抗炎组合物、方法及其用途与流程

抗炎组合物、方法及其用途
1.相关申请
2.本技术从新西兰专利申请号765957和pct国际专利申请号pct/nz2020/050065获得优先权，其通过引用并入本文。
技术领域
3.本发明涉及包含3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶的组合物，其在预防、改善或治疗炎症和/或预防、改善和治疗tg2、jak和/或cox-2相关病症的方法及其用途。例如，与炎症相关的病症，例如胃肠道的炎症和/或与胃肠道相关的炎性病症。


背景技术：

4.与免疫系统相关的炎症可能是有益的，但并不总是这样。通常被认为是阴性反应或要避免的反应；特别是在胃肠系统的情况下。
5.炎症涉及多种胃肠道疾病。在健康的肠中，肠粘膜处于由促炎和抗炎细胞因子和细胞的复杂平衡调节的受控反应状态。这种平衡的破坏可达到免疫/非免疫应答的持续活化，导致主动炎症和组织破坏。不能充分预防或解决炎症涉及几种胃肠道疾病的发病机理，包括胃溃疡、炎性肠病(ibd)、克罗恩(crohn’s)病和溃疡性结肠炎。
6.根据治疗的严重性、程度和医学目的，炎性病症的常规药物，如柳氮磺吡啶(sulfasalazine)、美沙拉嗪(mesalazine)、皮质类固醇和甲氨蝶呤主要用于调节免疫和炎性反应。目前用于炎性病症的医学方法所遇到的安全性和功效的限制继续推动寻找更好和更安全的替代治疗剂。消费者还更普遍地寻求自然的方式来支持他们的健康和福祉。
7.尽管炎症的具体原因在许多疾病中仍有待鉴定，但肠粘膜系统中的细胞因子活化是调节肠道炎性疾病中炎症的关键靶标。已知环加氧酶-2(cox-2)、janus激酶(jak)和转谷氨酰胺酶2(tg2)都与ibd和许多其他炎性疾病有关。
8.胃溃疡是另一种常见的炎症相关胃肠病症。胃溃疡是良性粘膜病变，其深入穿透肠壁超过粘膜肌层并形成被急性和慢性炎性细胞浸润包围的凹坑。许多研究报道胃溃疡的主要危险因素包括幽门螺杆菌(helicobacter pylori)感染、吸烟、阿司匹林/非甾体抗炎药(nsaid)使用、酒精滥用和应激。
9.cox-2已知为促炎酶并且在几种炎性和疼痛相关病症的调节中起重要作用。cox-2过度表达与几种病症如脑缺氧/缺血和癫痫发作以及炎性慢性疾病中的神经毒素相关，慢性疾病包括克-雅病、肌萎缩性侧索硬化、多发性硬化、帕金森病和阿尔茨海默病(minghetti,l(2007)；minghetti(2004))。cox-2还在肠免疫应答的调节中起重要作用。传统上被认为是促炎酶，长期以来也认识到在ibd患者的发炎组织中cox-2上调。
10.jak和细胞内转录因子家族-信号转导子和转录激活子(stat)-组合以通过
‘
jak-stat’通路的通路发挥许多细胞因子的功能。在新的药物靶标中，jak抑制剂是有前景的新类别的药物，其在临床试验中已证明具有有利的安全性特征的功效。托法替尼是批准用于治疗溃疡性结肠炎的第一种jak抑制剂。
11.tg2是一种钙依赖性酶，其催化蛋白质中谷氨酰胺残基的聚氨基化。tg2与ibd和许多其他炎性疾病有关，包括乳糜泻和脓毒症。tg2也被由组织损伤、炎症或缺氧引起的氧化应激激活。tg2在触发炎症中具有作用。
12.胃溃疡的常规治疗包括用诸如奥美拉唑(omeprazole)和雷尼替丁(ranitinine)的药物进行药物治疗。此类药物可具有严重的副作用，例如骨髓抑制和异常心律，并且已知具有高复发率。
13.因此，有兴趣鉴定用于治疗炎症，疼痛和/或tg2、jak和/或cox-2相关病症的其他抗炎和止痛剂。例如，用于治疗胃肠炎症的抗炎剂和止痛剂。
14.蜂蜜的抗微生物活性是众所周知的。本领域还建议蜂蜜具有抗炎活性，尽管其原因尚未被很好地表征。一个专利公开wo2015/030609(其通过引用并入本文)探索了蜂蜜的特定部分的抗炎活性。该出版物教导了来自蜂蜜的低分子量部分具有普遍的抗炎作用并且没有免疫刺激作用。它没有讨论具体的抗炎作用。
15.从上文可以理解，提供治疗炎性病症(包括与胃肠道相关的炎性病症)的替代方法将是有用的。
16.本发明的目的是提供治疗炎性病症(包括与胃肠道相关的炎性病症)的方法和/或解决前述问题的一或多个和/或至少向公众提供有用的选择。
17.产品、组合物、方法和用途的其他方面和优点将从以下仅以实施例的方式给出的描述中变得显而易见。


技术实现要素：

18.本文描述了包含3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶的组合物，以及使用其预防、改善或治疗tg2、jak和/或cox-2相关病症、胃肠道炎症、与胃肠道相关的炎性病症和/或疼痛的方法。
19.本发明人已经鉴定来自蜂蜜的蝶啶，3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶，具有tg2、jak和/或cox-2抑制活性。能够分离所述化合物并表征抗炎和cox-2、tg2和/或jak抑制活性提供了生产用于各种用途的药物的能力，所述用途包括治疗、预防和改善与tg2、jak和/或cox-2相关的病症，包括炎性病症和疼痛。例如，与胃肠道相关的炎症和疼痛。
20.在第一特定方面，本发明提供了一种预防、改善或治疗受试者中cox-2相关病症的方法，其包括向有需要的受试者施用包含3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶的组合物。在一个实施方案中，cox-2相关病症是炎性病症。在一个实施方案中，相关炎性病症与胃肠道炎症相关。
21.在第一方面的一个实施方案中，cox-2相关病症选自由以下组成的组：胃肠炎性疾病、胃溃疡、消化性溃疡、胃炎、炎性肠病(ibd)、克罗恩病、溃疡性结肠炎、肠易激综合征(ibs)、消化疾病、胃食管反流病(gerd)、胃灼热、酸反流、幽门螺杆菌感染、口腔溃疡、口炎、咽炎、齿龈炎、食管溃疡、炎性和退行性神经系统疾病、神经精神疾病、精神分裂症、双相心境障碍、神经退行性疾病、创伤性脑损伤、多发性硬化、阿尔茨海默病、神经系统疾病、帕金森病、癫痫发作、脑缺氧/缺血、克-雅病、肌萎缩性侧索硬化、关节炎、类风湿性关节炎、幼年型类风湿性关节炎、强直性脊柱炎、慢性炎症、心血管疾病、疼痛、癌症、结直肠癌(crc)和肌肉骨骼疾病。
22.在第一方面的一个实施方案中，cox-2相关病症是疼痛。在一个实施方案中，疼痛是急性疼痛、慢性疼痛和/或痛经。
23.在第二特定方面，本发明提供了一种预防、改善或治疗受试者中cox-2相关炎症的方法，其包括向有需要的受试者施用包含3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶的组合物。在一个实施方案中，炎症与受试者的胃肠道有关。
24.在第三个具体方面，本发明提供了预防、改善或治疗受试者中cox-2相关疼痛的方法，其包括向有此需要的受试者施用包含3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶的组合物。
25.在另一个方面，本发明提供了预防、改善或治疗受试者中tg2相关病症的方法，其包括向有需要的受试者施用包含3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶的组合物。在一个实施方案中，tg2相关病症选自由以下组成的组：胃肠炎性疾病、胃溃疡(例如消化性溃疡)、胃炎、tg2相关炎性病症、炎性肠病(ibd)、克罗恩病、溃疡性结肠炎、肠易激综合征(ibs)、消化疾病、胃食管反流病(gerd)、胃灼热、酸反流、幽门螺杆菌感染、口腔溃疡、口炎、咽炎、齿龈炎和/或食管溃疡、神经精神疾病(例如精神分裂症和双相情感障碍)、多发性硬化、神经变性病症(例如创伤性脑损伤、多发性硬化和阿尔茨海默病)、心血管疾病、癌症、关节炎、乳糜泻、亨廷顿氏病、纤维化和癌症。tg2还在伤口愈合中起作用。
26.在另一个方面，本发明提供了预防、改善或治疗受试者中jak相关病症的方法，其包括向有需要的受试者施用包含3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶的组合物。在一个实施方案中，jak相关病症选自由以下组成的组：胃肠炎性疾病、胃溃疡(例如消化性溃疡)、胃炎、jak相关炎性病症、炎性肠病(ibd)、克罗恩病、溃疡性结肠炎、肠易激综合征(ibs)、消化疾病、胃食管反流病(gerd)、胃灼热、酸反流、幽门螺杆菌感染、口腔溃疡、口炎、咽炎、齿龈炎和/或食管溃疡、神经精神疾病(例如精神分裂症和双相情感障碍)、多发性硬化、神经变性病症(例如创伤性脑损伤、多发性硬化和阿尔茨海默病)、心血管疾病、癌症、关节炎、慢性炎症、自身免疫性病症、溃疡性结肠炎、斑秃、特应性皮炎、弥漫性硬皮病、克罗恩病、白癜风、噬血细胞综合征、非感染性葡萄膜炎和皮肤红斑狼疮。
27.在第七方面的一个实施方案中，3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶的来源是麦卢卡树(leptospermum)。在一个实施方案中，3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶基本上衍生自选自以下的植物：松红梅(leptospermum scoparium)、澳洲茶(leptospermum polygalifolium)、麦卢卡亚属(leptospermum subtenue)和/或其组合。在一个实施方案中，3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶来自松红梅。
28.在以上方面的一个实施方案中，3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶的来源是蜂蜜。
29.在以上方面的一个实施方案中，蜂蜜包括基本上来自麦卢卡树属的花来源的蜂蜜。在一个实施方案中，蜂蜜包含基本上来自以下的花来源的蜂蜜：松红梅(leptospermum scoparium)、澳洲茶(leptospermum polygalifolium)、麦卢卡亚属(leptospermum subtenue)和/或其组合。在一个实施方案中，蜂蜜包含基本上来自松红梅(也称为麦努考(manuka))的花来源的蜂蜜。
30.在以上方面的一个实施方案中，蜂蜜基本上来自麦卢卡树属的花来源。在一个实施方案中，蜂蜜基本上来自以下的花来源：松红梅(leptospermum scoparium)、澳洲茶(leptospermum polygalifolium)、麦卢卡亚属(leptospermum subtenue)和/或其组合。在一个实施方案中，蜂蜜是基本上来自松红梅(也称为麦努考(manuka))的花来源。
31.在以上方面的一个实施方案中，3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶直接衍生自麦卢卡树属植物。在一个实施方案中，3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶直接衍生自麦卢卡树属植物的花、花蜜、根、果实、种子、树皮、油、叶、木材、茎或其他植物材料。在一个实施方案中，3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶基本上来自选自以下的植物：松红梅(leptospermum scoparium)、澳洲茶(leptospermum polygalifolium)、麦卢卡亚属(leptospermum subtenue)和/或其组合。
32.在以上方面的一个实施方案中，包含3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶的组合物包含蜂蜜。在一个实施方案中，包含3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶的组合物由蜂蜜组成。
33.在以上方面的一个实施方案中，包含3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶的组合物包含蜂蜜提取物。在以上方面的一个实施方案中，包含3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶的组合物包含蜂蜜提取物，其中蜂蜜提取物包含的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶的浓度高于蜂蜜中天然存在的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶的浓度。在一个实施方案中，组合物由蜂蜜提取物组成，其中蜂蜜提取物包含的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶的浓度高于蜂蜜中天然存在的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶的浓度。在一个实施方案中，蜂蜜提取物包含的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶的浓度高于在衍生该提取物的蜂蜜中天然存在的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶的浓度。
34.在以上方面的一个实施方案中，从中获得提取物的蜂蜜包含基本上来自麦卢卡树属的花来源的蜂蜜。在一个实施方案中，从中获得提取物的蜂蜜包含基本上来自以下的花来源的蜂蜜：松红梅(leptospermum scoparium)、澳洲茶(leptospermum polygalifolium)、麦卢卡亚属(leptospermum subtenue)和/或其组合。在一个实施方案中，从中获得提取物的蜂蜜包含基本上来自松红梅的花来源的蜂蜜。在一个实施方案中，组合物进一步包含抗蜂蜜。
35.在以上方面的一个实施方案中，从中获得提取物的蜂蜜基本上来自麦卢卡树属的花来源。在一个实施方案中，从中获得提取物的蜂蜜基本上来自以下的花来源：松红梅(leptospermum scoparium)、澳洲茶(leptospermum polygalifolium)、麦卢卡亚属(leptospermum subtenue)和/或其组合。在一个实施方案中，从中获得提取物的蜂蜜基本上来自松红梅的花来源。在一个实施方案中，组合物进一步包含抗蜂蜜。
36.在以上方面的一个实施方案中，蜂蜜是生蜂蜜、热处理蜂蜜或巴氏灭菌蜂蜜。
37.在以上方面的一个实施方案中，组合物包含分离自蜂蜜的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶。在一个实施方案中，蜂蜜是基本上来自麦卢卡树属的花来源。在一个实施方案中，蜂蜜基本上来自以下的花来源：松红梅(leptospermum scoparium)、澳洲茶(leptospermum polygalifolium)、麦卢卡亚属(leptospermum subtenue)和/或其组合。在一个实施方案中，3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶通过将蜂蜜进行固相萃取，随后进行正相快速色谱法和制备型薄层色谱法来分离。
38.在以上方面的一个实施方案中，3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶是合成的。在一个实施方案中，组合物进一步包含抗蜂蜜。
39.在以上方面的一个实施方案中，所述组合物包含约2.5μg/ml至约1000μg/ml的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶。在一个实施方案中，组合物包含约2.5μg/ml、约5μg/ml、约10μg/ml、约20μg/ml、约40μg/ml、约50μg/ml、约60μg/ml、约70μg/ml、约80μg/ml、约90μg/ml、约100μg/ml、150μg/ml、约200μg/ml、约250μg/ml、约300μg/ml、约350μg/ml、约400μg/ml、约450约500μg/ml、约550μg/ml、约600μg/ml、约650μg/ml、约700μg/ml、约750μg/ml、约800μg/
ml、约850μg/ml、约900μg/ml、或约950μg/ml至约1000μg/ml的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶，或组合物包含约2.5至5μg/ml、约5至10μg/ml、约10至20μg/ml、约20至40μg/ml、约40至50μg/ml、约50至60μg/ml、约60至70μg/ml、约70至80μg/ml、约80至90μg/ml、约90至100μg/ml、约100至150μg/ml、150至200μg/ml、约200至250μg/ml、约250至300μg/ml、约300至350μg/ml、约350至400μg/ml、约400至450μg/ml、约450至500μg/ml、约500至550μg/ml、约550至600μg/ml、约600至650μg/ml、约650至700μg/ml、约700至750μg/ml、约750至800μg/ml、约800至850μg/ml、约850至900μg/ml、约900至950μg/ml、或约950至1000μg/ml的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶。
40.在以上方面的一个实施方案中，组合物包含约5mg/kg至约3000mg/kg的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶。在一个实施方案中，组合物包含约5mg/kg、约10mg/kg、约15mg/kg、约20mg/kg、约25mg/kg、约30mg/kg、约35mg/kg、约40mg/kg、约45mg/kg、约50mg/kg、约55mg/kg、约60mg/kg、约70mg/kg、约80mg/kg、约90mg/kg、约100mg/kg、约150mg/kg、约200mg/kg、约250mg/kg、约300mg/kg、约350mg/kg、约400mg/kg、约450mg/kg、约500mg/kg、约550mg/kg、约600mg/kg、约650mg/kg、约700mg/kg、约750mg/kg、约800mg/kg、约850mg/kg、约900mg/kg、约950mg/kg、约1000mg/kg、约1100mg/kg、约1200mg/kg、约1300mg/kg、约1400mg/kg、约1500mg/kg、约1600mg/kg、约1700mg/kg、约1800mg/kg、约1900mg/kg、约2000mg/kg、约2100mg/kg、约2200mg/kg、约2300mg/kg、约2400mg/kg、约2500mg/kg、约2600mg/kg、约2700mg/kg、约2800mg/kg、或约2900mg/kg至约3000mg/kg的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶，或所述组合物包含约5至10mg/kg、约10至15mg/kg、约15至20mg/kg、约20至25mg/kg、约25至30mg/kg、约30至35mg/kg、约35至40mg/kg、约40至45mg/kg、约45至50mg/kg、约50至55mg/kg、约55至60mg/kg、约60至70mg/kg、约70至80mg/kg、约约90至100mg/kg、约100至150mg/kg、约150至200mg/kg、约200mg/kg、约250至300mg/kg、约300至350mg/kg、约350至400mg/kg、约400至450mg/kg、约450至500mg/kg、约500至550mg/kg、约550至600mg/kg、约600至650mg/kg、约650至700mg/kg、约700至750mg/kg、约750至800mg/kg、约800至850mg/kg、约850至900mg/kg、约900至950mg/kg、约950至1000mg/kg、约1000至1100mg/kg、约1100至1200mg/kg、约1200至1300mg/kg、约1300至1400mg/kg、约1400至1500mg/kg、约1500至1600mg/kg、约1600至1700mg/kg、约1700至1800mg/kg、约1800至1900mg/kg、约1900至2000mg/kg、约2000至2100mg/kg、约2100至2200mg/kg、约2200至2300mg/kg、约2300至2400mg/kg、约2400至2500mg/kg、约2500至2600mg/kg、约2600至2700mg/kg、约2700至2800mg/kg、约2800至2900mg/kg、或约2900至3000mg/kg的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶的浓度。
41.在以上方面的一个实施方案中，组合物包含治疗有效量的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶。
42.在以上方面的一个实施方案中，将包含3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶的组合物配制为药物、治疗产品或健康补充剂。可将包含3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶的组合物配制成一系列递送系统，包括但不限于液体制剂、胶囊、咀嚼片、片剂、栓剂、快速移动消费品、静脉内制剂、肌内制剂、皮下制剂、溶液、食品、饮料、膳食补充剂、化妆品制剂、凝胶、洗剂、粉末和喷雾剂。
43.在以上方面的一个实施方案中，所述方法包括每天一次、两次、三次、四次或五次
施用包含3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶的组合物。
44.在以上方面的一个实施方案中，所述方法包括每周一、二、三、四、五、六、或七次施用包含3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶的组合物。
45.在以上方面的一个实施方案中，包含3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶的组合物以单剂量或分剂量施用。在一个实施方案中，包含3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶的组合物以一个、两个、三个或四个分开的剂量施用。
46.在以上方面的一个实施方案中，所述方法包括以约1mg至约3000mg的剂量施用包含3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶的组合物。在一个特定实施方案中，所述方法包括施用包含约1mg、10mg、20mg、30mg、40mg、50mg、60mg、70mg、80mg、90mg、100mg、150mg、200mg、250mg、300mg、350mg、400mg、450mg、500mg、550mg、600mg、650mg、700mg、750mg、800mg、850mg、900mg、950mg、1000mg、1100mg、1200mg、1300mg、1400mg、1500mg、1600mg、1700mg、1800mg、1900mg、2000mg、2100mg、2200mg、2300mg、2400mg、2500mg、2600mg、2700mg、2800mg、2900mg、或3000mg的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶的组合物。
47.在以上方面的一个实施方案中，所述方法包括以约5g至约100g的剂量施用包含3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶的组合物。
48.在以上方面的一个实施方案中，包含3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶的组合物具有通过以下获得的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶的标准化浓度：
49.a.选择具有已知浓度的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶的第一组合物；
50.b.选择至少一种具有已知浓度的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶的另外的组合物；以及
51.c.将所述第一组合物与所述第二组合物组合以获得具有约5mg/kg至约3000mg/kg的标准化3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶浓度的最终组合物。
52.在以上方面的一个实施方案中，包含3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶的组合物具有通过以下获得的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶的标准化浓度：
53.a.选择具有已知浓度的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶的第一组合物；
54.b.将所选择的第一组合物与以下中的一种或多种组合：
55.·
合成的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶；
56.·
分离的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶；
57.·
蜂蜜提取物，其包含3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶；和/或
58.·
直接衍生自麦卢卡树属植物的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶；
59.以形成具有约5mg/kg至约3000mg/kg的标准化3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶浓度的组合物。
60.在以上方面的一个实施方案中，所述组合物包含蜂蜜、蜂蜜提取物、分离的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶和/或合成的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶。
61.在以上方面的一个实施方案中，直接衍生自植物的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶直接衍生自麦卢卡树属植物的花、花蜜、根、果实、种子、树皮、油、叶、木材、茎或其他植物材料。
62.在以上方面的一个实施方案中，标准化的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶浓度为约5mg/kg至约3000mg/kg。在一个实施方案中，标准化的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶浓度来
自：约5mg/kg、约10mg/kg、约15mg/kg、约20mg/kg、约25mg/kg、约30mg/kg、约35mg/kg、约40mg/kg、约45mg/kg、约50mg/kg、约55mg/kg、约60mg/kg、约70mg/kg、约80mg/kg、约90mg/kg、约100mg/kg、约150mg/kg、约200mg/kg、约250mg/kg、约300mg/kg、约350mg/kg、约400mg/kg、约450mg/kg、约500mg/kg、约550mg/kg、约600mg/kg、约650mg/kg、约700mg/kg、约750mg/kg、约800mg/kg、约850mg/kg、约900mg/kg、约950mg/kg、约1000mg/kg、约1100mg/kg、约1200mg/kg、约1300mg/kg、约1400mg/kg、约1500mg/kg、约1600mg/kg、约1700mg/kg、约1800mg/kg、约1900mg/kg、约2000mg/kg、约2100mg/kg、约2200mg/kg、约2300mg/kg、约2400mg/kg、约2500mg/kg、约2600mg/kg、约2700mg/kg、约2800mg/kg、或约2900mg/kg至约3000mg/kg的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶。
63.在以上方面的一个实施方案中，3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶的浓度通过色谱法、分析测量、分光光度法和/或本领域技术人员已知的任何其他方法测定。在一个实施方案中，3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶的浓度通过反相hplc测定。
64.在第四个具体方面，本发明提供了制备具有抗炎、镇痛和/或tg2、jak和/或cox-2抑制活性的组合物的方法，其包括：
65.a.测试包含蜂蜜的第一组合物的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶浓度；
66.b.测试包含蜂蜜的至少一种另外组合物的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶浓度；
67.c.选择包含3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶浓度大于约5mg/kg的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶的蜂蜜的组合物；
68.d.选择包含3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶浓度大于约5mg/kg的蜂蜜的至少一种另外的组合物；
69.e.将所选择的包含蜂蜜的组合物组合以形成具有约5mg/kg至约80mg/kg的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶浓度的蜂蜜组合物。
70.在第四方面的一个实施方案中，如果包含蜂蜜的组合物的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶的浓度大于约5mg/kg、约10mg/kg、约15mg/kg、约20mg/kg、约25mg/kg、约30mg/kg、约35mg/kg、约40mg/kg、约45mg/kg、约50mg/kg、约55mg/kg、约60mg/kg、约70mg/kg或约80mg/kg，则选择所述组合物。
71.在第四方面的一个实施方案中，组合物包含蜂蜜、基本上由蜂蜜组成或由蜂蜜组成。
72.在一个实施方案中，3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶浓度通过色谱法、分析测量、分光光度法和/或本领域技术人员已知的任何其他方法测定。在一个实施方案中，3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶的浓度通过反相hplc测定。
73.在第四方面的一个实施方案中，具有抗炎、镇痛和/或tg2、jak和/或cox-2抑制活性的组合物适用于第一、第二或第三方面中任一方面的方法。
74.在第五具体方面，本发明提供了鉴定具有抗炎、镇痛和/或tg2、jak和/或cox-2抑制活性的组合物的方法，其包括：
75.a.测试组合物的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶浓度；以及
76.i.如果所述组合物含有大于约5mg/kg的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶浓度，则鉴定所述组合物具有抗炎、镇痛和/或tg2、jak和/或cox-2抑制活性；或
77.ii.如果所述组合物含有低于约5mg/kg的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶浓度，则鉴
定所述组合物不具有抗炎、镇痛和/或tg2、jak和/或cox-2抑制活性。
78.在一些实施方案中，组合物包含蜂蜜或蜂蜜提取物。
79.在第五方面的一个实施例中，如果包含蜂蜜的组合物含有大于约5mg/kg、约10mg/kg、约15mg/kg、约20mg/kg、约25mg/kg、约30mg/kg、约35mg/kg、约40mg/kg、约45mg/kg、约50mg/kg、约55mg/kg、约60mg/kg、约70mg/kg或约80mg/kg，则确定其为具有抗炎活性。
80.在第五方面的一个实施方案中，所述组合物包含蜂蜜或蜂蜜提取物、基本上由蜂蜜或蜂蜜提取物组成或由蜂蜜或蜂蜜提取物组成。
81.在第五方面的一个实施方案中，具有抗炎活性的组合物适用于第一至第三方面中任一方面的方法。
82.在第六特定方面，本发明提供了鉴定具有抗炎、镇痛和/或tg2、jak和/或cox-2抑制活性的组合物的方法，所述组合物适用于第一至第三个方面中任一方面的方法，所述方法包括：
83.a.测试组合物的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶浓度；以及
84.i.如果所述组合物含有的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶浓度为约5至约80mg/kg的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶，则鉴定所述组合物适用于第一至第三方面中的任一方面；或
85.ii.如果所述组合物含有的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶浓度低于约5mg/kg的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶，则鉴定所述组合物不适用于第一至第三方面中的任一方面。
86.在第六方面的一个实施方案中，如果组合物含有的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶浓度大于约5mg/kg、约10mg/kg、约15mg/kg、约20mg/kg、约25mg/kg、约30mg/kg、约35mg/kg、约40mg/kg、约45mg/kg、约50mg/kg、约55mg/kg、约60mg/kg、约70mg/kg或约80mg/kg，则将组合物鉴定为适用于第一至第三方面中任一方面的方法。
87.在一个实施方案中，所述组合物包含蜂蜜或蜂蜜提取物、基本上由蜂蜜或蜂蜜提取物组成或由蜂蜜或蜂蜜提取物组成。
88.在一个实施方案中，3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶浓度通过色谱法、分析测量、分光光度法和/或本领域技术人员已知的任何其他方法测定。在一个实施方案中，3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶的浓度通过反相hplc系统测定。
89.在第七特定方面，本发明提供适用于第一、第二或第三个方面中任一个的方法的包含3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶的组合物。
90.在第七方面的一个实施方案中，3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶的来源是麦卢卡树(leptospermum)。在一个实施方案中，3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶基本上来自选自以下的植物：松红梅(leptospermum scoparium)、澳洲茶(leptospermum polygalifolium)、麦卢卡亚属(leptospermum subtenue)和/或其组合。在一个实施方案中，3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶来自松红梅。
91.在第七方面的一个实施方案中，3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶的来源是蜂蜜。在一个实施方案中，蜂蜜是基本上来自麦卢卡树属的花来源。在一个实施方案中，蜂蜜基本上来自以下的花来源：松红梅(leptospermum scoparium)、澳洲茶(leptospermum polygalifolium)、麦卢卡亚属(leptospermum subtenue)和/或其组合。在一个实施方案中，蜂蜜是基本上来自松红梅(麦努考(manuka))的花来源。
92.在第七方面的一个实施方案中，3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶直接衍生自麦卢卡树
属植物。在一个实施方案3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶直接衍生自麦卢卡树属植物的花蜜、根、果实、种子、树皮、油、叶、木材、茎或其他植物材料。在一个实施方案中，3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶基本上来自选自以下的植物：松红梅(leptospermum scoparium)、澳洲茶(leptospermum polygalifolium)、麦卢卡亚属(leptospermum subtenue)和/或其组合。
93.在第七方面的一个实施方案中，包含3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶的组合物包含蜂蜜。在一个实施方案中，包含3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶的组合物基本上由蜂蜜组成。在一个实施方案中，包含3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶的组合物由蜂蜜组成。
94.在以上方面的一个实施方案中，包含3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶的组合物包含蜂蜜提取物。在一个实施方案中，包含3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶的组合物包含蜂蜜提取物，其中蜂蜜提取物包含的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶的浓度高于蜂蜜中天然存在的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶的浓度。在一个实施方案中，包含3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶的组合物基本上由蜂蜜提取物组成，其中蜂蜜提取物包含的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶的浓度高于蜂蜜中天然存在的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶的浓度。在一个实施方案中，包含3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶的组合物由蜂蜜提取物组成，其中蜂蜜提取物包含的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶的浓度高于蜂蜜中天然存在的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶的浓度。在一个实施方案中，蜂蜜提取物包含的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶的浓度高于在衍生该提取物的蜂蜜中天然存在的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶的浓度。
95.在一个实施方案中，从中获得提取物的蜂蜜基本上来自麦卢卡树属的花来源。在一个实施方案中，从中获得提取物的蜂蜜基本上来自以下的花来源：松红梅(leptospermum scoparium)、澳洲茶(leptospermum polygalifolium)、麦卢卡亚属(leptospermum subtenue)和/或其组合。在一个实施方案中，组合物进一步包含抗蜂蜜。
96.在一个实施方案中，蜂蜜是生蜂蜜、热处理蜂蜜或巴氏灭菌蜂蜜。
97.在一个实施方案中，组合物包含分离自蜂蜜的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶。在一个实施方案中，蜂蜜是基本上来自麦卢卡树的花来源。在一个实施方案中，蜂蜜基本上来自以下的花来源：松红梅(leptospermum scoparium)、澳洲茶(leptospermum polygalifolium)、麦卢卡亚属(leptospermum subtenue)和/或其组合。在一个实施方案中，3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶通过将蜂蜜进行固相萃取，随后进行正相快速色谱法和制备型薄层色谱法来分离。
98.在一个实施方案中，组合物包含合成的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶。在一个实施方案中，组合物进一步包含抗蜂蜜。
99.在一个实施方案中，组合物包含约2.5μg/ml至约1000μg/ml的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶。在一个实施方案中，组合物包含约2.5μg/ml、约5μg/ml、约10μg/ml、约20μg/ml、约40μg/ml、约50μg/ml、约60μg/ml、约70μg/ml、约80μg/ml、约90μg/ml、约100μg/ml、150μg/ml、约200μg/ml、约250μg/ml、约300μg/ml、约350μg/ml、约400μg/ml、约450约500μg/ml、约550μg/ml、约600μg/ml、约650μg/ml、约700μg/ml、约750μg/ml、约800μg/ml、约850μg/ml、约900μg/ml、约950μg/ml至或约1000μg/ml的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶，或其中组合物包含约2.5至5μg/ml、约5至10μg/ml、约10至20μg/ml、约20至40μg/ml、约40至50μg/ml、约50至60μg/ml、约60至70μg/ml、约70至80μg/ml、约80至90μg/ml、约90至100μg/ml、约100至150μg/ml、150至200μg/ml、约200至250μg/ml、约250至300μg/ml、约300至350μg/ml、约350至400μ
g/ml、约400至450μg/ml、约450至500μg/ml、约500至550μg/ml、约550至600μg/ml、约600至650μg/ml、约650至700μg/ml、约700至750μg/ml、约750至800μg/ml、约800至850μg/ml、约850至900μg/ml、约900至950μg/ml、约950至1000μg/ml的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶。
100.在一个实施方案中，所述组合物包含约5mg/kg的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶至约3000mg/kg的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶。在一个实施方案中，组合物包含约5mg/kg、约10mg/kg、约15mg/kg、约20mg/kg、约25mg/kg、约30mg/kg、约35mg/kg、约40mg/kg、约45mg/kg、约50mg/kg、约55mg/kg、约60mg/kg、约70mg/kg、约80mg/kg、约90mg/kg、约100mg/kg、约150mg/kg、约200mg/kg、约250mg/kg、约300mg/kg、约350mg/kg、约400mg/kg、约450mg/kg、约500mg/kg、约550mg/kg、约600mg/kg、约650mg/kg、约700mg/kg、约750mg/kg、约800mg/kg、约850mg/kg、约900mg/kg、约950mg/kg、约1000mg/kg、约1100mg/kg、约1200mg/kg、约1300mg/kg、约1400mg/kg、约1500mg/kg、约1600mg/kg、约1700mg/kg、约1800mg/kg、约1900mg/kg、约2000mg/kg、约2100mg/kg、约2200mg/kg、约2300mg/kg、约2400mg/kg、约2500mg/kg、约2600mg/kg、约2700mg/kg、约2800mg/kg、或约2900mg/kg至约3000mg/kg的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶，或所述组合物包含5至10mg/kg、或约10至15mg/kg、或约15至20mg/kg、或约20至25mg/kg、或约25至30mg/kg、或约30至35mg/kg、或约35至40mg/kg、或约40至45mg/kg、或约45至50mg/kg、或约50至55mg/kg、或约55至60mg/kg、或约60至70mg/kg、或约70至80mg/kg、约90至100mg/kg、约100至150mg/kg、约150至200mg/kg、约200mg/kg、约250至300mg/kg、约300至350mg/kg、约350至400mg/kg、约400至450mg/kg、约450至500mg/kg、约500至550mg/kg、约550至600mg/kg、约600至650mg/kg、约650至700mg/kg、约700至750mg/kg、约750至800mg/kg、约800至850mg/kg、约850至900mg/kg、约900至950mg/kg、约950至1000mg/kg、约1000至1100mg/kg、约1100至1200mg/kg、约1200至1300mg/kg、约1300至1400mg/kg、约1400至1500mg/kg、约1500至1600mg/kg、约1600至1700mg/kg、约1700至1800mg/kg、约1800至1900mg/kg、约1900至2000mg/kg、约2000至2100mg/kg、约2100至2200mg/kg、约2200至2300mg/kg、约2300至2400mg/kg、约2400至2500mg/kg、约2500至2600mg/kg、约2600至2700mg/kg、约2700至2800mg/kg、约2800至2900mg/kg、或约2900至3000mg/kg的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶的浓度。
101.在一个实施方案中，药物组合物包括治疗有效量的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶。
102.在一个实施方案中，将包含3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶的组合物配制为药物、治疗产品或健康补充剂。可以将包含3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶的组合物配制成一系列递送系统，包括但不限于液体制剂、快速移动消费品、胶囊、咀嚼片、片剂、栓剂、静脉内制剂、肌内制剂、皮下制剂、溶液、食品、饮料、膳食补充剂、化妆品制剂、凝胶、洗剂、粉末或喷雾剂。
103.在第八个具体方面，本发明提供了包含3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶的组合物在制备用于预防、改善或治疗受试者中cox-2相关病症的药物中的用途。
104.在第八方面的一个实施方案中，cox-2相关病症选自由以下组成的组：胃肠炎性疾病、胃溃疡、消化性溃疡、胃炎、炎性肠病(ibd)、克罗恩病、溃疡性结肠炎、肠易激综合征(ibs)、消化疾病、胃食管反流病(gerd)、胃灼热、酸反流、幽门螺杆菌感染、口腔溃疡、口炎、咽炎、齿龈炎、食管溃疡、炎性和退行性神经系统疾病、神经精神疾病、精神分裂症、双相心境障碍、神经退行性疾病、创伤性脑损伤、多发性硬化、阿尔茨海默病、神经系统疾病、帕金森病、癫痫发作、脑缺氧/缺血、克-雅病、肌萎缩性侧索硬化、关节炎、类风湿性关节炎、幼年
型类风湿性关节炎、强直性脊柱炎、慢性炎症、心血管疾病、癌症、疼痛、结直肠癌(crc)和肌肉骨骼疾病。
105.在第八方面的一个实施方案中，cox-2相关病症是疼痛。在一个实施方案中，疼痛是急性疼痛、慢性疼痛和痛经。
106.在第九特定方面，本发明提供了包含3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶的组合物在制备用于预防、改善或治疗受试者中cox-2相关炎症的药物中的用途。在一个实施方案中，炎症与胃肠道有关。
107.在第十特定方面，本发明提供了包含3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶的组合物在制备用于预防、改善或治疗受试者中cox-2相关疼痛的药物中的用途。在一个实施方案中，疼痛是急性疼痛、慢性疼痛和/或痛经。
108.在第十一特定方面，本发明提供了包含3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶的组合物在制备用于预防、改善或治疗tg2和/或jak相关病症的药物中的用途。
109.在第十一方面的一个实施方案中，tg2相关病症选自由以下组成的组：胃肠炎性疾病、胃溃疡(例如消化性溃疡)、胃炎、tg2相关炎性病症、炎性肠病(ibd)、克罗恩病、溃疡性结肠炎、肠易激综合征(ibs)、消化疾病、胃食管反流病(gerd)、胃灼热、酸反流、幽门螺杆菌感染、口腔溃疡、口炎、咽炎、齿龈炎和/或食管溃疡、神经精神疾病(例如精神分裂症和双相情感障碍)、多发性硬化、神经变性病症(例如创伤性脑损伤、多发性硬化和阿尔茨海默病)、心血管疾病、癌症、关节炎、乳糜泻、亨廷顿氏病、纤维化、癌症和创伤。
110.在十一方面的一个实施方案中，jak相关病症选自由以下组成的组：胃肠炎性疾病、胃溃疡(例如消化性溃疡)、胃炎、jak相关炎性病症、炎性肠病(ibd)、克罗恩病、溃疡性结肠炎、肠易激综合征(ibs)、消化疾病、胃食管反流病(gerd)、胃灼热、酸反流、幽门螺杆菌感染、口腔溃疡、口炎、咽炎、齿龈炎和/或食管溃疡、神经精神疾病(例如精神分裂症和双相情感障碍)、多发性硬化、神经变性病症(例如创伤性脑损伤、多发性硬化和阿尔茨海默病)、心血管疾病、癌症、关节炎、慢性炎症、自身免疫性病症、溃疡性结肠炎、斑秃、特应性皮炎、弥漫性硬皮病、克罗恩病、白癜风、噬血细胞综合征、非感染性葡萄膜炎和皮肤红斑狼疮。
111.在第十二个具体方面，提供了以上方面中任一个的方法、用途或组合物，其中组合物还包含cox-2抑制剂。
112.在第十三个具体方面，提供了以上方面中任一个的方法或用途，其还包括共施用cox-2抑制剂。上述方法和用途的优点可以改变。在一些实施方案中，3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶的来源是天然存在的并且能够在可持续的基础上制造。3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶预期不具有副作用，并且其可以多种方式配制用于多种施用方法。
113.本发明还可以广义地描述为包括在本技术的说明书中单独地或共同地提及或指示的部分、元件和特征，以及所述部分、元件或特征中的任何两个或更多个的任何或所有组合，并且其中在本文中提及的特定整数在本发明涉及的领域中具有已知的等同物，这些已知的等同物被认为并入本文，如同单独阐述一样。
114.在阅读提供本发明的实际应用的至少一个示例的以下描述后，本发明的其他方面(应在其所有新颖方面中考虑)将对所属领域的技术人员变得显而易见。
附图说明
115.现在将仅通过示例并参考附图来描述本发明的实施例，其中：
116.图1是说明mmp-9活性在10分钟内产生的荧光强度的图。
117.图2是说明从2.5-40μg/ml的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶抑制mmp-9活性的百分比的图。
118.图3是说明3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶浓度与mmp-9抑制之间的相关性的图。
119.图4是说明通过在120分钟内在412nm处的吸光度测量的mmp-9活性的图。
120.图5是说明3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶对mmp-9活性的抑制百分比的图。
121.图6是说明在20分钟内3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶与显色底物(a)或反应产物(b)之间没有显著相互作用的图。
122.图7显示了典型的明胶凝胶酶谱，显示了在正常显影缓冲液(3-5列)、补充了3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶的缓冲液(6-8列)和nngh(9-11列)中孵育的凝胶。
123.图8是说明使用明胶酶谱法(n＝5)的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶的抑制百分比的图。
124.图9说明将3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶对接到mmp-9的s’1底物结合口袋中。
125.图10示出了在四种麦努考蜂蜜样品(a、b、c、d)的胃消化过程中3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶的量(ng/ml)作为消化时间的函数。
126.图11示出了在四种麦努考蜂蜜样品(a、b、c、d)的肠消化过程中3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶的量(ng/ml)作为消化时间的函数。
127.图12示出了在四种50％麦努考蜂蜜样品(a、b、c、d)的胃消化期间3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶的量(ng/ml)作为消化时间的函数。
128.图13示出了在四种50％麦努考蜂蜜样品(a、b、c、d)的肠消化过程中3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶的量(ng/ml)作为消化时间的函数。
129.图14说明在纯3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶的胃消化过程中3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶的量(ng/ml)作为消化时间的函数。
130.图15说明在纯3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶的肠消化过程中3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶的量(ng/ml)作为消化时间的函数。
131.图16示出了3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶(2.5-40μg/ml)对细胞活力的影响。
132.在图17中示出了3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶对脂多糖的作用(055:b5，1μg/ml)在分化的thp-1细胞中诱导基质金属肽酶9(mmp-9)分泌(n＝2次重复)(基于原始值)。
133.在图18中示出了3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶对脂多糖的作用(055:b5，1μg/ml)在分化的thp-1细胞中诱导基质金属肽酶9(mmp-9)分泌(n＝2次重复)(基于绝对值)。
134.图19说明人jak1(pdb id:6n7a)的晶体结构。
135.图20说明了与原始姿态(绿色并标记为b)相比的kev的对接姿态(紫色并标记为a)。
136.图21说明了已知活性物质(绿色并标记为a)、非活性物质(红色并标记为b)和3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶(黄色并标记为c)的报告姿态的goldscore和chemscore评分分布。
137.图22说明3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶对6n7a的最高等级对接姿态。
138.图23说明人转谷氨酰胺酶2(pdb id:1kv3)的晶体结构。
139.图24说明了与原始姿态(b)相比的gdp的对接姿态(紫色并标记为a)。
140.图25说明了已知活性物质(绿色并标记为a)、非活性物质(红色并标记为b)和3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶(黄色并标记为c)的报告姿态的goldscore和chemscore评分分布。
141.图26说明3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶对1kv3的最高等级对接位姿。
142.图27是说明在用地塞米松(dex)、吲哚美辛(indo)或3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶(12.5、25、50和100μg/ml)处理并用lps共刺激后通过thp-1细胞的wst-1测定评估的细胞活力百分比的图。
143.图28说明在lps暴露和用lps与地塞米松、吲哚美辛或3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶联合共处理后单核细胞中cox-2的蛋白表达。图28a提供了cox-2蛋白表达的代表性蛋白质印迹，图18b是说明暴露于不同干预的thp-1细胞中cox-2的相对蛋白表达的图。
具体实施方式
144.本文描述了包含3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶的组合物、方法及其用于预防、改善或治疗炎症、疼痛和/或炎性病症的用途。具体地，炎症、疼痛或炎症tg2、jak和/或cox-2相关病症。
145.定义
146.就本说明书而言，本说明书中使用的术语“包括”是指“全部或至少部分包括”。当解释本说明书中包括该术语的陈述时，在每个陈述中以该术语序言的特征都需要存在，但也可以存在其他特征。诸如“包含(comprise)”、“包含(comprises)”和“包含(comprised)”的相关术语将以相同的方式解释。
147.术语“约”或“大约”及其语法变化意指数量、水平、程度、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度变化多达30％、25％、20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％。
148.术语“药物”或其语法变体是指医药产品。医药产品包括但不限于液体制剂、胶囊、片剂、咀嚼片、凝胶、洗剂、粉末、快速移动消费品、栓剂、化妆品制剂、喷雾制剂、食品制剂、饮料、静脉内制剂、肌内制剂、皮下制剂和溶液。
149.术语“治疗产品”或其语法变体是指有助于支持、治愈或恢复健康的产品。产品包括但不限于快速移动消费品、液体制剂、胶囊、片剂、咀嚼片、凝胶、洗剂、粉末栓剂、喷雾制剂、食品制剂、饮料、化妆品制剂、静脉内制剂、肌内制剂、皮下制剂和溶液。
150.术语“炎性病症”意指与不需要的和/或异常的炎症相关的病症或障碍。
151.术语“炎症”是指作为感染、刺激、损伤、疾病、病症或其他原因的结果而产生发红、温热、肿胀和/或疼痛的身体反应。炎症也可以在细胞水平表征。细胞炎症的特征可在于产生各种炎性介质，例如细胞因子、趋化因子或反应性氮和氧物质。
152.术语“抗炎”或其语法上的指当与不添加一种或多种抗炎化合物的持续时间、等级或情况相比时，与炎症相关的细胞因子、趋化因子、反应性氮和氧物质的预防、减轻、淬灭、平静、抑制或减少。其还指炎症被预防、减轻、淬灭、平息或抑制至减少发红、变暖、肿胀和/或疼痛的程度，减少的量是相对于未添加一种或多种抗炎化合物的持续时间、等级或情况。
153.关于组合物或药物的量或剂量的术语“治疗有效的”是指组合物的量足以有效地预防、改善或消除受试者的炎症、疼痛或本文所述的病况之一。该术语不应被视为限制性
的。它可以指根据期望的应用优化对受试者的作用(例如抗炎作用)的组合物或药物的剂量。
154.术语“健康补充剂”是指拟添加到受试者饮食中的产品。
155.术语“治疗”在其最宽的范围内考虑。该术语不需要被暗示为治疗受试者直到完全恢复。因此，“治疗”包括减轻、缓解或改善特定病症的症状或严重性或预防或以其他方式降低发展特定病症的风险。它还可包括维持或促进病症的完全或部分缓解状态。
156.术语“原料蜂蜜”是指已经历最小热量(例如《50℃)处理或未经历任何热处理的蜂蜜。
157.术语“标准化浓度”是指已经确定满足预定浓度范围的浓度。
158.如本文所用，术语“和/或”意指“和”或“或”，或两者。
159.如本文所用，跟随名词后的“s”意指名词的复数和/或单数形式。
160.意图是，对本文公开的数字范围的引用(例如1至10)也包含对该范围内所有合理数字的引用(例如1、1.1、2、3、3.9、4、5、6，6.5、7、8、9和10)以及该范围内的任何有理数范围(例如2至8、1.5至5.5和3.1至4.7。
161.受试者可以是人或非人动物。非人动物的非限制性示例是伴侣动物(例如猫和狗)、马和家畜，如牛、绵羊和鹿。
162.如上所述，本发明人已经鉴定，3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶，例如在蜂蜜中发现的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶，具有抗炎活性。特别地，本发明人惊奇地发现3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶具有抗炎作用。特别地，本发明人发现3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶具有tg2、jak和/或cox-2抑制活性。能够表征3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶的活性和稳定性提供了制备用于预防、改善或治疗炎症的组合物的能力，包括预防、改善或治疗各种tg2、jak和/或cox-2相关病症和炎性病症，特别是胃肠道的炎性病症。
163.蝶啶是一组基于嘧啶并[4,5-b]吡嗪环结构的化合物。双环化合物是由许多活生物体天然产生的，通常称为蝶呤。蝶啶和蝶啶衍生物也可以合成制备。许多蝶啶衍生物作为酶促辅因子发挥重要的代谢作用，包括合成核酸、氨基酸、神经递质、一氧化氮以及嘌呤和芳香族氨基酸。
[0164]
3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶是来自麦卢卡树蜂蜜的蝶啶衍生物。先前在同一申请人提交的新西兰专利申请no.722140(nz 722140)中描述了3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶的分离、结构阐明和合成，该申请通过引用并入本文。
[0165]
炎症是涉及多种疾病的多因素现象。在健康肠中，肠粘膜处于受促炎细胞因子(例如肿瘤坏死因子、tnf-α、干扰素、ifn-γ、il-1、il-6)和抗炎细胞因子(例如il-4、il-10)的复杂平衡调节的受控应答状态。其中的缺陷可促进涉及遗传、微生物和环境因素之间的复杂相互作用，最终导致免疫/非免疫应答的持续活化，导致主动炎症和组织破坏。不能解决炎症涉及胃肠炎症相关病症，如胃溃疡、炎性肠病(ibd)、克罗恩病和溃疡性结肠炎的发病机理。
[0166]
与tg2、jak和/或cox-2相关的病症包括一系列不同的病症，例如胃肠炎性疾病、胃溃疡、消化性溃疡、胃炎、炎性肠病(ibd)、克罗恩病、溃疡性结肠炎、肠易激综合征(ibs)、消化疾病、胃食管反流病(gerd)、胃灼热、酸反流、幽门螺杆菌感染、口腔溃疡、口炎、咽炎、齿龈炎、食管溃疡、炎性和退行性神经系统疾病、神经精神疾病、精神分裂症、双相情感障碍、
神经退行性疾病、创伤性脑损伤、多发性硬化、阿尔茨海默病、神经系统疾病、帕金森病、癫痫、脑缺氧/缺血、克-雅病、肌萎缩性侧索硬化、关节炎、类风湿性关节炎、幼年型类风湿性关节炎、强直性脊柱炎、慢性炎症、心血管疾病、癌症、疼痛、结肠直肠癌(crc)、肌肉骨骼疾病、伤口、自身免疫病症、斑秃、特应性皮炎、弥漫性硬皮病、白癜风、噬血细胞综合征、非感染性葡萄膜炎、皮肤红斑狼疮、乳糜泻、亨廷顿氏病和纤维化。
[0167]
mmp
[0168]
mmp在炎症中的主要作用之一是调节物理屏障。mmp促进炎性细胞迁移，这是由于它们消化细胞间连接处的能力。内皮粘附连接的几种主要成分已被鉴定为mmp的底物。这些细胞组分的分解增加了血管渗透性，从而允许炎性细胞和血浆蛋白的流入。
[0169]
mp-9(也称为明胶酶b)是促炎酶，其可以将许多细胞因子和趋化因子蛋白水解加工成更有活性的形式，如pro-il-1β和il-8(schonbeck等人，1998；van den steen,proost,wuyts,van damme,&opdenakker,2000)。还报道了mmp-9可以通过降解紧密连接中的闭合蛋白以促进炎性细胞和蛋白质的流入来调节上皮屏障渗透性(caron等人，2005；reijerkerk等人，2006)并且高度涉及细胞外基质(ecm)降解，其导致粘膜损伤和细胞重塑(swarnakar等人，2007)。mmp-9与多种病症相关，包括神经精神疾病(例如精神分裂症以及双相情感障碍)、多发性硬化、神经变性病症(例如创伤性脑损伤、多发性硬化和阿尔茨海默病)、心血管疾病、癌症和关节(rybakowski 2009,fingleton(2007),reinhard,2015).
[0170]
mmp-9也与胃溃疡的发生和严重程度高度相关。大量研究报道了胃溃疡过程中mmp-9的表达和活性升高(pradeepkumar singh,kundu,ganguly,mishra,&swarnakar,2007；swarnakar等人，2005，2007)。还报道了乙醇诱导的胃溃疡与剂量、时间和严重程度依赖性方式的pro-mmp-9活性升高相关，以及mmp-9是胃溃疡复发的风险因素(li等人，2013)。
[0171]
正常健康组织中mmp-9的表达和分泌非常低。在胃溃疡形成期间，氧化应激的诱导增强mmp-9的分泌并导致粘膜损伤(ganguly&swarnakar,2012；li et al.,2013)。因此，mmp-9是预防和治愈胃溃疡的已知治疗靶标。
[0172]
因此，mmp-9相关病症是其中mmp-9的表达增加的病症，并且包括其中mmp-9的表达或过表达增加的炎性病症。这样的病症包括但不限于胃溃疡(例如消化性溃疡)、胃炎、mmp-相关炎性病症、炎性肠病(ibd)、克罗恩病、溃疡性结肠炎、肠易激综合征(ibs)、消化疾病、胃食管反流病(gerd)、胃灼热、酸反流、幽门螺杆菌感染、口腔溃疡、口腔炎、咽炎、齿龈炎和/或食管溃疡。在一个具体实施方案中，mmp-9相关炎性病症是胃溃疡或胃炎。mmp-9相关病症还包括其他病症，如包括神经精神疾病(例如精神分裂症和双相情感障碍)、多发性硬化、神经变性病症(例如创伤性脑损伤、多发性硬化和阿尔茨海默病)、心血管疾病、癌症和关节炎。
[0173]
cox-2
[0174]
cox-2是促炎酶，并且已知在许多炎性和疼痛相关病症的调节中起重要作用。
[0175]
cox-2及其在神经炎性疾病和退行性疾病中所起的作用已被广泛研究。cox-2过度表达与几种病症如脑缺氧/缺血和癫痫发作以及炎性慢性疾病中的神经毒素相关，慢性疾病包括克-雅病、肌萎缩性侧索硬化、多发性硬化、帕金森病和阿尔茨海默病(minghetti,l(2007)；minghetti(2004))。
[0176]
cox-2还在肠免疫应答的调节中起重要作用。在通过tlr(例如tlr4)识别肠腔中例
如细菌产物的外来试剂时，cox-2表达由例如nf-κb的转录因子诱导。cox-2激活可通过抑制nf-κb和激活过氧化物酶体增殖物激活受体γ(ppar-γ)以及通过改变粘膜屏障功能来影响炎症过程。传统上认为是促炎性的，长期以来也认识到在ibd患者的发炎组织中cox-2上调。
[0177]
cox-2还与癌症的进展和发展有关。例如，在结直肠癌(crc)患者中，cox-2表达发现于大多数crc组织中，并且与较差的存活相关(wang等人，(2010))。
[0178]
从上述可以理解，cox-2相关病症是与cox-2表达或过表达增加相关的病症。这样的病症包括胃肠炎性疾病、胃溃疡(例如消化性溃疡)、胃炎、炎性肠病(ibd)、克罗恩病、溃疡性结肠炎、肠易激综合征(ibs)、消化疾病、胃食管反流病(gerd)、胃灼热、酸反流、幽门螺杆菌感染、口腔溃疡、口炎、咽炎、齿龈炎、食管溃疡、炎性和退行性神经系统疾病、神经精神疾病(例如精神分裂症和双相情感障碍)、神经退行性疾病(例如创伤性脑损伤、多发性硬化和阿尔茨海默病)、神经系统疾病(例如帕金森病和/或癫痫发作)、脑缺氧/缺血、克-雅病、肌萎缩性侧索硬化、关节炎(例如类风湿性关节炎、幼年型类风湿性关节炎和强直性脊柱炎)、慢性炎症、心血管病、疼痛、癌症(例如结直肠癌(crc))和肌肉骨骼疾病。
[0179]
从上述可以理解，cox-2相关的病症也可以是cox-2相关的疼痛。例如，急性疼痛(例如由身体损伤引起的疼痛)、慢性疼痛和/或痛经(与月经有关的疼痛)。疼痛还可以是与上述任一cox-2相关病症相关的疼痛。
[0180]
jak
[0181]
jak是四种细胞内酪氨酸激酶的家族：jak1、jak2、jak3和酪氨酸激酶2(tyk2)。jak和七种细胞内转录因子家族-信号转导子和转录激活子(stat)-组合以通过
‘
jak-stat’通路的激活发挥许多细胞因子的功能。细胞因子与其受体的细胞外结构域结合后，jak与细胞内结构域结合并活化。这导致胞浆内stat的募集、磷酸化和活化，这允许它们易位到细胞核中，然后调节参与炎症的各种靶基因的表达。在目前的治疗管理下，大量ibd患者不能实现持续的缓解。在新的药物靶标中，jak抑制剂是有前景的新类别的药物，其在临床试验中已证明具有有利的安全性特征的功效。托法替尼是批准用于治疗溃疡性结肠炎的第一种jak抑制剂。
[0182]
从上文可以理解，jak相关病症是与“jak-stat”通路的激活相关的病症。此类病状包括：胃肠炎性疾病、胃溃疡(例如消化性溃疡)、胃炎、jak相关炎性病症、炎性肠病(ibd)、克罗恩病、溃疡性结肠炎、肠易激综合征(ibs)、消化疾病、胃食管反流病(gerd)、胃灼热、酸反流、幽门螺杆菌感染、口腔溃疡、口炎、咽炎、齿龈炎和/或食管溃疡、神经精神疾病(例如精神分裂症和双相情感障碍)、神经变性病症(例如创伤性脑损伤、多发性硬化和阿尔茨海默病)、心血管疾病、癌症、关节炎、慢性炎症、自身免疫性病症、溃疡性结肠炎、斑秃、特应性皮炎、弥漫性硬皮病、克罗恩病、白癜风、噬血细胞综合征、非感染性葡萄膜炎和皮肤红斑狼疮。
[0183]
tg2
[0184]
tg2是一种钙依赖性酶，其催化蛋白质中谷氨酰胺残基的聚氨基化。tg2与ibd和许多其他炎性疾病有关，包括乳糜泻和脓毒症。nf-kb被tg2活化，然后聚合并因此通过交联其c-末端谷氨酰胺簇使其抑制剂ikbα失活。临床前研究已经显示tg2还可以通过pparγ的聚集和功能螯合促进炎症，其中tg2的特异性体外抑制能够恢复pparγ和炎性细胞因子水平。
tg2也被由组织损伤、炎症或缺氧引起的氧化应激激活。活化后，蛋白质共价活化许多蛋白质，导致调节细胞粘附分子、细胞因子和其他参与细胞存活的介质。tg2在触发炎症中具有作用，因此下调其活性将可能用于治疗ibd。以前的研究也报道了ibd患者血清中的转谷氨酰胺酶2抗体显著高水平。
[0185]
从上文可以理解，tg2相关病症是与tg2的表达或过表达增加相关的病症。这样的病症包括胃肠炎性疾病，胃肠炎性疾病、胃溃疡(例如消化性溃疡)、胃炎、tg2相关炎性病症、炎性肠病(ibd)、克罗恩病、溃疡性结肠炎、肠易激综合征(ibs)、消化疾病、胃食管反流病(gerd)、胃灼热、酸反流、幽门螺杆菌感染、口腔溃疡、口炎、咽炎、齿龈炎和/或食管溃疡、神经精神疾病(例如精神分裂症和双相情感障碍)、神经变性病症(例如创伤性脑损伤、多发性硬化和阿尔茨海默病)、心血管疾病、癌症、关节炎、乳糜泻、亨廷顿氏病、纤维化和癌症。。tg2还在伤口愈合中起作用。
[0186]
从上文可以理解，cox-2是用于预防、改善或治疗炎症、疼痛和/或预防、改善或治疗与炎症、疼痛相关的病症的理想靶标。特别地，用于预防、改善或治疗与胃肠道炎症相关的病症。cox-2也是用于治疗与cox-2相关的其他病症的理想靶标，所述病症例如胃肠炎性疾病、胃溃疡(例如消化性溃疡)、胃炎、炎性肠病(ibd)、克罗恩病、溃疡性结肠炎、肠易激综合征(ibs)、消化疾病、胃食管反流病(gerd)、胃灼热、酸反流、幽门螺杆菌感染、口腔溃疡、口炎、咽炎、齿龈炎、食管溃疡、炎性和退行性神经系统病症、神经精神疾病(例如精神分裂症和双相情感障碍)、神经退行性病症(例如创伤性脑损伤、多发性硬化和阿尔茨海默病)、神经系统疾病(例如帕金森病和/或癫痫发作)、脑缺氧/缺血、克-雅病、肌萎缩性侧索硬化、关节炎(例如类风湿性关节炎、幼年型类风湿性关节炎和强直性脊柱炎)、慢性炎症、心血管疾病、疼痛(例如急性疼痛(例如由身体损伤引起的疼痛)、慢性疼痛和/或痛经(与月经相关的疼痛))、癌症(例如结肠直肠癌(crc))和肌肉骨骼疾病。
[0187]
本发明人已发现3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶和包含其的组合物具有cox-2抑制活性，因此可用于预防、改善或治疗cox-2相关病症的方法中，如与炎症和/或疼痛相关的那些病症。本发明人意外地发现，3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶抑制cox-2的表达。cox-2抑制作用是显著的，表明良好的功效和潜在的广泛的应用和用途，特别是在预防和/或治疗炎症和疼痛中。例如，在炎性病症的治疗中，例如胃肠炎性病症，包括胃炎和胃溃疡。
[0188]
在一个实施方案中，cox-2相关病症是炎性病症。在一个实施方案中，相关炎性病症与胃肠道炎症相关。在一个实施方案中，cox-2相关病症选自胃肠炎性疾病、胃溃疡(例如消化性溃疡)、胃炎、炎性肠病(ibd)、克罗恩病、溃疡性结肠炎、肠易激综合征(ibs)、消化疾病、胃食管反流病(gerd)、胃灼热、酸反流、幽门螺杆菌感染、口腔溃疡、口炎、咽炎、齿龈炎、食管溃疡、炎性和退行性神经系统病症、神经精神疾病(例如精神分裂症和双相情感障碍)、神经退行性病症(例如创伤性脑损伤、多发性硬化和阿尔茨海默病)、神经系统疾病(例如帕金森病和/或癫痫发作)、脑缺氧/缺血、克-雅病、肌萎缩性侧索硬化、关节炎(例如类风湿性关节炎、幼年型类风湿性关节炎和强直性脊柱炎)、慢性炎症、心血管疾病、疼痛(例如急性疼痛(例如由身体损伤引起的疼痛)、慢性疼痛和/或痛经(与月经相关的疼痛))、癌症(例如结肠直肠癌(crc))和肌肉骨骼疾病。
[0189]
本发明人还意外地发现3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶与jak结合，因此可用于治疗与jak相关的病症。在一个实施方案中，病症是炎性病症。
[0190]
在一个实施方案中，tg2相关病症选自由以下组成的组：胃肠炎性疾病、胃溃疡(例如消化性溃疡)、胃炎、tg2相关炎性病症、炎性肠病(ibd)、克罗恩病、溃疡性结肠炎、肠易激综合征(ibs)、消化疾病、胃食管反流病(gerd)、胃灼热、酸反流、幽门螺杆菌感染、口腔溃疡、口炎、咽炎、齿龈炎和/或食管溃疡、神经精神疾病(例如精神分裂症和双相情感障碍)、多发性硬化、神经变性病症(例如创伤性脑损伤、多发性硬化和阿尔茨海默病)、心血管疾病、癌症、关节炎、乳糜泻、亨廷顿氏病、纤维化、癌症和创伤。
[0191]
在一个实施方案中，jak相关病症选自由以下组成的组：胃肠炎性疾病、胃溃疡(例如消化性溃疡)、胃炎、jak相关炎性病症、炎性肠病(ibd)、克罗恩病、溃疡性结肠炎、肠易激综合征(ibs)、消化疾病、胃食管反流病(gerd)、胃灼热、酸反流、幽门螺杆菌感染、口腔溃疡、口炎、咽炎、齿龈炎和/或食管溃疡、神经精神疾病(例如精神分裂症和双相情感障碍)、多发性硬化、神经变性病症(例如创伤性脑损伤、多发性硬化和阿尔茨海默病)、心血管疾病、癌症、关节炎、慢性炎症、自身免疫性病症、溃疡性结肠炎、斑秃、特应性皮炎、弥漫性硬皮病、克罗恩病、白癜风、噬血细胞综合征、非感染性葡萄膜炎和皮肤红斑狼疮。
[0192]
在另一个方面，本发明提供了预防、改善或治疗受试者的胃肠道炎症的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用包含3,6,7-三甲基吩嗪的组合物。在一个实施方案中，炎症是cox-2相关的炎症。在一个实施方案中，炎症与受试者的胃肠道有关。
[0193]
在一个方面，本发明提供了预防、改善或治疗受试者中cox-2相关疼痛的方法，其包括向有需要的受试者施用包含3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶的组合物。在一个实施方案中，疼痛是急性疼痛、慢性疼痛和/或痛经。
[0194]
另一方面，本发明提供了预防、改善或治疗与胃肠道炎症相关的病症的方法。
[0195]
在一个方面，本发明提供了预防、改善或治疗受试者的炎症的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用包含3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶的组合物。在一个实施方案中，炎症是胃肠道的炎症。
[0196]
在一个实施方案中，本发明提供了预防、改善或治疗与cox-2相关病症、tg2相关病症和/或jak相关病症相关的炎症的方法。
[0197]
在一个实施方案中，本发明提供了预防、改善或治疗病症如cox-2相关病症、tg2相关病症和/或jak相关病症的方法。
[0198]
在一个实施方案中，cox-2相关病症选自由以下组成的组：胃肠炎性疾病、胃溃疡(例如消化性溃疡)、胃炎、炎性肠病(ibd)、克罗恩病、溃疡性结肠炎、肠易激综合征(ibs)、消化疾病、胃食管反流病(gerd)、胃灼热、酸反流、幽门螺杆菌感染、口腔溃疡、口炎、咽炎、齿龈炎、食管溃疡、炎性和退行性神经系统病症、神经精神疾病(例如精神分裂症和双相情感障碍)、神经退行性病症(例如创伤性脑损伤、多发性硬化和阿尔茨海默病)、神经系统疾病(例如帕金森病和/或癫痫发作)、脑缺氧/缺血、克-雅病、肌萎缩性侧索硬化、关节炎(例如类风湿性关节炎、幼年型类风湿性关节炎和强直性脊柱炎)、慢性炎症、心血管疾病、疼痛(例如急性疼痛(例如由身体损伤引起的疼痛)、慢性疼痛和痛经(与月经相关的疼痛))、癌症(例如结肠直肠癌(crc))和肌肉骨骼疾病。
[0199]
在一个实施方案中，tg2相关病症选自由以下组成的组：胃肠炎性疾病、胃溃疡(例如消化性溃疡)、胃炎、tg2相关炎性病症、炎性肠病(ibd)、克罗恩病、溃疡性结肠炎、肠易激综合征(ibs)、消化疾病、胃食管反流病(gerd)、胃灼热、酸反流、幽门螺杆菌感染、口腔溃
疡、口炎、咽炎、齿龈炎和/或食管溃疡、神经精神疾病(例如精神分裂症和双相情感障碍)、多发性硬化、神经变性病症(例如创伤性脑损伤、多发性硬化和阿尔茨海默病)、心血管疾病、癌症、关节炎、乳糜泻、亨廷顿氏病、纤维化、癌症和创伤。
[0200]
在一个实施方案中，jak相关病症选自由以下组成的组：胃肠炎性疾病、胃溃疡(例如消化性溃疡)、胃炎、jak相关炎性病症、炎性肠病(ibd)、克罗恩病、溃疡性结肠炎、肠易激综合征(ibs)、消化疾病、胃食管反流病(gerd)、胃灼热、酸反流、幽门螺杆菌感染、口腔溃疡、口炎、咽炎、齿龈炎和/或食管溃疡、神经精神疾病(例如精神分裂症和双相情感障碍)、多发性硬化、神经变性病症(例如创伤性脑损伤、多发性硬化和阿尔茨海默病)、心血管疾病、癌症、关节炎、慢性炎症、自身免疫性病症、溃疡性结肠炎、斑秃、特应性皮炎、弥漫性硬皮病、克罗恩病、白癜风、噬血细胞综合征、非感染性葡萄膜炎和皮肤红斑狼疮。
[0201]
从上文可以理解，3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶和包含其的组合物可用于广泛的其他用途，包括用于支持或维持受试者的正常消化、支持或维持受试者的健康消化和支持或维持受试者的一般肠道健康和健康。
[0202]
在本发明的一个实施方案中，本文所公开的方法、用途和组合物中的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶的来源来自麦卢卡树。在一个实施方案中，3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶基本上来自选自以下的植物：松红梅(leptospermum scoparium)、澳洲茶(leptospermum polygalifolium)、麦卢卡亚属(leptospermum subtenue)和/或其组合。在一个实施方案中，3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶得自松红梅(麦努考树)。
[0203]
在本发明的一个实施方案中，3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶的来源是蜂蜜。在一个实施方案中，蜂蜜是基本上来自麦卢卡树属的花来源。在一个实施方案中，蜂蜜基本上来自以下的花来源：松红梅(leptospermum scoparium)、澳洲茶(leptospermum polygalifolium)、麦卢卡亚属(leptospermum subtenue)和/或其组合。
[0204]
在一个实施方案中，蜂蜜是基本上来自松红梅(也称为麦努考(manuka))的花来源。
[0205]
在一个具体的实施方案中，3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶直接衍生自麦卢卡树属植物。在本发明的一个实施方案中，3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶直接衍生自花蜜、根、果实、种子、树皮、油、叶、木材、茎或麦卢卡树属植物的其他植物材料。在本发明的一个实施方案中，3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶直接衍生自麦卢卡树属的花蜜。在一个方面，3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶基本上来自选自以下的植物：松红梅(leptospermum scoparium)、澳洲茶(leptospermum polygalifolium)、麦卢卡亚属(leptospermum subtenue)和/或其组合。
[0206]
在本发明的一个实施方案中，3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶是合成的。
[0207]
例如，3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶可以如nz 722140中所述和如下所示合成。
[0208]
参考下面的方案，并遵循gala等，(1997)的工作，在催化量的硫酸(h2so4)存在下用六甲基二硅氮烷(hdms)处理后，通过环外的氨基和羰基的甲硅烷基化，实现6-氨基尿嘧啶(5)在3位的n-甲基化。硫酸铵也可用作催化剂。然后在作为有机溶剂的二甲基甲酰胺(dmf)存在下使用碘甲烷(mei)进行甲基化，两步产率为71％。硫酸二甲酯也可用作甲基化剂。随后在水处理期间脱甲硅烷基得到6-氨基-3-甲基尿嘧啶(6)，产率78％。
[0209]
然后将氨基尿嘧啶(6)用亚硝酸钠(nano2)和乙酸(acoh)溶液处理，接着用连二亚硫酸钠(na2s2o4)在水性溶剂氨(nh3)中在70℃下还原(chaudhari等人，2009)，经两步得到
5,6-二氨基-3-甲基尿嘧啶(7)，31％产率。可用于亚硝化第一步的替代酸包括盐酸。使用亚硝酸钠和乙酸的第一步还原的替代方案是在水性溶剂或有机溶剂中使用如碳载钯或二氧化铂的催化剂来催化氢化。
[0210]
二氨基尿嘧啶(7)与2,3-丁二酮(8)在乙醇(etoh)和乙酸(acoh)溶液中缩合，得到3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶(3)，为无色固体。用于缩合步骤的替代酸是盐酸。合成的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶的光谱数据(uv-可见光、ir、1hnmr、和
13
c nmr)与分离的天然产物的光谱数据非常一致。此外，天然和合成产物的1h nmr谱是相同的。因此，3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶(3)的结构最终确定为3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶。
[0211][0212]
化合物(9)的替代合成是通过如下所示的中间体化合物的n-3处甲基化，
[0213]
或经由如上所示的中间体化合物转化成瞬时异氰酸酯物质，包括但不限于通过curtius、hofmann、lossen或schmidt重排产生的那些。
[0214][0215]
参考上文，在催化量的硫酸(h2so4)存在下用六甲基二硅氮烷(hdms)处理后，通过环外的氨基和羰基的甲硅烷基化，实现6-氨基尿嘧啶(5)在3位的n-氘代甲基化。然后在作为有机溶剂的二甲基甲酰胺(dmf)存在下使用碘甲烷-d3(cd3l)进行甲基化，两步产率为71％。随后在水处理期间脱甲硅烷基得到6-氨基-3-(2h3)甲基尿嘧啶(9)，产率78％。
[0216]
然后将氨基尿嘧啶(6)用亚硝酸钠(nano2)和乙酸(acoh)溶液处理，接着用连二亚硫酸钠(na2s2o4)在水性溶剂氨(nh3)中在70℃下还原(chaudhari等人，2009)，经两步得到5,6-二氨基-3-(2h3)甲基尿嘧啶(10)，31％产率。可用于亚硝化第一步的替代酸包括盐酸。
使用亚硝酸钠和乙酸的第一步还原的替代方案是在水性溶剂或有机溶剂中使用如碳载钯或二氧化铂的催化剂来催化氢化。
[0217]
二氨基尿嘧啶(10)与2,3-丁二酮(8)在乙醇(etoh)和乙酸(acoh)溶液中缩合，得到3,6,7-(3-2h3)-三甲基二氧四氢蝶啶(11)，为无色固体。
[0218]
材料和方法
[0219]
所有反应在干燥氮气气氛下在火焰干燥或烘箱干燥的玻璃器皿中进行。所有试剂均以试剂级购买，并且不经进一步纯化而使用。将二甲基甲酰胺脱气并使用lc technical sp-1溶剂纯化系统干燥。通过mg(oet)2蒸馏乙醇。在使用前蒸馏乙酸乙酯、甲醇和石油醚。除非另有说明，所有其他溶剂按原样使用。使用strata c
18 e55μm 20g/60ml柱进行固相萃取(spe)。用agilent1100，使用jupiter c
18
5μm，2.0mm
×
250mm柱，以0.2ml min-1
的流速，用dad检测器在262、280和320nm下操作进行rp-hplc。使用5％b至100％b的适当调节的梯度，其中溶剂a为含0.1％hcooh的h2o且b为含20％a的甲醇。使用0.063-0.1mm硅胶和所需溶剂进行快速色谱。使用0.2mm kieselgel f254(merck)硅胶板进行薄层色谱(tlc)，并使用254或365nm的uv照射和/或用高锰酸钾和碳酸钾在氢氧化钠水溶液中的溶液染色使化合物可视化。使用500μm，20
×
20cm uniplate
tm
(analtech)硅胶tlc板进行制备型tlc，并使用254或365nm的uv照射使化合物可视化。熔点在kofler热台设备上测定，未校正。使用perkin-elmer spectrum 100 ftir光谱仪在薄膜atr取样附件上获得红外光谱。吸收最大值以波数(cm-1
)表示。nmr光谱记录如下：bruker avance 400波谱仪，1h核在400mhz下操作，
13
c核在100mhz下操作；bruker drx-400波谱仪，1h核在400mhz下操作，
13
c核在100mhz下操作；bruker avance aviii-hd 500波谱仪，1h核在500mhz下操作，
13
c核在125mhz下操作；bruker avance 600波谱仪，1h核在600mhz下操作，
13
c核在150mhz下操作。1h和
13
c化学位移以相对于cdcl3(1h和
13
c)或(cd3)2so(1h和
13
c)的百万分率(ppm)报告。使用由bruker库函数“xiref”实现的统一ξi尺度(harris等人，2008)参考
15
n化学位移。1h nmr数据报告为化学位移、相对积分、多重性(s，单峰；分配)。根据需要借助于cosy、noesy、hsqc和hmbc实验进行分配。在具有esi电离源的bruker microtof-q ii质谱仪上记录高分辨率质谱。紫外-可见光谱作为h2o溶液在shimadzu uv-2101pc扫描分光光度计上运行。
[0220]
在一个实施方案中，本发明提供用于上述方法的包含3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶的组合物。在一个实施方案中，药物组合物包括治疗有效量的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶。
[0221]
在本发明的一个实施方案中，包含3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶的组合物包含蜂蜜。在一个特定实施方案中，包含3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶的组合物由蜂蜜组成。
[0222]
在一个实施方案中，蜂蜜是基本上来自麦卢卡树属的花来源。在一个实施方案中，蜂蜜基本上来自选自由以下组成的组的植物：松红梅(leptospermum scoparium)、澳洲茶(leptospermum polygalifolium)、麦卢卡亚属(leptospermum subtenue)和/或其组合。
[0223]
在一个实施方案中，组合物包含约2.5μg/ml至约80μg/ml的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶。在一个实施方案中，组合物包含约2.5μg/ml、约5μg/ml、约10μg/ml、约20μg/ml、约40μg/ml、约50μg/ml、约60μg/ml、约70μg/ml或约80μg/ml的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶，或组合物包含浓度为2.5μg/ml至5μg/ml、5μg/ml至10μg/ml、10μg/ml至20μg/ml、20μg/ml至40μg/ml、40μg/ml至50μg/ml、50μg/ml至约60μg/ml、60μg/ml至70μg/ml、或70μg/ml至80μg/ml的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶。
[0224]
在一个实施方案中，组合物包含约5至约80mg/kg的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶。在一个实施方案中，组合物包含约5mg/kg、约10mg/kg、约15mg/kg、约20mg/kg、约25mg/kg、约30mg/kg、约35mg/kg、约40mg/kg、约45mg/kg、约50mg/kg、约55mg/kg、约60mg/kg、约70mg/kg、或约80mg/kg的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶，或其中组合物包含5至10mg/kg、10至15mg/kg、15至20mg/kg、20至25mg/kg、25至30mg/kg、30至35mg/kg、35至40mg/kg、40至45mg/kg、45至50mg/kg、50至55mg/kg、55至60mg/kg、60至70mg/kg、或70至80mg/kg浓度的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶。
[0225]
在一个实施方案中，蜂蜜是原蜜。在一个实施方案中，根据本领域技术人员熟知的方法对蜂蜜进行热处理或巴氏灭菌。
[0226]
在一个具体的实施方案中，组合物包含蜂蜜提取物。在一个实施方案中，组合物由蜂蜜提取物组成。
[0227]
在一个实施方案中，蜂蜜提取物包含的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶的浓度高于蜂蜜中天然存在的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶的浓度。
[0228]
在一个实施方案中，蜂蜜提取物包含的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶的浓度高于在衍生该提取物的蜂蜜中天然存在的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶的浓度。
[0229]
在一个实施方案中，从中获得提取物的蜂蜜基本上来自麦卢卡树属的花来源。在一个实施方案中，获得提取物的蜂蜜基本上来自选自以下的植物：松红梅(leptospermum scoparium)、澳洲茶(leptospermum polygalifolium)、麦卢卡亚属(leptospermum subtenue)和/或其组合。
[0230]
在一个实施方案中，提取物包含约2.5μg/ml至约1000μg/ml的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶。在一个实施方案中，提取物包含约2.5μg/ml、约5μg/ml、约10μg/ml、约20μg/ml、约40μg/ml、约50μg/ml、约60μg/ml、约70μg/ml、约80μg/ml、约90μg/ml、约100μg/ml、150μg/ml、约200μg/ml、约250μg/ml、约300μg/ml、约350μg/ml、约400μg/ml、约450约500μg/ml、约550μg/ml、约600μg/ml、约650μg/ml、约700μg/ml、约750μg/ml、约800μg/ml、约850μg/ml、约900μg/ml、约950μg/ml至约1000μg/ml的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶，或组合物包含约2.5至5μg/ml、约5至10μg/ml、约10至20μg/ml、约20至40μg/ml、约40至50μg/ml、约50至60μg/ml、约60至70μg/ml、约70至80μg/ml、约80至90μg/ml、约90至100μg/ml、约100至150μg/ml、150至200μg/ml、约200至250μg/ml、约250至300μg/ml、约300至350μg/ml、约350至400μg/ml、约400至450μg/ml、约450至500μg/ml、约500至550μg/ml、约550至600μg/ml、约600至650μg/ml、约650至700μg/ml、约700至750μg/ml、约750至800μg/ml、约800至850μg/ml、约850至900μg/ml、约900至950μg/ml、约950至1000μg/ml的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶。
[0231]
在一个实施方案中，提取物包含约5至约3000mg/kg的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶。在一个实施方案中，提取物包含约5mg/kg、约10mg/kg、约15mg/kg、约20mg/kg、约25mg/kg、约30mg/kg、约35mg/kg、约40mg/kg、约45mg/kg、约50mg/kg、约55mg/kg、约60mg/kg、约70mg/kg、约80mg/kg、约90mg/kg、约100mg/kg、约150mg/kg、约200mg/kg、约250mg/kg、约300mg/kg、约350mg/kg、约400mg/kg、约450mg/kg、约500mg/kg、约550mg/kg、约600mg/kg、约650mg/kg、约700mg/kg、约750mg/kg、约800mg/kg、约850mg/kg、约900mg/kg、约950mg/kg、约1000mg/kg、约1100mg/kg、约1200mg/kg、约1300mg/kg、约1400mg/kg、约1500mg/kg、约1600mg/kg、约1700mg/kg、约1800mg/kg、约1900mg/kg、约2000mg/kg、约2100mg/kg、约
2200mg/kg、约2300mg/kg、约2400mg/kg、约2500mg/kg、约2600mg/kg、约2700mg/kg、约2800mg/kg、或约2900mg/kg至约3000mg/kg的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶，或所述提取物包含约5至10mg/kg、约10至15mg/kg、约15至20mg/kg、约20至25mg/kg、约25至30mg/kg、约30至35mg/kg、约35至40mg/kg、约40至45mg/kg、约45至50mg/kg、约50至55mg/kg、约55至60mg/kg、约60至70mg/kg、约70至80mg/kg、约约90至100mg/kg、约100至150mg/kg、约150至200mg/kg、约200mg/kg、约250至300mg/kg、约300至350mg/kg、约350至400mg/kg、约400至450mg/kg、约450至500mg/kg、约500至550mg/kg、约550至600mg/kg、约600至650mg/kg、约650至700mg/kg、约700至750mg/kg、约750至800mg/kg、约800至850mg/kg、约850至900mg/kg、约900至950mg/kg、约950至1000mg/kg、约1000至1100mg/kg、约1100至1200mg/kg、约1200至1300mg/kg、约1300至1400mg/kg、约1400至1500mg/kg、约1500至1600mg/kg、约1600至1700mg/kg、约1700至1800mg/kg、约1800至1900mg/kg、约1900至2000mg/kg、约2000至2100mg/kg、约2100至2200mg/kg、约2200至2300mg/kg、约2300至2400mg/kg、约2400至2500mg/kg、约2500至2600mg/kg、约2600至2700mg/kg、约2700至2800mg/kg、约2800至2900mg/kg、或约2900至3000mg/kg的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶的浓度。
[0232]
在一个实施方案中，所述组合物包含至少0.1％、1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶，或包含基本上纯的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶。
[0233]
在一个实施方案中，组合物包含蜂蜜提取物并且进一步包含蜂蜜。
[0234]
在一个实施方案中，组合物包含分离自蜂蜜的分离的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶。在一个实施方案中，蜂蜜是基本上来自麦卢卡树属的花来源。在一个实施方案中，蜂蜜基本上来自选自由以下组成的组的植物：松红梅(leptospermum scoparium)、澳洲茶(leptospermum polygalifolium)、麦卢卡亚属(leptospermum subtenue)和/或其组合。
[0235]
3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶可通过本领域技术人员熟知的任何方法分离。在一个实施方案中，3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶通过将蜂蜜进行spe(固相萃取)，随后进行正相快速色谱法和制备型tlc(薄层色谱法)来分离。
[0236]
在一个实施方案中，3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶通过本技术人早期公开为nz 722140的专利中描述的方法分离，并且如下所示。
[0237]
化学分离3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶
[0238]
将粗制麦努考蜂蜜(51.3g)溶解于h2o+0.1％hcooh(150ml)中并超声处理20min。将所得悬浮液通过celite过滤并将滤液用于下一步骤。
[0239]
将滤液分成两份，每份100ml，使用meoh-h2o+0.1％ hcooh(1:9，80ml)对每份进行spe，以除去不需要的物质。然后使用meoh-h2o+0.1％ hcooh(4:1，80ml)洗脱期望的级分。将两个级分合并并浓缩，得到粗提取物(0.23g)，将其通过快速色谱法(石油醚-etoac 1:4)纯化，得到纯化的提取物(3mg)，为棕色固体。
[0240]
合并几种纯化的提取物(总共6mg)并通过制备型tlc(石油醚-etoac 1:3，4次运行)，得到3(4mg)(如下所示)，为无色固体。
[0241][0242]
对于leptosperin(4)的存在，同时使用hplc检测新西兰和澳大利亚蜜蜂的存在，新西兰和澳大利亚蜜蜂来自麦卢卡树、尤加利(eucalyptus)、坤希草(kunzea)和艾氏鱼(knightia)的物种(kato等人，2012 and 2014；aitken等人，2013；如下所示的结构)提出的麦卢卡树蜂蜜的生物标记，在320nm处观察到出乎意料的uv吸光度。
[0243][0244]
该峰仅在麦卢卡树蜂蜜(松红梅(l.scoparium)、l.scoparium var.exinium、远志叶细子(l.polygalifolium)、澳洲茶(l.subtenue))，包括源自澳洲茶的蜂蜜，其中未检测到瘦蛋白。使用固相萃取(spe)，随后使用反相hplc能够纯化在320nm显示uv吸光度的化合物。然而，该方法耗时，产率低且不可缩放，因此寻求更有效的分离方法。将麦努考蜂蜜进行spe，随后进行正相快速色谱和制备型tlc，使得能够分离出足够量的无色固体3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶以进行光谱分析。
[0245]
在本发明的一个实施方案中，组合物包含合成的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶或分离的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶。在一个实施方案中，组合物进一步包含抗蜂蜜。在一个实施方案中，组合物由合成的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶和蜂蜜组成。在一个实施方案中，组合物由分离的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶和蜂蜜组成。
[0246]
在一个实施方案中，蜂蜜是基本上来自麦卢卡树属的花来源。在一个实施方案中，蜂蜜基本上来自选自由以下组成的组的植物：松红梅(leptospermum scoparium)、澳洲茶(leptospermum polygalifolium)、麦卢卡亚属(leptospermum subtenue)和/或其组合。
[0247]
在一个实施方案中，组合物包含约2.5μg/ml至约1000μg/ml3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶的合成的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶或分离的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶。在一个实施方案中，组合物包含约2.5μg/ml、约5μg/ml、约10μg/ml、约20μg/ml、约40μg/ml、约50μg/ml、约60μg/ml、约70μg/ml、约80μg/ml、约90μg/ml、约100μg/ml、150μg/ml、约200μg/ml、约250μg/ml、约300μg/ml、约350μg/ml、约400μg/ml、约450约500μg/ml、约550μg/ml、约600μg/ml、约650μg/ml、约700μg/ml、约750μg/ml、约800μg/ml、约850μg/ml、约900μg/ml、或约950μg/ml至约1000μg/ml的合成的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶或分离的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶，或组合物包含约2.5至5μg/ml、约5至10μg/ml、约10至20μg/ml、约20至40μg/ml、约40至50μg/ml、约50至60μg/ml、约60至70μg/ml、约70至80μg/ml、约80至90μg/ml、约90至100μg/ml、约100至150μg/ml、150至200μg/ml、约200至250μg/ml、约250至300μg/ml、约300
至350μg/ml、约350至400μg/ml、约400至450μg/ml、约450至500μg/ml、约500至550μg/ml、约550至600μg/ml、约600至650μg/ml、约650至700μg/ml、约700至750μg/ml、约750至800μg/ml、约800至850μg/ml、约850至900μg/ml、约900至950μg/ml、或约950至1000μg/ml的合成的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶或分离的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶。
[0248]
在一个实施方案中，组合物包含约5mg/kg至约3000mg/kg的合成的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶或分离的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶。在一个实施方案中，组合物包含约5mg/kg、约10mg/kg、约15mg/kg、约20mg/kg、约25mg/kg、约30mg/kg、约35mg/kg、约40mg/kg、约45mg/kg、约50mg/kg、约55mg/kg、约60mg/kg、约70mg/kg、约80mg/kg、约90mg/kg、约100mg/kg、约150mg/kg、约200mg/kg、约250mg/kg、约300mg/kg、约350mg/kg、约400mg/kg、约450mg/kg、约500mg/kg、约550mg/kg、约600mg/kg、约650mg/kg、约700mg/kg、约750mg/kg、约800mg/kg、约850mg/kg、约900mg/kg、约950mg/kg、约1000mg/kg、约1100mg/kg、约1200mg/kg、约1300mg/kg、约1400mg/kg、约1500mg/kg、约1600mg/kg、约1700mg/kg、约1800mg/kg、约1900mg/kg、约2000mg/kg、约2100mg/kg、约2200mg/kg、约2300mg/kg、约2400mg/kg、约2500mg/kg、约2600mg/kg、约2700mg/kg、约2800mg/kg、或约2900mg/kg至约3000mg/kg的合成的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶或分离的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶，或所述组合物包含约5至10mg/kg、约10至15mg/kg、约15至20mg/kg、约20至25mg/kg、约25至30mg/kg、约30至35mg/kg、约35至40mg/kg、约40至45mg/kg、约45至50mg/kg、约50至55mg/kg、约55至60mg/kg、约60至70mg/kg、约70至80mg/kg、约约90至100mg/kg、约100至150mg/kg、约150至200mg/kg、约200mg/kg、约250至300mg/kg、约300至350mg/kg、约350至400mg/kg、约400至450mg/kg、约450至500mg/kg、约500至550mg/kg、约550至600mg/kg、约600至650mg/kg、约650至700mg/kg、约700至750mg/kg、约750至800mg/kg、约800至850mg/kg、约850至900mg/kg、约900至950mg/kg、约950至1000mg/kg、约1000至1100mg/kg、约1100至1200mg/kg、约1200至1300mg/kg、约1300至1400mg/kg、约1400至1500mg/kg、约1500至1600mg/kg、约1600至1700mg/kg、约1700至1800mg/kg、约1800至1900mg/kg、约1900至2000mg/kg、约2000至2100mg/kg、约2100至2200mg/kg、约2200至2300mg/kg、约2300至2400mg/kg、约2400至2500mg/kg、约2500至2600mg/kg、约2600至2700mg/kg、约2700至2800mg/kg、约2800至2900mg/kg、或约2900至3000mg/kg的合成的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶或分离的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶。
[0249]
在一个实施方案中，组合物包含0.1％至100％的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶。在一个实施方案中，所述组合物包含至少0.1％、1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶，或包含基本上纯的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶。
[0250]
包含蜂蜜衍生的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶和/或合成的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶的组合物预期不具有副作用。3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶天然存在于一些蜂蜜中，并且这种含有3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶的蜂蜜已经销售和消费多年。
[0251]
包含3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶的组合物可配制为药物、治疗产品或健康补充剂。
[0252]
将包含3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶的组合物配制成一系列递送系统，包括但不限于液体制剂、胶囊、快速移动消费品、咀嚼片、片剂、栓剂、静脉内制剂、肌内制剂、皮下制剂、
溶液、食品、饮料、膳食补充剂、化妆品制剂、凝胶、洗剂、粉末或喷雾剂。
[0253]
在一个具体的实施方案中，如上所述的本发明的方法包括施用约1mg至约3000mg的包含3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶的组合物。在一个具体的实施方案中，如上所述的本发明的方法包括施用包含约1mg、10mg、20mg、30mg、40mg、50mg、60mg、70mg、80mg、90mg、100mg、150mg、200mg、250mg、300mg、350mg、400mg、450mg、500mg、550mg、600mg、650mg、700mg、750mg、800mg、850mg、900mg、950mg、1000mg、1100mg、1200mg、1300mg、1400mg、1500mg、1600mg、1700mg、1800mg、1900mg、2000mg、2100mg、2200mg、2300mg、2400mg、2500mg、2600mg、2700mg、2800mg、2900mg、3000mg的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶的组合物。
[0254]
在一个具体的实施方案中，如上所述的本发明的方法包括施用包含3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶的组合物，包括其中组合物是蜂蜜或蜂蜜提取物。在一个实施方案中，本发明方法中的蜂蜜以约5g至约100g的剂量施用。在一个实施方案中，以约5g、10g、15g、20g、25g、30g、40g、50g、60g、70g、80g、90g、或100g的剂量施用蜂蜜。在一个实施方案中，蜂蜜以相当于约1茶匙至约5汤匙蜂蜜的剂量施用。在一个实施方案中，蜂蜜以单剂量或多剂量施用。
[0255]
在一个实施方案中，包含3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶的组合物以单剂量或以分剂量施用。在一个实施方案中，包含3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶的组合物以一个、两个、三个或四个分开的剂量施用。
[0256]
在一个具体的实施方案中，如上所述的本发明的方法包括每天一次、两次、三次或四次施用包含3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶的组合物。在另一个实施方案中，如上所述的本发明的方法包括每周一、二、三、四、五、六、或七次施用包含3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶的组合物。
[0257]
3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶的浓度可随蜂蜜样品而显著变化。因此，在本文所述的本发明的一个具体实施方案中，包含蜂蜜的组合物具有标准化浓度的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶。
[0258]
在一个实施方案中，包含3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶的组合物具有通过以下获得的标准化浓度的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶：
[0259]-选择具有已知浓度的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶的第一组合物；
[0260]-选择至少一种具有已知浓度的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶的另外组合物；以及
[0261]-将所述第一组合物与所述第二组合物组合以获得具有约5mg/kg至约3000mg/kg的标准化3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶浓度的最终组合物。
[0262]
在一个实施方案中，包含3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶的组合物具有通过以下获得的标准化浓度的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶：
[0263]-选择具有已知浓度的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶的第一组合物；以及
[0264]-将所选择的第一组合物与以下中的一种或多种组合：
[0265]
ο合成的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶；
[0266]
ο分离的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶；
[0267]
ο蜂蜜提取物，其包含3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶；和/或
[0268]
ο直接衍生自麦卢卡树属植物的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶；
[0269]
以形成具有约5mg/kg至约3000mg/kg的标准化3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶浓度的组合物。
[0270]
在一个实施方案中，包含3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶的组合物具有通过以下获得的标准化浓度的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶：
[0271]-选择具有已知浓度的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶的包含蜂蜜的第一组合物；以及
[0272]-将所选择的包含蜂蜜的第一组合物与以下一种或多种组合：
[0273]
ο合成的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶；
[0274]
ο分离的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶；以及
[0275]
ο蜂蜜提取物，其包含3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶；和/或
[0276]
ο直接衍生自麦卢卡树属植物的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶；
[0277]
以形成具有约5至约3000mg/kg的标准化3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶浓度的组合物。
[0278]
在一个实施方案中，所述组合物包含蜂蜜、蜂蜜提取物、分离的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶和/或合成的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶。
[0279]
在一个实施方案中，直接衍生自植物的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶直接衍生自花、花蜜、根、果实、种子、树皮、油、叶、木材、茎或麦卢卡树属植物的其他植物材料。
[0280]
在一个实施方案中，标准化的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶浓度来自：约2.5μg/ml至约1000μg/ml的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶。在一个实施方案中，标准化的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶浓度来自：约2.5μg/ml、约5μg/ml、约10μg/ml、约20μg/ml、约40μg/ml、约50μg/ml、约60μg/ml、约70μg/ml、约80μg/ml、约90μg/ml、约100μg/ml、150μg/ml、约200μg/ml、约250μg/ml、约300μg/ml、约350μg/ml、约400μg/ml、约450、约500μg/ml、约550μg/ml、约600μg/ml、约650μg/ml、约700μg/ml、约750μg/ml、约800μg/ml、约850μg/ml、约900μg/ml、或约950μg/ml、至约1000的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶。
[0281]
在一个实施方案中，标准化的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶浓度为约5mg/kg至约3000mg/kg。在一个实施方案中，标准化的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶浓度来自：约5mg/kg、约10mg/kg、约15mg/kg、约20mg/kg、约25mg/kg、约30mg/kg、约35mg/kg、约40mg/kg、约45mg/kg、约50mg/kg、约55mg/kg、约60mg/kg、约70mg/kg、约80mg/kg、约90mg/kg、约100mg/kg、约150mg/kg、约200mg/kg、约250mg/kg、约300mg/kg、约350mg/kg、约400mg/kg、约450mg/kg、约500mg/kg、约550mg/kg、约600mg/kg、约650mg/kg、约700mg/kg、约750mg/kg、约800mg/kg、约850mg/kg、约900mg/kg、约950mg/kg、约1000mg/kg、约1100mg/kg、约1200mg/kg、约1300mg/kg、约1400mg/kg、约1500mg/kg、约1600mg/kg、约1700mg/kg、约1800mg/kg、约1900mg/kg、约2000mg/kg、约2100mg/kg、约2200mg/kg、约2300mg/kg、约2400mg/kg、约2500mg/kg、约2600mg/kg、约2700mg/kg、约2800mg/kg、或约2900mg/kg至约3000mg/kg的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶。
[0282]
在一个实施方案中，3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶的浓度通过色谱法、分析测量、分光光度法和/或本领域技术人员已知的任何其他方法测定。在一个实施方案中，3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶的浓度通过反相hplc系统测定。
[0283]
在一个实施方案中，蜂蜜中的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶浓度通过如先前在nz 722140中所述的方法测定。
[0284]
在另一个具体方面，本发明提供了制备具有抗炎、镇痛和/或tg2、jak和/或cox-2
抑制活性的组合物的方法，其包括：
[0285]
a.测试包含蜂蜜的第一组合物的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶浓度；
[0286]
b.测试包含蜂蜜的至少一种另外组合物的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶浓度；
[0287]
c.选择包含3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶浓度大于约5mg/kg的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶的蜂蜜的组合物；
[0288]
d.选择3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶浓度大于约5mg/kg的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶的蜂蜜的至少一种另外的组合物；以及
[0289]
e.将所选择的包含蜂蜜的组合物组合以形成具有约5至约80mg/kg的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶浓度的蜂蜜组合物。
[0290]
在一个实施方案中，如果包含蜂蜜的组合物的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶的浓度大于：约5mg/kg、约10mg/kg、约15mg/kg、约20mg/kg、约25mg/kg、约30mg/kg、约35mg/kg、约40mg/kg、约45mg/kg、约50mg/kg、约55mg/kg、约60mg/kg、约70mg/kg或约80mg/kg，则选择所述组合物。
[0291]
在一个实施方案中，所述方法进一步包括用标签包装经鉴定具有抗炎活性的组合物的步骤，所述标签鉴定其具有约5至约80mg/kg的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶浓度。在一个特定实施方案中，来自：约5mg/kg、约10mg/kg、约15mg/kg、约20mg/kg、约25mg/kg、约30mg/kg、约35mg/kg、约40mg/kg、约45mg/kg、约50mg/kg、约55mg/kg、约60mg/kg、约70mg/kg或约80mg/kg的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶。在一个实施方案中，5至10mg/kg、约10至15mg/kg、约15至20mg/kg、约20至25mg/kg、约25至30mg/kg、约30至35mg/kg、约35至40mg/kg、或约40至45mg/kg、约45至50mg/kg、约50至55mg/kg、约55至60mg/kg、60至70mg/kg或约70至80mg/kg的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶。
[0292]
在一个具体的实施方案中，组合物是蜂蜜或蜂蜜提取物。
[0293]
在一个实施方案中，具有抗炎活性的组合物适用于如上文和下文所述的方法中的任一种。
[0294]
在一个实施方案中，3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶的浓度通过色谱法、分析测量、分光光度法和/或本领域技术人员已知的任何其他方法测定。在一个实施方案中，3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶的浓度通过反相hplc测定。
[0295]
在一个实施方案中，3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶浓度通过如先前在nz 722140中所述的方法测定。
[0296]
在另一个特定方面，本发明提供了鉴定具有抗炎、镇痛和/或tg2、jak和/或cox-2抑制活性的组合物的方法，其包括：
[0297]
a.测试组合物的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶浓度；以及
[0298]
i.如果所述组合物含有大于约5至约80mg/kg的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶浓度的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶浓度，则鉴定所述组合物具有抗炎、镇痛和/或tg2、jak和/或cox-2抑制活性；或
[0299]
ii.如果所述组合物含有低于约5mg/kg的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶浓度，则鉴定所述组合物不具有抗炎、镇痛和/或tg2、jak和/或cox-2抑制活性。
[0300]
在一个实施方案中，所述组合物包含蜂蜜、蜂蜜提取物、分离的3,6,7-三甲基二氧
四氢蝶啶和/或合成的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶。
[0301]
在一个实施方案中，如果组合物含有大于约5mg/kg、约10mg/kg、约15mg/kg、约20mg/kg、约25mg/kg、约30mg/kg、约35mg/kg、约40mg/kg、约45mg/kg、约50mg/kg、约55mg/kg、约60mg/kg、约70mg/kg或约80mg/kg的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶，则鉴定其为具有抗炎活性。
[0302]
在一个实施方案中，所述方法进一步包括用标签包装鉴定为具有抗炎活性的组合物的步骤，所述标签鉴定其具有约5至约80mg/kg的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶浓度并具有抗炎活性。
[0303]
在一个实施方案中，具有抗炎活性的组合物适用于如上文和下文所述的方法中的任一种。
[0304]
在一个具体的实施方案中，组合物是蜂蜜或蜂蜜提取物。
[0305]
在另一个具体方面，本发明提供了鉴定具有抗炎、镇痛和/或tg2、jak和/或cox-2抑制活性的组合物的方法，所述组合物适用于预防、改善或治疗与炎症相关的病症的方法，所述方法包括：a.测试组合物的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶浓度；以及
[0306]
i.如果所述组合物含有大于约5至约80mg/kg的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶浓度，则将所述组合物鉴定为适用于预防、改善或治疗与胃肠道炎症相关的病症的方法；
[0307]
ii.如果所述组合物含有的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶浓度低于约5mg/kg 3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶，则将所述组合物鉴定为不适合用于预防、改善或治疗与胃肠道炎症相关的病症的方法中。
[0308]
在一个实施方案中，所述组合物包含蜂蜜、蜂蜜提取物、分离的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶和/或合成的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶。
[0309]
在一个实施方案中，与炎症相关的病症是cox-2相关病症、tg2相关病症和/或jak相关病症。
[0310]
在一个实施方案中，cox-2相关病症选自由以下组成的组：胃肠炎性疾病、胃溃疡(例如消化性溃疡)、胃炎、炎性肠病(ibd)、克罗恩病、溃疡性结肠炎、肠易激综合征(ibs)、消化疾病、胃食管反流病(gerd)、胃灼热、酸反流、幽门螺杆菌感染、口腔溃疡、口炎、咽炎、齿龈炎、食管溃疡、炎性和退行性神经系统病症、神经精神疾病(例如精神分裂症和双相情感障碍)、神经退行性病症(例如创伤性脑损伤、多发性硬化和阿尔茨海默病)、神经系统疾病(例如帕金森病和/或癫痫发作)、脑缺氧/缺血、克-雅病、肌萎缩性侧索硬化、关节炎(例如类风湿性关节炎、幼年型类风湿性关节炎和强直性脊柱炎)、慢性炎症、心血管疾病、疼痛(例如急性疼痛(例如由身体损伤引起的疼痛)、慢性疼痛和痛经(与月经相关的疼痛))、癌症(例如结肠直肠癌(crc))和肌肉骨骼疾病。
[0311]
在一个实施方案中，tg2相关病症选自由以下组成的组：胃肠炎性疾病、胃溃疡(例如消化性溃疡)、胃炎、tg2相关炎性病症、炎性肠病(ibd)、克罗恩病、溃疡性结肠炎、肠易激综合征(ibs)、消化疾病、胃食管反流病(gerd)、胃灼热、酸反流、幽门螺杆菌感染、口腔溃疡、口炎、咽炎、齿龈炎和/或食管溃疡、神经精神疾病(例如精神分裂症和双相情感障碍)、多发性硬化、神经变性病症(例如创伤性脑损伤、多发性硬化和阿尔茨海默病)、心血管疾病、癌症、关节炎、乳糜泻、亨廷顿氏病、纤维化和癌症。tg2还在伤口愈合中起作用。
[0312]
在一个实施方案中，jak相关病症选自由以下组成的组：胃肠炎性疾病、胃溃疡(例如消化性溃疡)、胃炎、jak相关炎性病症、炎性肠病(ibd)、克罗恩病、溃疡性结肠炎、肠易激综合征(ibs)、消化疾病、胃食管反流病(gerd)、胃灼热、酸反流、幽门螺杆菌感染、口腔溃疡、口炎、咽炎、齿龈炎和/或食管溃疡、神经精神疾病(例如精神分裂症和双相情感障碍)、多发性硬化、神经变性病症(例如创伤性脑损伤、多发性硬化和阿尔茨海默病)、心血管疾病、癌症、关节炎、慢性炎症、自身免疫性病症、溃疡性结肠炎、斑秃、特应性皮炎、弥漫性硬皮病、克罗恩病、白癜风、噬血细胞综合征、非感染性葡萄膜炎和皮肤红斑狼疮。
[0313]
在一个实施方案中，所述方法进一步包括将通过上述方法鉴定的组合物与具有约5至约80mg/kg的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶浓度的标签一起包装的步骤。
[0314]
在另一个具体的方面，本发明提供了具有抗炎、镇痛和/或tg2、jak和/或cox-2抑制活性的组合物的方法，所述组合物适用于预防、改善或治疗炎症和/或疼痛的方法，所述方法包括：
[0315]
a.测试一批蜂蜜的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶浓度；以及
[0316]
i.如果所述组合物含有大于约5至约80mg/kg的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶浓度，则将所述组合物鉴定为适用于预防、改善或治疗炎症和/或疼痛的方法；
[0317]
ii.如果所述组合物含有低于约5mg/kg 3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶浓度，则将所述组合物鉴定为不适合用于预防、改善或治疗炎症和/或疼痛的方法中。
[0318]
在一个实施方案中，所述组合物包含蜂蜜、蜂蜜提取物、分离的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶和/或合成的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶。
[0319]
在一个实施方案中，炎症和/或疼痛与选自tg2、jak和/或cox-2相关病症的病症相关。
[0320]
在一个实施方案中，cox-2相关病症选自由以下组成的组：胃肠炎性疾病、胃溃疡(例如消化性溃疡)、胃炎、炎性肠病(ibd)、克罗恩病、溃疡性结肠炎、肠易激综合征(ibs)、消化疾病、胃食管反流病(gerd)、胃灼热、酸反流、幽门螺杆菌感染、口腔溃疡、口炎、咽炎、齿龈炎、食管溃疡、炎性和退行性神经系统病症、神经精神疾病(例如精神分裂症和双相情感障碍)、神经退行性病症(例如创伤性脑损伤、多发性硬化和阿尔茨海默病)、神经系统疾病(例如帕金森病和/或癫痫发作)、脑缺氧/缺血、克-雅病、肌萎缩性侧索硬化、关节炎(例如类风湿性关节炎、幼年型类风湿性关节炎和强直性脊柱炎)、慢性炎症、心血管疾病、疼痛(例如急性疼痛(例如由身体损伤引起的疼痛)、慢性疼痛和/或痛经(与月经相关的疼痛))、癌症(例如结肠直肠癌(crc))和肌肉骨骼疾病。
[0321]
在一个实施方案中，tg2相关病症选自由以下组成的组：胃肠炎性疾病、胃溃疡(例如消化性溃疡)、胃炎、tg2相关炎性病症、炎性肠病(ibd)、克罗恩病、溃疡性结肠炎、肠易激综合征(ibs)、消化疾病、胃食管反流病(gerd)、胃灼热、酸反流、幽门螺杆菌感染、口腔溃疡、口炎、咽炎、齿龈炎和/或食管溃疡、神经精神疾病(例如精神分裂症和双相情感障碍)、多发性硬化、神经变性病症(例如创伤性脑损伤、多发性硬化和阿尔茨海默病)、心血管疾病、癌症、关节炎、乳糜泻、亨廷顿氏病、纤维化、癌症和创伤。
[0322]
在一个实施方案中，jak相关病症选自由以下组成的组：胃肠炎性疾病、胃溃疡(例
如消化性溃疡)、胃炎、jak相关炎性病症、炎性肠病(ibd)、克罗恩病、溃疡性结肠炎、肠易激综合征(ibs)、消化疾病、胃食管反流病(gerd)、胃灼热、酸反流、幽门螺杆菌感染、口腔溃疡、口炎、咽炎、齿龈炎和/或食管溃疡、神经精神疾病(例如精神分裂症和双相情感障碍)、多发性硬化、神经变性病症(例如创伤性脑损伤、多发性硬化和阿尔茨海默病)、心血管疾病、癌症、关节炎、慢性炎症、自身免疫性病症、溃疡性结肠炎、斑秃、特应性皮炎、弥漫性硬皮病、克罗恩病、白癜风、噬血细胞综合征、非感染性葡萄膜炎和皮肤红斑狼疮。
[0323]
在一个实施方案中，炎症和/或疼痛与胃肠道有关。
[0324]
在一个实施方案中，所述方法进一步包括将通过上述方法鉴定的组合物与具有约5至约80mg/kg的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶浓度的标签一起包装的步骤。
[0325]
在一个实施方案中，3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶的浓度可以通过色谱法、分析测量、分光光度法和/或本领域技术人员已知的任何其他方法测定。在一个实施方案中，3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶的浓度通过反相hplc测定。
[0326]
质谱法对麦努考蜂蜜中的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶进行定量
[0327]
在本发明的一个实施方案中，3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶浓度通过如先前在nz 722140中所述并且如下所示的方法测定：
[0328]
描述了使用串联质谱法(lc-ms/ms)测量3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶浓度的定量技术。合成了较重的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶同位素，并将其用作内标以补偿麦努考蜂蜜的基质效应。麦努考蜂蜜中没有来自内源性化合物的干扰，并且3da质量差异可以在质谱上清楚地区分。lc-ms/ms的以下进一步描述的结果与来自hplc定量和荧光光谱法的先前数据强烈相关。因此，3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶可以使用所有三种方法精确地确定。来自lc-ms/ms定量的结果与来自hplc的先前数据相比是较低的，这可能是由在相同hplc峰下的次要共洗脱化合物引起的。这些发现证明定量质谱法可用作麦努考蜂蜜鉴定的独立或互补方法。
[0329]
为了验证lc-ms/ms方法，在补充较重的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶同位素之前和之后获得典型麦努考蜂蜜的质谱。如图所示，m/z 210-212的麦努考蜂蜜中没有来自内源性化合物的显著干扰峰。同位素之间的3da质量差异可以在质谱上清楚地识别。在0.2％w/v下测定麦努考蜂蜜的最终测试浓度以降低糖浓度，同时保持相对高的质谱分辨率。
[0330]
lc-ms/ms定量
[0331]
在lc阶段，内源性3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶和较重的同位素在完全相同的时间(12.85min)共洗脱。这些异构体显示几乎相同的ms/ms谱，而仅通过从m/z 189到m/z 192的3da质量位移来区分。在148.05m/z观察到最丰富的共同离子。重同位素不存在于该碎片离子所代表的结构部分上。该通用离子用于3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶定量以减少背景干扰。
[0332]
比较lc-ms/ms和hplc定量
[0333]
使用质谱定量将内源性3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶浓度定量为3-44mg/kg。结果证明与同一组麦努考蜂蜜样品的hplc分析的先前数据强线性相关(r2＝0.9517)。应当注意的是，质谱分析结果与先前的hplc定量(5-52mg/kg)相当地低。这表明其他uv吸收性化合物可以在相同的hplc峰下与3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶共洗脱。
[0334]
质谱定量的结果也与
ex
330nm-em
470nm处的特征荧光很好地相关(r2＝0.8995)。
[0335]
3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶的结构解析
[0336]
3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶的化学结构说明描述于nz 722140中，并且如下文所示。
[0337]
表1.3a的1h、
13
c和
15
n nmr数据
[0338][0339]
a 1
h(400mhz)；
13
c(100mhz)；
15
n(60.8mhz)，由1h-15
nhmbc nmr数据间接确定的化学位移。bhmbc相关性是从质子到指定的碳或氮。
[0340]
参考上表1，通过正离子hresims确定未知化合物的分子式为c9h
10
n4o2。该化合物可溶于cd3od和cdcl3；后者用于记录cd3od中记录的波谱中不存在的δ8.55ppm(h-1)处存在宽共振而用于记录nmr光谱。基于其化学位移和在ir光谱中不存在明显的羟基吸收，将该峰指定为酰胺质子。δ2.63ppm(h-10)和δ2.67ppm(h-11)处的两个单峰基于它们的化学位移被指定为杂芳基甲基，并且δ3.50ppm(h-9)处的剩余单峰由于与两个季羰基
13
c信号(c-2，c-4，参见下文)等强度的hmbc相关性和与δ28.5ppm(c-9)处的碳信号的hsqc相关性而被指定为n-甲基。
[0341][0342]
分别在δ292.0ppm和δ329.9ppm处h-10和h-11与n-5和n-8的1h-15
n hmbc相关性表
明这两个甲基基团连接至吡嗪环。基于从h-10到c-7和从h-11到c-6的1h-13
c hmbc相关性指定2,3-二甲基取代模式。
[0343]
鉴于结构中的高不饱和度和吡嗪环的存在，对于未知化合物提出稠合杂环结构。此外，注意到碳c-2、c-4和c-4a的化学位移之间的相似性，并且报道了含有二氧四氢蝶啶结构的天然产物中类似碳的位移(pfleiderer,1984；kakoi等人,1995；voerman等人，2005；meyer等人2010；chen等人2014)。该观察结果与从h-9至c-2和c-4的hmbc相关性以及从h-10至c-4a的另外四个键偶联结合，导致分离的化合物的结构暂时指定为3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶(3)。
[0344]
3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶(3)在1958年首次合成(curran和angier，1958)。自此以后，在几项有关二氧四氢蝶啶的研究中已有报道(pfleiderer与fink，1963；pfleiderer与hutzenlaub,1973；ritzmann与pfleiderer,1973；ram等人，1977；southon与pfleiderer,1978；uhlmann与pfleiderer,1981；ram等人，1982；bartke与pfleiderer,1989；-cueva等人，2000)。二氧四氢蝶啶3的表征数据限于熔点(curran与angier，1958；pfleiderer与hutzenlaub,1973)，元素分析(curran与angier，1958)和uv-可见光峰(pfleiderer与hutzenlaub,1973；ritzmann与pfleiderer,1973；uhlmann与pfleiderer，1981)；迄今为止没有报道nmr、ms或ir数据。
[0345]
上文和下文引用的所有申请、专利和出版物(如果有的话)的全部公开内容以引用的方式并入本文中。
[0346]
为了避免疑问，术语“组合物”包括但不限于蜂蜜、蜂蜜提取物或干蜂蜜。
[0347]
在本说明书中对任何现有技术的引用不是并且不应当被认为是承认或任何形式的建议，该现有技术形成世界上任何国家的努力领域中的公知常识的一部分。
[0348]
本发明还可以被广义地说成在于在本技术的说明书中单独地或共同地以两个或更多个所述部分、元件或特征的任何或所有组合提及或指示的部分、元件和特征。
[0349]
其中前面的描述参考了整体或具有其已知等同物的部件，这些整体在此并入，如同单独阐述一样。
[0350]
应当注意的是，对于本技术领域的技术人员来说，本文所述的当前首选实施方案的各种变化和修改将是明显的。在不背离本发明的精神和范围并且不减少其附带优点的情况下，可以进行这样的改变和修改。因此，这样的改变和修改旨在包括在由所附权利要求描述的本发明的范围内。
[0351]
实施例
[0352]
现在参考附图和具体实施例描述上述组合物、药物和用途。
[0353]
实施例1-荧光测定
[0354]
在该实施例中，荧光抑制剂筛选提供了快速、灵敏和高通量的方法来鉴定mmp-9的潜在抑制剂。
[0355]
方法和材料
[0356]
mmp-9抑制剂筛选测定(荧光测定)试剂盒购自abcam(墨尔本，澳大利亚)。荧光试剂盒含有重组mmp-9酶、mmp抑制剂nngh(n-异丁基-n-[4-甲氧基苯磺酰基]甘氨酰异羟肟酸)、溶解在dmso中的mmp荧光底物、荧光测定缓冲液和96孔透明微板。
[0357]
使用市售mmp-9抑制剂筛选测定试剂盒评估对mmp-9的抑制活性。mmp-9活性表示
为使用spectramax id3多模式酶标仪(molecular devices，圣何塞，美国)测量的荧光强度的变化。
[0358]
该测定法使用fret标记的(荧光共振能量转移)底物，其可被mmp-9在特定位点水解(艾博抗(abcam)，2018)。fret底物的裂解释放淬灭的荧光mca(7-甲氧基香豆素-4-基)-乙酰基(abcam，2018)。该试剂盒使用淬灭的荧光底物mca-pro-leu-gly-leu-dpa-ala-arg-nh2，其中mca荧光被dpa淬灭直至被mmp裂解。mmp-9产生的荧光产物的量可以通过荧光测定法检测，并且它与酶活性成比例。在
ex
320nm-em
395nm下测量荧光以最小化在
ex
330nm
–
em
470nm下来自3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶的荧光干扰。在试剂盒中包含的96孔透明微孔板上进行测定，最终反应体积为100μl。在添加底物之前，将mmp-9酶与测试样品和抑制剂对照在37℃下孵育60分钟。在测定前将荧光底物加入各孔中以引发反应。使测定运行20分钟并将反应室中的温度设定为37℃。
[0359]
制备包含如上所述制备的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶的测试样品。
[0360]
阳性对照仅包括mmp-9和荧光底物，用作计算抑制百分比的参照。包括广谱mmp抑制剂nngh作为阴性对照。在不含mmp-9和荧光底物的测试浓度下，一系列测试对照也包括3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶，其对于测量由3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶产生的自发荧光是必需的。
[0361]
结果
[0362]
将合成的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶以在麦努考蜂蜜中发现的2.5-40μg/ml(3-44μg/ml，通过lc-ms/ms测量)的浓度补充至反应混合物中。如图1所示，所有3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶样品和对照的荧光强度变化是线性的。nngh阳性对照的荧光几乎没有变化。相反，没有抑制剂的阴性对照观察到荧光的稳定增加。3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶样品由于其自身荧光性质而显示出较高的初始荧光。在该测定中包括每种3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶浓度的荧光对照。
[0363]
在该研究中，所有测试浓度的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶对mmp-9表现出12％至99％的抑制活性，如图2所示。与不含抑制剂的阴性对照相比，3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶在高于或等于5μg/ml的浓度下显著抑制mmp-9活性(所有p《0.05)。2.5μg/ml的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶将mmp-9活性抑制12％，但抑制不显著(p》0.05)。在40μg/ml下，3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶几乎完全抑制mmp-9，与nngh对照相比没有显著差异(p》0.05)。mmp-9的抑制似乎与3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶浓度呈剂量依赖性，因为与较低浓度相比，较高的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶浓度总是显示较强的抑制(所有p《0.05)。所有数据均为平均值
±
sem，n＝4。****p《0.0001。
[0364]
mmp-9的抑制百分比与3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶的浓度正相关，如图3所示。该相关性最适合r2为0.9965的二阶多项式模型。基于这些数据，3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶的ic
50
计算为11.5μg/ml。ic
50
计算为11.5μg/ml。所有数据均为平均值
±
sem，n＝4。
[0365]
实施例2-比色测定
[0366]
在该实施例中，使用mmp-9比色抑制剂筛选试剂盒进一步研究3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶的生物活性。
[0367]
方法和材料
[0368]
mmp-9抑制剂筛选测定(比色)试剂盒购自abcam(墨尔本，澳大利亚)。该试剂盒含
有重组mmp-9酶、mmp抑制剂nngh、mmp显色底物、比色测定缓冲液和96孔透明微板。
[0369]
比色试剂盒使用硫肽作为显色底物(ac-plg-[2-巯基-4-甲基-戊酰基]-lg-oc2h5)，其可被mmp水解以产生巯基。该中间产物进一步与dtnb[5,5
’‑
二硫代双(2-硝基苯甲酸)，ellman's试剂]反应形成2-硝基-5-硫代苯甲酸，其可通过412nm处的吸光度检测。使用spectramax id3多模式酶标仪(molecular devices，圣何塞，美国)测量吸光度的变化。在最终反应体积为100μl的方便的96孔微板上进行测定。在测定之前，将所有测试样品和抑制剂对照与mmp-9在37℃下孵育60min。将显色底物加入各孔中以引发反应。使测定在37℃下运行120min。在第一个20min期间以1min间隔测量吸光度，然后以10min间隔测量吸光度直至测定结束。
[0370]
将重组mmp-9和生色底物用作阳性对照以代表100％酶活性。nngh用作阴性对照。用比色测定缓冲液稀释3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶浓度的范围以测量反应产物的吸光度。
[0371]
结果
[0372]
使用mmp-9比色抑制剂筛选试剂盒进一步研究3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶的潜在抑制生物活性。比色试剂盒使用硫肽底物，其可被mmp水解以产生巯基中间体，其进一步与ellman试剂反应以形成2-硝基-5-硫代苯甲酸。ellman试剂用于检测蛋白巯基的浓度，反应产物可通过412nm的吸光度检测(riener，kada，和gruber，2002)。
[0373]
首先通过向反应混合物中补充3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶(40μg/ml)来研究抑制生物活性(图4)。与不含抑制剂的阴性对照相比，在补充3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶的样品中吸光度的变化率稍小。nngh用作抑制大部分mmp-9活性的阳性对照。预期nngh在1.3μm时不完全抑制mmp-9(abcam，2019)。在第一个40分钟期间，3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶样品和对照的吸光度变化是线性的。产物似乎不稳定，40分钟后开始分解。选择反应的前20分钟用于进一步计算。
[0374]
3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶在2.5-80μg/ml的浓度下显示出针对mmp-9的抑制生物活性。通过将3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶样品中的吸光度变化与阴性对照(无抑制剂，100％mmp-9活性)进行比较来计算抑制百分比。如图5所示，所有3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶样品抑制mmp-9达3.5％至10％(n＝5，各重复两次)。与阴性对照相比，较高浓度(20-80μg/ml)的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶显示对mmp-9的显著抑制(所有p《0.0001)。在较低的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶浓度(2.5-10μg/ml)下，mmp-9抑制水平不显著(所有p》0.05)。将3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶浓度从40μg/ml增加至80μg/ml不进一步抑制mmp-9(均为10％抑制，p》0.05)。这表明与显色底物相比，3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶对mmp-9酶[e]或酶-底物复合物[es]可具有相对较低的结合亲和力(ki)。
[0375]
在不存在mmp-9的情况下，3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶不干扰显色底物和反应产物产生的吸光度信号。这通过将3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶(40μg/ml和80μg/ml)与底物(图6a)和反应产物(图6b)一起孵育20分钟来研究。在两种情况下，3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶不显著干扰吸光度信号。
[0376]
实施例3:明胶凝胶酶谱
[0377]
为了证实3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶对mmp-9的抑制，本发明人进行了明胶凝胶酶谱以检测mmp-9的活性。明胶凝胶酶谱法由于其消化明胶的能力而被独特地设计用于检测活性mmp-9(明胶酶)。
[0378]
方法和材料
[0379]
novex
tm 10％酶谱加(明胶)蛋白凝胶(15孔)购自赛默飞世尔科技(thermo fisher scientific)公司(奥克兰，新西兰)。酶谱分析所需的所有化学品也购自赛默飞世尔科技，这些包括novex
tm sharp预染色蛋白质标准品、novex三羟甲基氨基甲烷-甘氨酸sds样品缓冲液、novex三羟甲基氨基甲烷-甘氨酸sds电泳缓冲液、novex酶谱复性缓冲液和novex酶谱显影缓冲液。从sartoriuspro(18.2mωcm)纯化体系中纯化双蒸水。作为独立的技术进行明胶凝胶酶谱以证实从3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶抑制mmp-9。该技术使用包埋有明胶的非还原sds-page(十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳)凝胶。蛋白质在电泳期间迁移和分离。电泳后除去sds，然后将凝胶与酶活性所需的必需辅因子一起孵育。嵌入的明胶可被mmp-9消化，在用考马斯蓝染料染色后在深蓝背景上产生清晰的条带。明胶酶活性由带密度测定法表示，其可以用图像分析软件评估。明胶凝胶酶谱是一种相对低成本的高灵敏技术(leber和balkwill，1997)。另外，该方法可以同时检测前mmp和活性mmp的明胶酶活性，因为它们可以基于它们通过凝胶的迁移距离来区分(rossano等人，2014)。
[0380]
将mmp-9酶稀释至5μg/ml的最终测试浓度。将mmp-9酶与上样缓冲液和水轻轻混合以达到每孔10μl的总上样体积。使用xcell surelock
tm
微细胞系统(赛默飞世尔科技，奥克兰，新西兰)进行凝胶电泳。上室用200ml 1x三异丙基乙磺酰-甘氨酸sds电泳缓冲液填充，下室用600ml。凝胶在125v和30ma(起始电流)的恒定电压下运行105min。电泳后，取出凝胶并在1x复性缓冲液中温和搅拌孵育30min。孵育后，小心地将凝胶切成小块，并在温和搅拌下在1x显影缓冲液或补充有3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶的显影缓冲液中分别进一步孵育30min。将凝胶在37℃下与含有或不含3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶的新鲜显影缓冲液进一步孵育过夜，持续13小时。还将2.6μm的nngh加入到显影缓冲液中作为阳性对照。
[0381]
孵育后，在温和搅拌下用水冲洗明胶凝胶三次(每次5min)。通过加入20ml的simplyblue safestain将凝胶染色，并在温和搅拌下在室温下孵育2小时。通过除去simplyblue safestain使其脱色，并在温和搅拌下在室温下用水冲洗2小时。在imagej version 1.52a上使用密度测定法分析mmp-9活性。
[0382]
结果
[0383]
通过比较在正常显影缓冲液中与补充3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶和补充nngh的缓冲液孵育的明胶凝胶，使用明胶酶谱法进一步检测3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶对mmp-9的生物活性。本研究中使用的mmp-9酶被4-氨基苯汞乙酸盐(4-apma)部分活化，得到更多关于分子相互作用的信息。凝胶上的清晰条带代表来自mmp-9的明胶酶活性，如图7所示。顶部的清晰条带表示来自无活性mmp-9(～47kda)的纤连蛋白结构域的明胶酶活性。底部条带表示来自活性mmp-9的明胶酶活性，其中前结构域被切割掉(～37kda)。在电泳期间，pro-mmp-9通过sds变性，然后通过用如triton x-100的去污剂除去sds而复性(ren，chen与khalil，2017)。该重折叠过程自动激活一部分pro-mmp-9而不裂解pro-结构域(woessner，1995)。然而，自活化的mmp-9原可能不代表体内真实活性。
[0384]
使用明胶酶谱法，3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶似乎具有来自活性和无活性mmp-9的降低的明胶酶活性。与不含抑制剂的阴性对照相比(图7，第3-5列)，在3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶处理的凝胶中，两条透明带的面积似乎都减少(图7，第6-8列)。阳性对照nngh完全抑制活性mmp-9的明胶酶活性(图7，第9-10列)。在nngh处理的凝胶中似乎存在一些来自无
活性mmp-9的明胶酶活性，这可能是来自纤连蛋白结构域的剩余明胶酶活性的结果。
[0385]
3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶显著降低活性和无活性mmp-9的明胶酶活性(图8，两者p《0.001)。通过光密度测定法分析3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶和nngh的抑制百分比并绘制在图8中。通过将光密度与阴性对照(无抑制剂)进行比较来计算抑制百分比。如图所示，3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶分别显著抑制活性和无活性mmp-9的活性31％和17％(两者p《0.01)。应注意，与非活性mmp-9相比，3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶对活性mmp-9表现出显著更强的抑制(p《0.05)。这表明3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶可能更多地与mmp-9的锌活性位点相互作用。用nngh处理也可以观察到相同的模式，其中nngh特异性地与锌离子相互作用(bertini等人，2005)。
[0386]
实施例4-3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶与mmp-9的分子对接
[0387]
在该实施例中，进行分子对接研究以预测3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶和mmp-9之间的非共价相互作用。
[0388]
原理
[0389]
分子对接是尝试预测配体与生物大分子靶标的非共价相互作用的计算程序。autodock和autodock vina是常用的计算工具，以帮助研究人员确定生物分子复合物。该软件计算靶蛋白和配体之间的最小相互作用能，同时有效地探索所有扭转自由度。autodock基于经验自由能力场和快速lamarckian遗传算法搜索方法(goodsell与olson1990；morris等人,2009)。autodock vina使用更简单的评分函数和快速梯度优化构象搜索，显著提高了速度和准确度(trott与olson，2010)。
[0390]
方法和材料
[0391]
使用autodock vina v1.1.2进行mmp-9和3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶的分子对接研究。在chimera v1.13.1上进行对接准备、对接后分析和可视化(pettersen等人，2004)。在avogadro v1.2.0(hanwell等人，2012)上绘制3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶的3d结构。mmp-9(pdb id:1l6j)的完整三维晶体结构通过rcsb蛋白质数据库检索(elkins等人，2002)。
[0392]
使用嵌合体对两种化合物进行对接制备。通过使用智能最小化算法使3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶结构最小化。扭转角的检测和gasteiger电荷的分配也在chimera上进行。通过添加氢原子、合并非极性氢原子、检查缺失gasteiger电荷来制备mmp-9结构。在mmp-9酶的催化结构域上定义网格框，体积为45，48(x，y，z坐标＝30，30，35)。这定义了参与对接计算的蛋白质的面积。
[0393]
在autodock vina上进行分子对接，耗竭性设定为8，结合模式数设定为10。具有最高得分的最佳结合构象在autodock vina上列出并在chimera上显现。还在chimera上分析了每个结合姿态的潜在分子间氢键。
[0394]
结果
[0395]
分子对接预测3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶与mmp-9之间的显著结合亲和力。使用autodock vina，将3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶成功地对接到mmp-9的活性部位，最佳对接分数为-7.9(表2)。通过考虑氢键、疏水相互作用和扭转罚分的组合，autodock vina评分代表两种化合物结合所需的预测能量(chang，ayeni，breuer，与torbett，2010)。结果，最有利的结合构象被表示为分数。相比之下，使用autodock vina，最具活性的合成mmp-9抑制剂的
对接分数在-7.6至-8.9之间(rathee等人，2018)。
[0396]
表2.由autodock vina计算的预测得分。
[0397]
得分rmsd l.b.rmsd u.b.h键数量-7.9001-6.72.2835.4181-6.52.9864.2391-6.53.6345.6991-6.53.6735.0521-6.416.118.0830-5.93.8556.350-5.84.9877.4230-5.715.918.0220-5.72.3614.7410
[0398]
通过与tyr
420
残基形成氢键，将3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶对接到s’1底物结合位点中。s’1底物结合位点框在最接近活性位点锌的活性位点裂隙的中心。与其他结合口袋相比，s’1口袋在氨基酸组成和口袋深度方面在mmp之间变化(aureli等人，2008)。结果，s’1口袋决定了底物结合特异性并且是许多mmp抑制剂的靶标。特别是对于mmp-9与不同抑制剂的共结晶揭示arg
424
残基是高度柔性的，这允许一些mmp抑制剂移动到s1’口袋中(tochowicz等人，2007)。
[0399]
在先前的对接研究中，具有羧酸和磺酰胺异羟肟酸基团的合成抑制剂结合至s’1口袋；而硫酯基团与s’1和s1口袋相互作用(tandon与sinha，2011)。在3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶的n-h基团和靠近mmp9的s’1腔壁的tyr
420
之间发现潜在的氢键(图9)。s’1壁残基通常充当主链间氢键与底物或抑制剂的氢受体(tyr
420
、pro
421
、tyr
423
)(tandon与sinha，2011)。具有羰基或n-h基团的锌结合抑制剂为与s1’口袋的氢键相互作用提供了机会。(tandon与sinha，2011)。两种结构都存在于3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶中。
[0400]
这些结果进一步支持3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶在位于纤连蛋白ii型结构域内的mmp-9的外部位的结合。本发明人进一步鉴定了3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶与mmp-9的高goldscore得分(53.4)(用goldv5.7.3进行对接，每个配体总共10次ga运行和最大搜索效率。对接姿态用goldscore评分)。这些发现表明3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶可通过破坏明胶的结合而与mmp-9的外部位相互作用。分子对接分析的结果进一步支持3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶在位于纤连蛋白ii型结构域内的mmp-9的外部位的结合。
[0401]
实施例5-模拟胃肠环境
[0402]
包含3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶的抗炎生物活性在胃肠消化期间可以保持的程度是未知的。可能的是，该生物活性分子在低ph下或通过消化酶进行修饰，完全丧失其生物活性。
[0403]
在体外进行含有3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶的蜂蜜样品的模拟胃消化，随后模拟肠消化。在该过程中的预定时间点，取出胃或肠浸液以分析剩余量的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶。
[0404]
材料和方法
[0405]
胃肠环境模拟：
[0406]
使用静态模型进行模拟胃肠消化。根据全球共识方案(minekus等2014)制备模拟胃液(sgf)和模拟肠液(sif)。sgf具有ph3以模拟胃的进食状态。当与麦努考蜂蜜(或蜂蜜溶液)混合时，最终混合物含有2000u/ml胃蛋白酶。sif具有ph7以模拟小肠的进食状态，在使用前含有2mg/ml胰酶(8
×
usp，或基于200u/ml的蛋白酶活性)和20mm猪胆汁提取物。
[0407]
胃消化：
[0408]
在模拟胃消化中，将2g麦努考蜂蜜在2ml sgf中在37℃下在95rpm振荡下孵育2h的时间段(一式三份)。在选定的时间点(0、30、60和120min)，取出预定体积(0.1ml)的混合物用于3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶分析。将用于分析的溶液保持在冰上，加入0.1ml sif(ph7)以终止胃蛋白酶活性。作为对照组，以相同方式处理纯3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶溶液用于比较目的。
[0409]
肠消化：
[0410]
2小时胃消化后，将所得溶液与sif(ph7)以1:1的体积比混合，得到含有1mg/ml胰酶和10mm猪胆汁提取物的最终混合物。将该混合物在37℃下在95rpm振荡下孵育4h(一式三份)。在选定的时间点(0、60、120和240min)，取出预定体积(0.1ml)的混合物用于3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶浓度分析。通过加入5mmol/(egger等，2019)猝灭取出液中的胰酶制剂活性。
[0411]
3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶保留的分析：
[0412]
在hplc分析之前，处理用于3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶分析的胃和肠消化物以除去不溶性级分(例如胰酶)。简言之，用0.1％甲酸稀释所有样品，然后以14,000rpm离心10min。取上清液用于分析。使用反相hplc系统分析不同时间点的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶的量，所述反相hplc系统先前已用于分析文献中报道的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶和独麦素(leptosperin)(bin lin等人，2017)。简言之，将样品在0.1％v/v甲酸中稀释5倍。将hypersil gold柱(150
×
2.1mm，3μm粒度)用作固定相(25℃)，并且流动相将由0.1％甲酸(相a)和80:20乙腈:0.1％甲酸(相b)组成。注射体积为3μl，流速为0.200ml，并且使用如下梯度洗脱来分离3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶和其他：初始2min(5％相b)，7min(25％b)，14min(50％b)，16min(100％b)，19min(5％b)和20min(5％b，保持10min)。在320nm处检测到3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶的信号。
[0413]
统计分析：
[0414]
使用双尾非配对student's t检验分析两个平均值之间差异的显著性。当比较两个以上的平均值时，通过单因素方差分析和随后的bonferroni多重比较检验(spss统计版本24，ibm)分析显著差异。在p《0.05时认为差异具有统计学显著性。
[0415]
结果
[0416]
四个蜂蜜样品的模拟胃肠消化的结果表明，麦努考蜂蜜中的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶在消化道的恶劣环境中是高度稳定的。直到研究结束，即2h胃消化加4h肠消化，来自四种蜂蜜样品的初始3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶量的几乎100％可在饮食中完全回收。没有观察到明显的降解。详细的动力学示于图10和11中，其中在第一个2h中，将3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶在模拟胃液中孵育，而随后的4h代表肠消化阶段。数据表示平均值
±
sd，n＝3。原始数据总结在表3中。
9)的作用
[0428]
本发明人使用酶联免疫吸附测定(elisa)技术研究了麦努考蜂蜜中存在的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶抑制人巨噬细胞系(thp-1)中脂多糖(lps)诱导的mmp-9分泌的功效。
[0429]
巨噬细胞是胃mmp的潜在来源，因为已知它们对细菌因子和促炎细胞因子两者的响应具有增加的mmp-9分泌。因此，thp-1分泌的mmp-9可用作胃炎症的标记。
[0430]
测试2.5-40μg/ml浓度的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶的mmp-9抑制活性。选择阿奇霉素作为阳性对照。与20和5μg/ml相比，40μg/ml(减少38％)和30μg/ml(减少23％)的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶显著(p《0.05)减少lps(1μg/ml)处理的分化thp-1细胞的mmp-9分泌。40μg/ml的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶降低mmp-9，且该降低略高于阿奇霉素超过30μg/ml。然而，基于细胞活力报告，30μg/ml(13％细胞死亡)比40μg/ml(20％细胞死亡)略安全。
[0431]
方法
[0432]
剂量
[0433]
使用分化的thp-1细胞，在2.5-40μg/ml的剂量下测试3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶对mmp-9炎症应答的抑制。
[0434]
细胞培养：
[0435]
thp-1细胞(atcc，atctib202)在rpmi-1640(gibco，11875093)+0.05mm 2-巯基乙醇+10％胎牛血清(fcs)+1％链霉素(pen-strep)中生长。对于实验，细胞在仅含10％胎牛血清(fbs)的rpmi-1640培养基中培养。
[0436]
将thp-1单核细胞以2.5
×
105细胞/ml的密度接种在96孔板中，并使用10ng/ml佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯(pma)(bergin等人)(sigma，p1585-1mg，批号slbx889，100％纯度)分化为巨噬细胞，持续72小时。然后从分化的thp-1细胞中除去pma培养基，然后将细胞在rpmi-1640培养基中洗涤一次，然后静置约～5小时。
[0437]
lps刺激和用3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶治疗：
[0438]
用来自大肠杆菌055:b5的lps刺激分化的thp-1细胞(sigma，l6529；lot#037k4068)。在1μg/ml的浓度下测试lps(kong等人)。将细胞与单独的lps或与浓度范围为2.5-40μg/ml的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶(从奥克兰大学(university of auckland)接收并在rpmi-1640中以1mg/ml的储备液浓度稀释，在使用前将储备液在冰箱中储存2天)一起孵育。6μm阿奇霉素(sigma，目录号75199-25mg，批号069m4826v)用作阳性对照(vandooren等人)。然后将细胞与不同的处理一起孵育24小时(kong等人)。24小时后，收集细胞培养基并使用mmp-9elisa(r&d systems，rdsdy91105，批号p239459和dy008，批号p 239900)测量mmp-9浓度。然后将细胞与wst-1一起孵育用于细胞活力。
[0439]
如上处理另外两个96孔板，除去培养基并将含有细胞的板冷冻在-80℃用于将来的rt-pcr实验。
[0440]
elisa特异性：
[0441]
该人mmp-9测定测量92kda pro-mmp-9和82kda活性mmp-9。它不测定65kda形式。当与分离自人源材料的脂质运载蛋白-2/ngal复合时，该测定还识别人mmp-9。
[0442]
测定以50ng/ml制备的以下因子并且不显示交叉反应性或干扰：mmp-1、mmp-2、mmp-3、mmp-7、mmp-8、mmp-10、mmp-12、mmp-13、mmp-14、timp-2、timp-3、timp-4、timp-4重组小鼠mmp-9。
[0443]
重组人timp-1在该测定中不交叉反应，但在浓度》1.56ng/ml时干扰。
[0444]
细胞活力和初步mmp-9分泌试验：
[0445]
为了测定不同剂量的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶的细胞毒性，使用2-(4-碘苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺基苯基)-2h-四唑一钠盐(wst-1)(roche，11644807001，批号45255800)。wst-1是用于使用比色测定法测量细胞增殖、生存力和细胞毒性的细胞增殖试剂(gosert(2011)；peskin(2000))。
[0446]
孵育后，取出一部分培养基并储存用于使用elisa的mmp-9分泌测试。然后除去板中剩余的培养基，向每个细胞孔中加入100μl在rpmi-1640培养基中的wst-1(1:10稀释)，并在37℃再孵育4小时。然后使用读板器在450nm的波长下读板。细胞毒性计算如下：
[0447]
[每个样品的wst-1评分/对照的wst-1评分]
×
100
[0448]
低于80％的wst-1评分被视为具有细胞毒性。
[0449]
统计分析：
[0450]
为了更好地捕捉变异性，在每个板(2个板)中至少一式三份地进行每种处理。汇集来自一式三份孔的培养基并一式两份分析mmp-9elisa。在具有lps的培养基和不同处理之间在excel中进行student检验。
[0451]
结果
[0452]
浓度为40μg/ml的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶的细胞毒性％略高于研究中选择的其他浓度(2.5-30μg/ml)(图16)。数据表示为平均值
±
sd。然而，基于临界考虑，认为它是毒性的(79.8)。与其为20和5μg/ml相比，40μg/ml(减少38％)和30μg/ml(减少23％)的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶显著(p《0.05)减少lps(1μg/ml)处理的分化thp-1细胞的mmp-9分泌(图17)。在图17中，小写字母代表治疗之间的显著差异。a-40μg/ml的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶抑制mmp-9分泌(p＝0.02)；b-30μg/ml的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶抑制mmp-9分泌(p＝0.02)。40μg/ml的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶降低mmp-9，略大于阿奇霉素超过30μg/ml。调整值(相对于lps)示于图18。在图18中，小写字母代表治疗之间的显著差异。a-40μg/ml的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶抑制mmp-9分泌(p＝0.00)，b-30μg/ml的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶抑制mmp-9分泌(p＝0.04)；c-阿奇霉素抑制mmp-9分泌(p＝0.00)。
[0453]
实施例7:分子对接-tg2、cox-2和jak
[0454]
分子对接是生物信息学建模，其涉及两个或更多个分子的相互作用以得到稳定的加合物。它用于预测配体与靶标的结合能力。根据配体和靶标的结合性质，预测任何复合物的三维结构。共结晶的配体和另外的已知的靶标抑制剂(例如：tg2、cox-2和jak)用于验证姿态预测质量并用作活性配体的阳性对照。未知具有例如tg2、cox-2或jak亲和力的化学或药理学相关配体被包括作为阴性对照。所有化合物在chem3d v18.1中用mmff94力场最小化。用gold v5.7.3进行对接，以最高搜索效率，每个配体总共运行10次ga，。用goldscore对对接姿态评分，随后用chemscore再评分。
[0455]
结果
[0456]
作为推定的jak-1配体的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶
[0457]
得分簇的分析显示已知活性物质和诱饵配体之间非常明显的区别。3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶(gold评分-43.31；chem评分-19.33)占据两个簇之间的空间，但比已知活性物的形心更接近诱饵配体的形心。
[0458]
采用量子力学hartree-fock方法计算了3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶的几何结构和电子结构，并采用3-21g基组。对3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶结构的几何学和电子学分析显示出负静电势的三个不同区域，其中潜在的氢键模式使人联想到腺苷的腺嘌呤部分。不受理论束缚，本发明人预测3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶与jak-1的atp结合位点的显著结合。这是由于3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶对atp结合位点的结构亲和力。
[0459]
结构数据
[0460]
与各种配体共结晶的人jak1的结晶解析结构可在蛋白质数据库(pdb)上获得。条目6n7a(图19)由于其高分辨率和共结晶配体与3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶的化学相似性而被选择为靶标结构。
[0461]
方案设计
[0462]
将共结晶配体和另外的已知jak1抑制剂对接以验证姿势预测质量并用作活性配体的阳性对照。来自jak1的其他pdb条目的共结晶配体和在chembl数据库中报道的具有jak1活性的配体用作活性化合物组。具有相似分子量和/或结构的小分子用作诱饵配体。化合物报告为其pdb id(3字母代码)或chembl id。在chem3d v18.1中用mmff94力场使所有化合物最小化。用gold v5.7.3进行对接，以最高搜索效率，每个配体总共运行10次ga，。用goldscore对对接姿态评分，随后用chemscore再评分。
[0463]
对接至结构6n7a
[0464]
加入氢，除去共结晶的配体kev并重封以验证姿态预测(图20)。剩余的配体在相同的运行中对接。报告最高评分的姿态，除了其中另一个姿态与共结晶配体的坐标更充分地重叠(表5)。
[0465]
表5.对接至6n7a的评分姿态
[0466][0467]
得分簇的分析(图21)显示了已知活性物质和诱饵配体之间的非常明显的区别。3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶占据活性和诱饵配体的两个簇之间的空间。这提供了3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶在体外的潜在功效的证据。
[0468]
对3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶的最高排名姿态的分析显示从三个单独的配体原子到leu959和ser961的主链杂原子的h键相互作用。(图22)
[0469]
尽管这些h键的存在是令人鼓舞的，但相互作用不涉及任何氨基酸侧链。主链相互作用在活性化合物的结合姿态中并不罕见，但需要侧链通过h键或通过芳族相互作用的接合来赋予配体特异性，因为大多数蛋白质结合位点含有暴露的主链杂原子。鉴于这一观察结果和聚类分析的结果，3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶已显示具有任何指定jak-1活性的最高goldscore。
[0470]
作为推定的tg2配体的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶
[0471]
分数簇的分析显示出令人好奇的趋势，其中大多数诱饵配体具有相对高的chemscore，但低的goldscore。共结晶的配体gdp和来自tg2的其他xrd结构的配体具有最高的goldscore，但也具有最低的chemscore。3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶具有第二低的goldscore(37.52)，但相当高的chemscore(20.38)。
[0472]
结构数据
[0473]
与各种配体共结晶的人转谷氨酰胺酶2的结晶解析结构可在蛋白质数据库(pdb)上获得。选择条目1kv3(图23)作为靶结构，因为它是与小分子(gdp)结合的可用野生型的最高分辨率模型。
[0474]
方案设计
[0475]
将共结晶配体和另外的已知转谷氨酰胺酶2抑制剂对接以验证姿态预测质量并用作活性配体的阳性对照。除了其他共结晶配体之外，使用chembl数据库寻找具有有利的低ic
50
值的配体以定义活性化合物组。一组具有与3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶相似化学结构和/或分子量的小分子用作诱饵配体。在chem3d v18.1中用mmff94力场使所有化合物最小化。用gold v5.7.3进行对接，以最高搜索效率，每个配体总共运行10次ga，。用goldscore对对接姿态评分，随后用chemscore再评分。
[0476]
对接至结构1kv3
[0477]
加入氢，除去共结晶的配体gdp并重封以验证姿态预测(图24)。剩余的配体在相同的运行中对接。报告最高评分的姿态，除了其中另一个姿态与共结晶配体的坐标更充分地重叠(表6)。
[0478]
表6.对接至1kv3的评分姿态。
[0479][0480]
分数簇的分析(图25)显示出令人好奇的趋势，其中大多数诱饵配体具有相对高的chemscore，但低的goldscore。共结晶的配体gdp和来自转谷氨酰胺酶2的其他xrd结构的配体具有最高的goldscore，但也具有最低的chemscore。3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶具有第二低的goldscore，但相当高的chemscore。
[0481]
对3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶的最高排名姿态的分析显示从arg580到羰基和吡
嗪氮的h键相互作用(图26)。另外，在phe174和吡嗪环之间存在π-π堆叠相互作用。
[0482]
然而，在提供3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶的氮的h键与提供酶的骨架氮的h键之间存在冲突。另外，结合袋的表面比通常所见的更暴露于溶剂，仅甲基取代基位于埋藏的空腔中。这显著削弱了相互作用的强度，这反映在与其他对接配体相比相对较低的goldscore(图25)中。总之，高chemscore提供了3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶体外效力的基本证据。
[0483]
作为推定的cox-2配体的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶
[0484]
本发明人还预测3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶结合并抑制cox-2，因此可用于治疗cox-2相关病症。
[0485]
实施例8:lps的抑制(大肠杆菌o111：b4)-诱导的cox-2蛋白表达
[0486]
我们评价了3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶抑制thp-1人单核细胞中cox-2表达的体外活性。单核细胞，包括循环单核细胞、树突细胞和肠驻留巨噬细胞，在肠道中是丰富的，并且已知在许多cox-2相关病症中起作用，包括介导结肠炎和肠炎症。
[0487]
材料和方法
[0488]
thp-1细胞中的样品细胞毒性
[0489]
将人单核细胞thp-1细胞以50,000个细胞/孔的密度接种在96孔组织培养处理的平板中，培养基(补充有10％胎牛血清、2mm l-谷氨酰胺和青霉素-链霉素的rpmi培养基)过夜。在磷酸盐缓冲盐水(pbs)中制备3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶样品稀释液，并用3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶(12.5、25、50和100μg/ml)、10μg/ml地塞米松、10μm吲哚美辛或pbs对照处理细胞，然后用100ng/ml lps(大肠杆菌e.coli o111:b4)刺激18小时。对照孔用过氧化氢(0、0.5、1和2mm)处理1小时，然后加入wst-1试剂(roche，nz)。在18小时孵育期结束时向所有孔中加入wst-1试剂，随后在加入wst-1后30min、1小时和10min测量吸光度读数。细胞活力表示相对于lps刺激的pbs对照的百分比变化。细胞活力低于lps刺激的对照的80％并且与lps刺激的或未刺激的对照显著不同的样品剂量被认为是细胞毒性的。
[0490]
thp-1单核细胞的lps-刺激
[0491]
将thp-1细胞以500,000个细胞/孔的密度接种在12孔组织培养处理的板中的生长培养基中过夜。在pbs中制备3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶样品稀释液，并用3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶(12.5、25、50和100μg/ml)、10μg/ml地塞米松、10μm吲哚美辛或pbs对照处理细胞，然后用100ng/ml lps(大肠杆菌e.coli o111:b4)刺激24小时。因为吲哚美辛不溶于水性缓冲液，所有不含吲哚美辛的孔都加入0.025％dmso以控制任何dmso对细胞活力或活性的影响。用冷pbs洗涤细胞并在含有蛋白酶抑制剂(sigma p2714)的ripa缓冲液中在冰上裂解15分钟。通过在14,000xg下离心15min使碎片沉淀，并且将裂解物上清液冷冻在-80℃下用于稍后通过蛋白质印迹进行分析。
[0492]
cox-2的蛋白表达
[0493]
在用含有蛋白酶抑制剂的ripa缓冲液裂解的thp-1单核细胞上进行半定量cox-2(abcam ab188183)蛋白表达的蛋白质印迹。将总共10μg蛋白质加载到预制的10％丙烯酰胺凝胶(biorad，nz)上，然后通过在室温下在120v电泳分离。然后通过在90v下在冰上电泳90min将蛋白质转移到聚偏二氟乙烯(pvdf)膜上，并用市售缓冲液(biorad 12010020)在4℃下封闭过夜以防止非特异性蛋白质结合到膜上。然后将膜与对应于目的蛋白的一抗孵育1小时。cox-2和β-肌动蛋白(管家蛋白；biolegend 622102)均来源于家兔。用pbs-tween缓
冲液洗涤三次10分钟后，将膜与驴抗兔igg(h+l)hrp缀合物(biolegend 406401)孵育1小时。然后如前所述洗涤膜，使用ecl蛋白质印迹底物试剂盒(biorad 170-5061)检测结合的感兴趣抗体。用amersham
tm imager 600(ge healthcare，美国伊利诺伊州芝加哥)捕获蛋白质印迹图像，并用附带的图像分析软件分析蛋白质条带的密度测定测量。
[0494]
统计分析
[0495]
对于蛋白质印迹的分析，将来自感兴趣的蛋白质的密度测定测量标准化为每个样品的β-肌动蛋白的密度测定。应用student t-检验检测与未处理的lps-刺激的细胞相比用3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶、地塞米松和吲哚美辛处理的thp-1细胞的蛋白质表达的差异。显著性水平设定为p≤
±
0.05。
[0496]
结果
[0497]
wst-1细胞活力测定
[0498]
图27显示了在用pbs、10μg/ml地塞米松(dex)、10μm吲哚美辛(indo)或lepteridine
tm 3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶(12.5、25、50和100μg/ml)处理并用1μg/ml lps共刺激18小时后，通过wst-1测定评估的thp-1细胞的细胞活力百分比。数据为平均值
±
sd。低于80％生存力的平均值(水平虚线)表明细胞不再存活。
[0499]
thp-1细胞的wst-1细胞活力测定显示lps(分别为1ug/ml和100ng/ml)、dex和indo的浓度不诱导细胞死亡。在thp-1细胞中，3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶的浓度都没有诱导细胞死亡(图27)。我们确信由3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶引起的cox-2蛋白表达的任何显著降低可能是与cox-2相互作用而不是细胞损失的结果。
[0500]
thp-1细胞中的cox-2蛋白表达
[0501]
用不同剂量的3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶、地塞米松或吲哚美辛与lps共处理的thp-1单核细胞中cox-2的蛋白质表达通过蛋白质印迹半定量地测量。
[0502]
表7-在thp-1细胞中的cox-2蛋白表达
[0503][0504]
表7：在暴露于lps和用地塞米松、吲哚美辛或3,6,7-三甲基二氧四氢蝶啶共处理
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