列数据中的短重复，以鉴定暗物质抗原；
61.·
rna测序数据，以鉴定共有病毒抗原；和
62.·
比较患者肿瘤样品的rna测序与患者自身的健康组织或者队列/数据库(例如tcga)与gtex/hpa基因表达数据。
63.在一个优选的实施方案中，抗原单元包含至少一个患者存在的共有抗原序列或已知具有免疫原性的这样的抗原序列的部分，例如，先前已在其他患者中显示出免疫原性应答，已被描述为在其他患者中引发免疫应答，或预测与特定患者的hla i类和/或hla ii类等位基因结合。在另一个优选的实施方案中，抗原单元包含至少一个患者存在的共有抗原序列的一个或多个部分，例如，已知具有免疫原性或预测与特定患者的hla i类和/或hla ii类等位基因结合的一个或多个表位。在进一步优选的实施方案中，抗原单元包含至少一
个患者存在的共有抗原序列的一个或多个部分，例如，已知具有免疫原性或预测与特定患者的hla i类等位基因结合的一个或多个表位。
64.在一个实施方案中，抗原单元包含患者存在的共有抗原序列或其一个或多个部分，其具有适合由特定患者的hla等位基因呈递的长度。因此，在一个实施方案中，患者存在的共有抗原序列或其部分的长度为7至30个氨基酸。在另一个实施方案中，患者存在的共有抗原序列或其部分的长度为7至10个氨基酸，或13至30个氨基酸，例如7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸，例如9个氨基酸。
65.抗原单元可以包含至少一个患者存在的共有抗原序列的全长，或者可以包含其一个或多个部分。在一个实施方案中，抗原单元包含患者存在的共有抗原序列的一个部分。在另一个实施方案中，抗原单元包含患者存在的共有抗原序列的数个部分。抗原单元可以包含多于一个患者存在的共有抗原序列，即数个患者共有抗原的序列，每个都是全长的，或者每个这样的抗原的一个或多个部分。在一个实施方案中，抗原单元包含全长的一个患者存在的共有抗原序列和一个或数个其他患者存在的共有抗原的序列的一个或多个部分，例如，一个其他患者存在的共有抗原的序列的一个部分或一个其他患者存在的共有抗原的序列的数个部分或所述数个其他患者存在的共有抗原中的每一个的序列的一个部分或所述数个其他患者存在的共有抗原中的一些或每一个的序列的数个部分。在一个优选的实施方案中，抗原单元包含数个患者存在的共有抗原的序列，例如，数个患者存在的共有抗原的序列的数个部分，更优选数个患者存在的共有抗原的数个表位，这些表位已知具有免疫原性或预测与该具体患者的hla i类和/或hla ii类等位基因结合，优选与该具体患者的hla i类等位基因结合。
66.在另一个实施方案中，抗原单元包含全长的一个或多个患者存在的共有抗原和一个或多个患者存在的共有癌症抗原的一个或多个部分。实例包括：
67.·
抗原单元，包含全长的一个患者存在的共有抗原和一个患者存在的共有癌症抗原的一个或多个表位；和
68.·
抗原单元，包含数个患者存在的共有癌症抗原，每个抗原都是全长的，以及一个患者存在的共有癌症抗原的一个或多个表位；和
69.·
抗原单元，包含全长的一个患者存在的共有抗原和数个患者存在的共有癌症抗原的一个或多个表位；和
70.·
抗原单元，包含数个患者存在的共有癌症抗原，每个抗原都是全长的，以及数个患者存在的共有癌症抗原的一个或多个表位。
71.在另一个实施方案中，抗原单元包含全长的至少一个患者存在的共有抗原序列或全长的多于一个患者存在的共有抗原序列。在一个实施方案中，抗原单元包含全长的1至10个患者存在的共有抗原序列。在另一个实施方案中，抗原单元包含长肽序列形式(例如约28至100个氨基酸长)的患者存在的共有抗原序列的1至30个部分，或编码此类长肽序列的核酸序列，其中长肽序列包含预测与患者的hla i类和/或hla ii类等位基因结合的多个表位。在另一个实施方案中，抗原单元包含短肽序列/表位形式的患者存在的共有抗原序列的1至50个部分，或编码此类短肽序列/表位的核酸序列，所述短肽序列/表位预测与患者的hla i类和/或hla ii类等位基因结合。
72.在一个实施方案中，抗原单元中包括3至50个患者存在的共有抗原序列，例如3至
30个序列，例如3至20个序列，例如3至15个序列，或例如3至10个序列。
73.在另一个实施方案中，抗原单元中包含5至50个患者存在的共有抗原序列，例如5至30个序列，例如5至25个序列，例如5至20个序列，例如5至15个序列或例如5至10个序列。
74.在进一步的实施方案中，抗原单元中包含10至50个患者存在的共有抗原序列，例如10至40个序列，例如10至30个序列，例如10至25个序列，例如10至20个序列或例如10至15个序列。
75.为了避免肿瘤通过例如关闭作为抗癌疫苗靶标的抗原的表达而逃逸免疫系统，优选将多个不同的患者存在的共有抗原的序列和任选的多个不同的患者特异性抗原的序列包含到抗原单元中。一般来说，肿瘤为逃逸免疫系统需要关闭的基因越多，肿瘤实际上能够关闭所有基因同时仍然能够增殖甚至存活的可能性就越小。此外，肿瘤可能是异质的，因为并非每个患者存在的共有抗原或患者特异性抗原均被所有肿瘤细胞表达。
76.因此，在一个优选的实施方案中，所述方法是将尽可能多的患者存在的共有抗原序列和任选的患者特异性抗原序列包含到本发明疫苗的抗原单元中，以通过激活能够识别更多的肿瘤细胞表达的肿瘤抗原的t细胞来有效地攻击肿瘤。此外，为了确保所有患者存在的共有抗原序列和任选的患者特异性抗原序列被有效接受到同一抗原呈递细胞中，它们经过安排而为一个氨基酸链或编码一个氨基酸链(即抗原单元)而不是分立的肽。然而，如上所述，本发明的疫苗的目的是激活患者的t细胞以对抗包含在抗原单元中的患者存在的共有抗原序列和任选的患者特异性抗原序列，并且在抗原单元中包含太多此类序列可能导致t细胞的稀释。因此，重要的是选择最佳的患者存在的共有抗原序列和可选的患者特异性抗原序列以包含在抗原单元中。
77.最佳的患者存在的共有抗原序列是已知具有免疫原性的那些。在一个优选的实施方案中，抗原单元包含至少一个患者存在的共有抗原序列的一个或多个部分，例如，已知具有免疫原性或预测与特定患者的hla等位基因、优选患者的hla i类等位基因结合的一个或多个表位。
78.优选“最佳利用”抗原单元，即抗原单元包含不导致对抗原单元的免疫原性的最少可能数量的氨基酸/序列。例如，如果全长的患者存在的共有抗原序列仅含有一些已知具有免疫原性或预测与特定患者的hla等位基因结合的表位，并且序列的其余部分不导致抗原单元的免疫原性，则将这样的序列包含在抗原单元中是较不优选的。另一方面，如果全长的患者存在的共有抗原序列含有数个或许多紧挨的此类表位，则包含这样的序列可能是有意义的。
79.抗原单元可以进一步包含一个或多个患者特异性抗原序列。可以通过对患者肿瘤的基因组或外显子组进行测序，来鉴定患者特异性抗原。与患者的正常组织外显子组相比，此类序列包含一个或多个突变。突变可以是导致至少一个氨基酸发生变化的任何突变。因此，突变可以是以下之一：
80.·
导致氨基酸变化的非同义突变，
81.·
导致移框从而在突变后在方向上形成完全不同的开放阅读框的突变，
82.·
通读突变，其中终止密码子被修饰或缺失，从而导致具有肿瘤特异性表位的更长蛋白，
83.·
导致独特的肿瘤特异性蛋白序列的剪接突变，
84.·
染色体重排，其产生在两个蛋白的连接处具有肿瘤特异性表位的嵌合蛋白。
85.抗原单元可以包含一个或多个患者特异性抗原序列或其一个或多个部分。在一个实施方案中，抗原单元包含一个或多个(数个)患者特异性抗原序列。在另一个实施方案中，抗原单元包含这样的一个或多个患者特异性抗原序列的一个或多个部分，优选一个或多个患者特异性表位。
86.表位优选具有适合由上述mhc分子呈递的长度。因此，在一个优选的实施方案中，表位为7至30个氨基酸长。更优选的是长度为7至10个氨基酸的表位序列或长度为13至30个氨基酸，例如7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸的表位序列。
87.在一个优选的实施方案中，抗原单元包含至少一个患者特异性表位或至少5个患者特异性表位或至少10个患者特异性表位。在另一个优选的实施方案中，抗原单元包含至少15个患者特异性表位，例如至少20个患者特异性表位。
88.在一个实施方案中，抗原单元中包含3至50个患者特异性抗原序列，例如3至30个序列，例如3至20个序列，例如3至15个序列或例如3至10个序列。在一个优选的实施方案中，这样的序列是表位。
89.在另一个实施方案中，抗原单元中包含5至50个患者特异性抗原序列，例如5至30个序列，例如5至25个序列，例如5至20个序列，例如5至15个序列或例如5至10个序列。在一个优选的实施方案中，这样的序列是表位。
90.在进一步的实施方案中，抗原单元中可以包含10至50个患者特异性抗原序列，例如10至40个序列，例如10至30个序列，例如10至25个序列，例如10至20个序列或例如10至15个序列。在一个优选的实施方案中，这样的序列是表位。
91.尤其是当要包含在抗原单元中的患者特异性抗原序列是短表位时，例如仅有数个氨基酸长，将短表位包含在抗原单元中，使得其侧翼两侧为氨基酸序列。优选地，短表位基本上位于两个侧翼序列的中间，以确保表位在其被加工后由抗原呈递细胞呈递。侧翼序列优选是抗原中表位侧翼的氨基酸序列。
92.以下适用于患者存在的共有抗原序列及其部分并且(如果存在的话)，也适用于患者特异性抗原序列及其部分。因此，在下文中，术语抗原序列用于并旨在涵盖患者存在的共有抗原序列及其部分和患者特异性抗原序列及其部分两者。在一个实施方案中，抗原单元包含每种抗原序列的一个拷贝，因此当例如10个不同的此类序列包含在抗原单元中时，包含所述抗原单元的疫苗会引发针对所有10个不同抗原序列的细胞介导的免疫应答。
93.然而，如果抗原单元中仅包含一些抗原序列—要么是因为仅鉴定了一些抗原，要么因为仅有已鉴定的一些抗原具有足够的免疫原性/已知或预测与患者的hla等位基因结合—那么抗原单元可以包含特定抗原序列的至少两个拷贝，以增强对抗原的免疫应答。
94.抗原单元的长度主要由其中包含的抗原序列的长度以及它们的数量来决定。在一个实施方案中，抗原单元包含7至2000个氨基酸，例如21至2000个氨基酸，优选约30个氨基酸至约1500个氨基酸，更优选约50至约1000个氨基酸，例如约100至约500个氨基酸，或约100至约400个氨基酸，或约100至约300个氨基酸。
95.尽管在抗原序列在抗原亚单元(antigenic subunit)中随机排列时有可能获得针对肿瘤的相关免疫应答，但优选遵循以下方法中的至少一种将它们排列在抗原单元中以增强免疫应答：
96.抗原单元可以描述为具有n-端起点(n-terminal start)和c-端末端(c-terminal end)的多肽。抗原单元与二聚化单元连接，优选通过单元接头连接。抗原单元位于多肽/二聚体蛋白的cooh-末端或nh2-末端。优选地，抗原单元位于多肽/二聚体蛋白的cooh-末端。
97.抗原序列优选由接头分开。在一个实施方案中，除了末端抗原序列，即位于抗原单元末端且不与二聚化单元连接的抗原序列之外，所有的抗原序列都排列在抗原亚单元中，每个亚单元由抗原序列和亚单元接头组成。由于抗原序列由接头分离，因此每个抗原以最佳方式呈递至免疫系统。
98.在一个实施方案中，抗原序列在从抗原单元的n-端起点到抗原单元的c-端末端的方向上，优选在二聚化单元朝向抗原单元的c-端末端的方向上，从最大抗原性到最小抗原性地排列。
99.在另一个实施方案中，尤其是如果抗原序列之间的亲水性/疏水性变化很大，优选的是最疏水的抗原序列基本上位于抗原单元的中间，且最亲水的抗原序列位于抗原单元的开始和/或末尾处。
100.由于仅当抗原单元包含奇数数量的抗原序列时才能真正定位抗原单元的中间，因此本文中的术语“基本上”是指包含偶数数量的抗原序列的抗原单元，其中最疏水的抗原序列尽可能靠近中间。例如，抗原单元包含5个抗原亚单元，每个抗原亚单元包含不同的抗原序列，它们排列如下：1-2-3*-4-5；其中1、2、3*、4和5分别是不同的抗原序列，并且-是接头，*表示最疏水的抗原序列，其位于抗原单元的中间。
101.在另一个实例中，抗原单元包含6个抗原亚单元，每个抗原亚单元包含不同的抗原序列，它们排列如下：1-2-3*-4-5-6，或者排列如下：1-2-4-3*-5-6；其中1、2、3*、4、5和6分别是不同的抗原序列，并且-是接头，*表示最疏水的抗原序列，其基本上位于抗原单元的中间。
102.或者，抗原序列可以在亲水和疏水抗原序列之间交替排列。
103.此外，不应将富含gc的抗原序列彼此相邻排列以避免gc簇。在一个优选的实施方案中，一个富含gc的抗原序列之后是至少一个非富含gc的抗原序列，然后是第二个富含gc的抗原序列。
104.在一个实施方案中，抗原单元包含具有以下顺序的抗原序列：e7|接头|ny-eso-1|接头|e6。在一个优选的实施方案中，抗原单元包含seq id no:14。
105.在另一个优选的实施方案中，抗原单元包含seq id no:14和seq id no:15。seq id no:15包含具有以下顺序的抗原序列：
106.t1d320|接头|t1d814|接头|t1d182|接头|t1d689|接头|e7|接头|t1d339|接头|t1d428|接头|ny-eso-1|接头|t1d572|接头|t1d359|接头|t1d488|接头|t1d554|接头|t1d272|接头|t1d210|接头|t1d849|接头|t1d4|接头|t1d77|接头|t1d717|接头|t1d586|接头|e6。
107.在一个实施方案中，抗原单元包含具有以下顺序的抗原序列：e6|接头|ny-eso-1|接头|e7。在一个优选的实施方案中，抗原单元包含seq id no:16。
108.在另一个优选的实施方案中，抗原单元包含seq id no:16和seq id no:17。seq id no:17包含具有以下顺序的抗原序列：e6|接头|t1d323|接头|t1d506|接头|t1d12|接头|t1d315|接头|t1d302|接头|t1d700|接头|ny-eso-1|接头|t1d535|接头|t1d358|接头|
t1d670|接头|t1d294|接头|t1d336|接头|t1d499|接头|t1d425|接头t1d491|接头|t1d314|接头|t1d430|接头|e7|接头|t1d582。
109.在一个实施方案中，抗原单元包含具有以下顺序的抗原序列：ny-eso-1|接头|e7|接头|e6。在一个优选的实施方案中，抗原单元包含seq id no:18。
110.在另一个优选的实施方案中，抗原单元包含seq id no:18和seq id no:19。seq id no:19包含具有以下顺序的抗原序列：t1d223|接头|t1d164|接头|t1d56|接头|t1d36|接头|t1d129|接头|t1d274|接头|t1d62|接头|t1d5|接头|t1d144|接头|t1d441|接头|t1d368|接头|ny-eso-1|接头|t1d234|接头|t1d162|接头|t1d39|接头|t1d272|接头|e7|接头|t1d328|接头|t1d188|接头|e6。
111.抗原单元可以进一步包含将一个抗原序列与另一个分隔的一个或多个接头和将抗原单元连接至二聚化单元的接头(下文也称为单元接头)。所述一个或多个接头确保每个抗原序列以最佳方式呈递给免疫系统，如果抗原单元包含在本发明的疫苗中，这会增加疫苗的功效。
112.所述一个或多个接头优选地设计为非免疫原性的并且优选地也是柔性的，这允许抗原序列以最佳方式呈递给t细胞，即使抗原单元包含大量抗原序列。
113.优选地，所述一个或多个接头的长度为4至20个氨基酸以确保柔性。在另一个优选的实施方案中，所述一个或多个接头的长度为8至20个氨基酸，例如8至15个氨基酸，例如8至12个氨基酸或例如10至15个氨基酸。在一个具体的实施方案中，所述一个或多个接头的长度是10个氨基酸。
114.在一个具体的实施方案中，抗原单元包含10个抗原序列，其中这些序列之间的接头具有8至20个氨基酸，例如8至15个氨基酸，例如8至12个氨基酸，或例如10至15个氨基酸的长度。在一个具体的实施方案中，抗原单元包含10个抗原序列并且这些序列之间的接头具有10个氨基酸的长度。
115.所述一个或多个接头优选具有全部相同的核苷酸或氨基酸序列。然而，如果一个或多个抗原序列包含与接头相似的氨基酸基序，则用不同序列的接头替换该抗原序列的相邻接头可能是有利的。此外，如果预测抗原序列/接头连接本身构成免疫原性表位，则可以使用不同序列的接头。
116.所述一个或多个接头优选为丝氨酸(s)-甘氨酸(g)接头或包含编码丝氨酸-甘氨酸氨基酸序列的核苷酸或由其组成，例如ggggs、gggss、gggsg、ggggs或其多个变体，例如ggggsggggs或(ggggs)m、(gggss)m、(gggsg)m，其中m是1至5、1至4或1至3的整数。在优选的实施方案中，m为2。
117.在一个优选的实施方案中，丝氨酸-甘氨酸接头进一步包含至少一个亮氨酸(l)，例如至少2个或至少3个亮氨酸。丝氨酸-甘氨酸接头可以例如包含1、2、3或4个亮氨酸。优选地，丝氨酸-甘氨酸接头包含1个亮氨酸或2个亮氨酸。
118.在一个实施方案中，所述一个或多个接头包含序列lgggs、glggs、gglgs、gggls或ggggl或由其组成。在另一个实施方案中，所述一个或多个接头包含序列lggsg、glgsg、gglsg、ggglg或gggsl或由其组成。在另一个实施方案中，所述一个或多个接头包含序列lggss、glgss、gglss、gggls或gggsl或由其组成。
119.在另一个实施方案中，所述一个或多个接头包含序列lglgs、glgls、gllgs、lggls
或glggl或由其组成。在另一个实施方案中，所述一个或多个接头包含序列lglsg、gllsg、gglsl、ggllg或glgsl或由其组成。在另一个实施方案中，所述一个或多个接头包含序列lglss、glgls、gglls、glgsl或glgsl或由其组成。
120.在另一个实施方案中，所述一个或多个接头是长度为10个氨基酸并且包含1个亮氨酸或2个亮氨酸的丝氨酸-甘氨酸接头。
121.在一个实施方案中，所述一个或多个接头包含序列lgggsggggs、glggsggggs、gglgsggggs、ggglsggggs或gggglggggs或由其组成。在另一个实施方案中，所述一个或多个接头包含序列lggsggggsg、glgsggggsg、gglsggggsg、ggglggggsg或gggslgggsg或由其组成。在又一个实施方案中，所述一个或多个接头包含序列lggssgggss、glgssgggss、gglssgggss、ggglsgggss或gggslgggss或由其组成。
122.在进一步的实施方案中，所述一个或多个接头包含序列lgggslgggs、glggsglggs、gglgsgglgs、ggglsgggls或gggglggggl或由其组成。在另一个实施方案中，所述一个或多个接头包含序列lggsglggsg、glgsgglgsg、gglsggglsg、ggglgggglg或gggslgggsl或由其组成。在另一个实施方案中，所述一个或多个接头包含序列lggsslggss、glgssglgss、gglssgglss、ggglsgggls或gggslgggsl或由其组成。
123.在一个实施方案中，抗原单元包含由9个接头分隔的10个抗原序列，即末端序列是抗原序列，而不是接头。在另一个实施方案中，抗原单元包含由14个接头分隔的15个抗原序列或由19个接头分隔的20个抗原序列。
124.在另一个实施方案中，抗原单元包含由接头分隔的10至20或10至25个抗原序列。优选地，所述接头具有10个氨基酸的长度。接头也可以具有如上文定义的任何长度，例如5至12个氨基酸的长度。
125.或者，所述一个或多个接头可选自以下：gsat接头，即包含一个或多个甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸和苏氨酸残基的接头，和seg接头，即包含一个或多个丝氨酸、谷氨酸和甘氨酸残基的接头，或其多个变体。
126.抗原单元和二聚化单元优选通过单元接头连接。单元接头可以包含限制性位点以便于多核苷酸的构建。单元接头优选是glggl接头或glsgl接头。
127.本发明的疫苗包含靶向抗原呈递细胞的靶向单元。由于靶向单元，本发明的多肽/二聚体蛋白/疫苗导致树突细胞(dc)、嗜中性粒细胞和其他免疫细胞的吸引(attraction)。因此，包含靶向单元的多肽/二聚体蛋白/疫苗不仅将抗原单元靶向特定细胞，而且还通过将特定免疫细胞募集至多核苷酸/多肽/二聚体蛋白/疫苗的施用位点来促进应答放大效应(佐剂效应)。这种独特的机制在患者可以在没有任何额外佐剂的情况下接受本发明疫苗的临床环境中非常重要，因为疫苗自身提供了佐剂效应。
128.如本文所用的术语“靶向单元”是指将具有其抗原单元的多肽/二聚体蛋白/疫苗递送至抗原呈递细胞，以用于向cd4+t细胞进行mhc ii类限制性呈递或用于通过mhc i类限制向cd8+t细胞提供交叉呈递的单元。
129.靶向单元通过二聚化单元连接至抗原单元，其中后者位于多肽/二聚体蛋白的cooh-端或nh
2-末端。优选地，抗原单元位于多肽/二聚体蛋白的cooh-末端。
130.靶向单元被设计为将本发明的多肽/二聚体蛋白/疫苗靶向在相关抗原呈递细胞上表达的表面分子，例如仅在树突细胞(dc)亚群上表达的分子。
131.apc上的此类靶表面分子的实例是hla、分化簇14(cd14)、分化簇40(cd40)、趋化因子受体和toll样受体(tlr)。趋化因子受体包括c-c基序趋化因子受体1(ccr1)、c-c基序趋化因子受体3(ccr3)和c-c基序趋化因子受体5(ccr5)和xcr1。toll样受体可以例如包括tlr-2、tlr-4和/或tlr-5。
132.本发明的多肽/二聚体蛋白/疫苗可以通过靶向单元的方式靶向至所述表面分子，所述靶向单元包含例如一个或多个对以下具有特异性的抗原结合区或由其组成：hla、cd14、cd40或toll-样受体；配体，例如可溶性cd40配体；天然配体，如趋化因子，例如趋化因子配体5，也称为c-c基序配体5(ccl5或rantes)或巨噬细胞炎性蛋白α(ccl3或mip-1a/mip1-α)；趋化因子基序配体1或2(xcl1或xcl2)或细菌抗原如鞭毛蛋白。
133.在一个实施方案中，靶向单元对mhc ii类蛋白具有亲和力。因此，在一个实施方案中，编码靶向单元的核苷酸序列编码对选自抗-hla-dp、抗-hla-dr和抗-pan hla ii类的mhc ii类蛋白具有特异性的抗体可变结构域(vl和vh)。
134.在另一个实施方案中，靶向单元对选自cd40、tlr-2、tlr-4和tlr-5的表面分子具有亲和力。因此，在一个实施方案中，编码靶向单元的核苷酸序列编码对抗-cd40、抗-tlr-2、抗-tlr-4和抗-tlr-5具有特异性的抗体可变结构域(vl和vh)。在一个实施方案中，编码靶向单元的核苷酸序列编码鞭毛蛋白。鞭毛蛋白对tlr-5具有亲和力。
135.优选地，靶向单元对选自ccr1、ccr3和ccr5的趋化因子受体具有亲和力。更优选地，编码靶向单元的核苷酸序列编码趋化因子人巨噬细胞炎性蛋白α(hmip-1α，也称为ld78β，在下文也称为(h)mip1α和ld78β)，其与其同源受体即在apc的细胞表面表达的ccr1和ccr5结合。
136.本发明的多肽/二聚体蛋白/疫苗与其同源受体的结合导致在apc中内化和蛋白降解成小肽，这些小肽被加载到mhc分子上并呈递给cd4+和cd8+t细胞以诱导肿瘤特异性免疫应答。一旦受到刺激并在活化的cd4+t细胞的帮助下，cd8+t细胞将靶向并杀伤表达相同抗原的肿瘤细胞。
137.在本发明的一个实施方案中，靶向单元包含与seq id no:1的24-93的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。在一个优选的实施方案中，靶向单元包含与seq id no:1的24-93的氨基酸序列具有至少85％序列同一性，例如至少86％、例如至少87％、例如至少88％、例如至少89％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，靶向单元包含seq id no:1的24-93的氨基酸序列。
138.在一个更优选的实施方案中，靶向单元由与seq id no:1的24-93的氨基酸序列具有至少80％序列同一性，例如与seq id no:1的24-93的氨基酸序列具有例如至少85％、例如至少86％、例如至少87％、例如至少88％、例如至少89％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如至少100％序列同一性的氨基酸序列组成。
139.如本文所用，术语“二聚化单元”是指抗原单元和靶向单元之间的核苷酸或氨基酸序列。因此，二聚化单元用于连接抗原单元和靶向单元并促进两个单体多肽二聚化成二聚体蛋白。此外，二聚化单元还为多肽/二聚体蛋白提供柔性，以允许靶向单元与apc上的表面
分子最佳结合，即使它们位于可变距离处。二聚化单元可以是满足这些要求的任何单元。
140.因此，在一个实施方案中，二聚化单元可以包含铰链区。在另一个实施方案中，二聚化单元包含促进二聚化的另一结构域。在另一个实施方案中，二聚化单元包含铰链区和促进二聚化的另一结构域。在一个实施方案中，所述铰链区和另一结构域可以通过接头(二聚化单元接头)连接。在另一个实施方案中，二聚化单元包含铰链区、二聚化单元接头和促进二聚化的另一结构域，其中二聚化单元接头位于所述铰链区和促进二聚化的另一结构域之间。
141.术语“铰链区”是指促进二聚化的二聚体蛋白的肽序列。换言之，术语“铰链区”是指包含在二聚化单元中的有助于连接两个多肽(即有助于形成二聚体蛋白)氨基酸序列。
142.此外，铰链区作为单元之间的柔性间隔区起作用，从而允许二聚体蛋白的两个靶向单元同时结合至apc上的两个靶分子，即使它们以可变距离表达。铰链区可以是ig衍生的，例如衍生自igg3。铰链区可以包含ig衍生的铰链区的一个或多个部分。铰链区可以通过形成共价键如半胱氨酸之间的二硫键来促进二聚化。因此，在一个实施方案中，铰链区具有形成一个或多个共价键的能力。共价键可以例如是二硫键。
143.在一个实施方案中，二聚化单元包含铰链外显子h1和铰链外显子h4(人铰链区1和人铰链区4)，其具有与seq id no:2的94-120的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。
144.在一个优选的实施方案中，二聚化单元包含铰链外显子h1和铰链外显子h4，其具有与seq id no:2的94-120的氨基酸序列具有至少85％序列同一性，例如至少86％、例如至少87％、例如至少88％、例如至少89％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％或例如至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一个优选的实施方案中，二聚化单元包含具有seq id no:2的94-120的氨基酸序列的铰链外显子h1和铰链外显子h4。
145.在一个实施方案中，促进二聚化的另一结构域是免疫球蛋白结构域，例如羧基端c结构域(c结构域)，例如chl结构域、ch2结构域或羧基端c结构域(即ch3结构域)，或与c结构域或其变体基本上相同的序列。优选地，促进二聚化的另一结构域是衍生自igg的羧基端c结构域。更优选地，促进二聚化的另一结构域是衍生自igg3的羧基端c结构域。
146.在一个实施方案中，二聚化单元包含衍生自igg3的羧基端c结构域，其具有与seq id no:2的131-237的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。
147.在一个优选的实施方案中，二聚化单元包含衍生自igg3的羧基端c结构域，其具有与seq id no:2的131-237的氨基酸序列具有至少85％序列同一性，例如至少86％、例如至少87％、例如至少88％、例如至少89％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％或例如至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一个优选的实施方案中，二聚化单元包含衍生自igg3的羧基端c结构域，其具有seq id no:2的131-237的氨基酸序列。
148.免疫球蛋白结构域通过非共价相互作用如疏水相互作用促进二聚化。因此，在一个实施方案中，免疫球蛋白结构域能够通过非共价相互作用形成二聚体。优选地，非共价相互作用是疏水相互作用。
149.优选地，如果二聚化单元包含ch3结构域，则它不包含ch2结构域。进一步优选地，
如果二聚化单元包含ch2结构域，则它不包含ch3结构域。
150.在一个优选的实施方案中，二聚化单元由由铰链外显子h1和铰链外显子h4组成的多肽、第三接头(或二聚化单元接头)和人igg3的ch3结构域组成。
151.在本发明的一个实施方案中，二聚化单元包含与seq id no:2的94-237的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。在一个优选的实施方案中，二聚化单元包含与seq id no:2的94-237的氨基酸序列具有至少85％序列同一性，例如至少86％、例如至少87％、例如至少88％、例如至少89％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％或例如至少99％序列同一性的氨基酸序列。
152.在一个更优选的实施方案中，二聚化单元由与seq id no:2的94-237的氨基酸序列具有至少80％序列同一性，例如与seq id no:2的94-237的氨基酸序列具有例如至少85％、例如至少86％、例如至少87％、例如至少88％、例如至少89％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％或例如至少99％、例如100％序列同一性的氨基酸序列组成。
153.在一个甚至更优选的实施方案中，二聚化单元由seq id no:2的94-237的氨基酸序列组成。
154.在一个实施方案中，连接铰链区与另一结构域的接头(二聚化单元接头)存在于二聚化单元中。在另一个实施方案中，所述接头存在并且是g3s2g3sg接头。在一个可选的实施方案中，二聚化单元接头是富含甘氨酸-丝氨酸的接头，优选gggssgggsg，即二聚化单元包含富含甘氨酸-丝氨酸的二聚化单元接头，并且优选地，二聚化单元接头是gggssgggsg。应当理解，二聚化单元可以具有相对于抗原单元和靶向单元的任何朝向。在一个实施方案中，抗原单元位于二聚化单元的cooh端(例如通过单元接头)，而靶向单元位于二聚化单元的n-末端。在另一个实施方案中，抗原单元位于二聚化单元的n-末端，而靶向单元位于二聚化单元的cooh-末端。优选地，抗原单元位于二聚化单元的cooh-末端。
155.在一个优选的实施方案中，本发明的多核苷酸进一步包含编码信号肽的核苷酸序列。信号肽位于靶向单元的n-末端，或者位于靶向单元的c-末端，这取决于靶向单元在多肽中的朝向。信号肽经构建而允许在用多核苷酸转染的细胞中分泌由所述多核苷酸编码的多肽。
156.可以使用任何合适的信号肽。合适的肽的实例是ig vh信号肽如seq id no:9、人tpa信号肽如seq id no:10以及包含与seq id no:1的1-23的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的信号肽。在一个可选的实施方案中，信号肽是人mip1-α信号肽。
157.在一个优选的实施方案中，信号肽包含与seq id no:1的1-23的氨基酸序列具有至少85％、例如至少86％、例如至少87％、例如至少88％、例如至少89％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％序列同一性的氨基酸序列。在一个可选的实施方案中，信号肽包含seq id no:1的1-23的氨基酸序列。
158.在更优选的实施方案中，信号肽由与seq id no:1的1-23的氨基酸序列具有至少80％，优选至少85％、例如至少86％、例如至少87％、例如至少88％、例如至少89％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如
至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％序列同一性的氨基酸序列组成。在一个可选的实施方案中，信号肽由seq id no:1的1-23的氨基酸序列组成。
159.序列同一性可以如下确定：高水平的序列同一性显示第二序列衍生自第一序列的可能性。氨基酸序列同一性要求两个比对序列之间具有相同氨基酸序列。因此，与参考序列具有70％氨基酸同一性的候选序列要求在比对后，候选序列中70％的氨基酸与参考序列中的相应氨基酸相同。同一性可以通过计算机分析的帮助来确定，例如但不限于clustalw计算机比对程序(higgins d.,thompson j.,gibson t.,thompson j.d.,higgins d.g.,gibson t.j.,1994.clustal w:improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting,position-specific gap penalties and weight matrix choice.nucleic acids res.22:4673-4680)和其中建议的默认参数。使用该程序及其默认设置，将查询多肽的成熟(生物活性)部分和参考多肽进行比对。计算完全保守的残基数量并除以参考多肽的长度。由此，在比对和随后的序列同一性计算中忽略任何标签或融合蛋白序列(其构成查询序列的一部分)。
160.clustalw算法可以类似地用于比对核苷酸序列。序列同一性可以以与氨基酸序列所示类似的方式计算。
161.用于序列比较的另一种优选数学算法是myers和miller,cabios(1989)的算法。这样的算法并入作为fasta序列比对软件包的一部分的align程序(2.0版)中(pearson wr,methods mol biol,2000,132:185-219)。align基于整体比对计算序列同一性。align0不对位于序列末端的空位进行罚分。当使用align和align0程序比较氨基酸序列时，优选使用具有-12/-2的空位开放/延伸罚分的blosum50取代矩阵。
162.本发明的疫苗可以包含如上所述的多核苷酸。所述多核苷酸可以包含双链或单链的dna核苷酸序列或rna核苷酸序列，例如基因组dna、cdna和rna序列。
163.优选地，将多核苷酸针对要表达本发明多肽的物种进行优化，即优选地，多核苷酸序列是人密码子优化的。
164.本发明的疫苗可以进一步包含由如上定义的多核苷酸序列编码的多肽。多肽可以在体外表达以生产本发明的疫苗，或者多肽可以作为将如上定义的多核苷酸施用于个体/患者的结果而在体内表达。
165.由于二聚化单元的存在，在多肽表达时形成二聚体蛋白。二聚体蛋白可以是同二聚体，即其中的两条多肽链是相同的并因此包含相同的抗原序列，或者二聚体蛋白可以是包含在抗原单元中编码的两个不同单体多肽的异二聚体。如果抗原序列的量超过抗原单元的大小的上限，则可能是后一种情况。然而优选地，二聚体蛋白是同二聚体蛋白。
166.在第五个方面，本发明涉及包含含有编码靶向单元、二聚化单元和抗原单元的核苷酸序列的多核苷酸的载体，其中所述抗原单元包含至少一个患者存在的共有抗原序列或其一个或多个部分，和任选的一个或多个患者特异性抗原序列或其一个或多个部分。
167.载体用于转染宿主细胞并表达由上述多核苷酸编码的多肽/二聚体蛋白，即表达载体，例如dna质粒。
168.优选地，载体允许上述各个单元，尤其是抗原单元的容易交换。在一个实施方案中，载体可以是pumvc4a载体或包含ntc9385r载体骨架的载体。抗原单元可以与受sfii限制性酶盒限制的抗原单元盒交换，其中5'位点引入glggl/glsgl接头中，3'位点包含在载体中
的终止密码子之后。
169.在第六个方面，本发明涉及包含含有编码靶向单元、二聚化单元和抗原单元的核苷酸序列的多核苷酸的宿主细胞，其中所述抗原单元包含至少一个患者存在的共有抗原序列或其一个或多个部分，和任选的一个或多个患者特异性抗原序列或其一个或多个部分。
170.在第七个方面，本发明涉及包含含有多核苷酸的载体的宿主细胞，所述多核苷酸包含编码靶向单元、二聚化单元和抗原单元的核苷酸序列，其中所述抗原单元包含至少一个患者存在的共有抗原序列或其一个或多个部分，和任选的一个或多个患者特异性抗原序列或其一个或多个部分。
171.合适的宿主细胞包括原核细胞、酵母、昆虫或高等真核细胞。在一个优选的实施方案中，宿主细胞是人细胞，优选癌症患者的细胞，更优选其至少一个患者存在的共有抗原序列或其一个或多个部分和任选的其一个或多个患者特异性抗原序列或其一个或多个部分由此衍生的癌症患者。
172.本发明的疫苗是个体化治疗性抗癌疫苗，因为所述至少一个患者存在的共有抗原序列和任选的一个或多个患者特异性抗原序列是在将被接种所述疫苗的患者中，例如在患者的肿瘤组织或体液如血液中鉴定出的。
173.因此，在第八个方面，本发明涉及通过在体外产生如上定义的多肽来制备包含免疫学有效量的所述二聚体蛋白或多肽的个体化治疗性抗癌疫苗的方法。
174.多肽和蛋白的体外合成可以通过本领域技术人员已知的任何合适的方法进行，例如通过肽合成或在本领域已知的任何合适的表达系统中表达多肽，然后进行纯化。
175.因此，在一个实施方案中，本发明提供了一种通过在体外产生二聚体蛋白或多肽来制备个体化治疗性抗癌疫苗的方法，所述疫苗包含免疫有效量的(i)由两个由多核苷酸编码的多肽组成的二聚体蛋白，所述多核苷酸包含编码靶向单元、二聚化单元和抗原单元的核苷酸序列，其中所述抗原单元包含至少一个患者存在的共有抗原序列或其一个或多个部分，和任选的一个或多个患者特异性抗原序列或其一个或多个部分；或
176.(ii)由多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸包含编码靶向单元、二聚化单元和抗原单元的核苷酸序列，其中所述抗原单元包含至少一个患者存在的共有抗原序列或其一个或多个部分，和任选的一个或多个患者特异性抗原序列或其一个或多个部分，
177.所述方法包括
178.a)用多核苷酸转染细胞；
179.b)培养细胞；
180.c)收集和纯化细胞表达的二聚体蛋白或多肽；和
181.d)将从步骤c)获得的二聚体蛋白或多肽与药学上可接受的载体混合。
182.在一个优选的实施方案中，来自步骤c)的二聚体蛋白或多肽溶解在所述药学上可接受的载体中。
183.药学上可接受的载体优选是水性的药学上可接受的载体，例如水或缓冲液。在一个实施方案中，疫苗进一步包含佐剂。
184.可以根据任何合适的方法进行纯化，例如色谱法、离心法或差异溶解度。
185.在第九个方面，本发明涉及在体外制备包含免疫学有效量的如上定义的多核苷酸的个体化治疗性抗癌疫苗的方法。
186.因此，在一个实施方案中，本发明提供了制备个体化治疗性抗癌疫苗的方法，所述疫苗包含免疫学有效量的多核苷酸，所述多核苷酸包含编码靶向单元、二聚化单元和抗原单元的核苷酸序列，其中所述抗原单元包含至少一个患者存在的共有抗原序列或其一个或多个部分，和任选的一个或多个患者特异性抗原序列或其一个或多个部分，所述方法包括
187.a.制备所述多核苷酸；
188.b.任选地将所述多核苷酸克隆到表达载体中；和
189.c.将来自步骤a)的多核苷酸或来自步骤b)的载体与药学上可接受的载体混合。
190.可以通过本领域技术人员已知的任何合适的方法来制备所述多核苷酸。例如，可以使用寡核苷酸合成仪通过化学合成来制备所述多核苷酸。
191.特别地，可以单独合成较小的核苷酸序列，例如编码靶向单元、二聚化单元和/或抗原单元的部分的核苷酸序列，然后进行连接以产生用于包含在载体骨架中的最终的多核苷酸。
192.对于包含在个体化治疗性抗癌疫苗中的抗原单元的设计，在制备疫苗的方法之前的是鉴定要包含在抗体单元中的抗原序列(即患者存在的共有抗原序列和任选的患者特异性抗原序列)的方法。
193.患者存在的共有抗原可以通过本领域已知的方法在患者的(肿瘤)组织或体液(通过本领域已知的方法获得)中鉴定，所述方法包括：
194.·
对患者的基因组或外显子组进行测序，以及可选地通过定制软件在全基因组/外显子组数据中搜索以例如鉴定突变的癌基因或突变的肿瘤抑制基因；
195.·
对患者肿瘤组织进行免疫组织化学，以检测突变蛋白的存在；
196.·
进行rt-pcr，以检测病毒抗原或癌基因中已知突变的存在；
197.·
使用针对突变肿瘤蛋白的抗体在血清样品中进行elisa；
198.·
对肿瘤组织进行rna测序，并与健康组织比较，以检测共有抗原的表达/过表达；
199.·
通过定制软件在原始rna序列数据中搜索，以鉴定内含子保留抗原；
200.·
通过定制软件在全基因组测序数据中搜索，以识别转座元件，这些转座元件是暗物质抗原的元件；
201.·
检测原始全外显子组/rna序列数据中的短重复，以识别暗物质抗原；
202.·
获得rna测序数据，以鉴定共有病毒抗原；和
203.·
比较患者肿瘤样品的rna测序与患者自身的健康组织或者队列/数据库(例如tcga)相对gtex/hpa基因表达数据。
204.在一个优选的实施方案中，抗原单元包含至少一个已知具有免疫原性的患者存在的共有抗原序列。在另一个优选的实施方案中，抗原单元包含至少一个患者存在的共有抗原序列的一个或多个部分，例如，已知具有免疫原性或预测与该患者的hla等位基因结合的一个或多个表位。如果抗原单元中包含患者特异性抗原序列，则抗原单元优选包含具有预测的免疫原性的患者特异性抗原序列。
205.因此，当将所鉴定的患者存在的共有抗原和患者特异性抗原包含在抗原单元中时，这些序列可以被进一步加工，以发现使本发明的疫苗最有效的那些序列。进行此类加工的方式和顺序取决于所述抗原是如何鉴定的，即构成此类加工的基础的数据。在一个实施方案中，包含在本发明的疫苗中的抗原序列的加工和选择是如下进行的：
206.1)在文献和/或一个或多个数据库中进行搜索，以获取有关共有抗原的的信息和序列，并且优选有关它们的表达谱图、免疫原性、表位和hla呈递的信息。进行这样的搜索，以确定所鉴定的抗原是患者存在的共有抗原或者患者特异性抗原。
207.2)如果确定了所鉴定的抗原是患者存在的共有抗原，则研究其序列以鉴定预测与患者特异性hla i类和/或ii类等位基因结合的表位，优选所有表位。确定患者的hla i类和/或ii类等位基因，例如通过对正常组织如血细胞进行测序。预测可以通过本领域已知的预测工具，即本领域已知的预测软件，例如netmhcpan和类似工具来进行。
208.3)选择患者存在的共有抗原中最有前景的，即显示出与患者的一个或多个hla i/ii类等位基因的预测的结合的最具免疫原性的序列，以包含在抗原单元中。在一个实施方案中，选择了许多最小表位，例如如果在步骤2中仅鉴定出一些有前景的表位，或者如果在表位之间存在非免疫原性序列的较长的延伸段。在另一个实施方案中，选择包含与患者特异性hla等位基因结合的数个表位的较长序列。在另一个实施方案中，选择全长序列以包含在抗原单元中。
209.4)任选地，基于此类序列的预测的免疫原性以及与患者hla i类和/或ii类等位基因的结合，选择最有前景的患者特异性抗原序列，例如表位，以包含在抗原单元中。
210.如果要在抗原单元中包含患者特异性抗原序列，一旦鉴定出此类抗原并确定了患者的hla i类和/或ii类等位基因，下一步就是基于此类序列的预测的免疫原性和与患者hla i类和/或ii类等位基因的结合来选择其最有前景的序列，例如表位。
211.通过对肿瘤和正常组织进行测序发现肿瘤突变，并对获得的序列进行比较。有多种方法可用于检测个体dna或rna中特定突变或等位基因的存在。例如，可以使用包括动态等位基因特异性杂交(dash)、微板阵列对角凝胶电泳(madge)、焦磷酸测序(pyrosequencing)、寡核苷酸特异性连接、taqman系统以及各种dna“芯片”技术如affymetrix snp芯片的技术。或者，可以进行通过直接蛋白测序鉴定突变的方法。
212.在肿瘤外显子组的数百或数千个突变中，最有前景的序列基于预测性hla结合算法而在计算机上选择。目的是鉴定所有相关表位，并在排序或评分后，确定要包含在抗原单元中的序列。
213.可以使用任何合适的算法，例如以下之一：
214.免费可用的肽-mhc结合分析软件(iedb和netmhcpan)可从以下网站下载：
215.http://www.iedb.org/
216.http://www.cbs.dtu.dk/services/netmhc/
217.预测用于疫苗设计的最佳序列的市售高级软件可见于：
218.http://www.oncoimmunity.com/
219.https://omictools.com/t-cell-epitopes-category
220.https://github.com/griffithlab/pvac-seq
221.http://crdd.osdd.net/raghava/cancertope/help.php
222.http://www.epivax.com/tag/neoantigen/
223.每个突变根据其抗原性进行评分，选择最具抗原性的表位并将其最佳地排列在抗原单元中。
224.因此，在一个实施方案中，本发明提供了制备个体化治疗性抗癌疫苗的方法，所述
方法包括以下步骤：
225.a)在患者的肿瘤组织或体液中鉴定至少一个患者存在的共有抗原；
226.b)确定患者的hla i类和/或ii类等位基因；
227.c)通过所鉴定的至少一个抗原或其一个或多个部分与患者的hla i类和/或ii类等位基因的预测结合来预测所鉴定的至少一个抗原或其一个或多个部分的免疫原性；
228.d)基于步骤c)中预测的免疫原性选择至少一个抗原或其一个或多个部分；和
229.e)制备包含抗原单元的多核苷酸序列，所述抗原单元包含编码步骤d)中选择的至少一个抗原或其一个或多个部分的核苷酸序列。
230.在另一个实施方案中，本发明提供了制备个体化治疗性抗癌疫苗的方法，所述方法包括以下步骤：
231.a)在患者的肿瘤组织或体液中鉴定至少一个患者存在的共有抗原，并鉴定所述患者的肿瘤组织中的一个或多个患者特异性抗原；
232.b)确定患者的hla i类和/或ii类等位基因；
233.c)通过所鉴定的至少一个患者存在的共有抗原或其部分和所鉴定的一个或多个患者特异性抗原或其一个或多个部分与患者的hla i类和/或ii类等位基因的预测结合，来预测所鉴定的至少一个患者存在的共有抗原或其部分和所鉴定的一个或多个患者特异性抗原或其一个或多个部分的免疫原性；
234.d)基于步骤c)中预测的免疫原性，选择至少一个患者特异性共有抗原或其一个或多个部分和一个或多个患者特异性抗原或其一个或多个部分；和
235.e)制备包含抗原单元的多核苷酸序列，所述抗原单元包含编码在步骤d)中选择的至少一个患者特异性共有抗原或其一个或多个部分和一个或多个患者特异性抗原或其一个或多个部分的核苷酸序列。
236.在一个实施方案中，步骤e)中制备的多核苷酸序列进一步包含编码如本文所述的靶向单元和如本文所述的二聚化单元的核苷酸序列。
237.在一个优选的实施方案中，将制备的多核苷酸序列克隆到表达载体中。在另一个优选的实施方案中，将步骤e)的多核苷酸序列克隆到包含编码二聚化单元和靶向单元的核苷酸序列的表达载体中。
238.在另一个实施方案中，将所述多核苷酸或载体与药学上可接受的载体混合。
239.然后生产最终疫苗，以包含以下之一：
[0240]-如上定义的多核苷酸，
[0241]-由如上定义的多核苷酸编码的多肽，
[0242]-包含由如上定义的多核苷酸编码的多肽链的二聚体蛋白，
[0243]
所述疫苗进一步包含药学上可接受的载体并且可以进一步包含其他药学上可接受的赋形剂，例如稳定剂、佐剂、缓冲剂等。
[0244]
药学上可接受的载体包括但不限于盐水、缓冲盐水如pbs、右旋葡萄糖、水、甘油、乙醇、无菌等渗水性缓冲液及其组合。
[0245]
尤其是对于包含多肽/蛋白的疫苗，药学上可接受的赋形剂包括但不限于聚-iclc、1018iss、铝盐、amplivax、as 15、bcg、cp-870,893、cpg7909、cyaa、dslim、gm-csf、ic30、ic31、咪喹莫特、imufact ev1 p321、is patch、iss、iscomatrix、juvlmmune、
lipovac、mf59、单磷酰脂质a、montanide ims 1312、montanide isa 206、montanide isa 50v、montanide isa-51、ok-432、om-174、om-197-mp-ec、ontak、peptel.rtm、载体系统、plga微粒、雷西莫特(resiquimod)、srl172、病毒体和其他病毒样颗粒、yf-17d、vegf陷阱、r848、β-葡聚糖、pam3cys、aquila qs21刺激素、vadimezan和/或asa404(dmxaa)。
[0246]
尤其是对于含有包含在表达载体中的多核苷酸的疫苗，所述疫苗可以包含使细胞易于转染的分子和/或质粒形式的佐剂，所述质粒包含编码趋化因子或细胞因子以增强免疫应答的核苷酸序列。
[0247]
将疫苗配制成适合施用给患者的任何制剂，例如用于皮内或肌内注射的液体制剂。
[0248]
疫苗可以以适合多肽/蛋白疫苗或多核苷酸疫苗的任何方式施用，例如通过皮内、肌内、皮下注射，或通过粘膜或上皮施用，如鼻内、口服、肠内或施用至膀胱。
[0249]
特别地，当疫苗是多核苷酸疫苗时，疫苗优选以肌内或皮内施用。
[0250]
在一个实施方案中，疫苗通过结内注射施用。如本文所用，术语“结内注射”意指将疫苗注射到淋巴结中。
[0251]
通过上述方法制备的本发明的个体化治疗性抗癌疫苗可以在少于12周内获得，例如在少于9周或少于8周或少于6周内或在4周内获得。
[0252]
治疗的癌症可以是任何癌症，例如其中的癌细胞包含导致共有癌症抗原和任选的患者特异性癌症抗原的改变的癌症。癌症可以是原发性肿瘤、转移瘤或两者兼有。检查其改变的肿瘤可以是原发性肿瘤或转移瘤。在一个实施方案中，待治疗的癌症是已知具有高抗原荷载的癌症，例如黑色素瘤、肺癌、肾癌、头颈癌或膀胱癌。在另一个实施方案中，所治疗的癌症是实体癌或液体癌(liquid cancer)。实体癌的实例是形成实体块的癌症，例如肿瘤。液体癌的实例是存在于体液中的癌症，例如淋巴瘤或血液癌症。可以使用本发明的疫苗治疗的癌症的实例是乳腺癌、卵巢癌、结肠癌、前列腺癌、骨癌、结肠直肠癌、胃癌、淋巴瘤、恶性黑色素瘤、肝癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、胰腺癌、甲状腺癌、肾癌、胆管癌、脑癌、宫颈癌、膀胱癌、食道癌、霍奇金病和肾上腺皮质癌。
[0253]
在一个优选的实施方案中，使用包含如上所述的多核苷酸的疫苗进行治疗，例如其中所述多核苷酸是dna或rna，优选包含在载体中。
[0254]
优选肌内注射本发明的多核苷酸疫苗，例如在大肌肉中，例如在肩部、臀部或大腿中。已经发现本发明的多肽/二聚体蛋白是局部产生的，并且相关免疫细胞基本上将多肽/二聚体蛋白在其产生位点处内化，即基本上没有多肽/二聚体蛋白到达血流。
[0255]
可以使用用于注射多核苷酸疫苗的任何合适的方法，例如通过使用无针注射器(jet injector)或通过电穿孔辅助。
[0256]
疫苗可以以单剂量施用，也可以重复施用。当重复施用疫苗时，优选以至少3周的间隔施用，以避免t细胞耗减。
[0257]
因此，在一个实施方案中，剂量方案是在第0、3和6周接种疫苗，然后每4周接种一次，只要患者具有临床益处。疫苗可以施用长达一年。
[0258]
所述疫苗包含免疫有效量的多核苷酸/多肽/二聚体蛋白。“免疫学有效量”是指在接种上述化合物的患者中引发免疫应答所需的此类化合物的量。指示此免疫应答的非限制性参数包括以下一项或多项：停止肿瘤的生长和/或停止其扩散和/或减小肿瘤的大小，减
少疾病进展或稳定疾病，即癌症确实以较慢的速度发展或不发展。这包括肿瘤确实以较慢的速度生长或不生长和/或扩散较慢或不扩散，例如至淋巴结或形成转移瘤和/或不会变得更具侵略性。表明此免疫应答的其他非限制性参数是肿瘤收缩(在重量和/或体积方面)；单独肿瘤集落的数量减少；肿瘤消除；和无发展生存期。最终，由医生确定剂量，剂量取决于正在被治疗的患者的年龄、体重和整体状况、正在被治疗的癌症的严重程度、医生的判断以及本发明个体化疫苗的特定性质和特性并且可变化。在一个实施方案中，dna疫苗的剂量通常在0.3至6mg的范围内，而多肽/蛋白疫苗的剂量通常在5μg至5mg的范围内。
[0259]
在第十个方面，本发明提供了治疗患者中癌症的方法，所述方法包括向患者施用个体化治疗性抗癌疫苗，所述疫苗包含免疫有效量的：
[0260]
(i)包含编码靶向单元、二聚化单元和抗原单元的核苷酸序列的多核苷酸，其中所述抗原单元包含存在于所述患者中的至少一个共有抗原序列或其一个或多个部分，和任选的一个或多个对所述患者特异的抗原序列或其一个或多个部分；或
[0261]
(ii)由(i)中定义的多核苷酸编码的多肽；或
[0262]
(iii)由两个如(i)中定义的多核苷酸编码的多肽组成的二聚体蛋白；和
[0263]
药学上可接受的载体。
[0264]
因此，本发明提供了治疗患者中癌症的方法，所述方法包括向患者施用专门为该患者制备的本发明的个体化治疗性抗癌疫苗。
[0265]
另外，本发明提供了个体化治疗性抗癌疫苗，所述疫苗包含免疫有效量的：
[0266]
(i)包含编码靶向单元、二聚化单元和抗原单元的核苷酸序列的多核苷酸，其中所述抗原单元包含至少一个患者存在的共有抗原序列或其一个或多个部分和任选的一个或多个患者特异性抗原序列或其一个或多个部分；或
[0267]
(ii)由(i)中定义的多核苷酸编码的多肽；或
[0268]
(iii)由两个如(i)中定义的多核苷酸编码的多肽组成的二聚体蛋白；和
[0269]
药学上可接受的载体，用于治疗患者中癌症的方法中，其中所述疫苗专门为该患者制备。
[0270]
此外，本发明提供了以下在制备用于治疗患者癌症的药物中的用途：
[0271]
(i)包含编码靶向单元、二聚化单元和抗原单元的核苷酸序列的多核苷酸，其中所述抗原单元包含至少一个患者存在的共有抗原序列或其一个或多个部分和任选的一个或多个患者特异性抗原序列或其一个或多个部分；或
[0272]
(ii)由(i)中定义的多核苷酸编码的多肽；或
[0273]
(iii)由两个如(i)中定义的多核苷酸编码的多肽组成的二聚体蛋白；其中所述多核苷酸、多肽或二聚体蛋白是专门为该患者制备的。
[0274]
本发明的疫苗治疗可以与任何其他抗癌治疗如放射治疗、化学疗法和手术治疗组合。
[0275]
本发明的疫苗治疗也可以与检查点阻断抑制剂治疗组合。
附图说明
[0276]
图1显示了hpv16 e6的氨基酸序列和预测与患者1的hla i类等位基因结合的所有表位。两个带下划线的序列构成了hla i类优化序列，用于包含在针对患者1进行个体化的
治疗性抗癌疫苗的抗原单元中。
[0277]
图2显示了hpv16 e6的氨基酸序列和预测与患者1的hla i类和hla ii类等位基因结合的所有表位。方框中的序列构成了hla i类/hla ii类优化序列，用于包含在针对患者1进行个体化的治疗性抗癌疫苗的抗原单元中。
[0278]
图3显示了hpv16 e7的氨基酸序列和预测与患者1的hla i类等位基因结合的所有表位。带下划线的序列构成hla i类优化序列，用于包含在针对患者1进行个体化的治疗性抗癌疫苗的抗原单元中。
[0279]
图4显示了hpv16 e7的氨基酸序列和预测与患者1的hla i类和hla ii类等位基因结合的所有表位。两个方框中的序列构成hla i类/hla ii类优化序列，用于包含在针对患者1进行个体化的治疗性抗癌疫苗的抗原单元中。
[0280]
图5显示了hpv16 e6的氨基酸序列和预测与患者2的hla i类等位基因结合的所有表位。带下划线的序列构成了hla i类优化序列，用于包含在针对患者2进行个体化的治疗性抗癌疫苗的抗原单元中。
[0281]
图6显示了hpv16 e6的氨基酸序列和预测与患者2的hla i类和hla ii类等位基因结合的所有表位。方框中的序列构成了hla i类/hla ii类优化序列，用于包含在针对患者2进行个体化的治疗性抗癌疫苗的抗原单元中。
[0282]
图7显示了hpv16 e7的氨基酸序列和预测与患者2的hla i类等位基因结合的所有表位。带下划线的序列构成hla i类优化序列，用于包含在针对患者2进行个体化的治疗性抗癌疫苗的抗原单元中。
[0283]
图8显示了hpv16 e7的氨基酸序列和预测与患者2的hla i类和hla ii类等位基因结合的所有表位。两个方框中的序列构成hla i类/hla ii类优化序列，用于包含在针对患者2进行个体化的治疗性抗癌疫苗的抗原单元中。
[0284]
图9显示了与阴性对照vb1026相比，通过测量t细胞的ifn-γ免疫应答(总t细胞应答)，测定的dna疫苗(构建体)vb4097、vb4100和vb4105在接种了这些构建体的小鼠中的免疫原性。
[0285]
图10显示了与阴性对照vb1026比较，通过测量cd8+t细胞的ifn-γ免疫应答，测定的dna疫苗(构建体)vb4100、vb4101和vb4102在接种了这些构建体的小鼠中的免疫原性。
[0286]
图11显示了与阴性对照vb1026相比，通过测量a)t细胞(总t细胞应答)、b)cd8+t细胞和c)cd4+t细胞的ifn-γ免疫应答，测定的dna疫苗(构建体)vb4100和vb4102在接种了这些构建体的小鼠中的免疫原性。
[0287]
图12显示了与阴性对照vb1026相比，通过测量t细胞的ifn-γ免疫应答，测定的dna疫苗(构建体)vb4118、vb4119、vb4121、vb4127、vb4128和vb4130在接种了这些构建体的小鼠中的免疫原性。
实施例
[0288]
实施例1：包含在本发明的多核苷酸/多肽/二聚体蛋白和疫苗中的抗原单元的设计
[0289]
抗原单元可以设计为在患者存在的共有抗原序列中具有以下变化：
[0290]
a.全长序列
[0291]
b.hla优化序列。包含在抗原单元中的所选序列经过优化，以覆盖最具免疫原性的表位，即对患者的hla i和/或hla ii分子具有高结合亲和力的那些表位
[0292]
c.预测与患者的hla i和/或hla ii分子结合的表位
[0293]
d.a+c的组合
[0294]
e.b+c结合
[0295]
f.a+b的组合
[0296]
上述患者存在的共有抗原序列可以例如是hpv16。在包括全长序列的d和f的情况下，情况d可以例如是作为全长序列的hpv16 e7(a)和来自hpv e6的表位(c)的组合，而情况f可以例如是作为全长序列的hpv16 e7(a)和hla优化序列(b)的组合。上述实例包括一个单一的患者存在的共有抗原，但包括其两个不同的区域。在另一个实施方案中，情况d和f涉及第一患者存在的共有抗原如hpv16 e7的全长序列(a)和第二患者共有抗原的表位如kras的表位(c)或hla优化序列(b)的组合。
[0297]
因此，抗原单元可以包含来自一个患者存在的共有抗原的a-f或包含来自数个患者存在的共有抗原的a-f。
[0298]
根据本文提供的方法将序列a-f排列在抗原单元中。可以在动物模型中评估不同的抗原单元设计，例如如实施例3中所述，以确定最佳抗原单元设计。抗原特异性免疫原性的广度、强度和动力学可以通过ifn-γelispot分析来确定。
[0299]
可以在肿瘤挑战实验中测试抗肿瘤功效。
[0300]
实施例2：本发明的多核苷酸的构建
[0301]
设计了本发明的多核苷酸，其包含以下单元和组分：
[0302]
表1
[0303][0304][0305]
实施例3：选择患者存在的共有抗原的序列以包含在本发明的多核苷酸/多肽/二聚肽和疫苗中包含的抗原单元中
[0306]
获得了显示头颈部鳞状细胞癌的两名患者(患者1和2)的血液样品和肿瘤组织样
品。对血液样品进行外显子测序分析，以表征健康细胞中的外显子。对肿瘤组织样品进行外显子测序分析以表征肿瘤组织中的外显子，并进行rna-seq以评估每个基因的rna表达水平。在elisa中使用抗-hpv16抗体鉴定hpv16共有抗原的存在。
[0307]
为了找到最具免疫原性的序列，通过对正常组织(血细胞)进行测序来确定每个患者的hla i类和ii类等位基因。发现了以下hla i类和ii类等位基因：
[0308]
表2
[0309][0310][0311]
hpv具有大小约8kb的环状双链dna基因组，其编码八个基因，其中e6和e7具有转化特性。已知病毒e6和e7蛋白参与健康细胞向恶性细胞的转化。hpv16 e6和e7蛋白分别与肿瘤抑制因子p53和prb结合的能力已被认为是这些病毒蛋白诱导肿瘤的机制。因此，hpv16的e6和e7序列是已知的共有肿瘤抗原，并被选择用于在其中寻找包含在抗原单元中的序列。使用netmhcpan 4.0软件预测与患者的hla i类和hla ii类等位基因的结合。
[0312]
患者1：
[0313]
hpv 16 e6：
[0314]
预测共有16个长度均为9个氨基酸的表位与患者1的hla i类等位基因结合，并且预测共有16个长度均为9个氨基酸的表位与患者1的hla ii类等位基因结合(图2和表3)。
[0315]
因此，设计了包含在针对患者1的个体化治疗性抗癌疫苗中的抗原单元，其可以包含：
[0316]
a.全长hpv16 e6序列(151个氨基酸)。
[0317]
b.包含16个表位中的一些，例如图1左侧显示的12个带下划线的表位的hla i类优化序列。该序列含有65个氨基酸，即全长序列的43％。
[0318]
c.两个hla i类优化序列，其中第一个序列包含16个表位中的12个，第二个序列包含该表位中的3个(图1)。因此，两种序列的组合包括16个表位中的15个，并含有92个氨基酸，即全长序列的61％。
[0319]
d.hla i类/hla ii类优化序列，其包含16个hla i类表位中的12个和16个hla ii类表位中的9个，因此包含32个hla i类/ii类表位中的21个(图2，方框)。该序列含有65个氨基酸，即全长序列的43％。
[0320]
优选在抗原单元中包含c或d。
[0321]
表3
[0322]
[0323]
[0324][0325]
hpv16 e7：
[0326]
预测共有9个长度均为9个氨基酸的表位与患者1的hla i类等位基因结合，并且预测共有12个长度均为9个氨基酸的表位与患者1的hla ii类等位基因结合(图4和表4)。
[0327]
因此，设计了包含在针对患者1的个体化治疗性抗癌疫苗中的抗原单元，其可以包含：
[0328]
e.全长hpv16 e7序列(98个氨基酸)。
[0329]
f.包含9个表位中的一些，如图3中带下划线的表位的hla i类优化序列。该序列含有56个氨基酸，即全长序列的57％。
[0330]
g.两个hla i类/hla ii类优化序列，其中第一个序列包含9个hla i类表位中的2个和16个hla ii类表位中的7个，且第二个序列包含9个hla i类表位中的4个和16个hla ii类表位中的5个(图4，方框)。因此，两种序列的组合包含9个hla i类表位中的6个和所有的hla ii类表位。两种序列的组合含有54个氨基酸，即全长序列的55％。
[0331]
优选在抗原单元中包含f或g。
[0332]
基于上述，设计了包含在针对患者1的个体化治疗性抗癌疫苗中的抗原单元，其包含c、d、f和g中的至少一个或c、d、f和g的全部或这两个所述极值之间的任意组合。
[0333]
表4
[0334]
[0335][0336]
患者2：
[0337]
hpv16 e6
[0338]
预测共有14个长度均为9个氨基酸的表位与患者2的hla i类等位基因结合，并且预测共有14个长度均为9个氨基酸的表位与患者2的hla ii类等位基因结合(图6和表5)。
[0339]
因此，设计了包含在针对患者2的个体化治疗性抗癌疫苗中的抗原单元，其可以包含：
[0340]
h.全长hpv16 e6序列(151个氨基酸)。
[0341]
i.包含14个表位中的一些，如图5中所示的11个带下划线的表位的hla i类优化序列。该序列含有57个氨基酸，即全长序列的38％。
[0342]
j.hla i类/hla ii类优化序列，其包含14个hla i类表位中的11个和14个hla ii类表位中的8个，因此包含28个hla i类/ii类表位中的19个(图6，方框)。该序列含有59个氨基酸，即全长序列的39％。
[0343]
优选将j包含在抗原单元中。
[0344]
表5
[0345]
[0346][0347]
hpv16 e7
[0348]
预测共有10个长度均为9个氨基酸的表位与患者2的hla i类等位基因结合，并且预测共有11个长度均为9个氨基酸的表位与患者2的hla ii类等位基因结合(图8和表6)。
[0349]
因此，可以设计包含在针对患者2的个体化治疗性抗癌疫苗中的抗原单元，其包含：
[0350]
a.全长hpv16 e7序列(98个氨基酸)。
[0351]
b.包含10个表位中的一些，如图7中显示的6个带下划线的表位的hla i类优化序列。该序列含有26个氨基酸，即全长序列的27％。
[0352]
c.两种hla i类/hla ii类优化序列，其中第一个序列包含10个hla i类表位中的6个和11个hla ii类表位中的6个，且第二个序列包含10个hla i类表位中的2个和11个hla ii类表位中的5个(图8，方框)。因此，两种序列的组合包含11个hla i类表位中的8个和所有的hla ii类表位。两种序列的组合含有45个氨基酸，即全长序列的45％。
[0353]
优选在抗原单元中包含l或m。
[0354]
基于上述，设计了包含在针对患者2的个体化治疗性抗癌疫苗中的抗原单元，其包含j、l和m中的至少一个或j、l和m的全部或这两个所述极值之间的任意组合。
[0355]
表6
[0356][0357][0358]
比较患者1和2，即图2和6以及图4和8，明显地，包含在本发明的疫苗中的最佳序列在两个患者之间显著不同。
[0359]
实施例4：比较包含患者特异性抗原和患者存在的共有抗原的疫苗
[0360]
为了比较仅包含患者特异性抗原序列的疫苗与本发明的包含患者存在的共有抗原序列和任选的患者特异性抗原序列的疫苗的功效，使用小鼠tc-2肿瘤模型。
[0361]
如本文所述鉴定、加工和选择存在于tc-2肿瘤细胞系中的共有抗原和特异性抗原，即包含在抗原单元中的共有抗原序列基于它们与mhc分子的结合来选择，而特异性抗原序列在计算机预测免疫原性方法中基于其他参数来选择。选择包含在抗原单元中的共有抗
原是病毒抗原hpv16，并且选择了编码其e6和e7蛋白的部分的序列。
[0362]
所有选择的抗原序列均订购自商业供应商例如genscript(new jersey,us)，并克隆到表达载体pumvc4a中，其包含编码ld78beta靶向单元和higg3二聚化单元的序列。
[0363]
载体1的抗原单元仅包含共有的抗原序列，而载体2的抗原单元包含共有的抗原序列和特异性抗原序列。
[0364]
为了验证正确的疫苗体(vaccibody)形成，用载体转染hek293细胞，并通过蛋白质印迹和/或夹心elisa鉴定上清液中的疫苗体蛋白。空pumvc4a载体作为阴性对照。完整的同二聚体蛋白的形成如下验证：在导致二聚体蛋白被还原为单体的还原剂的存在下，或没有还原剂的情况下，通过抗-hmip-1α抗体在蛋白质印迹中检测来自转染细胞的上清液中的蛋白。
[0365]
通过将20μg的载体1和2分别与水性缓冲液混合来制备疫苗。将疫苗肌内注射到小鼠的胫骨前肌中，然后使用trigrid,ichor,(us)进行电穿孔。在第13天，将小鼠处死，并收获脾脏。
[0366]
通过ifn-γelispot评估t细胞应答。我们观察到本发明的疫苗诱导更广泛的t细胞应答，该应答比仅包含特异性抗原序列的疫苗更高。
[0367]
实施例5：本发明的个体化治疗性抗癌dna疫苗
[0368]
本发明的个体化治疗性抗癌dna疫苗可以根据监管机构的指导通过gmp制造包含本发明的多核苷酸的载体，以及dna疫苗的填充和完成(fill&finish)来制备。可以通过将载体以2-6mg/ml的浓度溶解在无菌盐溶液如pbs中来配制载体。疫苗可以在电穿孔(有或者没有)之后皮内或肌内施用，或者可以使用无针注射器施用。
[0369]
实施例6：选择患者存在的共有抗原(和患者特异性抗原)的序列用于包含在本发明的多核苷酸/多肽/二聚肽和疫苗中包含的抗原单元中
[0370]
获得了三名显示头颈部鳞状细胞癌的患者(患者1、2和3)的血液样品和肿瘤组织样品。对血液样品进行外显子测序分析以表征健康细胞中的外显子。对肿瘤组织样品进行外显子测序分析以表征肿瘤组织中的外显子，并进行rna-seq分析以评估每个基因的rna表达水平。
[0371]
使用pcr鉴定了hpv16共有抗原的存在。ny-eso-1的异位表达通过抗-ny-eso-1抗体在elisa中确定。针对每个患者的患者特异性抗原序列如先前在本技术和wo 2017/118695(通过引用包括在本文中)中所述地进行鉴定。
[0372]
ny-eso-1(也称为癌症/睾丸抗原1b)是属于癌症-睾丸抗原(cta)家族的蛋白，已发现其在多种恶性肿瘤中在mrna和蛋白水平上重表达，而其在成人组织中的正常表达仅限于生殖细胞和胎盘细胞。ny-eso-1表达在多种肿瘤类型中已有报道。
[0373]
对于hpv，hpv16的e6和e7序列是已知的共有肿瘤抗原，并选择用于在其中寻找包含在抗原单元中的序列。
[0374]
为了找到最具免疫原性的序列，通过对正常组织(血细胞)进行测序来确定每个患者的hla i类和ii类等位基因。使用netmhcpan 4.0软件预测hpv16 e6/e7序列和ny-eso-1序列与患者的hla i类和hla ii类等位基因的结合。分析中包括来自iedb数据库的序列，从文献中已知这些序列会引发阳性t细胞应答(与患者的hla等位基因不匹配)。
[0375]
下表列出了在患者1、2和3中发现的hla i类和ii类等位基因：
[0376]
表7
[0377][0378]
患者1：
[0379]
表8
[0380][0381]
*预测的长度均为9个氨基酸的分别与患者1的hla i类和ii类等位基因结合的表位总数。
[0382]
设计了包含在针对患者1的个体化治疗性抗癌疫苗中的抗原单元，其包含seq id no:14，seq id no:14包含以以下顺序的如上表右侧列中所示的序列：e7|接头|ny-eso-1|接头|e6。
[0383]
设计了包含在针对患者1的个体化治疗性抗癌疫苗中的第二抗原单元，其包含seq id no:15，seq id no:15包含如上表右侧列中所示的序列以及另外17个患者特异性抗原序列。最疏水的序列基本上位于抗原单元的中间，且最亲水的序列位于抗原单元的开头和末端。在序列之间插入甘氨酸-丝氨酸接头。抗原单元包含以下顺序的序列，其中t1d表示患者特异性抗原序列：t1d320|接头|t1d814|接头|t1d182|接头|t1d689|接头|e7|接头|t1d339|接头|t1d428|接头|ny-eso-1|接头|t1d572|接头|t1d359|接头|t1d488|接头|t1d554|接头|t1d272|接头|t1d210|接头|t1d849|接头|t1d4|接头|t1d77|接头|t1d717|接头|
t1d586|接头|e6。
[0384]
表9
[0385]
t1d320hnegddqqgsryslipqiqkvcevvdgt1d814seqermkssllkehmlrkqaelesaqct1d182elrenlltylpdsvtqlrrleeldlgnt1d689qevfssykfnhlvrrlvlqrekhfhylt1d339ieknadlcylstvhwslildavsnnyit1d428latagepyhdirfklmavvpdrrikyet1d572mlrlptvfrqirpvsrvlaphltrt1d359iqimenpfvqsmlwnpdlmrqlimanpt1d488llrflflglsalalpsraqlqlhlpant1d554mgknpvrpprafppvpsiddiplsrt1d272ghvdftieveraltvldgavlvlcavgt1d210eyklmygmlfsirlfvskmspldmkdgt1d849sqgagvesldfrlylryeflmlgiqpvt1d4aaktlvlcvsdiillsanisetssnktt1d77ckdlqlylsnlanhidretgigdvplvt1d717qskhtearelmysaallffshgqqnsat1d586mtlaesyaqyvynlcnslsikvees
[0386]
患者2：
[0387]
表10
[0388][0389]
*预测长度均为9个氨基酸的分别与患者2的hla i类和ii类等位基因结合的表位总数。
[0390]
设计了包含在针对患者2的个体化治疗性抗癌疫苗中的抗原单元，其包含seq id no:16，seq id no:16包含以以下顺序的如上表右侧列中所示的序列：e6|接头|ny-eso-1|接头|e7。
[0391]
设计了包含在针对患者2的个体化治疗性抗癌疫苗中的第二抗原单元，其包含seq id no:17，seq id no:17包含如上表右侧列中所示的序列以及另外17个患者特异性抗原序列。最疏水的序列基本上位于抗原单元的中间，且最亲水的序列位于抗原单元的开头和末端。在序列之间插入甘氨酸-丝氨酸接头。抗原单元包含以下顺序的序列，其中t1d表示患者特异性抗原序列：e6|接头|t1d323|接头|t1d506|接头|t1d12|接头|t1d315|接头|t1d302|接头|t1d700|接头|ny-eso-1|接头|t1d535|接头|t1d358|接头|t1d670|接头|t1d294|接头|t1d336|接头|t1d499|接头|t1d425|接头t1d491|接头|t1d314|接头|t1d430|接头|e7|接头|t1d582。
[0392]
表11
[0393]
t11d323kkvsktrhtretvfrrakrrwapipcst11d506nlkhenilqfltaqerktelgkqywlit11d12vqvfglyfgeefhetfdcpikt11d315gqaaasqaggargyargaqlwppgsdpt11d302simqtwftlftptdatsivattvmsnst11d700qenvrfvlvrseallpnagprsaearvt11d535dafpnlkdfisrfqvmppssflfdapct11d358psslqvkpetpaseavavaaaaaptttt11d670rffhladlflsssqlpaylvaafakrlt11d294lvflwlhslrrlfgclyvsvfsnvmiht11d336wenaiaalfrrhiavswliratlseset11d499ryifvksagsrieegvlqflvllvagrt11d425qeiewlpfrcikclklsfstaellcmht11d491lvarcppclrllrqardfqaarydrhdt11d314algtpedldsyidlsleslnqmileldt11d430sqdmlsimeklefldfsydlnlcgltet11d582rreqyipneeflhfdlledskyrkiys
[0394]
患者3：
[0395]
表12
[0396][0397]
*预测的长度均为9个氨基酸的分别与患者3的hla i类和ii类等位基因结合的表位总数。
[0398]
设计了包含在针对患者3的个体化治疗性抗癌疫苗中的抗原单元，其包含seq id no:18，seq id no:18包含以以下顺序的如上表右侧列中所示的序列：ny-eso-1|接头|e7|接头|e6。
[0399]
设计了包含在针对患者3的个体化治疗性抗癌疫苗中的第二抗原单元，其包含seq id no:19，seq id no:19包含如上表右侧列中所示的序列以及另外17个患者特异性抗原序列。最疏水的序列基本上位于抗原单元的中间，且最亲水的序列位于抗原单元的开头和末端。在序列之间插入甘氨酸-丝氨酸接头。抗原单元包含以下顺序的序列，其中t1d表示患者特异性抗原序列：t1d223|接头|t1d164|接头|t1d56|接头|t1d36|接头|t1d129|接头|t1d274|接头|t1d62|接头|t1d5|接头|t1d144|接头|t1d441|接头|t1d368|接头|ny-eso-1|接头|t1d234|接头|t1d162|接头|t1d39|接头|t1d272|接头|e7|接头|t1d328|接头|t1d188|接头|e6。
[0400]
表13
[0401]
t1d223gpsyrsnsvssldleget1d164lkeekenlqglvthqtyiiqelekqlnt1d56qrqktagkifraevstgqdaprqaqart1d36ilrpstvnelesgeisydevgerikdft1d129dtcinedveslrkmvqdllaklqeakrt1d274lreegtkyksfvqrarlvfreegylaft1d62hegarpmraiflangnvfttgfsrmset1d5ipdaafiqaarrkcelaraqddyisldt1d144meiakmragrrlwvhliekmfqpknskt1d441melvsfrdvaiefspeewt1d368tcvheipfhfdlmellpqcqqlqmfflt1d234vrrvfitddfhdmipkylnfvkgvvdst1d162nfhahrekapslfcsrilnkavylfygt1d39dankegmflfraahklrqflkmnstgdt1d272llslgwsvdvgrhsgwtghvstswsint1d328ntifslrkdlrqgkarrlrcmeekemft1d188nhfndfegdpamtqfleefeknledtk
[0402]
实施例7：本发明的dna疫苗的免疫原性
[0403]
包含共有抗原序列和/或新表位的dna疫苗的设计：
[0404]
设计了五种dna疫苗(构建体)，其包含编码表14中所示单元/部分的核苷酸序列：
[0405]
表14
[0406][0407]
包含10个ct26新表位的dna疫苗vb4097：
[0408]
选择该构建体作为包含患者特异性抗原序列即新表位的个体化dna疫苗的模型。
[0409]
先前描述的对小鼠结肠癌细胞系ct26的外显子组测序和rna测序揭示了成百上千个肿瘤特异性非同义突变。使用计算机方法鉴定潜在的免疫原性序列，即新表位，并且选这些表位中有10个(表15)被选择包含在vb4097的抗原单元中。所鉴定的10个新表位均是由27个氨基酸组成的肽。除了末端新表位以外，所有新表位排列在亚单元中，每个亚单元由一个新表位和一个柔性甘氨酸-丝氨酸接头(ggggsggggs)组成。
[0410]
vb4097由编码氨基酸序列为seq id no:20的多肽的dna序列组成。
[0411]
表15
[0412][0413]
包含ny-eso-1序列或其部分的dna疫苗vb4100、vb4101和vb4102。
[0414]
选择这些构建体作为包含患者存在的共有抗原序列的个体化dna疫苗的模型。
[0415]
人纽约食管鳞状细胞癌1(ny-eso-1)已被证明是一种高免疫原性的癌症睾丸抗原，其在多种癌症类型中异常表达。ny-eso-1不在ct26癌细胞系中内源性表达，但使用计算机方法，预测数种免疫原性序列与balb/c小鼠中的小鼠mhc i类和ii类结合。选择上述构建体作为包含患者存在的共有抗原序列的个体化dna疫苗的模型。
[0416]
因此设计了三种ny-eso-1构建体：
[0417]
·
vb4100，具有包含全长ny-eso-1的抗原单元。vb4100，由编码氨基酸序列为seq id no:21的多肽的dna序列组成。
[0418]
·
vb4101，具有包含预测为mhc i类抗原的ny-eso-1序列的氨基酸81-88的抗原单元。vb4101由编码氨基酸序列是seq id no:22的多肽的dna序列组成。
[0419]
·
vb4102具有包含含有被预测为mhc i类和ii类抗原的数种抗原的ny-eso-1序列的氨基酸81-126的抗原单元。vb4102由编码氨基酸序列为seq id no:23的多肽的dna序列
组成。
[0420]
构建体中包含的各种ny-eso-1序列如表16所示。
[0421]
表16
[0422][0423][0424]
包含10个ct26新表位和ny-eso-1序列的全长序列的dna疫苗vb4105
[0425]
选择该构建体作为包含患者存在的共有抗原序列和患者特异性抗原序列(新表位)的个体化dna疫苗的模型。它包含含有ny-eso-1的全长序列和表1中所示的10个ct26新表位的抗原单元，这些表位中的每一个均通过柔性甘氨酸-丝氨酸接头(ggggsggggs)与随后的新表位或ny-eso-1序列分隔开。vb4105由编码氨基酸序列为seq id no:24的多肽的dna序列组成。
[0426]
阴性对照vb1026：
[0427]
该构建体与上述构建体相同，但既不包含单元接头，也不包含抗原单元。它用作阴性对照。vb1026由编码氨基酸序列为seq id no:25的多肽的dna序列组成。
[0428]
构建包含构建体的表达载体并验证由构建体编码的完整二聚体蛋白的表达和分泌：
[0429]
所有上述构建体的抗原单元的序列均订购自genscript(new jersey,usa)并克隆到表达载体pumvc4a，主质粒，其包含编码如上表14中所述的信号肽、靶向单元和二聚化单
元的核苷酸序列。
[0430]
用上述构建体瞬时转染hek293细胞(atcc)。简言之，将2x105个细胞/孔铺板在具有10％fbs生长培养基的24孔组织培养板中，并在制造商(invitrogen，thermo fischer scientific)建议的条件下使用2000试剂用1μg相应的dna质粒转染细胞。然后将转染的细胞在37℃和5％co2下保持长达5天。随后，收获细胞上清液，通过使用针对抗higg(ch3结构域)、hmip-1α和相应抗原单元的特异性抗体对上清液进行夹心elisa来表征由构建体编码的蛋白的表达。
[0431]
评估构建体的免疫原性：
[0432]
构建体的免疫原性通过测量接种了构建体的小鼠体内引发的t细胞免疫应答的方式来确定。
[0433]
雌性6周龄balb/c小鼠购自janvier labs(法国)。所有动物都饲养在位于radium医院(挪威奥斯陆)的动物设施中。所有动物方案均经挪威食品安全局(挪威奥斯陆)批准。5只小鼠/组用于测试包含抗原单元的构建体，而3只小鼠/组用于阴性对照。
[0434]
肌内施用两次20μg构建体，即在第0天和第21天，然后进行电穿孔。在第28天收集脾脏。
[0435]
将脾脏在细胞过滤器中捣碎以获得单细胞悬液。对于每个测试的构建体，一部分单细胞悬液用于使用dynabeads
tm
耗减来纯化cd4+和cd8+t细胞。然后在elispot测定中检测总脾细胞、cd4耗减的脾细胞和cd8耗减的脾细胞的inf-γ产生。表15中所示的10个新表位用于再刺激从接种了构建体vb4097和vb4105的小鼠中收获的脾细胞，而下表17中所示的ny-eso-1肽用于再刺激从接种了如该表所示的构建体的小鼠中收获的脾细胞。
[0436]
表17：用于刺激脾细胞的ny-eso-1肽
[0437]
[0438]
[0439][0440]
构建体vb4097、vb4100和vb4105的免疫原性比较
[0441]
比较了构建体vb4097(10个新表位)、vb4100(ny-eso-1全长)和vb4105(10个新表位和ny-eso-1全长)引发针对表15(vb4097和vb4105)和表17(vb4100和vb4105)中的肽的t细胞免疫应答的能力。
[0442]
如图9所示，接种了阴性对照vb1026的小鼠对新表位和ny-eso-肽序列均表现出低的基础免疫原性。
[0443]
包含相同的10个ct26新表位的vb4097和vb4105两者均诱导针对10个新表位的相似的总t细胞应答(inf-γ应答)(图9，灰色条形)，这与抗原单元是否仅包含10个新表位
(vb4097)或是还包含ny-eso-1的全长序列(vb4105)无关。
[0444]
此外，包含ny-eso-1的全长序列的vb4100和vb4105两者均诱导针对如表17所示的用于再刺激的肽的相似的总t细胞应答(inf-γ应答)(图9，黑色条形)，这与抗原单元是否仅包含ny-eso-1的全长序列(vb4100)或是还包含10个新表位(vb4105)无关。
[0445]
对于vb4105，将ny-eso-1全长序列添加到包含10个新表位的vb4097的抗原单元中确实引发了比由接种vb4097更高的总t细胞应答，这是由于增加的针对ny-eso-1的免疫原性。
[0446]
这些结果表明，本发明的包含患者存在的共有抗原的疫苗能够引发与包含患者特异性抗原(新表位)的疫苗相似的免疫应答。此外，这些结果表明，在抗原单元中包含患者存在的共有抗原和患者特异性抗原(新表位)两者是有益的。
[0447]
构建体vb4100、vb4101和vb4102的免疫原性比较
[0448]
使用计算机方法，预测由ny-eso-1的氨基酸81-88组成的表位强烈地结合mhc i类以活化cd8+t细胞，而预测由ny-eso-1的氨基酸81至126组成的肽含有数个mhc i类和ii类抗原。因此，构建了构建体vb4100(ny-eso-1全长)、vb4101(ny-eso-1氨基酸81-88)和vb4102(ny-eso-1氨基酸81-126)，并比较了它们引发t细胞免疫应答的能力。
[0449]
首先，比较了三种构建体引发针对预测的氨基酸81-88区域的cd8+t细胞免疫应答的能力。用表16中所示的氨基酸81-88最小表位重新刺激了从接种了构建体的小鼠的脾细胞分离的cd8+t细胞。如图10所示，实验证实由ny-eso-1的氨基酸81-88组成的表位确实是强cd8+t细胞表位。此外，该区域的免疫原性与表位是抗原单元中的唯一序列(vb4101)还是抗原单元包含较长ny-eso-1序列或完整ny-eso-1序列无关。
[0450]
接下来，将vb4102与vb4100进行比较，以评估ny-eso-1的81-126的氨基酸序列中的数个预测的mhc i类和ii类抗原是否引发与全长ny-eso-1序列相似的应答。用表17中所示的肽重新刺激了从接种了构建体的小鼠的脾细胞中分离的cd4+t细胞和cd8+t细胞。如图11所示，从分离的cd8+(图11b)和cd4+t细胞(图11c)以及从总t细胞应答(图11a)来看，ny-eso-1的81-126的氨基酸序列引发了比ny-eso-1全长序列更强的应答。
[0451]
这些结果表明，通过使用计算机方法，可以鉴定出预测会引发强免疫应答的患者存在的共有抗原的短(更短)序列/表位。通过在本发明疫苗的抗原单元中包含此类序列/表位而不是患者存在的共有抗原的较长序列或全长序列，在抗原单元中留有空间用于包含其他患者存在的共有抗原和/或患者特异性抗原/新表位的序列。这将增加接受这样的单独抗癌疫苗的患者显示对疫苗的强免疫应答的机率。
[0452]
实施例8：本发明的dna疫苗的免疫原性
[0453]
包含共有抗原序列和/或新表位的dna疫苗的设计：
[0454]
设计了六种dna疫苗(构建体)，其包含编码表18中所示单元/部分的核苷酸序列：
[0455]
表18
[0456][0457][0458]
包含10个b16新表位的dna疫苗vb4118：
[0459]
选择该构建体作为包含患者特异性抗原序列即新表位的个体化dna疫苗模型。
[0460]
先前描述的对小鼠黑色素瘤细胞系b16.f10的外显子组测序和rna测序揭示了成百上千个肿瘤特异性非同义突变。计算机方法用于鉴定潜在的免疫原性序列，即新表位，这些表位中有10个(表19)选择包含在vb4118的抗原单元中。所鉴定的10个新表位均是由27个氨基酸组成的肽。除末端新表位外，所有新表位均排列在亚单元中，每个亚单元由一个新表位和一个柔性甘氨酸-丝氨酸接头(ggggsggggs)组成。
[0461]
vb4118由编码氨基酸序列为seq id no:26的多肽的dna序列组成。
[0462]
表19
[0463][0464][0465]
包含trp-2序列的dna疫苗vb4119和包含移框抗原的dna疫苗vb4127
[0466]
选择这些构建体作为包含患者存在的共有抗原序列的个体化dna疫苗模型。
[0467]
酪氨酸酶相关蛋白2(trp-2)是一种黑色素细胞谱系正常分化蛋白。已知这种共有抗原(分化抗原)在c57bl/6小鼠体内诱导b16黑色素瘤细胞的肿瘤排斥。在文献中，表20中所示的9个氨基酸长的mhc i类表位(trp-2的氨基酸180-188)已被鉴定为引起trp-2抗肿瘤作用的免疫原性序列。
[0468]
vb4119由编码氨基酸序列为seq id no:27的多肽的dna序列组成。
[0469]
表20
[0470][0471]
移框突变是当核苷酸的indel(插入或缺失)导致dna阅读框发生移位时出现的dna突变。因此，indel后的整个dna序列会被错误读取，从而产生的蛋白将被改变。肿瘤细胞中出现的移框突变会产生可能具有高免疫原性的新的肽序列，此外，相同的移框抗原可能会出现在不同患者中，因此代表了有前景的共有抗原癌症疫苗靶标(参见例如ballhausen et al.,nat.commun.11,2020,1-13)。表21中所示的三种移框抗原通过计算机方法鉴定为具有免疫原性并在vb4127构建体中编码。在抗原单元中，它们被柔性甘氨酸-丝氨酸接头(ggggsggggs)彼此分隔开。
[0472]
vb4127由编码氨基酸序列为seq id no:28的多肽的dna序列组成。
[0473]
表21
[0474][0475]
包含10个b16新表位和trp-2表位(vb4121)或10个b16新表位和3个移框抗原(vb4128)或10个b16新表位、trp-2表位和3个移框抗原(vb4130)的dna疫苗
[0476]
选择这些构建体作为包含患者存在的共有抗原序列和患者特异性抗原序列(新表位)的个体化dna疫苗的模型。每种构建体均包含含有表19中所示的10个b16新表位的抗原单元，这些表位均都通过柔性甘氨酸-丝氨酸接头(ggggsggggs)与随后的新表位或共有抗原序列分隔开。使用相同的接头来分隔包含数个共有抗原序列的构建体中的共有抗原序列。vb4121由编码氨基酸序列为seq id no:29的多肽的dna序列组成；vb4128由编码具有氨基酸序列为seq id no:30的多肽的dna序列组成，vb4130由编码氨基酸序列为seq id no:31的多肽的dna序列组成。
[0477]
实施例7中描述的构建体vb1026用作阴性对照。
[0478]
构建包含构建体的表达载体和验证由构建体编码的完整二聚体蛋白的表达和分
泌
[0479]
如实施例7中所述地构建包含上述构建体的表达载体。如实施例7中所述地验证由构建体编码的完整二聚体蛋白的表达和分泌。
[0480]
评估构建体的免疫原性
[0481]
构建体的免疫原性通过测量接种了构建体的小鼠体内引发的t细胞免疫应答来确定。
[0482]
雌性6周龄balb/c小鼠从janvier labs(法国)获得。所有动物都饲养在位于radium医院(挪威奥斯陆)的动物设施中。所有动物方案均经挪威食品安全局(挪威奥斯陆)批准。5只小鼠/组用于测试包含抗原单元的构建体，而3只小鼠/组用于阴性对照。
[0483]
在第0天肌内施用20μg构建体，然后进行电穿孔。在第14天收集经接种的小鼠的脾脏。处理收集的脾脏，并如实施例7所述进行elispot测定。
[0484]
表19中所示的10个新表位用于重刺激从接种了构建体vb4118、vb4121、vb4128和vb4130的小鼠中收获的脾细胞。表20中的trp-2肽用于重刺激从接种了构建体vb4119、vb4121和vb4130的小鼠中收获的脾细胞。下表22中所示的移框肽用于重刺激从接种了构建体vb4127、vb4128和vb4130的小鼠中收获的脾细胞。
[0485]
表22
[0486]
基因移框肽id序列长度mazb-pepm108yisdhmkvhspspcl dync1h1b-pepm115egwqtcwgrsrkhwg15个氨基酸dync1h1b-pepm116grsrkhwgstwngsa15个氨基酸dync1h1b-pepm117gstwngsarlspgst15个氨基酸dync1h1b-pepm118arlspgstlwvmric15个氨基酸dync1h1b-pepm119tlwvmriclrslgia15个氨基酸dync1h1b-pepm120clrslgiartwlscr15个氨基酸dync1h1b-pepm121artwlscrstsrkcs15个氨基酸dync1h1b-pepm122rstsrkcspafpass15个氨基酸prtgb-pepm141lfrllpsgpkvndghrsrrwhsldlyp27个氨基酸prtgb-pepm142srrwhsldlyphlcshldlpkqsqevirl29个氨基酸
[0487]
构建体vb4118、vb4119、vb4121、vb4127、vb4128和vb4130的免疫原性比较
[0488]
比较构建体vb4118(10个新表位)、vb4119(trp-2)、vb4121(10个新表位和trp-2)、vb4127(3个移框抗原)、vb4128(10个新抗原和3个移框抗原)和vb4130(10个新表位、3个移框抗原和trp-2)引发针对表19、20和22中的肽的t细胞免疫应答的能力，如果适用的话。
[0489]
如图12所示，接种了阴性对照vb1026的小鼠对所有测试的肽均显示出低的基础免疫原性。
[0490]
仅包含患者特异性抗原的疫苗模型构建体(vb4118)和仅包含患者存在的共有抗原的疫苗模型构建体(vb4119和vb4127)在接种的小鼠中引发免疫应答。
[0491]
vb4118、vb4121、vb4128和vb4130均包含相同的10个b16新表位，诱导针对10个新表位的相似的总t细胞应答(inf-γ应答)(图12，黑条)，这与抗原单元是否仅包含10个新表位(vb4118)或另外包含trp-2表位(vb4121)、3个移框抗原(vb4128)或trp-2表位加上3个移
框抗原(vb4130)无关。
[0492]
此外，图12显示，将共有抗原添加至新表位构建体导致更广泛且增加的总t细胞应答，其中编码10个新表位、3个移框抗原和trp-2表位的构建体(vb4130)观察到的总t细胞应答最高。
[0493]
该研究的结果还表明，本发明的包含患者存在的共有抗原的疫苗可以引发与包含患者特异性抗原(新表位)的疫苗相似的免疫应答。此外，这些结果表明，通过将不同类型的共有抗原和患者特异性抗原(新表位)包含在抗原单元中，将具有更广泛的增加的t细胞应答的益处。
[0494]
序列
[0495]
seq id no:1
[0496]
c-c基序趋化因子3-样1前体，包含信号肽(aa 1-23)和成熟肽(hmip1α/ld78-beta,aa 24-93):
[0497]
mqvstaalavllctmalcnqvlsaplaadtptaccfsytsrqipqnfiadyfetssqcskpsvifltkrgrqvcadpseewvqkyvsdlelsa
[0498]
seq id no:2
[0499]
mqvstaalavllctmalcnqvls|aplaadtptaccfsytsrqipqnfiadyfetssqcskpsvifltkrgrqvcadpseewvqkyvsdlelsa|elktplgdttht i epkscdtpppcprcp|gggssgggsg|gqprepqvytlppsreemtk
[0500]
nqvsltclvkgfypsdiavewessgqpennynttppmldsdgsfflyskltvdksrwqqgnifscsvmhealhnrftqkslslspgk|glggl|
[0501]
seq id no:3
[0502]
接头，氨基酸序列:glsgl
[0503]
seq id no:4
[0504]
接头，氨基酸序列:glggl
[0505]
seq id no:5
[0506]
铰链区1(人igg3 uh铰链),12个氨基酸:elktplgdttht
[0507]
seq id no:6
[0508]
铰链区4(人igg3,mh铰链,15个氨基酸):epkscdtpppcprcp
[0509]
seq id no:7
[0510]
甘氨酸-丝氨酸接头:gggssgggsg
[0511]
seq id no:8
[0512]
hch3 igg3,氨基酸序列:
[0513]
gqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewessgqpennynttppmldsdgsfflyskl tvdksrwqqg nifscsvm h ealh nrftqkslslspgk
[0514]
seq id no:9
[0515]
信号肽
[0516]
mnfglrliflvltlkgvqc
[0517]
seq id no:10
[0518]
信号肽
[0519]
mdamkrglccvlllcgavfvsp
[0520]
seq id no:11:hpv16 e6
[0521]
mfqdpqerprklpqlctelqttihdiilecvyckqqllrrevydfarrdlcivyrdgnpyavrdkclkfyskiseyrhycyslygttleqqynkplcdllircinrqkplcpeekqrhldkkqrfhnirgrwtgrcmsccrssrtrretql
[0522]
seq id no:12:hpv16 e7
[0523]
mhgdtptlheymldlqpettdlygygqlndsseeedeidgpagqaepdrahynivtfcckcdstlrlcvqsthvdirtledllmgtlgivcpicsqkp
[0524]
seq id no:13:ny-eso-1
[0525]
mqaegrgtggstgdadgpggpgipdgpggnaggpgeagatggrgprgagaarasgpgggaprgphggaasglngccrcgargpesrllefylampfatpmeaelarrslaqdapplpvpgvllkeftvsgniltirltaadhrqlqlsissclqqlsllmwitqcflpvflaqppsgqrr
[0526]
seq id no:14(302个氨基酸)
[0527]
包含以下顺序的抗原序列的抗原单元:e7|接头|ny-eso-1|接头|e6.vqsthvdirtledllmgtlgivcpicsqkpggggsggggsargpesrllefylampfatpmeaelarrslaqdapplpvpgvllkeftvsgniltirltaadhrqlqlsissclqqlsllmwitqcflpvflaqppsgqrrsggggsggggmfqdpqerprklpqlctelqttihdiilecvyckqqllrrevydfarrdlcivyrdgnpyavrdkclkfyskiseyrhycyslygttleqqynkplcdllircinrqkplcpeekqrhldkkqrfhnirgrwtgrcmsccrssrtrretql
[0528]
seq id no:15(924个氨基酸)
[0529]
包含以下顺序的抗原序列的抗原单元:t1d320|接头|t1d814|接头|t1d182|接头|t1d689|接头|e7|接头|t1d339|接头|t1d428|接头|ny-eso-1|接头|t1d572|接头|t1d359|接头|t1d488|接头|t1d554|接头|t1d272|接头|t1d210|接头|t1d849|接头|t1d4|接头|t1d77|接头|t1d717|接头|t1d586|接头|e6
[0530]
hnegddqqgsryslipqiqkvcevvdggssgggssggseqermkssllkehmlrkqaelesaqcsggggsggggelrenlltylpdsvtqlrrleeldlgnggggsggggsqevfssykfnhlvrrlvlqrekhfhylsggggsggggvqsthvdirtledllmgtlgivcpicsqkpggggsggggsieknadlcylstvhwslildavsnnyiggggsggggslatagepyhdirfklmavvpdrrikyeggggsggggsargpesrllefylampfatpmeaelarrslaqdapplpvpgvllkeftvsgniltirltaadhrqlqlsissclqqlsllmwitqcflpvflaqppsgqrrsggggsggggmlrlptvfrqirpvsrvlaphltrsggggsggggiqimenpfvqsmlwnpdlmrqlimanpggggsggggsllrflflglsalalpsraqlqlhlpanggggsggggsmgknpvrpprafppvpsiddiplsrgsggggsgggghvdftieveraltvldgavlvlcavgssgggssgggeyklmygmlfsirlfvskmspldmkdggssgggssggsqgagvesldfrlylryeflmlgiqpvggggsggggsaaktlvlcvsdiillsanisetssnktsggggsggggckdlqlylsnlanhidretgigdvplvggggsggggsqskhtearelmysaallffshgqqnsaggggsggggsmtlaesyaqyvynlcnslsikveessggggsggggmfqdpqerprklpqlctelqttihdiilecvyckqqllrrevydfarrdlcivyrdgnpyavrdkclkfyskiseyrhycyslygttleqqynkplcdllircinrqkplcpeekqrhldkkqrfhnirgrwtgrcmsccrssrtrretql
[0531]
seq id no:16(227个氨基酸)
[0532]
包含以下顺序的抗原序列的抗原单元:e6|接头|ny-eso-1|接头|e7
[0533]
vrdkclkfyskiseyrhycyslygttleqqynkplcdllircinrqkplcpeekqrhldkkqrfhnirg
rwtgrcmsccrssrtrretqlsggggsgggggargpesrllefylampfatpmeaelarrslaqdapplpvpgvllkeftvsgniltirltaadhrqlqlsiggggsggggsagqaepdrahynivtfcckcdstlrlcvqsthvdirtledllmgtl
[0534]
seq id no:17(850个氨基酸)
[0535]
包含以下顺序的抗原序列的抗原单元:e6|接头|t1d323|接头|t1d506|接头|t1d12|接头|t1d315|接头|t1d302|接头|t1d700|接头|ny-eso-1|接头|t1d535|接头|t1d358|接头|t1d670|接头|t1d294|接头|t1d336|接头|t1d499|接头|t1d425|接头t1d491|接头|t1d314|接头|t1d430|接头|e7|接头|t1d582
[0536]
vrdkclkfyskiseyrhycyslygttleqqynkplcdllircinrqkplcpeekqrhldkkqrfhnirgrwtgrcmsccrssrtrretqlsggggsggggkkvsktrhtretvfrrakrrwapipcssggggsggggnlkhenilqfltaqerktelgkqywliggggsggggsvqvfglyfgeefhetfdcpikgsggggsggggqaaasqaggargyargaqlwppgsdpggggsggggssimqtwftlftptdatsivattvmsnssggggsggggqenvrfvlvrseallpnagprsaearvggggsggggsgargpesrllefylampfatpmeaelarrslaqdapplpvpgvllkeftvsgniltirltaadhrqlqlsiggggsggggsdafpnlkdfisrfqvmppssflfdapcsggggsggggpsslqvkpetpaseavavaaaaaptttsggggsggggrffhladlflsssqlpaylvaafakrlsggggsgggglvflwlhslrrlfgclyvsvfsnvmihsggggsggggwenaiaalfrrhiavswliratlseseggggsggggsryifvksagsrieegvlqflvllvagrsggggsggggqeiewlpfrcikclklsfstaellcmhggggsggggslvarcppclrllrqardfqaarydrhdggggsggggsalgtpedldsyidlsleslnqmileldggggsggggssqdmlsimeklefldfsydlnlcglteggggsggggsagqaepdrahynivtfcckcdstlrlcvqsthvdirtledllmgtlgggsggggsgrreqyipneeflhfdlledskyrkiys
[0537]
seq id no:18(221个氨基酸):
[0538]
包含以下顺序的抗原序列的抗原单元:ny-eso-1|接头|e7|接头|e6
[0539]
gargpesrllefylampfatpmeaelarrslaqdapplpvpgvllkeftvsgniltirltaadhrqlqlsissclqqlsllmwitqcflpvfggggsggggsagqaepdrahynivtfcckcdstlrlcvqsthvdirtlsggggsggggkfyskiseyrhycyslygttleqqynkplcdllircinrqkplcpeekqrhldkkqrfhnirgrwtgrcms
[0540]
seq id no:19(831个氨基酸)
[0541]
包含以下顺序的抗原序列的抗原单元:t1d223|接头|t1d164|接头|t1d56|接头|t1d36|接头|t1d129|接头|t1d274|接头|t1d62|接头|t1d5|接头|t1d144|接头|t1d441|接头|t1d368|接头|ny-eso-1|接头|t1d234|接头|t1d162|接头|t1d39|接头|t1d272|接头|e7|接头|t1d328|接头|t1d188|接头|e6
[0542]
gpsyrsnsvssldlegeggggsggggslkeekenlqglvthqtyiiqelekqlnggggsggggsqrqktagkifraevstgqdaprqaqargggssgggssilrpstvnelesgeisydevgerikdfggggsggggsdtcinedveslrkmvqdllaklqeakrsggggsgggglreegtkyksfvqrarlvfreegylafggggsggggshegarpmraiflangnvfttgfsrmseggggsggggsipdaafiqaarrkcelaraqddyisldggggsggggsmeiakmragrrlwvhliekmfqpknskggggsggggsmelvsfrdvaiefspeewggggsggggstcvheipfhfdlmellpqcqqlqmfflgggsggggsggargpesrllefylampfatpmeaelarrslaqdapplpvpgvllkeftvsgniltirltaadhrqlqlsissclqqlsllmwitqcflpvfggggsggggsvrrvfitddfhdmipkylnfvkgvvdssggggsggggnfhahrekapslfcsrilnkavylfygssgggssgggdankegmflfraahklrqflkmnstgdggggsggggsllslgwsvdvgrhsgwtghvstswsinggggsggggsagqaepdrahynivtfcckcdstlrlcvqsthvdirtlsggggsggg
gntifslrkdlrqgkarrlrcmeekemfggggsggggsnhfndfegdpamtqfleefeknledtkggggsggggskfyskiseyrhycyslygttleqqynkplcdllircinrqkplcpeekqrhldkkqrfhnirgrwtgrcms
[0543]
seq id no:20
[0544]
vb4097的氨基酸序列
[0545]
mqvstaalavllctmalcnqvlsaplaadtptaccfsytsrqipqnfiadyfetssqcskpsvifltkrgrqvcadpseewvqkyvsdlelsaelktplgdtthtepkscdtpppcprcpgggssgggsggqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewessgqpennynttppmldsdgsfflyskltvdksrwqqgnifscsvmhealhnrftqkslslspgkglgglkiyefdyhlygqnitmimtsvsghllaggggsggggsaeygdyqpevhgvpyfrlehylparvmggggsggggsgslfgssrvqyvvnpavkivflnidpsggggsggggslwvylrpvprpatiylqilrlkpltgeggggsggggstlaflvlstpamfnralkpflkschfqggggsggggsfvspmahyvpgimaiesvvarfqfivpggggsggggsvilpqapsgpsyatylqpaqaqmltppggggsggggseviqtskyymrdviaiesawllelaphggggsggggsdtlsamsnpramqvllqiqqglqtlatggggsggggskswihcwkylsvqsqlfrgssllfrrv
[0546]
seq id no:21
[0547]
vb4100的氨基酸序列
[0548]
mqvstaalavllctmalcnqvlsaplaadtptaccfsytsrqipqnfiadyfetssqcskpsvifltkrgrqvcadpseewvqkyvsdlelsaelktplgdtthtepkscdtpppcprcpgggssgggsggqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewessgqpennynttppmldsdgsfflyskltvdksrwqqgnifscsvmhealhnrftqkslslspgkglgglmqaegrgtggstgdadgpggpgipdgpggnaggpgeagatggrgprgagaarasgpgggaprgphggaasglngccrcgargpesrllefylampfatpmeaelarrslaqdapplpvpgvllkeftvsgniltirltaadhrqlqlsissclqqlsllmwitqcflpvflaqppsgqrr
[0549]
seq id no:22
[0550]
vb4101的氨基酸序列
[0551]
mqvstaalavllctmalcnqvlsaplaadtptaccfsytsrqipqnfiadyfetssqcskpsvifltkrgrqvcadpseewvqkyvsdlelsaelktplgdtthtepkscdtpppcprcpgggssgggsggqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewessgqpennynttppmldsdgsfflyskltvdksrwqqgnifscsvmhealhnrftqkslslspgkglgglrgpesrll
[0552]
seq id no:23
[0553]
vb4102的氨基酸序列
[0554]
mqvstaalavllctmalcnqvlsaplaadtptaccfsytsrqipqnfiadyfetssqcskpsvifltkrgrqvcadpseewvqkyvsdlelsaelktplgdtthtepkscdtpppcprcpgggssgggsggqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewessgqpennynttppmldsdgsfflyskltvdksrwqqgnifscsvmhealhnrftqkslslspgkglgglrgpesrllefylampfatpmeaelarrslaqdapplpvpgvllkef
[0555]
seq id no:24
[0556]
vb4105的氨基酸序列
[0557]
mqvstaalavllctmalcnqvlsaplaadtptaccfsytsrqipqnfiadyfetssqcskpsvifltkrgrqvcadpseewvqkyvsdlelsaelktplgdtthtepkscdtpppcprcpgggssgggsggqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewessgqpennynttppmldsdgsfflyskltvdksrwqqgnifscsvmhealhnrftqkslslspgkglgglkiyefdyhlygqnitmimtsvsghllaggggsggggsaeygdyqpevhgvpyfrlehylparvmggggsggggsgslfgssrvqyvvnpavkivflnidpsggggsggggslwvylrpvprpatiylqilrlkpl
tgeggggsggggstlaflvlstpamfnralkpflkschfqggggsggggsfvspmahyvpgimaiesvvarfqfivpggggsggggsvilpqapsgpsyatylqpaqaqmltppggggsggggseviqtskyymrdviaiesawllelaphggggsggggsdtlsamsnpramqvllqiqqglqtlatggggsggggskswihcwkylsvqsqlfrgssllfrrvggggsggggsmqaegrgtggstgdadgpggpgipdgpggnaggpgeagatggrgprgagaarasgpgggaprgphggaasglngccrcgargpesrllefylampfatpmeaelarrslaqdapplpvpgvllkeftvsgniltirltaadhrqlqlsissclqqlsllmwitqcflpvflaqppsgqrr
[0558]
seq id no:25
[0559]
vb1026的氨基酸序列
[0560]
mqvstaalavllctmalcnqvlsaplaadtptaccfsytsrqipqnfiadyfetssqcskpsvifltkrgrqvcadpseewvqkyvsdlelsaelktplgdtthtepkscdtpppcprcpgggssgggsggqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewessgqpennynttppmldsdgsfflyskltvdksrwqqgnifscsvmhealhnrftqkslslspgk
[0561]
seq id no:26
[0562]
vb4118的氨基酸序列
[0563]
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[0564]
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vb4119的氨基酸序列
[0566]
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[0567]
seq id no:28
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vb4127的氨基酸序列
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mqvstaalavllctmalcnqvlsaplaadtptaccfsytsrqipqnfiadyfetssqcskpsvifltkrgrqvcadpseewvqkyvsdlelsaelktplgdtthtepkscdtpppcprcpgggssgggsggqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewessgqpennynttppmldsdgsfflyskltvdksrwqqgnifscsvmhealhnrftqkslslspgkglgglyisdhmkvhspspclggggsggggsegwqtcwgrsrkhwgstwngsarlspgstlwvmriclrslgiartwlscrstsrkcspafpassgggggsggggslfrllpsgpkvndghrsrrwhsldlyphlcshldlpkqsqevirl
[0570]
seq id no:29
[0571]
vb4121的氨基酸序列
[0572]
mqvstaalavllctmalcnqvlsaplaadtptaccfsytsrqipqnfiadyfetssqcskpsvifltkr
grqvcadpseewvqkyvsdlelsaelktplgdtthtepkscdtpppcprcpgggssgggsggqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewessgqpennynttppmldsdgsfflyskltvdksrwqqgnifscsvmhealhnrftqkslslspgkglgglregvelcpgnkyemrrhgtthslvihdggggsggggssspdevalvegvqslgftylrlkdnymggggsggggslkdfffsrgrfssalkrtlilssgfrlggggsggggsknilavsfaplvqlskndngtpdsvglggggsggggsleavlrylethprlpkpdpvkssssvlggggsggggspaadrweprapmraprvlhamlgaagrggggsggggsvlsadlvhylrlsleylrawhsedvslggggsggggsylpgggaghldqnvflrvralcyvisgggggsggggspatiemaietlqkfdglsthrssllnsggggsggggsagkdhkikqwdadtfehiqtleghhqeggggsggggssvydffvwl
[0573]
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vb4128的氨基酸序列
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mqvstaalavllctmalcnqvlsaplaadtptaccfsytsrqipqnfiadyfetssqcskpsvifltkrgrqvcadpseewvqkyvsdlelsaelktplgdtthtepkscdtpppcprcpgggssgggsggqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewessgqpennynttppmldsdgsfflyskltvdksrwqqgnifscsvmhealhnrftqkslslspgkglgglyisdhmkvhspspclggggsggggsegwqtcwgrsrkhwgstwngsarlspgstlwvmriclrslgiartwlscrstsrkcspafpassgggggsggggslfrllpsgpkvndghrsrrwhsldlyphlcshldlpkqsqevirlggggsggggsregvelcpgnkyemrrhgtthslvihdggggsggggssspdevalvegvqslgftylrlkdnymggggsggggslkdfffsrgrfssalkrtlilssgfrlggggsggggsknilavsfaplvqlskndngtpdsvglggggsggggsleavlrylethprlpkpdpvkssssvlggggsggggspaadrweprapmraprvlhamlgaagrggggsggggsvlsadlvhylrlsleylrawhsedvslggggsggggsylpgggaghldqnvflrvralcyvisgggggsggggspatiemaietlqkfdglsthrssllnsggggsggggsagkdhkikqwdadtfehiqtleghhqe
[0576]
seq id no:31
[0577]
vb4130的氨基酸序列
[0578]
mqvstaalavllctmalcnqvlsaplaadtptaccfsytsrqipqnfiadyfetssqcskpsvifltkrgrqvcadpseewvqkyvsdlelsaelktplgdtthtepkscdtpppcprcpgggssgggsggqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewessgqpennynttppmldsdgsfflyskltvdksrwqqgnifscsvmhealhnrftqkslslspgkglgglyisdhmkvhspspclggggsggggsegwqtcwgrsrkhwgstwngsarlspgstlwvmriclrslgiartwlscrstsrkcspafpassgggggsggggslfrllpsgpkvndghrsrrwhsldlyphlcshldlpkqsqevirlggggsggggsregvelcpgnkyemrrhgtthslvihdggggsggggssspdevalvegvqslgftylrlkdnymggggsggggslkdfffsrgrfssalkrtlilssgfrlggggsggggsknilavsfaplvqlskndngtpdsvglggggsggggsleavlrylethprlpkpdpvkssssvlggggsggggspaadrweprapmraprvlhamlgaagrggggsggggsvlsadlvhylrlsleylrawhsedvslggggsggggsylpgggaghldqnvflrvralcyvisgggggsggggspatiemaietlqkfdglsthrssllnsggggsggggsagkdhkikqwdadtfehiqtleghhqeggggsggggssvydffvwlggggsggggs
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hpv e6的氨基酸6-15
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hpv e6的氨基酸24-33
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hpv e6的氨基酸26-35
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iilecvyck
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hpv e6的氨基酸35-44
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qqllrrevy
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dfarrdlci
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hpv e6的氨基酸45-54
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yavrdkclk
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yslygttle
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hpv e6的氨基酸125-134
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fhnirgrwt
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srtrretql
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hpv e6的氨基酸16-31
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hpv e6的氨基酸17-32
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telqttihdiilecv
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hpv e6的氨基酸18-33
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elqttihdiilecvy
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hpv e6的氨基酸19-34
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hpv e6的氨基酸20-35
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hpv e6的氨基酸34-49
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kqqllrrevydfarr
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hpv e6的氨基酸49-64
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hpv e6的氨基酸51-66
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hpv e6的氨基酸95-110
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hpv e6的氨基酸96-111
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hpv e7的氨基酸48-57
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hpv e7的氨基酸55-64
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vtfcckcds
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hpv e7的氨基酸66-75
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rlcvqsthv
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hpv e7的氨基酸72-81
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thvdirtle
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hvdirtled
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gtlgivcpi
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tptlheymldlqpet
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ptlheymldlqpett
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heymldlqpettdly
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hvdirtledllmgtl
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vdirtledllmgtlg
[0738]
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[0739]
hpv e6的氨基酸16-25
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ctelqttih
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vydfarrdl
[0744]
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hpv e6的氨基酸45-54
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farrdlciv
[0747]
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[0748]
hpv e6的氨基酸52-61
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ivyrdgnpy
[0750]
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hpv e6的氨基酸54-63
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yrdgnpyav
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[0754]
hpv e6的氨基酸68-77
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kfyskisey
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[0757]
hpv e6的氨基酸73-82
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iseyrhycy
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[0760]
hpv e6的氨基酸75-84
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eyrhycysl
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[0763]
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[0766]
hpv e6的氨基酸84-93
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ygttleqqy
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[0769]
hpv e6的氨基酸88-97
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leqqynkpl
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[0772]
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qynkplcdl
[0774]
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[0775]
hpv e6的氨基酸11-20
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rhldkkqrf
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rfhnirgrw
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elqttihdiilecvy
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dlcivyrdgnpyavr
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civyrdgnpyavrdk
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yrhycyslygttleq
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hpv e6的氨基酸77-92
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rhycyslygttleqq
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[0805]
hpv e6的氨基酸78-93
[0806]
hycyslygttleqqy
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hpv e6的氨基酸98-113
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hpv e6的氨基酸99-114
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[0823]
hpv e7的氨基酸3-12
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ttdlygygq
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tdlygygql
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qaepdrahy
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rahynivtf
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hpv e6的氨基酸71-80
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sthvdirtl
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hpv e6的氨基酸79-88
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ledllmgtl
[0852]
seq id no:123
[0853]
hpv e6的氨基酸03-18
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gdtptlheymldlqp
[0855]
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[0856]
hpv e6的氨基酸4-19
[0857]
dtptlheymldlqpe
[0858]
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[0859]
hpv e6的氨基酸5-20
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tptlheymldlqpet
[0861]
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hpv e6的氨基酸6-21
[0863]
ptlheymldlqpett
[0864]
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hpv e6的氨基酸7-22
[0866]
tlheymldlqpettd
[0867]
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hpv e6的氨基酸8-23
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lheymldlqpettdl
[0870]
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[0871]
hpv e6的氨基酸70-85
[0872]
qsthvdirtledllm
[0873]
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hpv e6的氨基酸71-86
[0875]
sthvdirtledllmg
[0876]
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hpv e6的氨基酸72-87
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thvdirtledllmgt
[0879]
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hpv e6的氨基酸73-88
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[0882]
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hpv e6的氨基酸74-89
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vdirtledllmgtlg
[0885]
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t1d320
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elrenlltylpdsvtqlrrleeldlgn
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ieknadlcylstvhwslildavsnnyi
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latagepyhdirfklmavvpdrrikye
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mlrlptvfrqirpvsrvlaphltr
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iqimenpfvqsmlwnpdlmrqlimanp
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llrflflglsalalpsraqlqlhlpan
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mgknpvrpprafppvpsiddiplsr
[0915]
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ghvdftieveraltvldgavlvlcavg
[0918]
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t1d210
[0920]
eyklmygmlfsirlfvskmspldmkdg
[0921]
seq id no:146
[0922]
t1d849
[0923]
sqgagvesldfrlylryeflmlgiqpv
[0924]
seq id no:147
[0925]
t1d4
[0926]
aaktlvlcvsdiillsanisetssnkt
[0927]
seq id no:148
[0928]
t1d77
[0929]
ckdlqlylsnlanhidretgigdvplv
[0930]
seq id no:149
[0931]
t1d717
[0932]
qskhtearelmysaallffshgqqnsa
[0933]
seq id no:150
[0934]
t1d586
[0935]
mtlaesyaqyvynlcnslsikvees
[0936]
seq id no:151
[0937]
t11d323
[0938]
kkvsktrhtretvfrrakrrwapipcs
[0939]
seq id no:152
[0940]
t11d506
[0941]
nlkhenilqfltaqerktelgkqywli
[0942]
seq id no:153
[0943]
t11d12
[0944]
vqvfglyfgeefhetfdcpik
[0945]
seq id no:154
[0946]
t11d315
[0947]
gqaaasqaggargyargaqlwppgsdp
[0948]
seq id no:155
[0949]
t11d302
[0950]
simqtwftlftptdatsivattvmsns
[0951]
seq id no:156
[0952]
t11d700
[0953]
qenvrfvlvrseallpnagprsaearv
[0954]
seq id no:157
[0955]
t11d535
[0956]
dafpnlkdfisrfqvmppssflfdapc
[0957]
seq id no:158
[0958]
t11d358
[0959]
psslqvkpetpaseavavaaaaapttt
[0960]
seq id no:159
[0961]
t11d670
[0962]
rffhladlflsssqlpaylvaafakrl
[0963]
seq id no:160
[0964]
t11d294
[0965]
lvflwlhslrrlfgclyvsvfsnvmih
[0966]
seq id no:161
[0967]
t11d336
[0968]
wenaiaalfrrhiavswliratlsese
[0969]
seq id no:162
[0970]
t11d499
[0971]
ryifvksagsrieegvlqflvllvagr
[0972]
seq id no:163
[0973]
t11d425
[0974]
qeiewlpfrcikclklsfstaellcmh
[0975]
seq id no:164
[0976]
t11d491
[0977]
lvarcppclrllrqardfqaarydrhd
[0978]
seq id no:165
[0979]
t11d314
[0980]
algtpedldsyidlsleslnqmileld
[0981]
seq id no:166
[0982]
t11d430
[0983]
sqdmlsimeklefldfsydlnlcglte
[0984]
seq id no:167
[0985]
t11d582
[0986]
rreqyipneeflhfdlledskyrkiys
[0987]
seq id no:168
[0988]
t1d223
[0989]
gpsyrsnsvssldlege
[0990]
seq id no:169
[0991]
t1d164
[0992]
lkeekenlqglvthqtyiiqelekqln
[0993]
seq id no:170
[0994]
t1d56
[0995]
qrqktagkifraevstgqdaprqaqar
[0996]
seq id no:171
[0997]
t1d36
[0998]
ilrpstvnelesgeisydevgerikdf
[0999]
seq id no:172
[1000]
t1d129
[1001]
dtcinedveslrkmvqdllaklqeakr
[1002]
seq id no:173
[1003]
t1d274
[1004]
lreegtkyksfvqrarlvfreegylaf
[1005]
seq id no:174
[1006]
t1d62
[1007]
hegarpmraiflangnvfttgfsrmse
[1008]
seq id no:175
[1009]
t1d5
[1010]
ipdaafiqaarrkcelaraqddyisld
[1011]
seq id no:176
[1012]
t1d144
[1013]
meiakmragrrlwvhliekmfqpknsk
[1014]
seq id no:177
[1015]
t1d441
[1016]
melvsfrdvaiefspeew
[1017]
seq id no:178
[1018]
t1d368
[1019]
tcvheipfhfdlmellpqcqqlqmffl
[1020]
seq id no:179
[1021]
t1d234
[1022]
vrrvfitddfhdmipkylnfvkgvvds
[1023]
seq id no:180
[1024]
t1d162
[1025]
nfhahrekapslfcsrilnkavylfyg
[1026]
seq id no:181
[1027]
t1d39
[1028]
dankegmflfraahklrqflkmnstgd
[1029]
seq id no:182
[1030]
t1d272
[1031]
llslgwsvdvgrhsgwtghvstswsin
[1032]
seq id no:183
[1033]
t1d328
[1034]
ntifslrkdlrqgkarrlrcmeekemf
[1035]
seq id no:184
[1036]
t1d188
[1037]
nhfndfegdpamtqfleefeknledtk
[1038]
seq id no:185
[1039]
c-pepm1
[1040]
vilpqapsgpsyatylqpaqaqmltpp
[1041]
seq id no:186
[1042]
c-pepm6
[1043]
dtlsamsnpramqvllqiqqglqtlat
[1044]
seq id no:187
[1045]
c-pepm8
[1046]
eviqtskyymrdviaiesawllelaph
[1047]
seq id no:188
[1048]
c-pepm29
[1049]
gslfgssrvqyvvnpavkivflnidps
[1050]
seq id no:189
[1051]
c-pepm31
[1052]
aeygdyqpevhgvpyfrlehylparvm
[1053]
seq id no:190
[1054]
c-pepm43
[1055]
kswihcwkylsvqsqlfrgssllfrrv
[1056]
seq id no:191
[1057]
c-pepm89
[1058]
tlaflvlstpamfnralkpflkschfq
[1059]
seq id no:192
[1060]
c-pep149
[1061]
fvspmahyvpgimaiesvvarfqfivp
[1062]
seq id no:193
[1063]
c-pepm171
[1064]
lwvylrpvprpatiylqilrlkpltge
[1065]
seq id no:194
[1066]
c-pepm173
[1067]
kiyefdyhlygqnitmimtsvsghlla
[1068]
seq id no:195
[1069]
vb 4101的氨基酸81-88
[1070]
rgpesrll
[1071]
seq id no:196
[1072]
vb4102的氨基酸81-126
[1073]
rgpesrllefylampfatpmeaelarrslaqdapplpvpgvllkef
[1074]
seq id no:197
[1075]
ny-eso_pep-1
[1076]
mqaegrgtggstgda
[1077]
seq id no:198
[1078]
ny-eso_pep-2
[1079]
tggstgdadgpggpg
[1080]
seq id no:199
[1081]
ny-eso_pep-3
[1082]
adgpggpgipdgpgg
[1083]
seq id no:200
[1084]
ny-eso_pep-4
[1085]
gipdgpggnaggpge
[1086]
seq id no:201
[1087]
ny-eso_pep-5
[1088]
gnaggpgeagatggr
[1089]
seq id no:202
[1090]
ny-eso_pep-6
[1091]
eagatggrgprgaga
[1092]
seq id no:203
[1093]
ny-eso_pep-7
[1094]
rgprgagaarasgpg
[1095]
seq id no:204
[1096]
ny-eso_pep-8
[1097]
aarasgpgggaprgp
[1098]
seq id no:205
[1099]
ny-eso_pep-9
[1100]
gggaprgphggaasg
[1101]
seq id no:206
[1102]
ny-eso_pep-10
[1103]
phggaasglngccrc
[1104]
seq id no:207
[1105]
ny-eso_pep-11
[1106]
glngccrcgargpes
[1107]
seq id no:208
[1108]
ny-eso_pep-12
[1109]
cgargpesrllefyl
[1110]
seq id no:209
[1111]
ny-eso_pep-13
[1112]
rgpesrllefylamp
[1113]
seq id no:210
[1114]
ny-eso_pep-14
[1115]
srllefylampfatp
[1116]
seq id no:211
[1117]
ny-eso_pep-15
[1118]
lampfatpmeaelar
[1119]
seq id no:212
[1120]
ny-eso_pep-16
[1121]
pmeaelarrslaqda
[1122]
seq id no:213
[1123]
ny-eso_pep-17
[1124]
rrslaqdapplpvpg
[1125]
seq id no:214
[1126]
ny-eso_pep-18
[1127]
dapplpvpgvllkef
[1128]
seq id no:215
[1129]
ny-eso_pep-19
[1130]
applpvpgvllkeft
[1131]
seq id no:216
[1132]
ny-eso_pep-20
[1133]
gvllkeftvsgnilt
[1134]
seq id no:217
[1135]
ny-eso_pep-21
[1136]
tvsgniltirltaad
[1137]
seq id no:218
[1138]
ny-eso_pep-22
[1139]
tirltaadhrqlqls
[1140]
seq id no:219
[1141]
ny-eso_pep-23
[1142]
dhrqlqlsissclqq
[1143]
seq id no:220
[1144]
ny-eso_pep-24
[1145]
sissclqqlsllmwi
[1146]
seq id no:221
[1147]
ny-eso_pep-25
[1148]
qlsllmwitqcflpv
[1149]
seq id no:222
[1150]
ny-eso_pep-26
[1151]
itqcflpvflaqpps
[1152]
seq id no:223
[1153]
ny-eso_pep-27
[1154]
vflaqppsgqrr
[1155]
seq id no:224
[1156]
ny-eso_pep-28
[1157]
rgpesrll
[1158]
seq id no:225
[1159]
b-pepm2
[1160]
regvelcpgnkyemrrhgtthslvihd
[1161]
seq id no:226
[1162]
b-pepm7
[1163]
sspdevalvegvqslgftylrlkdnym
[1164]
seq id no:227
[1165]
b-pepm36
[1166]
knilavsfaplvqlskndngtpdsvgl
[1167]
seq id no:228
[1168]
b-pepm78
[1169]
paadrweprapmraprvlhamlgaagr
[1170]
seq id no:229
[1171]
b-pepm79
[1172]
vlsadlvhylrlsleylrawhsedvsl
[1173]
seq id no:230
[1174]
b-pepm82
[1175]
leavlrylethprlpkpdpvkssssvl
[1176]
seq id no:231
[1177]
b-pepm83
[1178]
lkdfffsrgrfssalkrtlilssgfrl
[1179]
seq id no:232
[1180]
b-pepm84
[1181]
agkdhkikqwdadtfehiqtleghhqe
[1182]
seq id no:233
[1183]
b-pepm85
[1184]
patiemaietlqkfdglsthrssllns
[1185]
seq id no:234
[1186]
b-pepm86
[1187]
ylpgggaghldqnvflrvralcyvisg
[1188]
seq id no:235
[1189]
vb4119的氨基酸180-188
[1190]
svydffvwl
[1191]
seq id no:236
[1192]
b-pepm108
[1193]
yisdhmkvhspspcl
[1194]
seq id no:237
[1195]
b-pepm115-m122
[1196]
egwqtcwgrsrkhwgstwngsarlspgstlwvmriclrslgiartwls
[1197]
crstsrkcspafpass
[1198]
seq id no:238
[1199]
b-pepm141-m142
[1200]
lfrllpsgpkvndghrsrrwhsldlyphlcshldlpkqsqevirl
[1201]
seq id no:239
[1202]
b-pepm108
[1203]
yisdhmkvhspspcl
[1204]
seq id no:240
[1205]
b-pepm115
[1206]
egwqtcwgrsrkhwg
[1207]
seq id no:241
[1208]
b-pepm116
[1209]
grsrkhwgstwngsa
[1210]
seq id no:242
[1211]
b-pepm117
[1212]
gstwngsarlspgst
[1213]
seq id no:243
[1214]
b-pepm118
[1215]
arlspgstlwvmric
[1216]
seq id no:244
[1217]
b-pepm119
[1218]
tlwvmriclrslgia
[1219]
seq id no:245
[1220]
b-pepm120
[1221]
clrslgiartwlscr
[1222]
seq id no:246
[1223]
b-pepm121
[1224]
artwlscrstsrkcs
[1225]
seq id no:247
[1226]
b-pepm122
[1227]
rstsrkcspafpass
[1228]
seq id no:248
[1229]
b-pepm141
[1230]
lfrllpsgpkvndghrsrrwhsldlyp
[1231]
seq id no:249
[1232]
b-pepm142
[1233]
srrwhsldlyphlcshldlpkqsqevirl
[1234]
实施方案a：
[1235]
1.个体化治疗性抗癌疫苗，其包含免疫有效量的：
[1236]
(i)包含编码靶向单元、二聚化单元和抗原单元的核苷酸序列的多核苷酸，其中所述抗原单元包含至少一个患者存在的共有抗原序列或其一个或多个部分，和任选的一个或多个患者特异性抗原序列或其一个或多个部分；或
[1237]
(ii)由(i)中定义的多核苷酸编码的多肽；或
[1238]
(iii)由两个由(i)中定义的多核苷酸编码的多肽组成的二聚体蛋白；和
[1239]
药学上可接受的载体。
[1240]
2.根据实施方案a1所述的疫苗，其中所述至少一个患者存在的共有抗原序列是选自以下的共有抗原：过表达的细胞蛋白、异常表达的细胞蛋白、癌睾丸抗原、病毒抗原、分化抗原、突变的癌基因、突变的肿瘤抑制基因、癌胚抗原、共有融合抗原、共有内含子保留抗原、暗物质抗原以及由剪接体突变或移框突变引起的共有抗原。
[1241]
3.根据实施方案a1或a2中任一项所述的疫苗，其中所述至少一个患者存在的共有抗原序列是其为人细胞蛋白，优选过度表达或异常表达的人细胞蛋白或分化抗原的共有抗
原。
[1242]
4.根据实施方案a1至a3中任一项所述的疫苗，其中已知所述至少一个患者存在的共有抗原序列具有免疫原性，或者其中已知其一个或多个部分具有免疫原性，或者预测其一个或多个部分与患者的hla i类或hla ii类等位基因结合，优选与患者的hla i类等位基因结合。
[1243]
5.根据实施方案a1至a4中任一项所述的疫苗，其中所述至少一个患者存在的共有抗原序列具有适合由患者的hla等位基因呈递的长度，优选7至30个氨基酸的长度。
[1244]
6.根据实施方案a1至a5中任一项所述的疫苗，其包含多于一个患者存在的共有抗原序列或其一个或多个部分。
[1245]
7.根据实施方案a6所述的疫苗，其包含数个患者存在的共有抗原的序列或其一个或多个部分，优选数个患者存在的共有抗原的序列的数个部分，更优选数个患者存在的共有抗原的数个表位，已知这些表位具有免疫原性，或预测这些表位与该患者的hla i类和hla ii类等位基因结合。
[1246]
8.根据实施方案a1至a7中任一项所述的疫苗，其中抗原单元包含全长的一个或多个患者存在的共有抗原序列，优选全长的1至10个患者存在的共有抗原序列。
[1247]
9.根据实施方案a1至a7中任一项所述的疫苗，其中抗原单元包含长肽序列形式的患者存在的共有抗原序列的1至30个部分，优选约28至100个氨基酸的肽序列。
[1248]
10.根据实施方案a9所述的疫苗，其中长肽序列包含预测与患者的hla i类或hla ii类等位基因结合的多个表位。
[1249]
11.根据实施方案a1至a7中任一项所述的疫苗，其中抗原单元包含短肽序列/表位形式的患者存在的共有抗原序列的1至50个部分。
[1250]
12.根据实施方案a11所述的疫苗，其中短肽序列/表位预测与患者的hla i类或hla ii类等位基因结合。
[1251]
13.根据实施方案a11至a12中任一项所述的疫苗，其中短肽序列/表位具有7至30个氨基酸，例如7至10或13至30个氨基酸的长度。
[1252]
14.根据实施方案a1至a13中任一项所述的疫苗，其包含一个或多个患者特异性抗原序列或其一个或多个部分。
[1253]
15.根据实施方案a14所述的疫苗，其包含数个患者特异性抗原序列或其一个或多个部分。
[1254]
16.根据实施方案a15所述的疫苗，其包含所述患者特异性抗原序列的一个或多个部分，优选一个或多个患者特异性表位。
[1255]
17.根据实施方案a16所述的疫苗，其包含具有7至30个氨基酸，例如7至10或13至30个氨基酸的长度的一个或多个患者特异性表位。
[1256]
18.根据实施方案a14至a17中任一项所述的疫苗，其中抗原单元包含至少10个患者特异性表位，优选至少15个患者特异性表位，例如至少20个患者特异性表位。
[1257]
19.根据前述实施方案a1至a18中任一项所述的疫苗，其中抗原单元包含21至2000个氨基酸，优选约30个氨基酸至约1500个氨基酸，更优选约50至约1000个氨基酸，例如约100至约500个氨基酸，或约100至约400个氨基酸，或约100至约300个氨基酸。
[1258]
20.根据前述实施方案a1至a19中任一项所述的疫苗，其中抗原单元包含一个或多
个接头，优选一个或多个非免疫原性接头和/或柔性接头。
[1259]
21.根据实施方案a20所述的疫苗，其中所述一个或多个接头的长度为4至20个氨基酸。
[1260]
22.根据实施方案a20至a21中任一项所述的疫苗，其中所述一个或多个接头将抗原序列彼此分隔。
[1261]
23.根据前述实施方案a1至a22中任一项所述的疫苗，其中二聚化单元包含铰链区和任选的促进二聚化的另一结构域，任选地通过接头连接。
[1262]
24.根据实施方案a23所述的疫苗，其中铰链区是ig衍生的。
[1263]
25.根据实施方案a23和a24中任一项所述的疫苗，其中铰链区能够形成一个或多个共价键，优选二硫键形式的共价键。
[1264]
26.根据实施方案a23至a25中任一项所述的疫苗，其中促进二聚化的另一结构域是免疫球蛋白结构域，优选羧基端c结构域，或与所述c结构域基本相同的序列或其变体。
[1265]
27.根据实施方案a26所述的疫苗，其中羧基端c结构域衍生自igg。
[1266]
28.根据实施方案a26和a37中任一项所述的疫苗，其中二聚化单元的免疫球蛋白结构域能够同二聚化，优选通过非共价相互作用，更优选通过为疏水相互作用的非共价相互作用。
[1267]
29.根据实施方案a23至a28中任一项所述的疫苗，其中所述二聚化单元不包含ch2结构域。
[1268]
30.根据实施方案a23至a29中任一项所述的疫苗，其中二聚化单元由通过所述第三接头与人igg3的ch3结构域连接的铰链外显子h1和h4组成。
[1269]
31.根据实施方案a23至a30中任一项所述的疫苗，其中二聚化单元包含与seq id no:3的94-237的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。
[1270]
32.根据前述实施方案a1至a31中任一项所述的疫苗，其中抗原单元和二聚化单元通过接头连接，优选包含限制性位点的接头。
[1271]
33.根据前述实施方案a1至a32中任一项所述的疫苗，其中靶向单元对选自ccr1、ccr3和ccr5的趋化因子受体具有亲和力。
[1272]
34.根据前述实施方案a1至a33中任一项所述的疫苗，其中所述靶向单元包含对cd14、cd40或toll样受体，或配体如可溶性cd40配体，或趋化因子如rantes或mip-1a，或细菌抗原如鞭毛蛋白具有特异性的抗体结合区域。
[1273]
35.根据实施方案a1至a33中任一项所述的疫苗，其中所述靶向单元对mhc ii类蛋白，优选选自抗-hla-dp、抗-hla-dr和抗-pan hla ii类的mhc ii类蛋白具有亲和力。
[1274]
36.根据实施方案a1至a33中任一项所述的疫苗，其中所述靶向单元具有与seq id no:1的24-93的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。
[1275]
37.根据前述实施方案a1至a36中任一项所述的疫苗，其中所述多核苷酸进一步编码信号肽。
[1276]
38.根据前述实施方案a1至a37中任一项所述的疫苗，其中所述肽中的所述靶向单元、二聚化单元和抗原单元以n端至c端顺序为靶向单元、二聚化单元和抗原单元。
[1277]
39.根据前述实施方案a1至a38中任一项所述的疫苗，其中所述多核苷酸序列是人密码子优化的。
[1278]
40.根据前述实施方案a1至a39中任一项所述的疫苗，其中所述多核苷酸序列是dna核苷酸序列或rna核苷酸序列。
[1279]
41.多核苷酸，其如实施方案a1至a40中任一项所定义。
[1280]
42.载体，其包含实施方案a41所述的多核苷酸。
[1281]
43.宿主细胞，其包含实施方案a1至a40中任一项所定义的多核苷酸或包含实施方案a42所述的载体。
[1282]
44.根据实施方案a41所述的多核苷酸，其经配制施用于患者以诱导所述患者产生二聚体蛋白。
[1283]
45.多肽，其由实施方案a1至a40中任一项所定义的多核苷酸序列编码。
[1284]
46.二聚体蛋白，其由两个实施方案a45所述的多肽组成。
[1285]
47.根据实施方案a46所述的二聚体蛋白，其是同二聚体蛋白。
[1286]
48.根据实施方案a41所述的多核苷酸或根据实施方案a45所述的多肽或根据实施方案a46至a47中任一项所述的二聚体蛋白，其用作药物。
[1287]
49.一种制备个体化治疗性抗癌疫苗的方法，所述疫苗包含免疫有效量的(i)由两个由多核苷酸编码的多肽组成的二聚体蛋白，所述多核苷酸包含编码靶向单元、二聚化单元和抗原单元的核苷酸序列，其中所述抗原单元包含至少一个患者存在的共有抗原序列或其一个或多个部分，和任选的一个或多个患者特异性抗原序列或其一个或多个部分；或
[1288]
(ii)由包含编码靶向单元、二聚化单元和抗原单元的核苷酸序列的多核苷酸编码的多肽，其中所述抗原单元包含至少一个患者存在的共有抗原序列或其一个或多个部分，和任选的一个或多个患者特异性抗原序列或其一个或多个部分，所述方法包括
[1289]
a)用所述多核苷酸转染细胞；
[1290]
b)培养细胞；
[1291]
c)收集和纯化细胞表达的二聚体蛋白或多肽；和
[1292]
d)将从步骤c)获得的二聚体蛋白或多肽与药学上可接受的载体混合。
[1293]
50.一种制备个体化治疗性抗癌疫苗的方法，所述疫苗包含免疫有效量的多核苷酸，所述多核苷酸包含编码靶向单元、二聚化单元和抗原单元的核苷酸序列，其中所述抗原单元包含至少一个患者存在的共有抗原序列或其一个或多个部分，和任选的一个或多个患者特异性抗原序列或其一个或多个部分，所述方法包括：
[1294]
a.制备多核苷酸；
[1295]
b.任选地将多核苷酸克隆到表达载体中，和
[1296]
c.将来自步骤a)的多核苷酸或来自步骤b)的载体与药学上可接受的载体混合。
[1297]
51.根据实施方案a49或a50所述的方法，包括以下步骤：鉴定患者存在的共有抗原和患者特异性抗原，鉴定患者的hla i类和hla ii类等位基因，在制备多核苷酸之前基于免疫原性选择患者存在的共有抗原序列和任选的患者特异性抗原序列。
[1298]
52.一种治疗患者中癌症的方法，所述方法包括向所述患者施用实施方案a1至a40中任一项所述的疫苗。
[1299]
53.根据实施方案a52所述的方法，其中疫苗包含多核苷酸，并以皮内或肌内施用。
[1300]
54.根据实施方案a53所述的方法，其中多核苷酸是dna。
[1301]
55.根据实施方案a53所述的方法，其中多核苷酸是rna。
[1302]
56.根据权利要求a52至a55中任一项所述的方法，其中使用无针注射器进行施用。
[1303]
57.根据权利要求a52至a56中任一项所述的方法，其中通过电穿孔辅助施用。
[1304]
实施方案b
[1305]
1.个体化治疗性抗癌疫苗，其包含免疫有效量的：
[1306]
(i)包含编码靶向单元、二聚化单元和抗原单元的核苷酸序列的多核苷酸，其中所述抗原单元包含至少一个患者存在的共有抗原序列或其一个或多个部分；或
[1307]
(ii)由(i)中定义的多核苷酸编码的多肽；或
[1308]
(iii)由两个由(i)中定义的多核苷酸编码的多肽组成的二聚体蛋白；和
[1309]
药学上可接受的载体。
[1310]
2.根据实施方案b1所述的疫苗，其中所述抗原单元进一步包含一个或多个患者特异性抗原序列或其一个或多个部分。
[1311]
3.根据实施方案b1或b2中任一项所述的疫苗，其中所述至少一个患者存在的共有抗原序列是选自以下的共有抗原的序列：过表达的细胞蛋白、异常表达的细胞蛋白、癌睾丸抗原、病毒抗原、分化抗原、突变的癌基因、突变的肿瘤抑制基因、癌胚抗原、共有融合抗原、共有内含子保留抗原、暗物质抗原、由剪接体突变引起的共有抗原和由移框突变引起的共有抗原。
[1312]
4.根据实施方案b1至b3中任一项所述的疫苗，其中所述至少一个患者存在的共有抗原序列是为人细胞蛋白的共有抗原的序列。
[1313]
5.根据实施方案b4所述的疫苗，其中所述人细胞蛋白是过表达或异常表达的人细胞蛋白或分化抗原。
[1314]
6.根据实施方案b1至b5中任一项所述的疫苗，其中所述至少一个患者存在的共有抗原序列或其一个或多个部分已知具有免疫原性或预测与患者的hla i类和/或hla ii类等位基因结合。
[1315]
7.根据实施方案b6所述的疫苗，其中预测所述至少一个患者存在的共有抗原序列或其一个或多个部分与患者的hla i类等位基因结合。
[1316]
8.根据实施方案b1至b7中任一项所述的疫苗，其中所述至少一个患者存在的共有抗原序列或其一个或多个部分具有适合由患者hla等位基因呈递的长度。
[1317]
9.根据实施方案b8所述的疫苗，其中所述至少一个患者存在的共有抗原序列或其一个或多个部分具有7至30个氨基酸的长度。
[1318]
10.根据实施方案b1至b9中任一项所述的疫苗，其中抗原单元包含多于一个患者存在的共有抗原序列或其一个或多个部分。
[1319]
11.根据实施方案b10所述的疫苗，其中抗原单元包含数个患者存在的共有抗原的序列或其一个或多个部分。
[1320]
12.根据实施方案b11所述的疫苗，其中抗原单元包含数个患者存在的共有抗原的序列的数个部分。
[1321]
13.根据实施方案b12所述的疫苗，其中抗原单元包含数个患者存在的共有抗原的数个表位，这些表位已知具有免疫原性或预测与患者的hla i类和/或hla ii类等位基因结合。
[1322]
14.根据实施例b1至b13中任一项所述的疫苗，其中抗原单元包含全长的一个或多
个患者存在的共有抗原序列。
[1323]
15.根据实施方案b14所述的疫苗，其中抗原单元包含全长的1至10个患者存在的共有抗原序列。
[1324]
16.根据实施方案b1至b15中任一项所述的疫苗，其中抗原单元包含至少一个患者存在的共有抗原序列的1至30个部分。
[1325]
17.根据实施方案b16所述的疫苗，其中所述1至30个部分具有28至100个氨基酸的长度。
[1326]
18.根据实施方案b17所述的疫苗，其中所述部分包含预测与患者的hla i类和/或hla ii类等位基因结合的多个表位。
[1327]
19.根据实施方案b1至b18中任一项所述的疫苗，其中抗原单元包含表位形式的1至50个患者存在的共有抗原序列。
[1328]
20.根据实施方案b19所述的疫苗，其中预测表位与患者的hla i类和/或hla ii类等位基因结合。
[1329]
21.根据实施方案b19至b20中任一项所述的疫苗，其中表位具有7至30个氨基酸的长度。
[1330]
22.根据实施方案b2至b21中任一项所述的疫苗，其中抗原单元包含数个患者特异性抗原序列或其一个或多个部分。
[1331]
23.根据实施方案b22所述的疫苗，其中抗原单元包含所述数个患者特异性抗原序列的一个或多个部分。
[1332]
24.根据实施方案b2至b23中任一项所述的疫苗，其中抗原单元包含一个或多个患者特异性表位。
[1333]
25.根据实施方案b24所述的疫苗，其中一个或多个患者特异性表位具有7至30个氨基酸的长度。
[1334]
26.根据实施方案b24至b25中任一项所述的疫苗，其中抗原单元包含至少5个患者特异性表位。
[1335]
27.根据实施方案b24至b25中任一项所述的疫苗，其中抗原单元包含至少10个患者特异性表位。
[1336]
28.根据实施方案b24至b25中任一项所述的疫苗，其中抗原单元包含至少15个患者特异性表位。
[1337]
29.根据前述实施方案b1至b28中任一项所述的疫苗，其中抗原单元包含7至2000个氨基酸。
[1338]
30.根据实施方案b29所述的疫苗，其中抗原单元包含30至1500个氨基酸。
[1339]
31.根据实施方案b29所述的疫苗，其中抗原单元包含50至1000个氨基酸。
[1340]
32.根据前述实施方案b1至b31中任一项所述的疫苗，其中抗原单元包含一个或多个接头。
[1341]
33.根据实施方案b32所述的疫苗，其中所述一个或多个接头是非免疫原性接头和/或柔性接头。
[1342]
34.根据实施方案b32或b33中任一项所述的疫苗，其中所述一个或多个接头的长度为4至20个氨基酸。
[1343]
35.根据实施方案b32至b34中任一项所述的疫苗，其中所述一个或多个接头将抗原序列彼此分隔开。
[1344]
36.根据前述实施方案b1至b35中任一项所述的疫苗，其中二聚化单元包含铰链区。
[1345]
37.根据实施方案b36所述的疫苗，其中铰链区能够形成一个或多个共价键，优选以二硫键的形式。
[1346]
38.根据实施方案b36或b37中任一项所述的疫苗，其中铰链区是ig衍生的。
[1347]
39.根据实施方案b36至b38中任一项所述的疫苗，其中二聚化单元进一步包含促进二聚化的另一结构域。
[1348]
40.根据实施方案b39所述的疫苗，其中另一结构域是免疫球蛋白结构域，优选免疫球蛋白恒定结构域。
[1349]
41.根据实施方案b39或b40中任一项所述的疫苗，其中另一结构域是衍生自igg，优选衍生自igg3的羧基端c结构域。
[1350]
42.根据实施方案b36至b41中任一项所述的疫苗，其中二聚化单元进一步包含接头，优选连接铰链区和促进二聚体的另一结构域的接头。
[1351]
43.根据实施方案b36至b42中任一项所述的疫苗，其中二聚化单元包含通过接头与人igg3的ch3结构域连接的铰链外显子h1和h4。
[1352]
44.根据实施方案b36至b43中任一项所述的疫苗，其中二聚化单元包含与seq id no:3的94-237的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。
[1353]
45.根据实施方案b36至b44中任一项所述的疫苗，其中二聚化单元由seq id no:3的94-237的氨基酸序列组成。
[1354]
46.根据前述实施方案b1至b45中任一项所述的疫苗，其中抗原单元和二聚化单元通过接头，优选包含限制性位点的接头连接。
[1355]
47.根据前述实施方案b1至b46中任一项所述的疫苗，其中靶向单元靶向抗原呈递细胞。
[1356]
48.根据实施方案b47所述的疫苗，其中靶向单元是与抗原呈递细胞上的表面分子相互作用的部分或包含与抗原呈递细胞上的表面分子相互作用的部分。
[1357]
49.根据实施方案b48所述的疫苗，其中表面分子选自hla、cd14、cd40、趋化因子受体和toll样受体。
[1358]
50.根据实施方案b47至b49中任一项所述的疫苗，其中靶向单元包含可溶性cd40配体、rantes、mip-1α、xcl1、xcl2、鞭毛蛋白、抗-hla-dp、抗-hla-dr、抗-pan hla ii类或对抗-cd40、抗-tlr-2、抗-tlr-4或抗-tlr-5具有特异性的抗体可变结构域，或由以上组成。
[1359]
51.根据实施方案b50所述的疫苗，其中靶向单元包含mip-1α或由mip-1α组成。
[1360]
52.根据实施方案b51所述的疫苗，其中靶向单元包含与seq id no:1的24-93的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。
[1361]
53.根据实施例b52所述的疫苗，其中靶向单元由与序列id no:1的24-93的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列组成。
[1362]
54.根据实施方案b53所述的疫苗，其中靶向单元由seq id no:1的24-93的氨基酸序列组成。
[1363]
55.根据前述实施方案b1至b54中任一项所述的疫苗，其中所述疫苗包含多核苷酸，优选rna或dna。
[1364]
56.根据实施方案b55所述的疫苗，其中所述多核苷酸是人密码子优化的。
[1365]
57.根据实施方案b55或b56中任一项所述的疫苗，其中多核苷酸进一步包含编码信号肽的核苷酸序列。
[1366]
58.根据实施方案b57所述的疫苗，其中信号肽选自ig vh信号肽、人tpa信号肽和人mip1-α信号肽。
[1367]
59.根据实施方案b57至b58中任一项所述的疫苗，其中信号肽包含与seq id no:1的1-23的氨基酸序列具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。
[1368]
60.根据实施方案b59所述的疫苗，其中信号肽由与序列id no:1的1-23的氨基酸序列具有至少85％序列同一性的氨基酸序列组成。
[1369]
61.根据实施方案b60所述的疫苗，其中信号肽由seq id no:1的1-23的氨基酸序列组成。
[1370]
62.根据前述实施方案b1至b61中任一项所述的疫苗，其中所述多肽中的所述靶向单元、二聚化单元和抗原单元以n-端至c-端顺序为靶向单元、二聚化单元和抗原单元，或其中所述多肽中的所述靶向单元、二聚化单元和抗原单元以5’至3’顺序为靶向单元、二聚化单元和抗原单元。
[1371]
63.根据前述实施方案b1至b62中任一项所述的疫苗，其中药学上可接受的载体选自盐水、缓冲盐水、pbs、右旋葡萄糖、水、甘油、乙醇、无菌等渗水性缓冲液及其组合。
[1372]
64.一种制备实施方案b1的个体化治疗性抗癌疫苗的方法，所述方法包括以下步骤：
[1373]
a)鉴定患者的肿瘤组织或体液中的至少一个患者存在的共有抗原；
[1374]
b)确定患者的hla i类和/或ii类等位基因；
[1375]
c)通过所鉴定的至少一个抗原或其一个或多个部分与患者的hla i类和/或ii类等位基因的预测结合，来预测所鉴定的至少一个抗原或其一个或多个部分的免疫原性；
[1376]
d)基于步骤c)中预测的免疫原性选择至少一个抗原或其一个或多个部分；和
[1377]
e)制备包含抗原单元的多核苷酸序列，所述抗原单元包含编码步骤d)中选择的所述至少一个抗原或其一个或多个部分的核苷酸序列；
[1378]
f)将多核苷酸序列克隆到包含编码靶向单元和二聚化单元的核苷酸序列的表达载体中；和
[1379]
g)将在步骤f)中获得的表达载体与药学上可接受的载体混合。
[1380]
65.根据实施方案b64所述的制备实施方案b2所述的个体化抗癌疫苗的方法，其中所述方法进一步包括：
[1381]
在步骤a)中，鉴定患者肿瘤组织中的一个或多个患者特异性抗原；
[1382]
在步骤c)中，通过所鉴定的一个或多个患者特异性抗原或其一个或多个部分与患者的hla i类和/或ii类等位基因的预测结合，来预测所鉴定的一个或多个患者特异性抗原或其一个或多个部分的免疫原性；
[1383]
在步骤d)中，基于步骤c)中预测的其免疫原性来选择一个或多个患者特异性抗原或其一个或多个部分；
[1384]
并且其中步骤e)的多核苷酸序列进一步包含编码在步骤d)中选择的一个或多个患者特异性抗原或其一个或多个部分的核苷酸序列。
[1385]
66.多核苷酸，其如实施方案b1至b62中任一项所定义。
[1386]
67.载体，其包含实施方案b66所述的多核苷酸。
[1387]
68.宿主细胞，其包含实施方案b1至b62中任一项定义的多核苷酸或包含实施方案b67所述的载体。
[1388]
69.根据实施方案b66所述的多核苷酸，其经配制施用于患者以诱导所述患者产生二聚体蛋白。
[1389]
70.多肽，其由实施方案b1至b62中任一项所定义的多核苷酸序列编码。
[1390]
71.二聚体蛋白，其由两个如实施方案b70中所定义的多肽组成。
[1391]
72.根据实施方案b71所述的二聚体蛋白，其是同二聚体蛋白。
[1392]
73.根据实施方案b66所述的多核苷酸或根据实施方案b70所述的多肽或根据实施方案b71或b72中任一项所述的二聚体蛋白，其用作药物。
[1393]
74.一种制备个体化治疗性抗癌疫苗的方法，所述疫苗包含免疫有效量的如实施方案b1至b54中所定义的二聚体蛋白或如实施方案b1至b54中任一项所定义的多肽，所述方法包括：
[1394]
a)用实施方案b1至b62中任一项中定义的多核苷酸转染细胞；
[1395]
b)培养细胞；
[1396]
c)收集并纯化细胞表达的二聚体蛋白或多肽；和
[1397]
d)将从步骤c)获得的二聚体蛋白或多肽与药学上可接受的载体混合。
[1398]
75.一种制备个体化治疗性抗癌疫苗的方法，所述疫苗包含免疫有效量的如实施方案b1至b62中任一项所定义的多核苷酸，所述方法包括
[1399]
a)制备多核苷酸；
[1400]
b)任选地将多核苷酸克隆到表达载体中；和
[1401]
c)将来自步骤a)的多核苷酸或来自步骤b)的载体与药学上可接受的载体混合。
[1402]
76.一种治疗患有癌症的患者的方法，所述方法包括向患者施用实施方案b1至b63中任一项所述的疫苗，所述疫苗是专门为患者制备的。
[1403]
77.根据实施方案b76所述的方法，其中疫苗包含多核苷酸，并以皮内或肌内施用。
[1404]
78.根据实施方案b77所述的方法，其中多核苷酸是dna。
[1405]
79.根据实施方案b78所述的方法，其中多核苷酸是rna。
[1406]
80.根据实施方案b76至b79中任一项所述的方法，其中使用无针注射器进行施用。
[1407]
81.根据实施方案b76至b80中任一项所述的方法，其中通过电穿孔辅助施用。
[1408]
82.根据实施方案b1至b63中任一项所述的疫苗，其用于治疗患者中癌症的方法中，其中所述疫苗是专门为患者制备的。
[1409]
83.根据实施方案b66所述的多核苷酸或根据实施方案b70所述的多肽或根据实施方案b71或b72中任一项所述的二聚体蛋白用于制造用于治疗患者癌症的药物中的用途，其中多核苷酸、多肽或二聚体蛋白是专门为患者制备的。
[1410]
84.一种制备实施方案b66所述的多核苷酸的方法，所述方法包括以下步骤：
[1411]
a)在患者的肿瘤组织或体液中鉴定至少一个患者存在的共有抗原；
[1412]
b)确定患者的hla i类和/或ii类等位基因；
[1413]
c)通过所鉴定的至少一个抗原或其一个或多个部分与患者的hla i类和/或ii类等位基因的预测结合，来预测所鉴定的至少一个抗原或其一个或多个部分的免疫原性；
[1414]
d)基于步骤c)中预测的其免疫原性来选择至少一个抗原或其一个或多个部分；
[1415]
e)制备包含抗原单元的多核苷酸序列，所述抗原单元包含编码在步骤d)中选择的至少一个抗原或其一个或多个部分的核苷酸序列；
[1416]
f)将多核苷酸序列克隆到包含编码靶向单元和二聚化单元的核苷酸序列的表达载体中。
[1417]
85.根据实施方案b84所述的方法，其中所述方法进一步包括：
[1418]
在步骤a)中，鉴定患者肿瘤组织中的一个或多个患者特异性抗原；
[1419]
在步骤c)中，通过所鉴定的一个或多个患者特异性抗原或其一个或多个部分与患者的hla i类和/或ii类等位基因的预测结合，来预测所鉴定的一个或多个患者特异性抗原或其一个或多个部分的免疫原性；
[1420]
在步骤d)中，基于步骤c)中预测的其免疫原性来选择一个或多个患者特异性抗原或其一个或多个部分；
[1421]
并且其中步骤e)的多核苷酸序列进一步包含编码在步骤d)中选择的一个或多个患者特异性抗原或其一个或多个部分的核苷酸序列。