类法尼醇x受体调节化合物以及使用它们的方法
1.相关申请的交叉引用本技术要求2020年2月11日提交的美国临时专利申请系列号62/972,782的权益，其公开内容通过引用整体并入本文。
2.领域本发明涉及可以充当类法尼醇x受体(farnesoid x receptor，fxr)的调节剂且可用于治疗与fxr相关的疾病和/或障碍的化合物。在某些实施方案中，本发明涉及调节fxr的化合物和组合物以及它们的制备和使用方法。
3.背景类法尼醇x受体是核激素受体超家族的成员。fxr与维甲酸x受体(retinoid x receptor， rxr)一起作为异源二聚体发挥作用，并结合靶基因的启动子区域中的应答元件以调节基因转录。
4.研究已经表明，fxr在控制胆汁酸的肠肝循环、胆汁酸合成和分泌以及胆汁酸向肝细胞中的摄取方面起重要作用。许多研究人员已经利用这一方面来寻找用于治疗nash/nafld的适当药物靶标。
5.类法尼醇x受体是一种最初从大鼠肝cdna文库中鉴定出的孤儿核受体(bm. forman, 等人, cell, 1995, 81(5), 687-693)，其与昆虫蜕皮激素受体最密切相关。fxr是配体活化的转录因子的核受体超家族的成员，所述超家族包括类固醇、维甲酸和甲状腺激素的受体(dj. mangelsdorf, 等人, cell, 1995, 83(6), 841-850)。fxr在包括肝、肾、肠、结肠、卵巢和肾上腺在内的各种组织中表达(参见forman等人, cell 81:687-693, 1995；lu等人, j. biol. chem., 17:17, 2001)，并且是胆固醇稳态、甘油三酯合成和脂肪生成的关键调节剂(crawley, expert opinion ther. patents (2010), 20(8): 1047-1057)。
6.fxr的相关生理学配体是胆汁酸(d. parks等人, science, 1999, 284(5418), 1362-1365)。最有效的一种是鹅去氧胆酸(cdca)，其调节参与胆汁酸稳态的几个基因的表达。法尼醇和衍生物（一起称为类法尼醇）最初被描述为在高浓度活化大鼠直系同源物，但它们不活化人或小鼠受体。除了控制细胞内基因表达外，fxr似乎还通过上调细胞因子成纤维细胞生长因子的表达参与旁分泌和内分泌信号传递(j. holt等人, genes dev., 2003, 17(13), 1581-1591； t. inagaki等人, cell metab., 2005, 2(4), 217-225)。
7.fxr的活化有治疗一系列疾病的可能，所述疾病包括胆汁酸相关障碍、代谢综合征、2型糖尿病、高脂血症、高甘油三酯血症、原发性胆汁性肝硬化（pbc）、脂肪肝病、非酒精性脂肪性肝炎（nash）、炎症性自身免疫性疾病、克罗恩氏病、多发性硬化、动脉粥样硬化、肾障碍（包括慢性肾脏疾病）、肝癌和结肠癌、以及其它障碍。尽管众多fxr调节剂是已知的并且已经公开(关于最近的例子，参见，a. zampella等人, expert opinion ther. patents (2018), 28(5): 351-364)，但是仍然需要开发用于治疗和预防疾病的新型和有效的化合物。
8.在本说明书中对显然在先公开的文献的列出或讨论不应必然被认为是承认所述
文献是现有技术水平的一部分或是公知一般知识。
9.简述本发明的一个方面涉及由式i表示的化合物、或其对映异构体、立体异构体、互变异构体、溶剂化物、水合物、前药、氨基酸缀合物、代谢物或药学上可接受的盐：其中：r1和r2独立地选自氢、氯、甲基、三氟甲基、甲氧基、三氟甲氧基和环丙基；r3是氢、氯、甲基、甲氧基、氟或三氟甲氧基。
10.在某些方面，本发明提供了式ii的化合物、或其对映异构体、立体异构体、互变异构体、溶剂化物、水合物、前药、氨基酸缀合物、代谢物或药学上可接受的盐：其中：r4是氟或甲基。
11.在某些实施方案中，本发明提供了选自下列的化合物：2-(3-((5-环丙基-3-(2-(三氟甲氧基)苯基)异噁唑-4-基)甲氧基)-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-基)-4-氟苯并[d]噻唑-6-亚磺酸钠和2-((1r,3r,5s)-3-((5-环丙基-3-(2-(三氟甲氧基)苯基)异噁唑-4-基)甲氧基)-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-基)-4-甲基苯并[d]噻唑-6-亚磺酸钠。
[0012]
本发明的另一个方面涉及一种调节fxr的方法。所述方法包括给有此需要的对象施用有效量的本发明的化合物(例如，式i-ii的化合物或其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、前药、立体异构体或互变异构体)。
[0013]
本发明的另一个方面涉及一种活化fxr的方法。所述方法包括给有此需要的对象施用有效量的本发明的化合物(例如，式i-ii的化合物或其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、前药、立体异构体或互变异构体)。
[0014]
本发明的另一个方面涉及一种治疗和/或预防疾病和/或障碍的方法。在某些实施方案中，所述疾病和/或障碍是胆汁酸相关障碍、代谢综合征、2型糖尿病、糖尿病性肾病、高脂血症、高甘油三酯血症、肥胖、肝硬化、肝纤维化、原发性胆汁性肝硬化(pbc)、原发性硬化性胆管炎(psc)、脂肪肝病、非酒精性脂肪性肝炎(nash)、非酒精性脂肪肝病(nafld)、酒精性肝病、化学疗法相关的脂肪性肝炎(cash)、乙型肝炎、炎症性自身免疫性疾病、炎性肠病、
克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、直肠炎、结肠袋炎、乳糜泻、胆汁酸腹泻、多发性硬化、动脉粥样硬化、肾障碍(包括慢性肾脏疾病)、肾纤维化、肺纤维化、癌症（包括肝癌、结肠癌和乳腺癌）、以及其它障碍。所述方法包括给有此需要的对象施用治疗上有效量的本发明的化合物(例如，式i-ii的化合物或其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、前药、立体异构体或互变异构体))或包含所述本发明的化合物的药物组合物。
[0015]
本发明的另一个方面涉及一种药物组合物，其包含本发明的化合物(例如，式i-ii的化合物或其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、前药、立体异构体或互变异构体)和药学上可接受的载体。所述药物组合物可以进一步包括赋形剂、稀释剂和/或表面活性剂。
[0016]
本发明的另一个方面涉及用于制备药物的本发明的化合物(例如，式i-ii的化合物或其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、前药、立体异构体或互变异构体))，所述药物用于治疗和/或预防类法尼醇x受体(fxr)在其中起作用的疾病和/或障碍。在某些实施方案中，fxr在疾病和/或障碍中起作用，因为fxr涉及与疾病和/或障碍相关的途径、机制或作用，诸如，例如，控制胆汁酸的肠肝循环、胆汁酸合成和/或分泌、以及胆汁酸向肝细胞中的摄取。
[0017]
应当指出，关于一个实施方案描述的本发明的方面可以合并在不同的实施方案中，尽管没有与其相关的特别描述。也就是说，所有实施方案和/或任何实施方案的特征可以以任何方式和/或组合进行组合。申请人保留改变任何原始提交的权利要求和/或相应地提交任何新的权利要求的权利，包括能够修改任何原始提交的权利要求以依赖于和/或并入任何其它一项或多项权利要求的任何特征的权利，尽管最初未以该方式要求保护。在下文所述的说明书中详细解释了本发明的这些和其它目的和/或方面。通过阅读附图和随后的优选实施方案的详细描述，本领域普通技术人员将理解本发明的进一步特征、优点和细节，这样的对本发明的描述仅仅是说明性的。
附图说明
[0018]
图1是显示实施例2的化合物与原代人肝细胞一起温育以后bsep基因表达的倍数变化的图。
[0019]
图2是显示实施例2的化合物与原代人肝细胞一起温育以后shp基因表达的倍数变化的图。
[0020]
图3是显示实施例3的化合物与原代人肝细胞一起温育以后bsep基因表达的倍数变化的图。
[0021]
图4是显示实施例3的化合物与原代人肝细胞一起温育以后shp基因表达的倍数变化的图。
[0022]
图5是显示用实施例2的化合物治疗28天以后hfhc雄性小鼠中的肝甘油三酯含量的图。
[0023]
图6是显示用实施例2的化合物治疗28天以后hfhc雄性小鼠中的肝胆固醇含量的图。
[0024]
图7是显示用实施例2的化合物治疗28天以后hfhc雄性小鼠中的血浆总胆固醇含量的图。
[0025]
图8是显示用实施例3的化合物治疗28天以后hfhc雄性小鼠中的肝甘油三酯含量
的图。
[0026]
图9是显示用实施例3的化合物治疗28天以后hfhc雄性小鼠中的肝胆固醇含量的图。
[0027]
图10是显示用实施例3的化合物治疗28天以后hfhc雄性小鼠中的血浆总胆固醇含量的图。
[0028]
图11说明了如何根据本文描述的方法分离和解剖肝脏的左侧叶。
[0029]
图12显示当将实施例2的化合物以0.3 mg/kg、1 mg/kg或3 mg/kg剂量每天一次施用持续3周时在stam模型中的nafld活性评分。
[0030]
图13显示当将实施例2的化合物以0.3 mg/kg、1 mg/kg或3 mg/kg剂量每天一次施用持续3周时在stam模型中的天狼猩红阳性面积(%)。
[0031]
图14是实施例2的化合物的代谢物的ms/ms谱。
[0032]
实施例实施方案的详细描述现在在下文中参考附图更全面地描述本发明，其中示出了本发明的实施方案。但是，本发明可以以许多不同的形式体现，且不应被解释为限于本文给出的实施方案；相反，提供这些实施方案使得本公开内容将是彻底和完整的，并将向本领域技术人员充分传达本发明的范围。
[0033]
在本文本发明的描述中使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，无意限制本发明。如在本发明的描述和所附权利要求中使用的，单数形式“一个”、“一种”和“所述”也意图包括复数形式，除非上下文另外清楚地指出。
[0034]
除非另有定义，否则本文中使用的所有术语（包括技术术语和科学术语）具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。应进一步理解，术语，诸如在常用字典中定义的那些，应当解释为具有与它们在本技术的上下文和相关领域中的含义一致的含义，并且不应以理想化或过于正式的含义进行解释，除非在本文中明确地如此定义。在本文本发明描述中使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，无意限制本发明。本文中提及的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献通过引用整体并入。在术语冲突的情况下，以本说明书为准。
[0035]
并且，本文使用的“和/或”是指并包括一个或多个有关所列项目的任何和所有可能的组合，以及当以替代(“或”)方式解释时组合的缺少。除非上下文另外指示，否则特别意图的是，本文描述的本发明的各种特征可以以任何组合使用。此外，本发明也考虑，在本发明的某些实施方案中，可以排除或省略本文所给出的任何特征或特征组合。为了说明，如果说明书陈述复合物包含组分a、b和c，则其特别意图是，可以省略和放弃a、b或c中的任何一个或其组合。
[0036]
如本文中使用的，过渡短语“基本上由
……
组成”(和语法变体)将被解释为包括列举的材料或步骤“和不会实质上影响所要求保护的发明的基本和新颖特征的那些”。参见，in re herz, 537 f.2d 549, 551-52, 190 u.s.p.q. 461, 463 (ccpa 1976) (在原文中强调)；也参见mpep
§
2111.03。因此，本文中使用的术语”基本上由
……
组成”不应解释为等同于“包含”。
[0037]
当指代可测量的值诸如量或浓度等时，本文中使用的术语“约”意在包括指定值的
±
10%、
±
5%、
±
1%、
±
0.5%或甚至
±
0.1%的变化以及所述指定值。例如，在x是可测量值的情
况下，“约x”意在包括x以及x的
±
10%、
±
5%、
±
1%、
±
0.5%或甚至
±
0.1%的变化。本文为可测量值提供的范围可以包括在其中的任何其它范围和/或单个值。
[0038]
本文中使用的术语“增加”、“增加的”和类似术语指示指定的参数或值升高了至少约5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、100%、150%、200%、300%、400%、500%或更多。
[0039]
本文中使用的术语“减少”、“降低”、“减少的”、“抑制”和类似术语是指指定的参数或值减少了至少约5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%或100%。
[0040]
本文中使用的“类法尼醇x受体”或“fxr”是来自任何来源和/或存在于对象中和/或以任何形式表达的类法尼醇x受体。在某些实施方案中，类法尼醇x受体来自动物、和/或在动物中存在和/或表达，所述动物诸如例如哺乳动物。在某些实施方案中，类法尼醇x受体来自灵长类动物、牛、绵羊、山羊、马、狗、猫、兔、大鼠、小鼠、鱼、鸟和/或类似动物，和/或在所述动物中存在和/或表达。在某些实施方案中，类法尼醇x受体来自人和/或在人中存在和/或表达。
[0041]
在提及fxr时，术语“调节”是指化合物（例如，本发明的化合物）直接地或间接地活化或抑制fxr的一种或多种功能、作用和/或特征的能力。这可以在体外或在体内发生，且意图包括与fxr相关的功能、作用和/或特征的拮抗作用、激动作用、部分拮抗作用和/或部分激动作用。
[0042]
在提及fxr时，术语“活化”是指化合物（例如，本发明的化合物）活化、增加或增强与fxr相关的功能、作用和/或特征的能力，且因此，所述化合物是fxr激动剂。
[0043]
在提及fxr时，术语“调节剂”是指调节fxr的化合物（例如，本发明的化合物）。在某些实施方案中，本发明的化合物通过活化fxr的一种或多种功能、作用和/或特征来调节fxr。
[0044]
术语“激动剂”是指与特定受体（例如fxr）组合和/或结合并活化、增加或增强与所述受体相关的功能、作用和/或特征的化合物（例如，本发明的化合物）。术语“激动剂”包括完全激动剂和部分激动剂二者，所述部分激动剂活化、增加或增强与受体（例如fxr）相关的功能、作用和/或特征达到低于完全激动剂的程度和/或与完全激动剂相比在受体处具有部分效力。在某些实施方案中，本发明的化合物是fxr激动剂。在某些实施方案中，本发明的化合物是激动剂并活化fxr，从而提供与由内源性激动剂的结合通常产生的相同的或基本上相同的反应和/或药理学应答。
[0045]
在提及可测量的值和/或应答时，本文中使用的“基本上相同的”意指与值和/或应答相比，在其约
±
10%内。
[0046]
术语“亚磺酸”意指由亚磺酰基基团和羟基基团组成的官能团-s(o)oh。
[0047]
术语“亚磺酸盐”意指亚磺酸的共轭碱，其中羟基已经被去质子化以产生s(o)o-。
[0048]
术语“磺酸”意指由磺酰基基团和羟基基团组成的官能团-s(o)2oh。
[0049]
术语“任选地被取代的”被理解为意指，给定的化学基团（例如，烷基）可以（但不是必须）与其它取代基（例如，杂原子）键合。例如，任选地被取代的烷基基团可以是完全饱和的烷基链(例如，纯烃)。可替换地，相同的任选地被取代的烷基基团可以具有一个或多个不同于氢的取代基。例如，它可以在沿着链的任何点结合至卤素原子、羟基基团或本文描述的
任何其它取代基。因此，术语“任选地被取代的”意指，给定的化学基团可能含有其它官能团，但是并非一定具有任何另外的官能团。
[0050]
术语“立体异构体”是指由通过相同键结合的相同原子构成但具有不可互换的不同三维结构的化合物。本发明将各种立体异构体及其混合物考虑在内，并且包括“对映异构体”，其是指两种立体异构体，其分子是彼此不可重叠的镜像。
[0051]
术语“药学上可接受的盐”是指化合物的盐，其在合理的医学判断范围内适合用于与人和低等动物的组织接触，没有不适当的毒性、刺激、过敏反应等，并且与合理的收益/风险比相称。药学上可接受的盐是本领域众所周知的。
[0052]
关于药学上可接受的盐的详细综述，参见berge等人的j.pharmaceuticalsciences,66:1-19(1977)。在某些实施方案中，所述盐可以在本发明化合物的最终分离和/或纯化过程中原位制备，或通过游离酸官能团与合适的无机或有机碱的反应单独制备。合适的盐包括、但不限于金属，诸如钠、钾和钙，或胺，诸如三乙基铵、乙醇铵和赖氨酸。
[0053]
术语“溶剂化物”是指由溶质和溶剂形成的可变化学计量的复合物。就本发明的目的而言，这样的溶剂不可以干扰溶质的生物活性。合适溶剂的例子包括、但不限于水、meoh、etoh和acoh。其中水是溶剂分子的溶剂化物通常被称作水合物。水合物包括含有化学计量的量的水的组合物，以及含有可变量的水的组合物。
[0054]
术语“前药”是指化合物的前药，其在合理的医学判断范围内适合用于与人和低等动物的组织接触，没有不适当的毒性、刺激、过敏反应和/或类似应答，与合理的收益/风险比相称，并对其预期用途有效，以及在可能的情况下本发明的化合物的两性离子形式。本文中使用的“前药”意指通过代谢方式（例如，通过水解）在体内可转化以提供本发明化合物（例如，式i-ii的化合物）的化合物。前药的各种形式是本领域已知的，例如，如在以下文献中所讨论的：bundgaard(编),designofprodrugs,elsevier(1985)；widder,等人(编),methodsinenzymology,第4卷,academicpress(1985)；krogsgaard-larsen,等人(编),“designandapplicationofprodrugs,textbookofdrugdesignanddevelopment,第5章,113-191(1991)；bundgaard,等人,journalofdrugdeliverreviews,8:1-38(1992)；bundgaard,j.ofpharmaceuticalsciences,77:285以及以后(1988)；higuchi和stella(编)prodrugsasnoveldrugdeliverysystems,americanchemicalsociety(1975)；以及bernardtesta和joachimmayer,“hydrolysisindrugandprodrugmetabolism:chemistry,biochemistryandenzymology,”johnwileyandsons,ltd.(2002)。
[0055]
术语“氨基酸缀合物”是指本发明的化合物(例如，式i-ii的化合物)与氨基酸的缀合物。优选地，本发明的这样的氨基酸缀合物将具有在胆汁和/或肠液中增强的完整性的附加优点。合适的氨基酸包括、但不限于甘氨酸和牛磺酸。因此，本发明包括式i-ii的化合物的甘氨酸和牛磺酸缀合物。
[0056]
术语“gw4064”是具有以下结构的fxr激动剂化合物：
。
[0057]
除非另有说明，否则本文描述的结构意在包括所述结构的所有对映异构的、非对映异构的和几何的(或构象的)形式；例如，每个不对称中心的r和s构型、(z)和(e)双键异构体以及(z)和(e)构象异构体。因此，本发明化合物的单一立体化学异构体以及对映异构的、非对映异构的和几何的(或构象的)混合物均在本发明范围之内。除非另外说明，否则本发明化合物的所有互变异构形式均在本发明范围之内。
[0058]
根据本发明的实施方案提供了具有式i的结构的化合物：其中：r1和r2独立地选自氢、氯、甲基、三氟甲基、甲氧基、三氟甲氧基和环丙基；且r3是氢、氯、甲基、甲氧基、氟或三氟甲氧基。
[0059]
在某些实施方案中，本发明提供了具有式ii的结构的化合物或其对映异构体、立体异构体、互变异构体、溶剂化物、水合物、前药、氨基酸缀合物、代谢物或药学上可接受的盐其中：r4是氟或甲基。
[0060]
本发明的某些实施方案提供了选自以下的化合物：2-(3-((5-环丙基-3-(2-(三氟甲氧基)苯基)异噁唑-4-基)甲氧基)-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-基)-4-氟苯并[d]噻唑-6-亚磺酸钠和2-((1r,3r,5s)-3-((5-环丙基-3-(2-(三氟甲氧基)苯基)异噁唑-4-基)甲氧基)-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-基)-4-甲基苯并[d]噻唑-6-亚磺酸钠。
[0061]
在某些实施方案中，本发明的化合物是代谢物（即已经在对象中经历代谢或生物转化）。在某些实施方案中，本发明的化合物是亚磺酸(或其相应的亚磺酸盐)化合物。在某
些实施方案中，本发明的化合物可以是亚磺酸代谢物，其可以是所述化合物的相应磺酸（例如，具有-s(o)2oh或-s(o)2o-基团来替代所述化合物中的-s(o)oh或-s(o)o-基团的化合物）或所述化合物的相应亚磺酸酯（例如，具有-s(o)o(c
1-6
烷基)基团来替代所述化合物中的-s(o)oh或-s(o)o-基团的化合物）。在某些实施方案中，本发明的化合物是钠盐。在某些实施方案中，本发明的化合物是亚磺酸盐(例如亚磺酸钠盐)。
[0062]
在某些实施方案中，与相应的羧酸化合物（即，具有-cooh或-coo
‑ꢀ
基团来替代所述化合物中的-s(o)oh或-s(o)o
‑ꢀ
基团的化合物）相比，本发明的化合物可以在体内具有不同的代谢曲线。这些相应的羧酸化合物通常被代谢为酰基-葡萄糖醛酸苷，并且这样的代谢可以产生造成肝毒性和药物诱发的肝损伤的反应性代谢物(shipkova m, armstrong vw, oellerich m, 和wieland e (2003) acyl glucuronide drug metabolites: toxicological and analytical implications. ther drug monit 25: 1-16；regan s, maggs j, hammond t, lambert c, williams d和park bk (2010) acyl glucuronides: the good, the bad and the ugly. biopharm drug dispos 31: 367-395；shipkova m, armstrong vw, oellerich m, 和wieland e (2003) acyl glucuronide drug metabolites: toxicological and analytical implications. ther drug monit 25: 1-16)。
[0063]
在某些实施方案中，本发明的化合物可以仅通过氧化途径（诸如cyp氧化）代谢，和/或与相应的羧酸化合物相比可以避免酰基葡萄糖醛酸苷样代谢物。
[0064]
本发明的化合物可以通过与相应的羧酸化合物不同的代谢途径在体内分解，和/或本发明的化合物可以具有有益的肝脏安全效果和/或与相应的羧酸化合物相比改善的肝脏安全性和/或提高的效力。
[0065]
在某些实施方案中，本发明的化合物可以具有有益的肝脏安全效果和/或与另一种化合物（诸如，例如，相应的羧酸化合物）相比改善的肝脏安全性和/或提高的效力。
[0066]
在某些实施方案中，与在现有技术中已知的化合物相比，本发明的化合物可以更有效，毒性更小，作用时间更长，更强效，产生更少的副作用，更容易被吸收，具有更好的药代动力学曲线（例如，更高的口服生物利用度和/或更低的清除率），和/或具有其它有用的药理学、物理和/或化学性质。这样的效果可以由健康护理专业人员、治疗对象或观察者在临床上客观地和/或主观地评价。
[0067]
在某些实施方案中，与相应的羧酸化合物相比，本发明的化合物当在体内口服施用时可以具有不同的分布曲线，诸如在肝脏中相对于在血浆中增加的暴露。
[0068]
在某些实施方案中，本发明的化合物可以任选地在对象中和/或在体外上调和/或增加fxr相关基因的表达。fxr相关基因可以被上调和/或增加至少约5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%或更多。在某些实施方案中，本发明的化合物上调bsep基因和/或shp基因。
[0069]
在某些实施方案中，本发明的化合物可以任选地在对象中和/或在体外减少肝酶的表达。肝酶的表达可以被减少至少约5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%或更多。在某些实施方案中，所述化合物减少cyp7a1的表达。
[0070]
在本发明的某些实施方案中，当建立分布曲线时，本发明的化合物可以表现出相比于在血浆中，在肝脏中的高暴露。
[0071]
在本发明的某些实施方案中，本发明的化合物可以减少肝脏和/或血浆中的肝甘油三酯。在某些实施方案中，本发明的化合物可以使肝脏和/或血浆中的肝甘油三酯减少至少约5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%或更多。在本发明的某些实施方案中，本发明的化合物可以减少肝脏和/或血浆中的胆固醇。在某些实施方案中，本发明的化合物可以使肝脏和/或血浆中的胆固醇减少至少约5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%或更多。
[0072]
在某些实施方案中，本发明的化合物和/或方法可以减少施用所述化合物的对象中的脂肪变性、肝细胞气球样变和/或小叶炎症。在某些实施方案中，与施用本发明化合物之前对象中的脂肪变性、肝细胞气球样变和/或小叶炎症相比和/或与对照相比，本发明化合物和/或方法使对象中的脂肪变性、肝细胞气球样变和/或小叶炎症减少至少约5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%或更多。在某些实施方案中，在施用本发明化合物以后，本发明的化合物和/或方法可以减少对象的nafld活性评分(nas)。在某些实施方案中，与施用本发明化合物之前对象的nas相比和/或与对照相比，本发明的化合物和/或方法可以使对象的nafld活性评分(nas)减少至少约5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%或更多。
[0073]
在某些实施方案中，本发明的化合物和/或方法可以减少施用所述化合物的对象中的纤维化。在某些实施方案中，与施用本发明化合物之前对象的纤维化相比和/或与对照相比，本发明的化合物和/或方法使对象的纤维化减少至少约5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%或更多。
[0074]
在某些实施方案中，与在现有技术中已知的化合物相比，本发明的化合物可以更有效，毒性更小，作用时间更长，更强效，产生更少的副作用，更容易被吸收，具有更好的药代动力学曲线（例如，更高的口服生物利用度和/或更低的清除率），和/或具有其它有用的药理学、物理和/或化学性质。这样的效果可以由健康护理专业人员、治疗对象或观察者在临床上客观地和/或主观地评价。
[0075]
根据本发明的某些实施方案提供了包含本发明的化合物(例如，式i-ii的化合物)的组合物(例如，药物组合物)。在某些实施方案中，本发明的药物组合物包含本发明的化合物和药学上可接受的载体。
[0076]
本文中使用的术语“药学上可接受的载体”包括任意的和所有的溶剂、分散介质、包衣、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂(例如，抗细菌剂、抗真菌剂)、等渗剂、吸收延迟剂、盐、防腐剂、药物、药物稳定剂、粘合剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、甜味剂、矫味剂、染料等和它们的组合，如本领域技术人员已知的(参见，例如，remington's pharmaceutical sciences, 第18版mack printing company, 1990, 第1289-1329页)。除非任何常规载体都与活性成分（例如，本发明的化合物）不相容，否则考虑其在治疗和/或药物组合物中的用途。
[0077]
本发明的化合物被指示为药物。根据本发明的另一个方面，提供了用作药物（例如用在药物中）的本发明的化合物。
[0078]
根据某些实施方案，将本发明的化合物和/或组合物施用给对象。在某些实施方案中，提供了一种调节对象中的类法尼醇x受体(fxr)的方法，所述方法包括给所述对象施用本发明的化合物和/或本发明的组合物。在某些实施方案中，提供了一种活化类法尼醇x受
体(fxr)的方法，所述方法包括给对象施用本发明的化合物和/或本发明的组合物。
[0079]
在某些实施方案中，提供了一种治疗和/或预防类法尼醇x受体(fxr)在其中起作用的疾病或障碍的方法，所述方法包括给有此需要的对象施用有效量(例如，治疗上有效量、治疗有效量和/或预防有效量)的本发明的化合物和/或本发明的组合物。在某些实施方案中，所述疾病或障碍是胆汁酸相关障碍、代谢综合征、2型糖尿病、糖尿病性肾病、高脂血症、高甘油三酯血症、肥胖、肝硬化、肝纤维化、原发性胆汁性肝硬化(pbc)、原发性硬化性胆管炎(psc)、脂肪肝病、非酒精性脂肪性肝炎(nash)、非酒精性脂肪肝病(nafld)、酒精性肝病、化学疗法相关的脂肪性肝炎(cash)、乙型肝炎、炎症性自身免疫性疾病、炎性肠病、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、直肠炎、结肠袋炎、乳糜泻、胆汁酸腹泻、多发性硬化、动脉粥样硬化、肾障碍(包括慢性肾脏疾病)、肾纤维化、肺纤维化、癌症（包括肝癌、结肠癌和乳腺癌）、以及其它障碍。
[0080]
术语“治疗上有效量”是指足以在对象中实现或引发治疗上有用的应答或所述效果的本发明的化合物（例如，式i-ii的化合物）的量。因此，用于治疗由fxr介导的病症的式i-ii的化合物的治疗上有效量可以是足以治疗由fxr介导的病症的量。
[0081]
本文中使用的术语“对象”是指动物。通常，所述动物是哺乳动物。对象也是指，例如，灵长类动物(例如，人，男性或女性)、奶牛、绵羊、山羊、马、狗、猫、兔、大鼠、小鼠、鱼、禽类等。在某些实施方案中，所述对象是灵长类动物。在其它实施方案中，所述对象是人。
[0082]
在提及疾病或病症时，术语“治疗”及其语法变体是指给对象赋予益处的任何类型的治疗，并可以意指对象的病症的严重程度减轻、至少部分地改善或好转，和/或实现与疾病、障碍或病症相关的至少一种临床症状的某种减轻、缓解或减少，和/或存在症状进展的延迟。在某些实施方案中，与不存在本发明方法的情况下症状的严重程度相比，对象中与fxr介导的疾病、障碍或病症相关的症状的严重程度可以降低。在某些实施方案中，在提及疾病或障碍时，“治疗”及其语法变体是指改善疾病或障碍（即，减慢或阻止或减轻疾病或障碍或其至少一种临床症状的发展）。在某些实施方案中，在提及疾病或障碍时，“治疗”及其语法变体是指减轻或改善至少一个物理参数，包括对象可能无法辨别的那些。在某些实施方案中，在提及疾病或障碍时，“治疗”及其语法变体是指在物理上（例如，可辨别的症状的稳定）、在生理学上（例如物理参数的稳定）或在两者上调节疾病或障碍。
[0083]
在某些实施方案中，本发明的化合物可以以治疗有效量施用给对象。本文中使用的“治疗有效的”量是足以治疗（如本文所定义）对象的量。本领域技术人员会明白，治疗效果不需要是完全的或治愈的，只要向对象提供某种益处即可。在某些实施方案中，通过施用本发明的组合物可以实现治疗有效量。
[0084]
术语“预防”和“阻止”（及其语法变体）是指，与在没有本发明的方法存在下会发生的情况相比，避免、减少与疾病或障碍(例如，由fxr介导的疾病、障碍或病症)相关的症状和/或延迟所述症状的发作，和/或减轻与疾病或障碍(例如，由fxr介导的疾病、障碍或病症)相关的症状的发作的严重程度。预防可以是完全的，例如完全没有症状。预防也可以是部分的，诸如使得对象中症状的发生和/或发作的严重程度小于在没有本发明的方法存在下会发生的情况。
[0085]
在某些实施方案中，本发明的化合物可以以预防有效量施用。本文中使用的“预防有效的”量是足以预防（如本文所定义）对象中与疾病或障碍(例如，由fxr介导的疾病、障碍
或病症)相关的症状的量。本领域技术人员会明白，预防水平不需要是完全的，只要向对象提供某种益处即可。在某些实施方案中，通过施用本发明的组合物可以实现预防有效量。
[0086]
本文中使用的术语“施用”及其语法变体是指给对象直接施用本发明的化合物(或其药学上可接受的盐等)和/或本发明的组合物。在某些实施方案中，以可以在对象体内形成等同量的活性化合物的量将本发明的化合物和/或组合物施用给对象。
[0087]
可以以治疗上有效量施用本发明的化合物以治疗和/或预防对象中的疾病或障碍和/或预防其发展。通过治疗剂的任何施用模式可以完成本发明的化合物的施用，可以采用诸如例如口服、直肠、局部和/或胃肠外施用。在某些实施方案中，口服施用本发明的化合物。
[0088]
取决于预期的施用模式，本发明的化合物和/或本发明的组合物可以呈药学实践中的技术人员已知的剂型，诸如例如，注射剂、片剂、栓剂、丸剂、限时释放胶囊剂、乳剂、糖浆剂、粉剂、液体、混悬剂和/或类似剂型。
[0089]
典型的药物组合物包括、但不限于片剂、丸剂、粉剂或明胶胶囊剂，其包含活性成分(例如，本发明的化合物)和药学上可接受的载体，诸如例如：a)稀释剂，例如，纯净水、玉米油、橄榄油、葵花籽油、鱼油(诸如epa或dha或其酯或甘油三酯或它们的混合物)、乳糖、右旋糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇、纤维素和/或甘氨酸：b)润滑剂，例如，二氧化硅、滑石粉、硬脂酸其镁盐或钙盐和/或聚乙二醇；对于片剂还有c)粘合剂，例如，硅酸镁铝、淀粉糊、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羧甲纤维素钠、天然的和合成的树胶诸如阿拉伯胶、黄蓍胶或海藻酸钠、蜡类和/或聚乙烯吡咯烷酮，如果需要的话；d)崩解剂，例如，淀粉、琼脂、海藻酸或其钠盐和/或泡腾混合物；e)吸收剂、着色剂、矫味剂和/或甜味剂；f)乳化剂或分散剂，例如labrasol、hpmc、labrafil、peceol、capmul、维生素e tgps和/或其它可接受的乳化剂；和/或g)增强化合物吸收的试剂，诸如环糊精、羟丙基-环糊精、peg400和/或peg200。
[0090]
液体组合物，特别是可注射的组合物可以例如，通过溶解、分散等而制备。例如，将本发明的化合物溶解在药学上可接受的溶剂中，或与之混合，所述溶剂诸如例如水、盐水、右旋糖水溶液、甘油、乙醇和/或类似物，从而形成可注射的等渗溶液或混悬剂。所述组合物可以被灭菌和/或含有佐剂，诸如防腐剂、稳定剂、润湿剂或乳化剂、溶液促进剂、用于调节渗透压的盐和/或缓冲剂。
[0091]
本发明的化合物也可以配制成可以从脂肪乳液或悬浮液制备的栓剂；使用聚亚烷基二醇诸如丙二醇作为载体。
[0092]
还可以通过使用单克隆抗体作为与所述化合物偶联的单个载体来递送本发明的化合物。本发明的化合物可以与作为可靶向药物载体的可溶性聚合物偶联。这样的聚合物可以包括、但不限于聚乙烯吡咯烷酮、吡喃共聚物、聚羟丙基甲基丙烯酰胺-苯酚、聚羟乙基天冬酰胺苯酚或被棕榈酰残基取代的聚氧化乙烯聚赖氨酸(polyethyleneoxidepolylysine)。此外，本发明的化合物可以与可用于实现药物的控释的一类可生物降解的聚合物偶联，所述聚合物例如聚乳酸、聚ε己内酯、聚羟基丁酸、聚原酸
酯、聚缩醛、聚二氢吡喃、聚氰基丙烯酸酯以及水凝胶的交联或两亲嵌段共聚物。在一个实施方案中，所公开的化合物不共价结合聚合物，例如，聚羧酸聚合物或聚丙烯酸酯。
[0093]
胃肠外可注射施用通常用于皮下、肌肉内或静脉内注射和输注。注射剂可以以常规形式制备，作为液体溶液或混悬剂或适于在注射前溶解在液体中的固体形式。此外，它们还可能含有其它治疗上有价值的物质。所述组合物可以分别根据常规的混合、制粒和/或包衣方法制备，并且含有约0.1-75%的活性成分，或含有约1-50%的活性成分。
[0094]
除了本发明的活性化合物以外，软膏剂、糊剂、乳膏剂和凝胶还可以含有赋形剂诸如动物和植物脂肪、油、蜡类、石蜡、淀粉、黄蓍胶、纤维素衍生物、聚乙二醇、硅酮、膨润土、硅酸、滑石粉、氧化锌或其混合物。
[0095]
除了本发明的化合物以外，粉剂和喷雾剂还可以含有赋形剂诸如乳糖、滑石粉、硅酸、氢氧化铝、硅酸钙和聚酰胺粉末，或这些物质的混合物。喷雾剂可以另外含有常规推进剂诸如氯氟烃。
[0096]
透皮贴剂具有向身体提供化合物的受控递送的附加优点。通过将本发明的化合物溶解或分配在适当的介质中，可以制备这样的剂型。还可以使用吸收增强剂增加所述化合物穿过皮肤的通量。通过提供控制速率的膜或通过在聚合物基质或凝胶中分散化合物，可以控制速率。
[0097]
本发明的组合物可以分别根据常规的混合、制粒和/或包衣方法制备，并且本发明的药物组合物可以含有按重量或体积计从约0.1%至约99% 的化合物。
[0098]
本发明进一步提供了药物组合物和剂型，其包含一种或多种降低本发明的化合物作为活性成分的分解速率的试剂。这样的试剂在本文中被称作“稳定剂”，包括、但不限于抗氧化剂诸如抗坏血酸、ph缓冲剂和/或盐缓冲剂等。
[0099]
可以根据多种因素选择利用本发明的化合物的给药方案，所述因素包括对象的类型、物种、年龄、体重、性别和/或医学病症；要治疗的病症的严重程度；施用途径；对象的肾或肝功能；和所采用的特定公开的化合物。具有普通技术的医师、临床医师或兽医可以容易地确定预防、治疗或抑制障碍或疾病的进展所需的每种活性成分的有效量。
[0100]
当用于指出的效果时，按照治疗病症所需，本发明的化合物的有效剂量在从约0.5 mg至约5000 mg化合物的范围内。
[0101]
在某些实施方案中，本发明的方法包含以约0.05至约5 mg化合物/kg对象的量给所述对象施用本发明的化合物，例如，约0.1 mg/kg至约5 mg/kg、约0.1 mg/kg至约3 mg/kg、约0.3 mg/kg至约1 mg/kg、或约1 mg/kg至约3 mg/kg。在某些实施方案中，可以以约0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.45、0.5、0.55、0.6、0.65、0.7、0.75、0.8、0.85、0.9、0.95、1、1.25、1.5、1.75、2、2.25、2.5、2.75、3、3.25、3.5、3.75、4、4.25、4.5、4.75或5 mg化合物/kg对象的量将本发明的化合物施用给对象。
[0102]
可以每天和/或周一次或多次(例如，每天和/或周1、2、3、4、5或更多次)持续一段时间(例如，约1至约52周或直到实现期望的治疗效果和/或治疗和/或预防)将本发明的化合物施用给对象。在某些实施方案中，每天一、二或三次将本发明的化合物施用给对象。在某些实施方案中，每周或每二或三天二或三次将本发明的化合物施用给对象。在某些实施方案中，每天一次持续约1至约52周或直到实现期望的治疗效果和/或治疗和/或预防而将本发明的化合物施用给对象。
[0103]
本发明的化合物可以与一种或多种其它治疗剂同时或在其之前或之后施用。本发明的化合物可以通过与一种或多种其它治疗剂相同或不同的施用途径分开施用，或在相同的药物组合物中一起施用。
[0104]
在某些实施方案中，本发明提供了一种产品，其包含式i-ii的化合物和至少一种其它治疗剂作为组合制品，用于在治疗中同时、分开或依次使用。在某些实施方案中，所述一种或多种另外的治疗剂是ace抑制剂、乙酰基辅酶a羧化酶抑制剂、腺苷a3受体激动剂、脂联素受体激动剂、akt蛋白激酶抑制剂、amp-活化的蛋白激酶(ampk)、胰淀素受体激动剂、血管紧张素ii at-1受体拮抗剂、自分泌运动因子(autotaxin)抑制剂、生物活性的脂质、降钙素激动剂、天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶抑制剂、天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3刺激剂、组织蛋白酶抑制剂、窖蛋白1抑制剂、ccr2趋化因子拮抗剂、ccr3趋化因子拮抗剂、ccr5趋化因子拮抗剂、氯离子通道刺激剂、cnr1抑制剂、细胞周期蛋白d1抑制剂、细胞色素p450 7a1抑制剂、dgat1/2抑制剂、二肽基肽酶iv抑制剂、内皮唾酸蛋白调节剂、嗜酸性粒细胞趋化因子配体抑制剂、细胞外基质蛋白调节剂、类法尼醇x受体激动剂、脂肪酸合酶抑制剂、fgf1受体激动剂、成纤维细胞生长因子(fgf-15、fgf-19、fgf-21)配体、半乳糖凝集素-3抑制剂、胰高血糖素受体激动剂、胰高血糖素-样肽1激动剂、g-蛋白偶联的胆汁酸受体1激动剂、hedgehog (hh)调节剂、丙型肝炎病毒ns3蛋白酶抑制剂、肝细胞核因子4α调节剂(hnf4a)、肝细胞生长因子调节剂、hmg coa还原酶抑制剂、il-10激动剂、il-17拮抗剂、回肠胆汁酸钠协同转运蛋白抑制剂、胰岛素敏化剂、整联蛋白调节剂、白介素-1受体-相关的激酶4 (irak4)抑制剂、jak2酪氨酸激酶抑制剂、klothoβ刺激剂、5-脂氧合酶抑制剂、脂蛋白脂肪酶抑制剂、肝x受体、lpl基因刺激剂、溶血磷脂酸-1受体(lysophosphatidate-1 receptor)拮抗剂、赖氨酰基氧化酶同系物2抑制剂、基质金属蛋白酶(mmp)抑制剂、mekk-5蛋白激酶抑制剂、膜铜胺氧化酶(vap-1)抑制剂、甲硫氨酸氨肽酶-2抑制剂、甲基cpg结合蛋白2调节剂、microrna-21(mir-21)抑制剂、线粒体解偶联剂、髓鞘碱性蛋白刺激剂、nacht lrr pyd结构域蛋白3 (nlrp3)抑制剂、nad依赖性的脱乙酰基酶sirtuin刺激剂、nadph氧化酶抑制剂(nox)、烟酸受体1激动剂、p2y13嘌呤受体刺激剂、pde 3抑制剂、pde 4抑制剂、pde 5抑制剂、pdgf受体β调节剂、磷脂酶c抑制剂、pparα激动剂、pparδ激动剂、pparγ激动剂、pparγ调节剂、蛋白酶活化的受体-2拮抗剂、蛋白激酶调节剂、rho相关的蛋白激酶抑制剂、葡萄糖钠转运蛋白-2抑制剂、srebp转录因子抑制剂、stat-1抑制剂、硬脂酰基辅酶a去饱和酶-1抑制剂、细胞因子信号传递-1刺激剂的抑制剂、细胞因子信号传递-3刺激剂的抑制剂、转化生长因子3 (tgf-β3)、转化生长因子β活化的激酶1 (taki)、甲状腺激素受体β激动剂、tlr-4拮抗剂、转谷氨酰胺酶抑制剂、酪氨酸激酶受体调节剂、gpcr调节剂、核激素受体调节剂、wnt调节剂和/或yap/taz调节剂。
[0105]
在某些实施方案中，所述疗法是由fxr介导的疾病或病症的治疗或预防。作为组合制品提供的产品包括、但不限于组合物，其包含一起在同一药物组合物中的式i-ii的化合物和一种或多种治疗剂，或分开形式的式i-ii的化合物和一种或多种治疗剂，例如以试剂盒的形式。
[0106]
在某些实施方案中，本发明的化合物是同位素标记的化合物。本文中使用的“同位素标记的化合物”是指这样的化合物：其中至少一个原子位置富集指定元素的特定同位素至显著大于该同位素的天然丰度的水平。例如，化合物中的一个或多个氢原子位置可以富
集氘至显著大于氘的天然丰度的水平，例如，富集到至少1%、优选至少20%或至少50%的水平。这样的氘代化合物可以，例如，比其非氘代类似物更缓慢地代谢，并因此当施用给对象时表现出更长的半衰期(annual reports in medicinal chemistry, 第26卷, 2011, 第24章
–
deuterium in drug discovery and development, 第403-417页)。使用本领域已知的方法，例如通过采用氘代起始材料，可以合成这样的化合物。除非有相反说明，否则同位素标记的化合物为药学上可接受的。
[0107]
在以下非限制性实施例中更详细地解释了本发明。
实施例
[0108]
下文所述的反应方案旨在提供用于制备本发明的化合物的方法的一般描述。提供本文提供的实施例以说明而非限制本发明的化合物以及这样的化合物和中间体的制备。
[0109]
用于合成本发明的化合物的所有起始材料、结构单元、试剂、酸、碱、脱水剂、溶剂和催化剂都是商购可得的，或者可以通过文献中所述的程序(例如，houben-weyl“science of synthesis”, 第1-48卷, georg thieme verlag及其后续版本)常规地制备。
[0110]
可以在合适的溶剂或稀释剂或其混合物存在下以有机合成领域的技术人员已知的方式进行反应。如果需要的话，也可以在酸或碱存在下进行反应，并冷却或加热，例如在从约-30℃至约150℃的温度范围内。在某些实施方案中，在从约0℃至约100℃的温度范围内，且更特别地，在从室温至约80℃的温度范围内，在敞开或封闭的反应容器中和/或在惰性气体(例如氮气)的气氛中进行反应。
[0111]
缩写aq. 水性的amp腺苷单磷酸atp腺苷三磷酸boc叔丁氧羰基cdna互补脱氧核糖核酸co2二氧化碳cu(i)i碘化亚铜(i)d双重峰dd双二重峰dmf二甲基甲酰胺dmso二甲基亚砜et3n三乙胺etoh乙醇g克h小时lcms液相色谱和质谱m多重峰m摩尔meoh甲醇
ms质谱n标准的m多重峰mg毫克min(s)分钟ml毫升m 摩尔mmol毫摩尔na2so4硫酸钠nmr核磁共振o2氧s单峰tert叔thf四氢呋喃t三重峰。
[0112]
实施例14-((8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基氧基)甲基)-5-环丙基-3-(2-(三氟甲氧基)苯基)异噁唑的制备(e)-2-(三氟甲氧基)苯甲醛肟在0℃将氢氧化钠(3.75 g, 0.093 mol)在水(64 ml)中的溶液加入到盐酸羟胺(6.3 g, 0.0907 mol)在水(64 ml)中的搅拌溶液中。10分钟以后，加入2-(三氟甲氧基)苯甲醛(15 g, 0.078 mol)在乙醇(64 ml)中的溶液。将得到的溶液在室温搅拌另外1h。将得到的溶液用冰水稀释，用乙酸乙酯萃取，并将合并的有机层用盐水洗涤，经无水硫酸钠干燥，过滤，并将滤液在减压下浓缩以提供作为固体的标题化合物(16.5 g, 86%)。1h nmr (400 mhz, d
6-dmso): δ 11.75 (s, 1h), 8.22 (s, 1h), 7.60-7.38 (m, 3h)。8.23 (s, 1h), 7.88 (dd, j = 8.0 hz, j = 2 hz, 1h), 7.59-7.51 (m, 1h), 7.49-7.42 (m, 2h)。
[0113]
(z)-n-羟基-2-(三氟甲氧基)亚胺苄基氯在室温将n-氯琥珀酰亚胺(12 g, 0.0901 mol)缓慢地加入(e)-2-(三氟甲氧基)苯甲醛肟(16.5 g, 0.0804 mol)在n, n-二甲基甲酰胺(165 ml)中的溶液中。1h以后，将溶液用水稀释，并用乙酸乙酯萃取。将合并的有机层用盐水洗涤，经无水na2so4干燥，过滤并在
2h),7.46-7.38(m,2h),4.33(s,2h),2.16-2.06(m,1h),1.32-1.23(m,2h),1.22-1.15(m,2h)。
[0117]
4-((8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基氧基)甲基)-5-环丙基-3-(2-(三氟甲氧基)苯基)异噁唑将18-冠-6(5.6g,0.021mol)和叔丁醇钾(4.7g,0.042mol)加入n-boc-去甲托品醇(4.8g,0.021mol)在四氢呋喃(100ml)中的溶液中。1h以后，在室温逐滴加入4-(溴甲基)-5-环丙基-3-(2-(三氟甲氧基)-苯基)异噁唑(7g,0.019mol)在四氢呋喃(40ml)中的溶液。16h以后，将反应混合物浓缩，用水和乙酸乙酯稀释，分离并将有机层用盐水洗涤，经无水na2so4干燥，过滤并在减压下浓缩。将粗产物使用100-200目硅胶通过快速柱色谱纯化，用0-100%的在石油醚中的乙酸乙酯洗脱，以提供作为油状物的3-((5-环丙基-3-(2-(三氟甲氧基)苯基)异噁唑-4-基)甲氧基)-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯(7g,71%)。在室温将其溶解在二氯甲烷(80ml)中并加入三氟乙酸(20ml)。1h以后，将反应混合物在减压下蒸发，将残余物溶解在乙酸乙酯中，用饱和碳酸氢钠溶液洗涤，然后将有机层经无水na2so4干燥，过滤并将滤液在减压下浓缩以提供作为无色油状物的标题化合物(5.4g,70%)。lc-ms:1.81分钟,[m+h]
+
409。
[0118]
实施例22-(3-((5-环丙基-3-(2-(三氟甲氧基)苯基)异噁唑-4-基)甲氧基)-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-基)-4-氟苯并[d]噻唑-6-亚磺酸钠的制备2,6-二溴-4-氟苯并[d]噻唑在0℃将溴(7ml,0.131mol)在乙酸(50ml)中的溶液加入4-溴-2-氟苯胺(25g,0.131mol)和硫氰化钠(43g,0.526mol)在乙酸(200ml)中的溶液中，然后将得到的混合物温热至40℃。16h以后，将反应混合物用冰水稀释，并用氢氧化铵溶液将ph调至8-9。将得到的混合物过滤并将剩余的固体干燥以提供作为固体的粗制的6-溴-4-氟苯并[d]噻唑-2-胺。在0℃将产物溶解在乙腈(60ml)中，随后加入亚硝酸叔丁酯(3.6ml)，然后加入溴化铜(ii)(5.41g,0.024mol)。将反应混合物温热至40℃，并在16h以后将反应混合物用乙酸乙酯稀释，用水洗涤，并将有机层经无水na2so4干燥，过滤并在减压下浓缩以提供作为固体的标题化合物(4g,10%)。lc-ms：2.37分钟,[m+h]
+
310。
[0119]
4-((8-(6-溴-4-氟苯并[d]噻唑-2-基)-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基氧基)甲基)-5-环丙基-3-(2-(三氟甲氧基)苯基)异噁唑
在室温将碳酸钾(0.86 g, 0.0062 mol)加入4-((8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基氧基)甲基)-5-环丙基-3-(2-(三氟甲氧基)苯基)异噁唑(0.85 g, 0.0020 mol)和2,6-二溴-4-氟苯并[d]噻唑(0.64 g, 0.0020 mol)在dmf (16 ml)中的溶液中。16h以后，将反应混合物倒入冰水中，并用乙酸乙酯萃取。将合并的有机层用盐水洗涤，经无水na2so4干燥，过滤，在减压下浓缩，并使用100-200目硅胶通过柱色谱纯化，用80%的在石油醚中的乙酸乙酯洗脱，以提供作为固体的4标题化合物(0.75 g, 57%)。1h nmr (400 mhz, d
6-dmso): δ 7.88-7.85 (m, 1h), 7.72-7.62 (m, 2h), 7.58-7.54 (m, 2h), 7.41 (dd, j = 10.4 hz, j = 2 hz, 1h), 4.34 (s, 2h), 4.22-4.15 (m, 2h), 3.59-3.51 (m, 1h), 2.40-2.28 (m, 1h), 2.02-1.92 (m, 2h), 1.86-1.78 (m, 4h), 1.77-1.68 (m, 2h), 1.18-1.04 (m, 4h)。
[0120]
3-(2-(3-((5-环丙基-3-(2-(三氟甲氧基)苯基)异噁唑-4-基)甲氧基)-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-基)-4-氟苯并[d]噻唑-6-基磺酰基)丙酸甲酯在室温将碘化亚铜(i) (0.19 g, 0.0010 mol)加入4-((8-(6-溴-4-氟苯并[d]噻唑-2-基)-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基氧基)甲基)-5-环丙基-3-(2-(三氟甲氧基)苯基)异噁唑(0.65 g, 0.0010 mol)、3-甲氧基-3-氧代丙烷-1-亚磺酸钠(0.35 g, 0.0020 mol)和l-脯氨酸(0.117 g, 0.0010 mol)在二甲基亚砜(13 ml)中的溶液中，并将得到的混合物温热至130℃。16 h以后，加入水和乙酸乙酯，并将混合物穿过硅藻土过滤。然后将滤液用冷水、盐水洗涤，经无水na2so4干燥，过滤，在减压下浓缩，并使用100-200目硅胶通过快速柱色谱纯化，用0-70%的在石油醚中的乙酸乙酯洗脱，以提供作为固体的标题化合物(0.15 g, 20%)。lc-ms: 2.50分钟, [m+h]
+ 710。
[0121]
2-(3-((5-环丙基-3-(2-(三氟甲氧基)苯基)异噁唑-4-基)甲氧基)-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-基)-4-氟苯并[d]噻唑-6-亚磺酸钠在0℃将在甲醇中的1m甲醇钠(0.5 ml)加入3-(2-(3-((5-环丙基-3-(2-(三氟甲氧基)苯基)异噁唑-4-基)甲氧基)-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-基)-4-氟苯并[d]噻唑-6-基磺酰基)丙酸甲酯(0.15 g, 0.0002 mol)在甲醇(2 ml)中的溶液中。在室温5 h以后，将
反应混合物浓缩，与乙醚一起研磨，用正戊烷洗涤并在减压下干燥以提供作为固体的标题化合物(0.102g,75%)。lc-ms:4.85min,[m-na+h]
+
624；1hnmr(400mhz,d
6-dmso):δ7.72-7.62(m,2h),7.59-7.52(m3h),7.09(d,j=10.4hz,1h),4.33(s,2h),4.18-4.12(m,2h),3.58-3.54(m,1h),2.40-2.30(m,1h),2.06-1.96(m,2h),1.88-1.76(m,4h),1.74-1.66(m,2h),1.18-1.06(m,4h)。
[0122]
实施例32,6-二溴-4-甲基苯并[d]噻唑在0℃将溴(2.7ml,53.76mmol)在乙酸(20ml)中的溶液加入4-溴-2-氟苯胺(10g,53.76mmol)和硫氰化钠(17.4g,215mmol)在乙酸(80ml)中的溶液中，然后将得到的混合物温热至40℃。16h以后，将反应混合物用冰水稀释，并用氢氧化铵溶液将ph调至8-9。将得到的混合物过滤并将剩余的固体干燥以提供作为固体的粗制的6-溴-4-甲基苯并[d]噻唑-2-胺(3.2g)。在0℃将6-溴-4-甲基苯并[d]噻唑-2-胺(3g)溶解在乙腈(60ml)中，然后加入亚硝酸叔丁酯(3.84ml)，然后加入溴化铜(ii)(5.88g,223mmol)在乙腈(60ml)中的溶液。将反应混合物温热至40℃，并在16h以后，将反应混合物用乙酸乙酯稀释，用水洗涤并将有机层经无水na2so4干燥，过滤并在减压下浓缩以提供作为固体的标题化合物(1.4g,35%)。lc-ms:2.49分钟,[m+h]
+
308。
[0123]
4-((8-(6-溴-4-甲基苯并[d]噻唑-2-基)-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基氧基)甲基)-5-环丙基-3-(2-(三氟甲氧基)苯基)异噁唑在室温将碳酸钾(1.5g,11.02mmol)加入4-((8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基氧基)甲基)-5-环丙基-3-(2-(三氟甲氧基)苯基)异噁唑(1.5g,3.67mmol)和2,6-二溴-4-甲基苯并[d]噻唑(1.12g,3.67mmol)在n,n-二甲基甲酰胺(20ml)中的搅拌溶液中。16h以后，将反应混合物倒入冰水中，用乙酸乙酯萃取，将合并的有机层用盐水洗涤，经无水na2so4干燥，过滤，在减压下浓缩，并使用100-200目硅胶通过快速柱色谱纯化，用73%的在石油醚中的乙酸乙酯洗脱，以提供作为固体的标题化合物(1.06g,46%)。lc-ms:3.06分钟,[m+h]
+
636。
[0124]
3-(2-(3-((5-环丙基-3-(2-(三氟甲氧基)苯基)异噁唑-4-基)甲氧基)-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-基)-4-甲基苯并[d]噻唑-6-基磺酰基)丙酸甲酯
在室温将cu(i)i(570mg,3.02mmol)加入4-((8-(6-溴-4-甲基苯并[d]噻唑-2-基)-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基氧基)甲基)-5-环丙基-3-(2-(三氟甲氧基)苯基)异噁唑(960mg,1.51mmol)、3-甲氧基-3-氧代丙烷-1-亚磺酸钠(790mg,4.54mmol)和l-脯氨酸(174mg,1.51mmol)在二甲基亚砜(20ml)中的溶液中，并将得到的混合物温热至130℃。16h以后，加入水和乙酸乙酯，并将混合物穿过硅藻土过滤。然后将滤液用冷水、盐水洗涤，经无水na2so4干燥，过滤，在减压下浓缩，并使用100-200目硅胶通过快速柱色谱纯化，用0-65%的在石油醚中的乙酸乙酯洗脱，以提供作为固体的标题化合物(0.25g,25%)。lc-ms:2.57分钟,[m+h]
+
706。
[0125]
2-(3-((5-环丙基-3-(2-(三氟甲氧基)苯基)异噁唑-4-基)甲氧基)-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-基)-4-甲基苯并[d]噻唑-6-亚磺酸钠在0℃将在甲醇中的1m甲醇钠(7ml)加入3-(2-(3-((5-环丙基-3-(2-(三氟甲氧基)苯基)异噁唑-4-基)甲氧基)-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-基)-4-氟苯并[d]噻唑-6-基磺酰基)丙酸甲酯(0.25g,0.35mmol)在甲醇(2.5ml)中的溶液中。在室温5h以后，将反应混合物浓缩，与乙醚一起研磨，用正戊烷洗涤并在减压下干燥以提供作为固体的标题化合物(0.112g,51%)。lc-ms：4.91min,[m-na]
+
618；1hnmr(400mhz,d
6-dmso)：7.72-7.62(m,2h),7.59-7.52(m,3h),7.16-7.12(m,1h),4.33(s,2h),4.20-4.10(m,2h),3.58-3.51(m,1h),2.42(s,3h),2.39-2.30(m,1h),2.08-1.98(m,2h),1.85-1.77(m,4h),1.75-1.65(m,2h),1.18-1.05(m,4h)。
[0126]
实施例4人法尼醇x受体(nr1h4,fxr)报告测定确定配体介导的gal4启动子驱动的反式活化，以量化配体结合介导的fxr的活化。从indigobioscience(#ib00601-32)购买fxr报告测定试剂盒以确定可以诱导fxr活化的化合物的效能和效力。核受体测定系统利用非人哺乳动物细胞，其经工程改造以提供人fxr受体(nr1h4)(一种配体依赖性的转录因子)的组成型高水平表达。报告细胞包括与fxr-应答启动子连接的萤光素酶报告基因功能物(functionality)。定量经处理的报告细胞中萤光素酶表达的变化，以提供fxr活性的变化的灵敏替代量度。
[0127]
报告细胞整合了编码甲虫萤光素酶的cdna，所述甲虫萤光素酶是一种在mg
2+
依赖性反应中催化d-萤光素的单氧化的蛋白，所述反应消耗o2和atp作为协同底物，产生产物氧化萤光素、amp、ppi、co2和光子(光)发射。使用光度计定量反应的发光强度，并以相对光单位(rlu)的方式报告。
[0128]
根据生产商的说明书进行测定。简而言之，将试验化合物称重并溶解于磷酸盐缓冲溶液中作为10mm储备液，并使用化合物筛选培养基(csm)稀释至适当的浓度。将冷冻的报告细胞解冻并悬浮在37℃的细胞恢复培养基中。然后将化合物立即加入细胞板中，并将板放置在37℃的增湿co2培养箱中22-24小时。温育后，小心地除去培养基，加入萤光素酶检测溶液，并在光度计中读出板。按照试剂盒说明计算数据，其中发光的增加与化合物激动剂活性的增加成正比。
[0129]
表1总结了本发明的化合物的效能范围。使用人fxr (nr1h4)测定确定ec
50
值，并将效力归一化至设定为100%的gw4064。
[0130]
表1：试验的化合物的效能实施例ec50 (μ μ)效力(%)20.4611930.23111
[0131]
实施例5在人原代肝细胞中的基因表达将试验化合物溶解在缓冲液中以产生10mm储备溶液。将所述化合物连续稀释至所需浓度，然后与人原代肝细胞一起在37℃在co2培养箱中温育24小时。温育后，除去培养基，并使用trizol-chcl3方法收获rna，并使用nano drop定量。然后使用superscript vilo cdna合成试剂盒将rna反转录为cdna。cdna具有各自的taqman引物，然后使用定量rt-pcr系统扩增主混合物。图1显示了实施例2的化合物与原代人肝细胞一起温育后bsep基因表达的倍数变化。图2显示了实施例2的化合物与原代人肝细胞一起温育后shp基因表达的倍数变化。图3显示了实施例3的化合物与原代人肝细胞一起温育后bsep基因表达的倍数变化。图4显示了实施例3的化合物与原代人肝细胞一起温育后shp基因表达的倍数变化。
[0132]
实施例2和3的化合物在与原代人肝细胞一起温育后上调fxr相关基因和疾病相关基因。bsep（胆汁盐排泄泵）是fxr的直接靶标，并由fxr激动剂强烈诱导。它是一种单向的atp依赖性的外流转运蛋白，其在将胆汁盐从肝细胞清除到胆小管中以输出到胃肠道中发挥重要作用。fxr还诱导小异源二聚体配偶体(shp)的表达，所述配偶体在多种代谢途径中控制一组复杂的基因。它降低cyp7a1的表达，cyp7al是一种肝脏特异性酶，其催化胆汁酸生物合成的两条途径之一中的第一个且限速的步骤。
[0133]
实施例6在高脂肪高胆固醇饮食(hfhc)饲喂的雄性c57bl/6小鼠中的体内效力购买8周龄的c57bl/6j雄性小鼠。在1周的适应期后，将动物维持高脂肪高胆固醇饮食(研究饮食) 4周，其中60%千卡来自脂肪+ 0.5% (w/w)额外胆固醇(研究饮食, d02051401)。将年龄匹配的对照动物（n=6）维持正常食物。从第0天到第27天，在早上（上午7点）和晚上（下午5点）给小鼠服用媒介物、试验化合物和gw4064。在第28天，在早上7点给动物服药，并在接下来的4小时保持禁食，然后采集血液和组织。将从采集的血液分离的血浆样品立即在-20℃储存用于评估分析。使用siemens dimension rxl max临床化学分析仪分析样品。
[0134]
将右肝叶用于试验化合物暴露、甘油三酯和胆固醇估算。对肝组织进行解剖、称重和快速冷冻，并在-80℃储存用于进一步分析肝甘油三酯、胆固醇和化合物暴露。简言之，将
储存的组织解冻至室温，并通过将25 mg肝组织在1 ml的5% 的在水中的triton x100 (批号61k01741
‑ꢀ
sigma aldrich)中均质化来提取甘油三酯。将均质组织在水浴中缓慢地加热至80℃保持5分钟。将样品冷却，并再次加热以将所有甘油三酯溶解到溶液中。将样品在4000 rpm离心5分钟，并收集上清液，以使用来自erba (批号b061832)的市售试剂盒进行定量3。
[0135]
为了估算肝胆固醇，取~10 mg肝组织，并用~200 μl氯仿(批号shbg1163v
‑ꢀ
sigma aldrich)：异丙醇(批号shbg8515v
‑ꢀ
sigma aldrich)：np-40 (批号0001436781
‑ꢀ
sigma aldrich) (7:11:0.1)在微型匀浆器中萃取。将均质样品在13000 g离心10分钟以除去不溶物。将有机相分离到新试管中，并在50℃风干以除去氯仿。此后，将样品抽真空30分钟以除去残余有机溶剂。将干燥的脂质溶解在200 μl胆固醇测定缓冲液（与sigma胆固醇测定试剂盒批号b2j210603v一起提供）中，超声处理20分钟并旋转直到混合物是均匀的，如试剂盒方案所述。将样品用胆固醇测定缓冲液以（1:10）的比例稀释以符合标准曲线，并将最后50 μl稀释的样品用于测定。
[0136]
图5显示了用实施例2的化合物治疗28天以后hfhc雄性小鼠中的肝甘油三酯含量。图6显示了用实施例2的化合物治疗28天以后hfhc雄性小鼠中的肝胆固醇含量。图7显示了用实施例2的化合物治疗28天以后hfhc雄性小鼠中的血浆总胆固醇含量。图8显示了用实施例3的化合物治疗28天以后hfhc雄性小鼠中的肝甘油三酯含量。图9显示了用实施例3的化合物治疗28天以后hfhc雄性小鼠中的肝胆固醇含量。图10显示了用实施例3的化合物治疗28天以后hfhc雄性小鼠中的血浆总胆固醇含量。
[0137]
将实施例2和3的化合物以3 mg/kg每天两次（bid）、3mg/kg每天一次(qd)和10 mg/kg每天两次给hfhc饲喂的雄性小鼠经口服用。28天后，观察到肝脏和血浆二者中的肝甘油三酯以及胆固醇水平的降低。还测量了血浆和肝脏中的化合物水平以了解其分布曲线。表2总结了在第28天最后一次服用试验化合物以后4小时血浆和肝脏中的平均化合物暴露。计算出的比率显示相对于在血浆中，其在肝脏中的高暴露。本发明的化合物可以减少对象的肝脏和/或血浆中的肝甘油三酯和/或胆固醇。本发明的化合物可以显示出与血浆相比在肝脏中的高暴露的分布曲线。
[0138]
表2：在血浆和肝脏中的平均化合物暴露实施例剂量血浆ng/ml肝脏ng/g比率23mg/kg bid1.054.854.8210mg/kg qd1.280.166.8210mg/kg bid2.1138.365.933mg/kg bid3.788.924.0310mg/kg qd5.9176.329.9310mg/kg bid11.5198.317.2
[0139]
实施例7在非酒精性脂肪性肝炎的stam
tm
模型中的体内效力如下在雄性小鼠中诱导nash：在出生后2天单次皮下注射200 μg链脲霉素(stz, sigma-aldrich, 美国)溶液，并在4周龄后用高脂肪饮食(hfd, 57千卡%脂肪, 目录号hfd32, clea japan, inc., 日本)饲喂。基于治疗开始前一天的体重，将6周龄的nash模型
小鼠随机分组，每组8只小鼠。然后将实施例2的化合物以10 ml/kg的体积以0.3 mg/kg、1 mg/kg和3 mg/kg的剂量水平经口服施用，每天一次，持续3周。
[0140]
在研究结束时，将两小时禁食血液收集在含有抗凝血剂(novo-heparin, mochida pharmaceutical co. ltd., 日本)的聚丙烯试管中，并在1,000xg在4℃离心15分钟。收集上清液并在-80℃储存直至使用。
[0141]
按照以下方式制备肝样品——在处死后，收集整个肝脏并用冷盐水洗涤。如图11所述分离和解剖肝脏的左侧叶，并如下所述储存。
[0142]
对于切片a，将肝样本包埋在optimal cutting temperature (o.c.t., sakura finetek japan，日本)化合物中在-80℃储存，用于进一步分析或运输。
[0143]
对于切片b，将肝样本在bouin氏溶液(sigma-aldrich japan，日本)中固定24小时。固定后，处理这些样本以进行石蜡包埋用于he和天狼猩红染色。
[0144]
对于切片c，将肝样本在液氮中快速冷冻并在-80℃储存用于进一步分析或运输。
[0145]
对于he染色，从在bouin氏溶液中预固定的肝组织的石蜡块切下切片，并用lillie-mayer氏苏木精(muto pure chemicals co., ltd., 日本)和曙红溶液(wako pure chemical industries)染色。根据kleiner (kleiner de. 等人, hepatology, 2005;41:1313)的标准计算nafld活性评分(nas)。对于nas评分，使用数字照相机(dfc295；leica, 德国)以50倍和200倍放大率拍摄he染色的切片的明视野图像。估算1个切片/小鼠的脂肪变性评分（代表50倍放大率时中央静脉周围的1个视野）、1个切片/小鼠的炎症评分（代表200倍放大率时中心静脉周围的1个视野）和1个切片/小鼠的气球样变评分（代表200倍放大率时中央静脉周围的1个视野）。
[0146]
为了可视化胶原沉积，使用天狼猩红溶液(picro sirus red solution，waldeck, 德国)对bouin氏固定的肝切片进行染色。简言之，将切片用二甲苯、100-70%乙醇系列和ro水脱石蜡和亲水化，然后用0.03% 天狼猩红溶液(目录号: 1a-280)处理60分钟。在用0.5% 乙酸溶液和ro水洗涤后，将染色的切片脱水并用70-100% 乙醇系列和二甲苯清理，然后用entellan
®
new (merck, 德国)密封并用于观察。为了定量分析纤维化面积，使用数字照相机(dfc295；leica, 德国)在200倍放大率在中央静脉周围捕获天狼猩红染色的切片的明视野图像，并使用imagej软件(national institute of health, 美国)测量5个视野/切片中的阳性区域。
[0147]
nafld活性评分(nas)是一个数值评分，并且是脂肪变性(过量肝脂肪储存)、肝细胞气球样变(细胞肿胀和增大)和小叶炎症(巨噬细胞和淋巴细胞聚集)的单独评分之和。所述评分可以用于量化在疾病进展期间和施用潜在治疗剂后nafld的变化。为了量化纤维化程度，使用天狼猩红染色的肝切片来可视化和研究胶原分布。
[0148]
当将动物每天一次用化合物2治疗三周时，在stam模型中观察到nas评分和纤维化面积的显著降低。图12显示了当将实施例2的化合物以0.3 mg/kg、1 mg/kg或3 mg/kg剂量每天一次施用3周时在stam模型中的nafld活性评分。图13显示了当将实施例2的化合物以0.3 mg/kg、1 mg/kg或3 mg/kg剂量每天一次施用3周时在stam模型中的纤维化面积。
[0149]
实施例8在人微粒体中的代谢将人微粒体(1250 μl, 4 mg/ml)、磷酸钾缓冲液(1250 μl)、丙甲菌素
（alamethecin）(12.5 μl, 5 mg/ml)和辅因子烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸nadph (1250 μl, 4mm)/尿苷5'-二磷酸化-葡萄糖醛酸udpga (1250 μl, 4mm)或仅udpga的微粒体混合物(247.5 μl)负载到振荡器上10分钟。然后将试验化合物(2.5 μl，100 μm)分别加入到两种微粒体混合物(即一种具有nadph的混合物和一种不具有nadph的混合物)中，在37℃温育并在预定的时间点取样。使用ab sciex qtrap 4500 lc-ms/ms（kinetex c18, 50*4.6 mm, 5 μm柱）进行分析，并用10mm乙酸铵/甲醇洗脱。
[0150]
表3总结了在存在辅因子udpga和nadph或仅存在udpga的情况下与人微粒体一起温育45分钟后剩余的化合物的百分比。
[0151]
表3：温育45分钟后剩余化合物的百分比
实施例#的化合物与udpga和nadph一起温育45分钟时的%剩余与udpga一起温育45分钟时的%剩余25294
[0152]
人微粒体的显著代谢仅在辅因子nadph存在下发生，这表明所述化合物通过cyp氧化途径代谢。在辅因子udpga存在下所述化合物的稳定性表明，未发生通过酰基-葡萄糖醛酸化的代谢。
[0153]
实施例9在肝细胞中的代谢鉴定在dmso中制备来自实施例2的试验化合物(2-(3-((5-环丙基-3-(2-(三氟甲氧基)苯基)异噁唑-4-基)甲氧基)-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-基)-4-氟苯并[d]噻唑-6-亚磺酸钠)的10 mm储备液。然后通过在1996 μl的krebs-hensleit缓冲液中稀释4 μl的10 mm储备液，制备20 μm的最终工作储备液。
[0154]
将200 μl的肝细胞细胞悬浮液(2 x 106个细胞/ml)加入到tpp 48孔板中，并在培养箱中于37℃预温育30分钟。将200 μl的20 μm试验化合物的工作储备液加入到细胞悬浮液中，并在培养箱中以500 rpm的振荡速度在vibramax上温育。对于0分钟样品，将25 μl的肝细胞悬浮液用200 μl的乙腈沉淀，并加入25 μl的20 μm试验化合物。通过用200 μl的乙腈沉淀50 μl的温育混合物，在15、30、60、90、120分钟停止反应。将样品在1200 rpm涡旋5分钟，并在4000 rpm离心10分钟。分离上清液，用水稀释2倍，并使用hplc (shimadzu sil hts)和质谱仪(5500 qtrap)分析。将乙腈和0.1% 的在milli-q-水中的甲酸用作流动相，使用waters xbridge c18, 250x3.0 mm, 5.0 μ粒径或phenomnex kinetex 5 μevo c18 100a, 50 x 4.6 mm 5.0 μ粒径的柱。
[0155]
表4总结了当将本发明的实施例2的化合物在人、狗或小鼠肝细胞中温育时观察到的主要代谢物。
[0156]
表4：使用实施例2的化合物在肝细胞中的代谢鉴定物种观察到的主要代谢物酰基-葡萄糖醛酸苷人羟基、烯基和烯基-羟基无狗羟基、二羟基烯基和烯基-羟基无小鼠羟基、二羟基和烯基-羟基无
[0157]
图14显示了由实施例2的化合物与人肝细胞一起温育120分钟形成的主要代谢物的ms/ms谱。[m+h]
+
离子和断裂模式与氧化代谢相一致，以产生对应的羟基化合物。
[0158]
用微粒体（实施例8）和肝细胞（实施例9）的温育研究表明，所试验的化合物不是通
过酰基-葡萄糖醛酸化而是仅通过cyp氧化来代谢。这是与通常代谢为酰基-葡萄糖醛酸苷的相应的羧酸化合物不同的代谢曲线。这样的代谢可以产生反应性代谢物，其引起肝毒性和药物诱导的肝损伤(shipkova m, armstrong vw, oellerich m,和wieland e (2003) acyl glucuronide drug metabolites: toxicological and analytical implications. ther drug monit 25: 1-16；regan s, maggs j, hammond t, lambert c, williams d和park bk (2010) acyl glucuronides: the good, the bad and the ugly. biopharm drug dispos 31: 367-395；shipkova m, armstrong vw, oellerich m, 和wieland e (2003) acyl glucuronide drug metabolites: toxicological and analytical implications. ther drug monit 25: 1-16)。
[0159]
两类fxr激动剂(胆汁酸(例如奥贝胆酸)和非胆汁酸的衍生物)都通常含有羧酸官能团，并且由于其固有的化学性质而通过2期缀合(诸如酰基-葡萄糖醛酸化)而代谢(center for drug evaluation and research, 申请号: 207999orig1s000, pharmacology review(s)；gege c, hambruch e, hambruch n, kinzel o, kremoser c. nonsteroidal fxr ligands: current status and clinical applications, handb exp pharmacol. 2019年6月14日；tully dc, rucker pv, chianelli d, williams j, vidal a, alper pb, mutnick d, bursulaya b, schmeits j, wu x, bao d, zoll j, kim y, groessl t, mcnamara p, seidel hm, molteni v, liu b, phimister a, joseph sb, laffitte b., discovery of tropifexor(ljn452), a highly potent non-bile acid fxr agonist for the treatment of cholestatic liver diseases and nonalcoholic steatohepatitis (nash), j med chem. 2017年12月28日, 60(24), 9960-9973)；michael k. badman, jin chen, sachin desai, soniya vaidya, srikanth neelakantham, jie zhang, lu gan, kate danis, bryan laffitte和lloyd b. klickstei, safety, tolerability, pharmacokinetics, and pharmacodynamics of the novel non-bile acid fxr agonist tropifexor (ljn452) in healthy volunteers, clinical pharmacology in drug development, 2019年12月10日)。
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应当理解，本文所述的实施例和实施方案仅用于说明的目的，并且提示本领域技术人员可以以此为依据做出各种变型或改变，且它们应当被包括在本技术的精神和范围以及所附权利要求的范围内。