蛋白质颗粒

本发明涉及一种蛋白质颗粒，包含所述蛋白质颗粒的细胞和组合物、一种能够产生工程化蛋白质颗粒的细胞的制备方法、一种分离所述蛋白质颗粒的方法、所述蛋白质颗粒在药物中的用途以及一种利用所述蛋白质颗粒进行治疗的方法。

背景技术：

1、利用检查点阻断、肿瘤浸润淋巴细胞或car-t细胞的癌症免疫疗法对特定的癌症亚型产生了重大影响，但免疫疗法对脑癌(特别是胶质母细胞瘤)、食管癌、卵巢癌和胰腺癌等都未成功。与治疗这些和其他类型的癌症相关的挑战包括效应细胞进入肿瘤和免疫抑制肿瘤微环境(tme)。胶质母细胞瘤是一种特别具有挑战性的疾病，并且由于肿瘤位于常规免疫疗法或细胞无法很好地进入的免疫特权部位而具有有限的治疗选择方案。因此，需要能够克服这些挑战的替代免疫疗法。

技术实现思路

1、因此，根据本发明的第一方面，提供了一种分离的蛋白质颗粒，其包含穿孔素和/或颗粒酶的核心；所述核心被糖蛋白外壳包裹，所述糖蛋白外壳包含血小板反应蛋白-1(tsp-1)或其片段其变体或其直系同源物。

2、根据本发明的另一个方面，提供了一种工程化蛋白质颗粒，其包含具有穿孔素和/或颗粒酶的核心；所述核心被糖蛋白外壳包裹，所述糖蛋白外壳包含血小板反应蛋白或其片段或其变体或其直系同源物；其中，所述颗粒酶和/或血小板反应蛋白是基因修饰的。

3、目前已经发现，各种细胞类型的激活，特别是t淋巴细胞或自然杀伤(nk)细胞，导致蛋白质颗粒，本文也称为超分子攻击颗粒，(smaps)的释放，其不同于先前从这些细胞的细胞外释放中观察到的脂类形成的外泌体。蛋白质颗粒能够与局部靶细胞结合。一旦结合，smaps通常从其核心释放至少一个颗粒酶(即颗粒酶a、b、h、m或k)和一个孔形成蛋白(穿孔素)。酶和孔形成蛋白对其靶细胞(即它们结合的细胞)具有细胞毒性。这最终导致smap-结合细胞的死亡。因此，本发明的smap可被用于通过杀死与病症相关的适当细胞来治疗或治愈各种疾病或病症。例如，smap可能被用于通过杀死恶性肿瘤细胞(例如胶质母细胞瘤)来治疗癌症；或者其可能被用于通过杀死感染细胞来治疗细菌或病毒感染；或者其可能被用于通过直接杀死细菌来用于治疗细菌感染。本发明的smap也是具有优势的，因为与传统的生物制剂和细胞疗法不同，其不易受恶劣的细胞外环境(例如肿瘤的免疫抑制微环境)的影响，因此非常稳定。

4、所述颗粒可以保持细胞外稳定(即不降解/崩解)，例如至少1、2、5、12、24或48小时，或超过1天。所述颗粒可以保持细胞外稳定1-5小时或更长时间。所述颗粒可以保持细胞外稳定至少72小时。所述颗粒可以保持细胞外稳定1-5天或更长时间。

5、本发明第二方面的蛋白质颗粒可以被工程化成与任何球状多肽形成融合多肽。本发明第二方面的蛋白质颗粒可以被工程化以形成融合多肽，例如与特异性识别在目标靶细胞上表达的蛋白质(例如受体)的配体(例如靶向肽)。因此，配体使蛋白质颗粒对疾病或病症的细胞具有特异性，并且可以减少/防止可能与使用天然(即非工程)蛋白质颗粒相关的潜在脱靶效应。在一种实施方式中，所述融合多肽包括融合到异源多肽上的血小板反应蛋白。

6、所述蛋白质颗粒可以具有小于500nm的直径，例如约1nm至500nm。因此，颗粒可以是球状的。例如，所述蛋白质颗粒的直径可以小于约500nm、小于约400nm、小于约300nm、小于约200nm或小于约150nm、或小于约100nm。所述蛋白质颗粒的直径可以为约80nm至约500nm，或约90nm至约400nm，或约100nm至约300nm，或约50nm至约200nm，或约50nm至约180nm，或约70nm至约180nm，或约70nm至约170nm，或约70nm至约150nm，或约70nm至约140nm，或约90nm至约150nm，或约90nm至约140nm，或约100nm至约130nm，或约110nm至约130nm。在一种实施方式中，所述蛋白质颗粒的直径可为约120nm。所述蛋白质颗粒的直径可以不大于约200nm。优选地，所述蛋白质颗粒不具有大于约150nm的直径。在进一步优选的实施方式中，所述蛋白质颗粒的直径在约50nm和约150nm之间。在一种实施方式中，其中存在多个蛋白质颗粒，例如在组合物或种群中，本文讨论的蛋白质颗粒的尺寸是指在种群/组合物中的蛋白质颗粒平均尺寸。

7、本发明的蛋白质颗粒可以是分离的蛋白质颗粒，术语“分离的”可以指已经从细胞(诸如nk细胞和t细胞)和细胞结构中分离的蛋白质颗粒，包括外泌体和磷脂质膜。所述蛋白质颗粒可以是细胞外颗粒。在一种实施方式中，所述蛋白质颗粒是从细胞外血浆中获取的。所述蛋白质颗粒可能不是细胞内颗粒和/或可能不是从细胞内血浆中获取的。

8、本发明的蛋白质颗粒可以是工程化的蛋白质颗粒。本发明的蛋白质颗粒可以是工程化和分离的蛋白质颗粒。所述蛋白质颗粒可以在约10％至约100％的纯度范围内起作用。因此，本发明的蛋白质颗粒或组合物的纯度可以是约10％至约100％、约20％至约100％、约30％至约100％、约40％至约100％、约50％至约100％、约60％至约100％、约70％至约100％、约80％至约100％或约90％至约100％。在一种实施方式中，所述蛋白质颗粒被分离至至少约90％的纯度；优选地，所述蛋白质颗粒或蛋白质颗粒的组合物基本上是纯的。然而，在一些实施方式中，所述蛋白质颗粒组合物中可能存在少量杂质，例如外泌体。可能存在少于30％的外泌体。优选地，存在少于20％或更优选为少于10％的外泌体。所述分离的蛋白质颗粒可能不含细胞。

9、蛋白质颗粒的核心可能包含颗粒酶。颗粒酶是指细胞毒性丝氨酸蛋白酶的家族，其能够裂解细胞外和细胞内的蛋白质。颗粒酶存在于淋巴细胞(特别是细胞毒性t细胞和自然杀伤(nk)细胞)的分泌溶酶体中。它们通过细胞外泌被释放，但通常必须进入靶细胞的细胞质以裂解细胞内蛋白质并诱导细胞死亡。

10、在人类中，颗粒酶家族有五个成员，它们被称为颗粒酶a、b、h、m和k。人类颗粒酶a、b、h、m和k能够诱导细胞死亡。颗粒酶a以线粒体依赖性方式诱导靶细胞死亡。颗粒酶a前体的多肽序列长为262个氨基酸，在本文中由seq id no.1提供，如下所示。

11、

12、seq id no.1中粗体的氨基酸对应信号肽。seq id no.1中下划线的氨基酸对应颗粒酶a前肽的氨基酸，氨基酸29至262对应颗粒酶a的多肽链。

13、在所有颗粒酶中，颗粒酶b是最具特征性的。它诱导靶细胞的程序性细胞死亡(细胞凋亡)。细胞凋亡是通过激活线粒体/半胱天冬酶依赖性和半胱天冬酶非依赖性途径来实现的。颗粒酶b还诱导靶细胞的失巢凋亡(由于缺乏细胞外接触而死亡)。颗粒酶b前体的多肽序列长为247个氨基酸，在本文中由seq id no.2提供，如下所示。

14、

15、seq id no.2中粗体的氨基酸对应信号肽。seq id no.2中下划线的氨基酸对应颗粒酶b前肽的氨基酸，氨基酸21至247对应颗粒酶b的多肽链。

16、颗粒酶h引起靶细胞的半胱天冬酶非依赖性杀伤。颗粒酶h前体的多肽序列长为246个氨基酸，在本文中由seq id no.3提供，如下所示：

17、

18、seq id no.3中粗体的氨基酸对应信号肽。seq id no.3下划线的氨基酸对应颗粒酶h前肽的氨基酸，氨基酸21-246对应颗粒酶h的多肽链。

19、颗粒酶m以半胱天冬酶和线粒体依赖性途径诱导细胞死亡，颗粒酶m前体的多肽序列长为257个氨基酸，在本文中由seq id no.4提供，如下所示。

20、

21、seq id no.4中粗体的氨基酸对应信号肽。seq id no.4中下划线的氨基酸对应颗粒酶m前肽的氨基酸。氨基酸26至257对应颗粒酶m的多肽链。

22、颗粒酶k已被证明是nk细胞杀死t淋巴细胞所需的。颗粒酶k前体的多肽序列长为264个氨基酸，在本文由seq id no.5提供，如下所示。

23、

24、seq id no.5中粗体的氨基酸对应信号肽。seq id no.5中下划线的氨基酸对应颗粒酶k前肽的氨基酸。氨基酸27至264对应颗粒酶k的多肽链。

25、因此，所述蛋白质颗粒的颗粒酶可能包含颗粒酶a、b、h、m和/或k，或其变体或片段或直系同源物。此外，所述蛋白质颗粒的颗粒酶可能包含基本如seq id no.1、2、3、4和/或5或其变体或片段或直系同源物的多肽链所示的多肽序列。所述蛋白质颗粒的颗粒酶可能包含基本如seq id no.1、2、3、4和/或5或其变体或片段或直系同源物的多肽链中所示的成熟(即非前体)多肽序列。优选地，所述蛋白质颗粒的颗粒酶包括所述颗粒酶b的多肽链。优选地，所述蛋白质颗粒的颗粒酶包含基本如seq id no.2的多肽链所示的多肽序列。

26、尽管颗粒酶能够通过裂解细胞内蛋白质来诱导细胞死亡，但它们可能需要其他酶的辅助才能获得细胞内通路。穿孔素就是这样一种酶。穿孔素促进颗粒酶进入靶细胞的细胞质。穿孔素低聚以在靶细胞的质膜中形成孔/通道。该通道能够将离子、水、小分子物质和蛋白质(如颗粒酶)自由、非选择性、被动地转运到靶细胞中，从而导致质膜的破坏及其它提供的保护作用。穿孔素也可能触发靶细胞中发生反应，引发靶细胞将颗粒酶内吞，然后含有颗粒酶的核内体在细胞内破裂一次，将颗粒酶释放到细胞质中，在那里它们可以诱导靶细胞死亡。

27、在一种实施方式中，人类穿孔素单体的氨基酸序列，在本文由seq id no.6提供，如下所示。

28、maarllllgilllllplpvpapchtaarseckrshkfvpgawlagegvdvtslrrsgsfpvdtqrflrpdgtctlcenalqegtlqrlplaltnwraqgsgcqrhvtrakvssteavardaarsirndwkvgldvtpkptsnvhvsvagshsqaanfaaqkthqdqysfstdtvecrfysfhvvhtpplhpdfkralgdlphhfnastqpaylrlisnygthfiravelggrisaltalrtcelalegltdnevedcltveaqvnigihgsisaeakaceekkkkhkmtasfhqtyrerhsevvgghhtsindllfgiqagpeqysawvnslpgspglvdytleplhvlldsqdprrealrralsqyltdrarwrdcsrpcppgrqksprdpcqcvchgsavttqdccprqrglaqlevtfiqawglwgdwftatdayvklffggqelrtstvwdnnnpiwsvrldfgdvllatggplrlqvwdqdsgrdddllgtcdqapksgshevrcnlnhghlkfryharclphlgggtcldyvpqmllgeppgnrsgavw

29、[seq id no.6]

30、所述蛋白质颗粒的穿孔素可能是其变体或其片段或其直系同源物，其能够在靶细胞的质膜中形成孔/通道。此外，所述穿孔素可能包含基本上如seq id no.6或其变体或其片段或其直系同源物所示的多肽序列。

31、所述核心是指蛋白质颗粒的内部，它被糖蛋白外壳包裹。在一种实施方式中，所述核心包括穿孔素和颗粒酶或由穿孔素和颗粒酶组成。所述核心包括穿孔素和/或颗粒酶(例如颗粒酶b)，但还可以包含其他蛋白质(例如ifnγ，ccl5，xcl2，丝甘蛋白(srgn))。

32、蛋白聚糖，如丝甘蛋白(一种附有带负电荷的糖胺聚糖长链的短多肽)，改善细胞毒性t细胞和nk细胞中颗粒酶和穿孔素的稳定性和保留性。蛋白质颗粒可能需要也可能不需要丝甘蛋白来杀死靶细胞。因此，核心可进一步包含与颗粒酶和/或穿孔素复合的丝甘蛋白。颗粒酶和/或穿孔素可能与其他带负电荷的蛋白质(丝甘蛋白除外)形成复合物。此外，丝甘蛋白是可以使由颗粒酶和/或穿孔素与蛋白质颗粒核心内的其他酶形成的复合物稳定。

33、所述蛋白质颗粒的外壳具有多种功能。例如，糖蛋白外壳选择性地保护所述核心的内容物免受细胞外环境的影响。因此，当蛋白质颗粒在细胞外被释放时，外壳可以改善并保持核心稳定。所述外壳可以充当所述核心的载体。所述外壳可以保持核心聚集并防止核心的内容物的释放直至所述蛋白质颗粒到达靶细胞。所述外壳为几种蛋白质提供了驻留的表面(例如tsp-1)。所述糖蛋白外壳可能具有比核心更高的有机物质密度。所述外壳可能是非均匀的碳致密外壳(与具有均匀脂质和基于限制膜的跨膜糖蛋白的外泌体不同)。

34、所述蛋白质颗粒可能不包含外质膜或磷脂/胆固醇膜。所述蛋白质颗粒的糖蛋白外壳可能不是质膜或磷脂/胆固醇膜。因此，所述糖蛋白外壳可能不包含跨膜糖蛋白(例如cd45、cd81、t细胞抗原受体和主要组织相容性复合蛋白)，或分泌型溶酶体跨膜糖蛋白或“脱颗粒标志物”(例如cd57或cd107a)。在一种实施方式中，所述糖蛋白外壳可能不包含cd47、icam-1和/或其细胞外片段。所述外壳可进一步包含其它蛋白质，例如半乳糖凝集素-1、半乳糖凝集素-7或血小板反应蛋白-4(tsp-4)中的一种或多种。

35、所述外壳可能是多孔的。孔的直径至多约为13nm(基于igg的流体动力学直径)。孔可能是动态的和选择性的。外壳中的孔使igg型抗体能够在核心内与穿孔素和颗粒酶结合，而无需使用洗涤剂、孔形成剂，如皂苷，或蛋白酶。

36、tsp-1是一种黏附蛋白，其引起细胞对细胞的相互作用和细胞对ecm(细胞外基质)的相互作用，可能通过与icam-1，cd47和/或中间蛋白结合。因此，tsp-1引起所述蛋白质颗粒与靶细胞或细胞外基质蛋白的结合。tsp-1属于被称为血小板反应蛋白的糖蛋白家族。血小板反应蛋白家族成员包括tsp-1、血小板反应蛋白-2(tsp-2)、血小板反应蛋白-3(tsp-3)、tsp-4和血小板反应蛋白-5(tsp-5)。血小板反应蛋白的签名领域位于c末端，包含ca2+结合“线型”领域(也称为3型重复序列)和凝集素类“球状”领域。

37、在本发明的蛋白质颗粒中的血小板反应蛋白具有若干功能。例如，tsp-1有助于诱导靶细胞死亡，需要释放蛋白质颗粒中的颗粒酶和/或穿孔素，并且一旦蛋白质颗粒在细胞外释放，它就会稳定蛋白质颗粒。

38、在人类中，tsp-1由基因thbsj编码。本文提及的编码血小板反应蛋白-1的一种实施方式的基因组dna序列(内含子和外显子)为seq id no.7，可以在基因id：7057中找到。

39、(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene？db＝gene&cmd＝detailssearch&term＝7057)

40、编码thbsj的一种实施方式的cdna序列(仅外显子)，在本文中由seq id no.8提供，如下所示。

41、ggacgcacaggcattccccgcgcccctccagccctcgccgccctcgccaccgctcccggccgccgcgctccggtacacacaggatccctgctgggcaccaacagctccaccatggggctggcctggggactaggcgtcctgttcctgatgcatgtgtgtggcaccaaccgcattccagagtctggcggagacaacagcgtgtttgacatctttgaactcaccggggccgcccgcaaggggtctgggcgccgactggtgaagggccccgacccttccagcccagctttccgcatcgaggatgccaacctgatcccccctgtgcctgatgacaagttccaagacctggtggatgctgtgcgggcagaaaagggtttcctccttctggcatccctgaggcagatgaagaagacccggggcacgctgctggccctggagcggaaagaccactctggccaggtcttcagcgtggtgtccaatggcaaggcgggcaccctggacctcagcctgaccgtccaaggaaagcagcacgtggtgtctgtggaagaagctctcctggcaaccggccagtggaagagcatcaccctgtttgtgcaggaagacagggcccagctgtacatcgactgtgaaaagatggagaatgctgagttggacgtccccatccaaagcgtcttcaccagagacctggccagcatcgccagactccgcatcgcaaaggggggcgtcaatgacaatttccagggggtgctgcagaatgtgaggtttgtctttggaaccacaccagaagacatcctcaggaacaaaggctgctccagctctaccagtgtcctcctcacccttgacaacaacgtggtgaatggttccagccctgccatccgcactaactacattggccacaagacaaaggacttgcaagccatctgcggcatctcctgtgatgagctgtccagcatggtcctggaactcaggggcctgcgcaccattgtgaccacgctgcaggacagcatccgcaaagtgactgaagagaacaaagagttggccaatgagctgaggcggcctcccctatgctatcacaacggagttcagtacagaaataacgaggaatggactgttgatagctgcactgagtgtcactgtcagaactcagttaccatctgcaaaaaggtgtcctgccccatcatgccctgctccaatgccacagttcctgatggagaatgctgtcctcgctgttggcccagcgactctgcggacgatggctggtctccatggtccgagtggacctcctgttctacgagctgtggcaatggaattcagcagcgcggccgctcctgcgatagcctcaacaaccgatgtgagggctcctcggtccagacacggacctgccacattcaggagtgtgacaaaagatttaaacaggatggtggctggagccactggtccccgtggtcatcttgttctgtgacatgtggtgatggtgtgatcacaaggatccggctctgcaactctcccagcccccagatgaatgggaaaccctgtgaaggcgaagcgcgggagaccaaagcctgcaagaaagacgcctgccccatcaatggaggctggggtccttggtcaccatgggacatctgttctgtcacctgtggaggaggggtacagaaacgtagtcgtctctgcaacaaccccgcaccccagtttggaggcaaggactgcgttggtgatgtaacagaaaaccagatctgcaacaagcaggactgtccaattgatggatgcctgtccaatccctgctttgccggcgtgaagtgtactagctaccctgatggcagctggaaatgtggtgcttgtccccctggttacagtggaaatggcatccagtgcacagatgttgatgagtgcaaagaagtgcctgatgcctgcttcaaccacaatggagagcaccggtgtgagaacacggaccccggctacaactgcctgccctgccccccacgcttcaccggctcacagcccttcggccagggtgtcgaacatgccacggccaacaaacaggtgtgcaagccccgtaacccctgcacggatgggacccacgactgcaacaagaacgccaagtgcaactacctgggccactatagcgaccccatgtaccgctgcgagtgcaagcctggctacgctggcaatggcatcatctgcggggaggacacagacctggatggctggcccaatgagaacctggtgtgcgtggccaatgcgacttaccactgcaaaaaggataattgccccaaccttcccaactcagggcaggaagactatgacaaggatggaattggtgatgcctgtgatgatgacgatgacaatgataaaattccagatgacagggacaactgtccattccattacaacccagctcagtatgactatgacagagatgatgtgggagaccgctgtgacaactgtccctacaaccacaacccagatcaggcagacacagacaacaatggggaaggagacgcctgtgctgcagacattgatggagacggtatcctcaatgaacgggacaactgccagtacgtctacaatgtggaccagagagacactgatatggatggggttggagatcagtgtgacaattgccccttggaacacaatccggatcagctggactctgactcagaccgcattggagatacctgtgacaacaatcaggatattgatgaagatggccaccagaacaatctggacaactgtccctatgtgcccaatgccaaccaggctgaccatgacaaagatggcaagggagatgcctgtgaccacgatgatgacaacgatggcattcctgatgacaaggacaactgcagactcgtgcccaatcccgaccagaaggactctgacggcgatggtcgaggtgatgcctgcaaagatgattttgaccatgacagtgtgccagacatcgatgacatctgtcctgagaatgttgacatcagtgagaccgatttccgccgattccagatgattcctctggaccccaaagggacatcccaaaatgaccctaactgggttgtacgccatcagggtaaagaactcgtccagactgtcaactgtgatcctggactcgctgtaggttatgatgagtttaatgctgtggacttcagtggcaccttcttcatcaacaccgaaagggacgatgactatgctggatttgtctttggctaccagtccagcagccgcttttatgttgtgatgtggaagcaagtcacccagtcctactgggacaccaaccccacgagggctcagggatactcgggcctttctgtgaaagttgtaaactccaccacagggcctggcgagcacctgcggaacgccctgtggcacacaggaaacacccctggccaggtgcgcaccctgtggcatgaccctcgtcacataggctggaaagatttcaccgcctacagatggcgtctcagccacaggccaaagacgggtttcattagagtggtgatgtatgaagggaagaaaatcatggctgactcaggacccatctatgataaaacctatgctggtggtagactagggttgtttgtcttctctcaagaaatggtgttcttctctgacctgaaatacgaatgtagagatccctaatcatcaaattgttgattgaaagactgatcataaaccaatgctggtattgcaccttctggaactatgggcttgagaaaacccccaggatcacttctccttggcttccttcttttctgtgcttgcatcagtgtggactcctagaacgtgcgacctgcctcaagaaaatgcagttttcaaaaacagactcatcagcattcagcctccaatgaataagacatcttccaagcatataaacaattgctttggtttccttttgaaaaagcatctacttgcttcagttgggaaggtgcccattccactctgcctttgtcacagagcagggtgctattgtgaggccatctctgagcagtggactcaaaagcattttcaggcatgtcagagaagggaggactcactagaattagcaaacaaaaccaccctgacatcctccttcaggaacacggggagcagaggccaaagcactaaggggagggcgcatacccgagacgattgtatgaagaaaatatggaggaactgttacatgttcggtactaagtcattttcaggggattgaaagactattgctggatttcatgatgctgactggcgttagctgattaacccatgtaaataggcacttaaatagaagcaggaaagggagacaaagactggcttctggacttcctccctgatccccacccttactcatcaccttgcagtggccagaattagggaatcagaatcaaaccagtgtaaggcagtgctggctgccattgcctggtcacattgaaattggtggcttcattctagatgtagcttgtgcagatgtagcaggaaaataggaaaacctaccatctcagtgagcaccagctgcctcccaaaggaggggcagccgtgcttatatttttatggttacaatggcacaaaattattatcaacctaactaaaacattccttttctcttttttccgtaattactaggtagttttctaattctctcttttggaagtatgatttttttaaagtctttacgatgtaaaatatttattttttacttattctggaagatctggctgaaggattattcatggaacaggaagaagcgtaaagactatccatgtcatctttgttgagagtcttcgtgactgtaagattgtaaatacagattatttattaactctgttctgcctggaaatttaggcttcatacggaaagtgtttgagagcaagtagttgacatttatcagcaaatctcttgcaagaacagcacaaggaaaatcagtctaataagctgctctgccccttgtgctcagagtggatgttatgggattccttttttctctgttttatcttttcaagtggaattagttggttatccatttgcaaatgttttaa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42、[seq id no.8]

43、血小板反应蛋白-1的多肽序列在本文中由seq id no.9提供，如下所示。

44、

45、

46、因此，编码tsp-1多肽的编码序列可能包含基本上如任一seq id no.7或seq idno.8或其变体或其片段或其直系同源物中所示的核酸序列。所述蛋白质颗粒的tsp-1可能包含基本上如seq id no.9或其变体或其片段或其直系同源物中所示的多肽序列。血小板反应蛋白的变体或片段(例如tsp-1和/或tsp-4)可能是不能与cd47结合的氨基酸序列。

47、不能与cd47结合的tsp-1变体可能在负责tsp-1与cd47结合能力的八种氨基酸的选择中发生突变。负责tsp-1与cd47结合能力的八种氨基酸在seq id no.9中以粗体标出(例如rfyvvmwk(seq id no:35)，其对应4n-l肽的序列)。氨基酸rfyvvmwk(seq id no：35)的突变仍将允许tsp-1正确折叠并掺入本发明的所述蛋白质颗粒中。因此，tsp-1的变体可能包含4n-l的突变体或由4n-l的突变体组成。

48、tsp-1包含ca2+结合重复序列，其包括seq id no.9的氨基酸691至954。(参见seqid no.9的带下划线的氨基酸对应tsp-1的ca2+结合重复序列)。因此，tsp-1的片段可能包含seq id no.9的氨基酸691至1170。tsp-1的片段可能包含tsp-1的n-末端或c-末端区域。优选地，tsp-1的n-末端或c-末端区域包含tsp-1的ca2+结合重复序列。tsp-1的n-末端区域可能包含seq id no.9的氨基酸19至270、19至373、19至547或19至690。tsp-1的c-末端区域可能包含seq id no.9的氨基酸547至1170、646至1170、691至1170或727至1170。所述蛋白质颗粒的tsp-1可能包含或由seq id no.25和27至30中任一项的tsp-1氨基酸序列组成。

49、本发明的蛋白质颗粒的外壳还可能包含血小板反应蛋白家族的其它成员，例如tsp-2、tsp-3、tsp-4和/或tsp-5。优选地，本发明的蛋白质颗粒的外壳还包括tsp-4。

50、在人类中，血小板反应蛋白-4由基因thbs4编码。因此，本文提及的编码血小板反应蛋白-4的一种实施方式的基因组dna序列(内含子和外显子)为seq id no.10，并且可以在基因id：7060中找到。

51、(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene？db＝gene&cmd＝detailssearch&term＝7060)

52、编码thbs4的一种实施方式的cdna序列(仅外显子)，在本文由seq id no.11提供，如下所示。

53、ctggtccgtccaggctccttcccatcctcacacccgcgcctttctccctgcggccccggctcgctgctccagctgcccagctcttcccccgcccggccgcaccataaagcgcccggccgctgccgcggagcccagcagccagctccccagcaccgcgcggcggggacgcgagcgcgcccccgacggcagcccggacgccgagcacgggtcacctgcggcgccggcccgggcgccgaccgaggttcaacgcacggcccggggacccccaggcggggccaacgccgccgtcgcccccggcctcgcggggagcaggaagagccaacatgctggccccgcgcggagccgccgtcctcctgctgcacctggtcctgcagcggtggctagcggcaggcgcccaggccaccccccaggtctttgaccttctcccatcttccagtcagaggctaaacccaggcgctctgctgccagtcctgacagaccccgccctgaatgatctctatgtgatttccaccttcaagctgcagactaaaagttcagccaccatcttcggtctttactcttcaactgacaacagtaaatattttgaatttactgtgatgggacgcttaaacaaagccatcctccgttacctgaagaacgatgggaaggtgcatttggtggttttcaacaacctgcagctggcagacggaaggcggcacaggatcctcctgaggctgagcaatttgcagcgaggggccggctccctagagctctacctggactgcatccaggtggattccgttcacaatctccccagggcctttgctggcccctcccagaaacctgagaccattgaattgaggactttccagaggaagccacaggacttcttggaagagctgaagctggtggtgagaggctcactgttccaggtggccagcctgcaagactgcttcctgcagcagagtgagccactggctgccacaggcacaggggactttaaccggcagttcttgggtcaaatgacacaattaaaccaactcctgggagaggtgaaggaccttctgagacagcaggttaaggaaacatcatttttgcgaaacaccatagctgaatgccaggcttgcggtcctctcaagtttcagtctccgaccccaagcacggtggtgcccccggctccccctgcaccgccaacacgcccacctcgtcggtgtgactccaacccatgtttccgaggtgtccaatgtaccgacagtagagatggcttccagtgtgggccctgccccgagggctacacaggaaacgggatcacctgtattgatgttgatgagtgcaaataccatccctgctacccgggcgtgcactgcataaatttgtctcctggcttcagatgtgacgcctgcccagtgggcttcacagggcccatggtgcagggtgttgggatcagttttgccaagtcaaacaagcaggtctgcactgacattgatgagtgtcgaaatggagcgtgcgttcccaactcgatctgcgttaatactttgggatcttaccgctgtgggccttgtaagccggggtatactggtgatcagataaggggatgcaaagcggaaagaaactgcagaaacccagagctgaacccttgcagtgtgaatgcccagtgcattgaagagaggcagggggatgtgacatgtgtgtgtggagtcggttgggctggagatggctatatctgtggaaaggatgtggacatcgacagttaccccgacgaagaactgccatgctctgccaggaactgtaaaaaggacaactgcaaatatgtgccaaattctggccaagaagatgcagacagagatggcattggcgacgcttgtgacgaggatgctgacggagatgggatcctgaatgagcaggataactgtgtcctgattcataatgtggaccaaaggaacagcgataaagatatctttggggatgcctgtgataactgcctgagtgtcttaaataacgaccagaaagacaccgatggggatggaagaggagatgcctgtgatgatgacatggatggagatggaataaaaaacattctggacaactgcccaaaatttcccaatcgtgaccaacgggacaaggatggtgatggtgtgggggatgcctgtgacagttgtcctgatgtcagcaaccctaaccagtctgatgtggataatgatctggttggggactcctgtgacaccaatcaggacagtgatggagatgggcaccaggacagcacagacaactgccccaccgtcattaacagtgcccagctggacaccgataaggatggaattggtgacgagtgtgatgatgatgatgacaatgatggtatcccagacctggtgccccctggaccagacaactgccggctggtccccaacccagcccaggaggatagcaacagcgacggagtgggagacatctgtgagtctgactttgaccaggaccaggtcatcgatcggatcgacgtctgcccagagaacgcagaggtcaccctgaccgacttcagggcttaccagaccgtggtcctggatcctgaaggggatgcccagatcgatcccaactgggtggtcctgaaccagggcatggagattgtacagaccatgaacagtgatcctggcctggcagtggggtacacagcttttaatggagttgacttcgaagggaccttccatgtgaatacccagacagatgatgactatgcaggctttatctttggctaccaagatagctccagcttctacgtggtcatgtggaagcagacggagcagacatattggcaagccaccccattccgagcagttgcagaacctggcattcagctcaaggctgtgaagtctaagacaggtccaggggagcatctccggaactccctgtggcacacgggggacaccagtgaccaggtcaggctgctgtggaaggactccaggaatgtgggctggaaggacaaggtgtcctaccgctggttcctacagcacaggccccaggtgggctacatcagggtacgattttatgaaggctctgagttggtggctgactctggcgtcaccatagacaccacaatgcgtggaggccgacttggcgttttctgcttctctcaagaaaacatcatctggtccaacctcaagtatcgctgcaatgacaccatccctgaggacttccaagagtttcaaacccagaatttcgaccgcttcgataattaaaccaaggaagcaatctgtaactgcttttcggaacactaaaaccatatatattttaacttcaattttctttagcttttaccaacccaaatatatcaaaacgttttatgtgaatgtggcaataaaggagaagagatcatttttaaaaaaaaaaaaaaa

54、[seq id no.11]

55、血小板反应蛋白-4的多肽序列，在本文由seq id no.12提供，如下所示。

56、mlaprgaavlllhlvlqrwlaagaqatpqvfdllpsssqrlnpgallpvltdpalndlyvistfklqtkssatifglysstdnskyfeftvmgrlnkailrylkndgkvhlvvfnnlqladgrrhrillrlsnlqrgagslelyldciqvdsvhnlprafagpsqkpetielrtfqrkpqdfleelklvvrgslfqvaslqdcflqqseplaatgtgdfnrqflgqmtqlnqllgevkdllrqqvketsflrntiaecqacgplkfqsptpstvvppappapptrpprrcdsnpcfrgvqctdsrdgfqcgpcpegytgngitcidvdeckyhpcypgvhcinlspgfrcdacpvgftgpmvqgvgisfaksnkqvctdidecrngacvpnsicvntlgsyrcgpckpgytgdqirgckaerncrnpelnpcsvnaqcieerqgdvtcvcgvgwagdgyicgkdvdidsypdeelpcsarnckkdnckyvpnsgqedadrdgigdacdedadgdgilneqdncvlihnvdqrnsdkdifgdacdnclsvlnndqkdtdgdgrgdacdddmdgdgiknildncpkfpnrdqrdkdgdgvgdacdscpdvsnpnqsdvdndlvgdscdtnqdsdgdghqdstdncptvinsaqldtdkdgigdecdddddndgipdlvppgpdncrlvpnpaqedsnsdgvgdicesdfdqdqvidridvcpenaevtltdfrayqtvvldpegdaqidpnwvvlnqgmeivqtmnsdpglavgytafngvdfegtfhvntqtdddyagfifgyqdsssfyvvmwkqteqtywqatpfravaepgiqlkavksktgpgehlrnslwhtgdtsdqvrllwkdsrnvgwkdkvsyrwflqhrpqvgyirvrfyegselvadsgvtidttmrggrlgvfcfsqeniiwsnlkyrcndtipedfqefqtqnfdrfdn

57、[seq id no.12]

58、因此，编码tsp-4多肽的编码序列可能包含基本如任一seq id no.10或seq idno.11或其变体或其片段或其直系同源物中所示的核酸序列。

59、tsp-4包含ca2+结合重复序列，其中包括seq id no.12的氨基酸463至727(参见seqid no.12中带下划线的氨基酸对应tsp-4的ca2+结合重复序列)。因此，tsp-4的片段可能包含seq id no.12的氨基酸463至727。tsp-4的片段可能包含tsp-4的n-末端或c-末端区域。优选地，tsp-4的片段包含tsp-4的n-末端或c-末端区域。优选地，tsp-4的n-区片段或c-末端区包含tsp-4的ca2+结合重复序列。tsp-4的n-末端区域可能包含seq id no.12的氨基酸27至192、27至325、27至363、27至419或27至462。tsp-4的c-末端区域包括seq id no.12的氨基酸420至945、463至945或496至945。

60、因此，本发明的蛋白质颗粒的外壳还可能包含tsp-2、tsp-3、tsp-4和/或tsp-5。优选地，根据本发明的蛋白质颗粒的外壳还包括基本上如seq id no.12或其变体或其片段或其直系同源物中所示的氨基酸序列。

61、本发明的蛋白质颗粒的外壳还可能包含半乳糖凝集素。半乳糖凝集素是β-半乳糖结合蛋白家族，可介导细胞间相互作用和细胞间ecm(细胞外基质)相互作用。家族中有几个成员，其中两个是半乳糖凝集素-1和半乳糖凝集素-7。

62、人类半乳糖凝集素-1由基因lgalsj编码。因此，在一种实施方式中，编码半乳糖凝集素-1的一种实施方式的基因组dna序列(内含子和外显子)在本文中由seq id no.13提供，如下所示。

63、atctctctcgggtggagtcttctgacagctggtgcgcctgcccgggaacatcctcctggactcaatcatggcttgtgtgagtgtggggacccccccccaaggtccaggggatagggcaggaactgatggccagaggagagctgggcagatcgggagcagattctagccccagctgtgtggcctggaaccagtgccttctcttttctggacctcagtggccacatctgtaaaatgggggtgggcgccatggtccctcaaggccttctctgcattgataattgtctggattcctccagggtctgaaagcacagttatttctgcccagggttgacattctgcagctctctgagaagtgagcgtgggaagggtgtggccaactgggggacacccaggccactatccctttccccctcctccaccccaaagagcctcctgtcccctcccccctgcagctgtcccggtcaccaggccagggcagagttaccctctgctccagagaacgctgaaaagttgccaggacccgagacaagctgcccaggatgggcccttctaggtcgggggtggagggtggttgtgtccaggctggtggcggggggggcgggggaaattcccttccaccacccccaagctgggaggttggggtggcagggaggtgagaatcttcctcgggccccagggaaagggttcaagtttctggcagaagaaaccactcaaaccagttaactcttgcccacccactcggggtgccagggaacagcagtgcccagcagtttgctcaatcttgttaaccctgagccagcccagccacagcccgactgcagggctattctccctaatgcagagaggccgtgtttttcagggtctcctctctagcccctgggcctctttgcagagaggggcttgaaggagaatagtggggtcgcccgcccctagccacttcctctccagcagaggggccggcccctccattcagtgtgacggtgggccaagtgtcggcccctccccagcctgatcctctccatctgcgatgggacagagcaccccatctcccaagtcactcttgagtccaaaattcccaagccaatctgcaaaatcttctagagcctgtcttctagaaccttcacgttacagactgaagccaaccccggtgggaatagggactttcccaggaccacatagacaatcggaggctggaaattacagctcaatcctttccccaggcttccccttggcttggtcagaggatgccgggcgggaacaaccccactcccacccccagccacccccggacacttcgagcagtggaggccttgtcctctaacccggctgggccggggcttgtctgtgcagggtctggtcgccagcaacctgaatctcaaacctggagagtgccttcgagtgcgaggcgaggtggctcctgacgctaagaggtgagaagtgaagtcggggtggtgggcggcagggacgggcttggtccagcagggagggcgtggccggccaagcccacatctcctccctggccgggagcgggttaacggccagccgccgatgctgcgttttctgggtgactcacttcccccgcagggtctgggcgcccccaccgttgccgccccctcccccgctccctccctgctgtagcctcttaaactaaaccagctgcagcctcgtcatctgtaataccttgactcccccgcccccacccctttccggtctgggcgggacctgtcgctggggagggcggggagaggagtggggcgggcgtcaccgccgccttccccctgagtccctccttcctgcgtctggtcattcattcattcactggctcagtccggtccttcttccttcacttctcattcactcagacggctgccttattttctcggcagttaggtgaccttggaccagtcaaccaacctcacctagcctcagtttgttagaaaaacaaggggggaggtggttgtgtggaggaagtgagatgcggctggcgcagtgacagtgaggaggatgaggatcagctgatattgttaagagccgcacacttctcatgcactaatttcatttcaaccaaaccctcagaggcaggtattgctattatcaccactcaacaaatgtatttattattttatttatttatttattattttattattttatttatttattttttgagacacagtctcaccctgtcgcccaggctggagtgcaatggcgtgatctcggctcaccacaacctccgcctcccgggttcaaacgattctccggcttcagcctcctgagtagccgggattacaggggcccaccacaacgcccagctaatttatgtacttttagtagagacggggtttcaccatgttggccaggctggtctcgaactcctgacctcatgatctgcccgctcgcctcggcctcccaaagtgctggggttacaggcatgagccaccgtgcccgggagtattattattattatttgttaattcgccccataattactaagcatctttttctggtgtgccccacttgtgctgggcaccgggaatacagagatgtacaagacaggacgggaggtcaccatctggagggagtcactgaccttgaccaaacgggctaggatgctaatgacttcaagaatcaagcgagccctcctgtgcagcccccattgtacagatgagcaaacaggggaagaggggcaggagcaggtggcatggccagagctagaatccaggtttcttgtctctgttagtgagttcttccagcaaggtgcgttcatgggatactgagtgacagattagtcggtcagtggggctggagctggccgaggtggcctcatgcccacccgttaccccccagcttcgtgctgaacctgggcaaagacagcaacaacctgtgcctgcacttcaaccctcgcttcaacgcccacggcgacgccaacaccatcgtgtgcaacagcaaggacggcggggcctgggggaccgagcagcgggaggctgtctttcccttccagcctggaagtgttgcagaggtgggctgcagaccggaaccggggaccagggacaggggctgggtgggctggggcggggctgggttagtgactagagaccttggccctgcctgctctttcccctccccttccctcccttcctgtgtgatggccagtgtctgcccctctttgaacctcagtggttgattacaataaaacgaaggggaaaaaaaaaggctgggcttggtggctcatgcctgtaatcccagcactttgggaggccgaggcgggcggatcacctgaggtcgggagttcgagaccagcctgaccaacatggagaaaccctgtctcgactaaaaatacaaaaaattagctaggcgtgatggcgcatgcctgtaatcccagctactcaggaggctgaggcaggagaattggttgaacccgggaggcggaggttgcagtgagccgagattgcaccactgcactccagcctggccaacaagagcaaaactctgtctcaaaaaaaaaaaaaaaaattagccagcgtgctggctcatgcctgtaatcctggcactttgggagaccaaagtgggtggatcacctgaggtcaggagttcgagaccagcctgaccaacatggtgaaaccccgtctctatataaatacaaaaattagctgggcgtggtggcacacaactgtagtcctagctactcaggaggctgagacaggagaatcacttgaacctgggaggcggaggttgcagtgagccgagattatgccactgtactccagcctgggcgacagaggagactccatctcaaaaaaaaaaaaaaatctatcataggattagagtaaaaagaaagaaaaaatattataaatgtacctccgcaggctcagccacaaactggggctgtgtcagggccacatgaggaacgggttctggaagggcccatggcatgtgggcccggctcactgctctcctctacccccaggtgtgcatcaccttcgaccaggccaacctgaccgtcaagctgccagatggatacgaattcaagttccccaaccgcctcaacctggaggccatcaactacatggcagctgacggtgacttcaagatcaaatgtgtggcctttgactgaaatcagccagcccatggcccccaataaaggcagctgcctctgctccctctgaa

64、[seq id no.13]

65、编码半乳糖凝集素-1的一种实施方式的cdna序列(仅外显子)在本文由seq idno.14提供，如下所示。

66、atctctctcgggtggagtcttctgacagctggtgcgcctgcccgggaacatcctcctggactcaatcatggcttgtggtctggtcgccagcaacctgaatctcaaacctggagagtgccttcgagtgcgaggcgaggtggctcctgacgctaagagcttcgtgctgaacctgggcaaagacagcaacaacctgtgcctgcacttcaaccctcgcttcaacgcccacggcgacgccaacaccatcgtgtgcaacagcaaggacggcggggcctgggggaccgagcagcgggaggctgtctttcccttccagcctggaagtgttgcagaggtgtgcatcaccttcgaccaggccaacctgaccgtcaagctgccagatggatacgaattcaagttccccaaccgcctcaacctggaggccatcaactacatggcagctgacggtgacttcaagatcaaatgtgtggcctttgactgaaatcagccagcccatggcccccaataaaggcagctgcctctgctccctctgaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa

67、[seq id no.14]

68、未成熟半乳糖凝集素-1的多肽序列在本文由seq id no.15提供，如下所示。

69、macglvasnlnlkpgeclrvrgevapdaksfvlnlgkdsnnlclhfnprfnahgdantivcnskdggawgteqreavfpfqpgsvaevcitfdqanltvklpdgyefkfpnrlnleainymaadgdfkikcvafd

70、[seq id no.15]

71、seq id no.15的2至135位氨基酸对应半乳糖凝集素-1的成熟多肽链。半乳糖凝集素-1包含2个构成活性β-半乳糖苷结合基序的不连续的序列，包括seq id no.15的第4-49位和第69-72位氨基酸。(seq id no.15中标有下划线的氨基酸对应具有活性的β-半乳糖苷结合基序)。因此，半乳糖凝集素-1的一个片段可能由seq id no.15的45-49和/或69-72位氨基酸组成。半乳糖凝集素-1的一个片段可能包含半乳糖凝集素-1的n-末端区域或c-末端区域。优选地，n-末端区域或c-末端区域包含活性β-半乳糖苷结合基序。

72、因此，编码半乳糖凝集素-1多肽的编码序列可能包含基本如seq id no.13或seqid no.14或其变体或其片段或其直系同源物中所示的核酸序列。蛋白质颗粒的半乳糖凝集素-1可能包含一个多肽序列，基本上如seq id no.15或其变体或其片段或其直系同源物中所示的成熟多肽链。

73、人类半乳糖凝集素-7由lgals7基因编码。编码半乳糖凝集素-7的一种实施方式的cdna序列(仅外显子)，在本文由seq id no.16提供，如下所示。

74、acggctgcccaacccggtcccagccatgtccaacgtcccccacaagtcctcactgcccgagggcatccgccctggcacggtgctgagaattcgcggcttggttcctcccaatgccagcaggttccatgtaaacctgctgtgcggggaggagcagggctccgatgccgcgctgcatttcaacccccggctggacacgtcggaggtggtcttcaacagcaaggagcaaggctcctggggccgcgaggagcgcgggccgggcgttcctttccagcgcgggcagcccttcgaggtgctcatcatcgcgtcagacgacggcttcaaggccgtggttggggacgcccagtaccaccacttccgccaccgcctgccgctggcgcgcgtgcgcctggtggaggtgggcggggacgtgcagctggactccgtgaggatcttctgagcagaagcccaggcgggcccggggccttggctggcaaataaagcgttagcccgcagcgaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaggccacatgtgc

75、[seq id no.16]

76、未成熟的半乳糖凝集素-7的多肽序列长度为136个氨基酸，本文由seq id no.17提供，如下所示。

77、msnvphksslpegirpgtvlrirglvppnasrfhvnllcgeeqgsdaalhfnprldtsevvfnskeqgswgreergpgvpfqrgqpfevliiasddgfkavvgdaqyhhfrhrlplarvrlvevggdvqldsvrif

78、[seq id no.17]

79、seq id no.17的6至136位氨基酸对应半乳糖凝集素-7的成熟多肽链。半乳糖凝集素-7包含一个活性β-半乳糖苷结合基序，其中包括seq id no.17的第70-76个氨基酸(seqid no.17中标有下划线的氨基酸对应活性β-半乳糖苷结合基序)。因此，半乳糖凝集素-7的片段可能包含seq id no.17的第70-76个氨基酸。半乳糖凝集素-7的片段可能包含半乳糖凝集素-1的n-末端区域或c-末端区域。优选地，n-末端区域或c-末端区域包含活性β-半乳糖苷结合基序。

80、因此，编码半乳糖凝集素-7多肽的编码序列可能包含基本如seq id no.16或其变体或其片段或其直系同源物中所示的核酸序列。蛋白质颗粒的半乳糖凝集素-7可能包含多肽序列，基本上如seq id no.17或其变体或其片段或其直系同源物中所示的成熟多肽链。

81、所述蛋白颗粒的核心可能进一步包括从ifnγ、ccl5和xcl2或其片段、变体或直系同源物所组成的组中选择的蛋白质。

82、研究人员发现，cd8+t细胞的蛋白质颗粒接触含有fasl的膜囊/磷脂颗粒。因此，蛋白质颗粒的糖蛋白外壳可能与含有fasl的囊泡/磷脂颗粒接触形成杂化颗粒。本发明的蛋白类颗粒可能附着在含有fasl的膜囊/磷脂颗粒上(通过蛋白质颗粒上的tsp-1和膜囊/磷脂颗粒上的cd47或icam-1)。所述杂化颗粒可能使用基于颗粒酶和/或穿孔素和fasl的机制杀死靶细胞。

83、fasl是一种跨膜蛋白，是tnf超家族的一部分。它是可以在靶细胞上找到的受体fas的配体。fas的激活导致靶细胞的凋亡。因此，通过fasl将杂化颗粒与靶细胞结合可能通过另一种机制诱导细胞死亡(即细胞凋亡)。

84、在一种实施方式中，fasl的多肽序列在本文由seq id no.18提供，如下所示。

85、mqqpfnypypqiywvdssasspwappgtvlpcptsvprrpgqrrppppppppplpppppppplpplplpplkkrgnhstglcllvmffmvlvalvglglgmfqlfhlqkelaelrestsqmhtasslekqighpspppekkelrkvahltgksnsrsmplewedtygivllsgvkykkgglvinetglyfvyskvyfrgqscnnlplshkvymrnskypqdlvmmegkmmsycttgqmwarssylgavfnltsadhlyvnvselslvnfeesqtffglykl

86、[seq id no.18]

87、因此，fasl的杂化物可能基本上包含了seq id no.18或其变体或其片段或其直系同源物中所示的多肽序列。

88、本发明的蛋白质颗粒的外壳可能进一步包含其他蛋白质，例如ifnγ、ccl5、xcl2和毒素的一种或多种。

89、ifnγ(ⅱ型干扰素)是一种免疫调节细胞因子。它通过与干扰素γ受体1(ifngr1)和干扰素γ受体2(ifngr2)组成的异二聚体受体结合，促进细胞产生抗病毒或抗肿瘤响应。ifnγ的多肽序列在本文由seq id no.19提供，如下所示。

90、qdpyvkeaenlkkyfnaghsdvadngtlflgilknwkeesdrkimqsqivsfyfklfknfkddqsiqksvetikedmnvkffnsnkkkrddfekltnysvtdlnvqrkaiheliqvmaelspaaktgkrkrsqmlfrg

91、[seq id no.19]

92、因此，蛋白质颗粒的ifnγ可能包含基本上如seq id no.19或其变体或其片段或其直系同源物中所示的多肽序列。

93、ccl5(rantes)是一种趋化因子。它通过吸引白细胞(例如t细胞，嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞中的一个或多个)来调节炎症。ccl5的多肽序列在本文由seq id no.20提供，如下所示。

94、spyssdttpccfayiarplprahikeyfytsgkcsnpavvfvtrknrqvcanpekkwvreyinslems

95、[seq id no.20]

96、因此，所述蛋白质颗粒的ccl5可能包含基本上如seq id no.20或其变体或其片段或其直系同源物中所示的多肽序列。

97、xcl2是一种趋化因子。它由t细胞表达，并可能吸引表达xcl2受体的细胞(即趋化因子受体xcrl)。xcl2的多肽序列在本文由seq id no.21提供，如下所示。

98、vgsevshrrtcvslttqrlpvsriktytitegslravifitkrglkvcadpqatwvrdvvrsmdrksntrnnmiqtkptgtqqstntavtltg

99、[seq id no.21]

100、因此，蛋白质颗粒的xcl2可能包含基本上如seq id no.21或其变体或其片段或其直系同源物中所示的多肽序列。

101、所述外壳和/或蛋白质颗粒的核心可能进一步包含毒素，例如氯毒素。这种毒素可能有助于杀死所述蛋白质颗粒的靶细胞。氯毒素的一种实施方式的多肽序列在本文由seqid no.22提供，如下所示。

102、mcmpcfttdhqmarkcddccggkgrgkcygpqclcr

103、[seq id no.22]

104、所述蛋白质颗粒的氯毒素可能包含基本上如seq id no.22或其变体或其片段或其直系同源物中所示的多肽序列。优选地，氯毒素被连接至所述外壳的蛋白(例如tsp-1或其片段、tsp-4或其片段、半乳糖凝集素-1或其片段、或半乳糖凝集素-7或其片段)。因此，氯毒素可以通过接头(例如gggs(seq id no：36))与壳蛋白连接。因此，在进一步的实施方式中，氯毒素的多肽序列在本文由seq id no.23或seq id no.24提供，如下所示。mcmpcfttdhqmarkcddccggkgrgkcygpqclcrgggs

105、[seq id no.23]gggsmcmpcfttdhqmarkcddccggkgrgkcygpqclcr

106、[seq id no.24]

107、因此，所述蛋白质颗粒的外壳可能进一步包含选自以下组的蛋白质，包括：ifn-γ、ccl5、血管性血友病因子(vonwillebrand's factor)、xcl2、fasl(经由囊泡/磷脂颗粒)、毒素(例如氯毒素)或其片段或其直系同源物。

108、蛋白质颗粒的工程化可以通过将基因修饰的蛋白质掺入颗粒中来进行。基因修饰的蛋白质可能是基因修饰的壳蛋白(基于糖蛋白壳蛋白的融合蛋白，或壳蛋白的片段、变体或直系同源物，例如血小板反应蛋白或半乳糖凝集素)、基因修饰的核蛋白(例如颗粒酶融合蛋白，或颗粒酶的片段、变体或直系同源物)，异源蛋白，例如转基因蛋白(例如转基因配体)和/或抗体或其片段。因此，壳蛋白，例如血小板反应蛋白(例如tsp-1和/或tsp-4)、半乳糖凝集素(例如半乳糖凝集素-1和/或半乳糖凝集素-7)和/或蛋白质颗粒核心内的蛋白质(例如颗粒酶)可能是融合蛋白。融合蛋白可能是颗粒酶b融合蛋白。所述蛋白质颗粒可能包含一种或多种、两种或多种、三种或多种或四种或多种融合蛋白。优选地，壳蛋白是融合蛋白。最优选地，血小板反应蛋白(例如tsp-1和/或tsp-4)是融合蛋白。

109、融合蛋白可能由蛋白质颗粒或其片段的全长蛋白质/多肽与另一种多肽(例如靶细胞的配体)形成。例如，蛋白质颗粒可以被修饰，使得半乳糖凝集素-1、半乳糖凝集素-7、颗粒酶b、tsp-1和/或tsp-4与另一种多肽(例如靶细胞的配体)形成融合蛋白。包含tsp-1的融合蛋白可能包含全长tsp-1蛋白(如seq id no.9)或其片段(如seq id no.9的691至1170位氨基酸，或seq id no.9的19至690位氨基酸)和另一种多肽，如配体。在另一种实施方案中，包含tsp-4的融合蛋白可能包含全长tsp-4蛋白(如seq id no.12)或其片段(例如seqid no.12的463至945位氨基酸，或seq id no.12的27至462位氨基酸)和另一种多肽，例如配体。在另一种实施方式中，包含半乳糖凝集素-1的融合蛋白可能包含全长半乳糖凝集素-1蛋白(如seq id no.15)或其片段(如seq id no.15的4至135位氨基酸，或seq id no.15的2至135位氨基酸)和另一种多肽，例如配体。在另一种实施方式中，包含半乳糖凝集素-7的融合蛋白可能包含全长半乳糖凝集素-7蛋白(如seq id no.17)或其片段(如seq id no.17的6至136位氨基酸，或seq id no.17的1至136位氨基酸)和另一种多肽，例如配体。所述蛋白质颗粒的多肽/蛋白质可能是n末端至其他多肽融合伴侣，例如配体。还可能在融合多肽之间提供例如在1和10个残基之间的接头序列。接头的长度可能是约5个残基。优选地，接头包括或由不经过处理的ggggs(seq id no.37)接头组成。

110、在一种实施方式中，血小板反应蛋白，例如tsp-1，被工程化为与另一种多肽形成的融合蛋白。在一种实施方式中，转基因tsp-1可能包含本文所述的tsp-1/gfp融合蛋白的序列(seq id no.25)，其中gfp融合蛋白被可替代的多肽分子所取代，例如靶细胞的配体或受体。

111、因此，蛋白质颗粒可能是工程化蛋白质颗粒，其包括含有穿孔素和/或颗粒酶核心，所述核心被糖蛋白外壳包裹，糖蛋白外壳包含血小板反应蛋白-1(tsp-1)融合蛋白，以及任选的半乳糖凝集素-1或半乳糖凝集素-7或其片段，或其变体或其直系同源物。

112、tsp-1融合蛋白可能是tsp-1/gfp融合蛋白。tsp-1/gfp融合蛋白的多肽序列在本文中由seq id no.25提供，如下所示。

113、

114、

115、seq id no.25的氨基酸序列mglawglgvlflmhvcgt(seq id no:38)对应信号肽。seq id no.25中标有下划线的氨基酸对应tsp-1氨基酸。seq id no.25中标有斜体的氨基酸对应接头。seq id no.25中标有粗体的氨基酸对应gfp氨基酸。

116、因此，tsp-1融合蛋白可能包含基本上如seq id no.25或其变体或其片段或其直系同源物中所示的多肽序列。

117、此外，本领域技术人员将明白，seq id no.25的gfp序列可以被球状蛋白或肽标签的氨基酸序列取代，而且，一种或多种壳蛋白，半乳糖凝集素-1、半乳糖凝集素-7和tsp-4可能与gfp形成融合蛋白。gfp的氨基酸序列在seq id no.25中以粗体标出。

118、蛋白质颗粒可能是工程化蛋白质颗粒，其包含含有穿孔素和/或颗粒酶的核心，所述核心被糖蛋白外壳包裹，糖蛋白外壳包含血小板反应蛋白-1或其片段其变体或其直系同源物，以及半乳糖凝集素融合蛋白(例如半乳糖凝集素-1或半乳糖凝集素-7融合蛋白)。半乳糖凝集素-1和半乳糖凝集素-7在细胞质中产生，并且在合成之后和输出之前分别去除n-末端蛋氨酸和n端5个氨基酸。因此，序列的添加将优先在具有接头的固定的c-末端。优选地，接头包括不经过处理的ggggs(seq id no:37)接头，或由不经过处理的ggggs(seq idno:37)接头组成。

119、在一个种实施方式中，所述蛋白质颗粒可能是工程化蛋白质颗粒，其包含具有穿孔素和/或颗粒酶的核心，被糖蛋白外壳包裹的核心包含：

120、·tsp-1或其片段、其变体或其直系同源物；其中，所述tsp-1是具有配体的融合多肽；和可选地

121、·半乳糖凝集素或其片段、其变体或其直系同源物。

122、在另一种实施方式中，所述蛋白质颗粒可能是工程化蛋白质颗粒，其包含具有穿孔素和/或颗粒酶的核心，被糖蛋白外壳包裹的核心包含：

123、·tsp-1或其片段、其变体或其直系同源物；

124、·tsp-4融合蛋白；和可选地

125、·半乳糖凝集素或其片段，其变体或其直系同源物。

126、所述tsp-4融合蛋白可能是具有配体的融合蛋白。

127、在一种实施方式中，蛋白质颗粒可能是包含颗粒酶核心的工程化蛋白质颗粒；其中，所述颗粒酶是具有配体的融合蛋白；被糖蛋白外壳包裹的所述核心包含：

128、·tsp-1或其片段其变体或其直系同源物；以及可选地

129、·半乳糖凝集素或其片段、其变体或其直系同源物。

130、根据本发明的工程化蛋白质颗粒还可能包含转基因半乳糖凝集素。因此，根据本发明的工程化蛋白颗粒可能进一步包含半乳糖凝集素融合蛋白，例如半乳糖凝集素-1融合蛋白或半乳糖凝集素-7融合蛋白。半乳糖凝集素融合蛋白(例如半乳糖凝集素-1融合蛋白或半乳糖凝集素-7融合蛋白)可能是具有配体的半乳糖凝集素融合蛋白。

131、根据本发明的工程化蛋白颗粒可能进一步或可选地包含颗粒酶融合蛋白，例如颗粒酶a、b、h、m和/或k融合蛋白。在一种实施方式中，具有mcherry和sephluorin的颗粒酶b融合蛋白的多肽序列在本文由seq id no.26提供，如下所示。

132、

133、seq id no.26中标有斜体的氨基酸对应接头(即ggggs(seq id no:37))。seq idno.26中标有粗体的氨基酸对应mcherry的氨基酸。seq id no.26中标有下划线的氨基酸对应sephluorin的氨基酸。

134、颗粒酶融合蛋白可能包含具有标记蛋白的融合蛋白，例如荧光标记蛋白。具有标记蛋白的颗粒酶融合蛋白的示例由seq id no 26提供，并可用于本发明。在这个示例中，融合蛋白具有mcherry和sephluorin(gfp样蛋白质)。在一种实施方式中，mcherry和/或sephluorin序列可能用可替代的多肽序列取代。

135、本领域技术人员将明白，由于颗粒酶是颗粒核心的一部分，任何多肽，例如连接到颗粒酶以形成融合蛋白的配体(例如靶配体)，只能通过蛋白质颗粒外壳中的孔接近靶细胞上的受体。

136、在一种可选的实施方式中，根据本发明的蛋白质颗粒外壳包含配体(即非融合蛋白质多肽)。因此，本发明的蛋白质颗粒外壳还可能包含靶细胞的配体。

137、配体是指(具体地)与靶细胞上的蛋白质(例如受体或离子通道)或标记物结合的试剂或一部分。优选地，配体特异性地结合蛋白质或标志物。配体可能是多肽。优选地，配体是异源的，例如转基因(例如异源/转基因多肽)。配体可能是抗体或其片段(例如scfv、vl、vh、fd、fv、fab、fab'、f(ab')2、fc片段或双特异性抗体)，其特异性地结合在靶细胞上表达的蛋白质。优选地，抗体为scfv。在另一种实施方式中，配体可能包含抗体模拟物。

138、因此，tsp-1融合蛋白的另一种实施方式可以是tsp-1/tl-scfv融合蛋白。tl-scfv是一种单链抗体，其可与新抗原hla-a2 nyeso-1肽157-165结合。nyeso-1蛋白可以在胶质母细胞瘤细胞中表达，因此添加t1-scfv或其具有修饰亲和力的变体将改善蛋白质颗粒对胶质母细胞瘤和其他表达nyeso-1蛋白的肿瘤的靶向性。

139、tsp-1融合蛋白的另一种实施方式可能包含tsp-1/tl-scfv融合蛋白的多肽序列。多肽序列在本文中由seq id no.27提供，如下所示。

140、

141、

142、

143、seq id no.27中标有下划线的氨基酸对应tsp-1氨基酸。seq id no.27中标有斜体的氨基酸对应接头。seq id no.27中标有粗体的氨基酸对应tl-scfv氨基酸。

144、因此，蛋白质颗粒可包含基本上如seq id no.27或其变体或其片段中所示多肽序列。

145、tsp-1融合蛋白的另一种实施方案可能是tl-scfv/tsp-1融合蛋白。融合蛋白可能包含在本文中由seq id no.28提供的多肽序列，如下所示。

146、

147、

148、seq id no.28的氨基酸序列mglawglgvlflmhvcgt(seq id no：38)对应信号肽。seq id no.28中标有下划线的氨基酸对应tsp-1氨基酸。seq id no.28中标有斜体的氨基酸对应接头。seq id no.28中标有粗体的氨基酸对应tl-scfv氨基酸。

149、因此，蛋白质颗粒的tsp-1可能包含基本上如seq id no.28或其变体或其片段或其直系同源物中所示的多肽序列。

150、tsp-1融合蛋白的另一种实施方式可能是tsp-1/氯毒素融合蛋白。氯毒素肽与胶质母细胞瘤细胞上选择性表达的氯离子通道相互作用。因此，tsp-1/氯毒素融合蛋白将改善蛋白质颗粒对胶质母细胞瘤和其他具有氯毒素结合表型的肿瘤的靶向。本文提供tsp-1/氯毒素融合蛋白实施方式的多肽序列为seq id no.29，如下所示。

151、

152、

153、seq id no.29的氨基酸序列mglawglgvlflmhvcgt(seq id no:38)对应信号肽。seq id no.29中标有下划线的氨基酸对应tsp-1氨基酸。seq id no.29中标有斜体的氨基酸对应接头。seq id no.30中标有粗体的氨基酸对应氯毒素氨基酸。

154、因此，蛋白质颗粒的tsp-1可能包含基本上如seq id no.29或其变体或其片段或其直系同源物中所示的多肽序列。

155、tsp-1融合蛋白的另一种实施方式可能是氯毒素/tsp-1融合蛋白。本文以seq idno.30的形式提供氯毒素/tsp-1融合蛋白的多肽序列，如下所示。

156、

157、

158、seq id no.30的氨基酸序列mglawglgvlflmhvcgt(seq id no:38)对应信号肽。seq id no.30中标有下划线的氨基酸对应tsp-1氨基酸。seq id no.30中标有斜体的氨基酸对应接头。seq id no.30中标有粗体的氨基酸对应氯毒素氨基酸。

159、因此，蛋白质颗粒的tsp-1可能包含基本上如seq id no.30或其变体或其片段或其直系同源物中所示的多肽序列。

160、tsp-1融合蛋白可能包含连接tsp-1或其片段至另一种蛋白质的接头。接头可以是seq id no.25至30中的任何一个接头。

161、在另一种实施方式中，蛋白质颗粒包括由壳蛋白(例如tsp-1融合蛋白、tsp-4融合蛋白、半乳糖凝集素-1融合蛋白或半乳糖凝集素-7融合蛋白)形成的融合蛋白和/或靶细胞的配体(例如氯毒素靶向的氯离子通道)和/或特异性结合在靶细胞上表达的蛋白质(例如cd19)的抗体(例如scfv)。

162、本发明的蛋白质颗粒可用于治疗多种疾病。这可以通过根据本发明的第一或第二方面的蛋白质颗粒来实现。然而，根据第二方面的所述颗粒的优势为：其可能被工程化以提高其对在目的疾病的靶细胞上表达的蛋白质(例如生物标志物或受体)的特异性。例如，本发明的蛋白质颗粒可能包含靶向特定癌症/肿瘤细胞的配体、融合蛋白和/或抗体。或者，蛋白质颗粒可能包含靶向(细菌和/或病毒)感染的靶细胞的特定配体、融合蛋白和/或抗体。本领域技术人员理解哪种配体、融合蛋白和/或抗体将为蛋白质颗粒提供靶细胞的靶向特异性。同样地，本领域技术人员理解必须靶向哪些细胞以治疗受试者的疾病或病症。特定于肿瘤或受感染细胞且只与非必需正常细胞共享的靶向蛋白质包括：(i)cd19或cd20，可能针对b细胞白血病；(ii)与mhc分子结合的共享的肿瘤睾丸抗原和新抗原肽，是特定类型肿瘤的特征；(iii)在宿主中未发现的病原体相关肽，(iv)代谢传感器，如mrl蛋白，与肿瘤或微生物相关的代谢物结合，在癌症或受感染细胞表面产生特殊分子模式；和(v)根据经验发现与肿瘤细胞和非正常细胞结合的任何肽或多肽，例如氯毒素。因此，本发明的蛋白质颗粒可以被工程化成靶向蛋白质(i)至(v)中的任何一种。

163、本发明的蛋白质颗粒的外壳可能或可能不与包含cd47(也称为整合素相关蛋白(iap))的靶细胞结合。因此，本发明的颗粒可以通过tsp-1或其它血小板反应蛋白(例如tsp-2、tsp-3、tsp-4或tsp-5)与cd47结合。cd47还充当阻止免疫系统吞噬细胞和吞噬表达cd47的细胞的信号。因此，根据本发明，缺乏cd47的靶细胞可能不会被蛋白质颗粒靶向，但其更有可能被吞噬。cd47的这种特性使得通过肿瘤细胞或感染细胞上cd47表达的缺失来逃避蛋白质颗粒的可能性较小，使肿瘤或感染细胞的存活不太可能成功。

164、cd47由基因cd47编码。因此，编码一种实施方式的cd47的基因组dna序列(内含子和外显子)在本文中称为seq id no.31，并且可以在基因id：961中找到。

165、(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene？db＝gene&cmd＝detailssearch&term＝96l)

166、cd47的多肽序列在本文由seq id no.32提供，如下所示。

167、mwplvaalllgsaccgsaqllfnktksveftfcndtvvipcfvtnmeaqnttevyvkwkfkgrdiytfdgalnkstvptdfssakievsqllkgdaslkmdksdavshtgnytcevteltregetiielkyrvvswfspnenilivifpifaillfwgqfgiktlkyrsggmdektiallvaglvitvivivgailfvpgeyslknatglglivtstgilillhyyvfstaigltsfviailviqviayilavvglslciaacipmhgpllisglsilalaqllglvymkfvasnqktiqpprkaveeplnafkeskgmmnde

168、[seq id no.32]

169、因此，蛋白质颗粒可能靶向也可能不靶向包含基本如seq id no.32或其变体或其片段或其直系同源物中所示的多肽序列的细胞。此外，编码cd47多肽的编码序列可能包含基本上如seq id no.31或其变体或其片段或其直系同源物中所示的核酸序列。

170、本发明的蛋白样颗粒的外壳可能与或可能不与包含蛋白icam-1(又称细胞间粘附分子-1)的靶细胞结合。icam-1是一种多肽，其可作为根据本发明的蛋白质颗粒的受体。icam-1在许多细胞上的表达通过细胞激活或炎症细胞因子而增加，这可能使靶细胞更容易被蛋白质颗粒杀死。

171、icam-1蛋白由基因icamj编码。因此，编码一种实施方式的icam-1的基因组dna序列(内含子和外显子)在本文中称为seq id no.33，并且可以在基因id：3383中找到。

172、(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene？db＝gene&cmd＝detailssearch&term＝3383)

173、icam-1的多肽序列在本文中由seq id no.34提供，如下所示。

174、mapssprpalpallvllgalfpgpgnaqtsvspskvilprggsvlvtcstscdqpkllgietplpkkelllpgnnrkvyelsnvqedsqpmcysncpdgqstaktfltvywtpervelaplpswqpvgknltlrcqveggapranltvvllrgekelkrepavgepaevtttvlvrrdhhganfscrteldlrpqglelfentsapyqlqtfvlpatppqlvsprvlevdtqgtvvcsldglfpvseaqvhlalgdqrlnptvtygndsfsakasvsvtaedegtqrltcavilgnqsqetlqtvtiysfpapnviltkpevsegtevtvkceahprakvtlngvpaqplgpraqlllkatpedngrsfscsatlevagqlihknqtrelrvlygprlderdcpgnwtwpensqqtpmcqawgnplpelkclkdgtfplpigesvtvtrdlegtylcrarstqgevtrkvtvnvlspryeiviitvvaaavimgtaglstylynrqrkikkyrlqqaqkgtpmkpntqatpp

175、[seq id no.34]

176、因此，蛋白质颗粒可能靶向或者可能不靶向包含基本上如seq id no.34或其变体或其片段或其直系同源物中所示的多肽序列的细胞。

177、抗体可能是单价、二价或多价。一价抗体是二聚体(hl)，其包括通过二硫桥与轻链(l)连接的重链(h)。二价抗体是四聚体(h2l2)，其包含通过至少一个二硫桥连接的两个二聚体。还可以产生多价抗体，例如通过连接多个二聚体。抗体分子的基本结构由两条相同的轻链和两条相同的重链组成，它们非共价结合，并且可以通过二硫键连接。每个重链和轻链包含大约110个氨基酸的氨基末端可变域以及在链的其余部分中的恒定序列。可变域包括几个超变区或互补性决定区域(cdrs)，它们形成抗体分子的抗原结合位点，并确定其对抗原或其变体或片段(例如表位)的特异性。在重链和轻链的cdrs的任意一侧是框架区域，用于锚定和定向cdrs的相对保守的氨基酸序列。抗体片段可能包括双特异性抗体(bsab)或嵌合抗原受体(car)。恒定区由五个重链序列(μ、γ、ζ、a或ε)之一和两个轻链序列(κ或λ)之一组成。重链恒定区序列决定抗体的同种型和分子的效应器功能。

178、在一种实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含多克隆抗体，或其抗原结合片段。所述抗体或抗原结合片段可能在兔、小鼠或大鼠中产生。

179、在另一种实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段可包含单克隆抗体或其抗原结合片段。优选地，所述抗体为人类抗体。如本文所用，术语“人类抗体”可以指抗体，例如单克隆抗体，其包含与对抗原或其变体或片段展现免疫特异性的特定人类抗体中所发现的基本上相同的重链和轻链cdr氨基酸序列。与参考序列相比，与重链或轻链cdr基本上相同的氨基酸序列展现相当大程度的序列同一性。这种同一性是明确已知的或可识别的，代表特定人类抗体的氨基酸序列。

180、基本上相同的重链和轻链cdr氨基酸序列可具有例如氨基酸的少量修饰或保守取代。这种人类抗体维持其选择性结合抗原或其变体或片段的功能。

181、术语“人单克隆抗体”可包含基本上或完全人类cdr氨基酸序列的单克隆抗体，单克隆抗体例如通过重组方法产生，如通过噬菌体文库、淋巴细胞或杂交瘤细胞产生。术语“人源化抗体”可以指来自非人类物种(例如小鼠或兔子)的抗体，其蛋白质序列已被修饰以增加其与人类自然产生的抗体的相似性。

182、所述抗体可以是重组抗体。术语“重组人类抗体”可以包括使用重组dna技术产生的人类抗体。

183、术语“抗原结合区”可以指抗体中对其靶抗原具有特异性结合亲和力的区域。优选地，所述片段为表位。结合区可以是高变cdr或其功能部分。术语cdr的“功能部分”可以指cdr内对靶抗原显示出具有特异性亲和力的序列。cdr的功能部分可包含与抗原或其片段特异性结合的配体。

184、术语“cdr”可以指重可变链和轻可变链中的高变区。在抗体的每个重链和轻链中可能有一个、两个、三个或更多个cdrs。通常，每个链上至少有三个cdrs，当构造在一起时，其形成抗原结合位点，即抗原结合或特异性反应的三维结合位点。然而，据推测，在某些抗体的重链中可能存在四个cdrs。

185、cdr的定义还包括相互比较时氨基酸残基的重叠或子集。包含特定cdr或其功能部分的确切残基数将根据cdr的序列和大小而变化。本领域技术人员可以在给定抗体的可变区氨基酸序列的情况下常规地确定哪些残基包含特定cdr。

186、术语抗体的“(功能)片段”可以指保留功能活性的抗体的一部分。功能活性可以是例如抗原结合活性或特异性。功能活性也可以是，例如由抗体恒定区域提供的效应器功能。术语“功能片段”还意在包括，例如通过人类单克隆抗体的蛋白酶消化或还原以及通过本领域技术人员已知的重组dna方法产生的片段。人类单克隆抗体功能片段包括例如单个重链或轻链及其片段，例如vl、vh和fd；单价片段，例如fv、fab和fab'；二价片段，例如f(ab')2；单链fv(scfv)；和fc片段。

187、术语“vl片段”可以指人单克隆抗体的轻链的片段，其包括轻链可变区的全部或部分，包括cdrs。vl片段可以进一步包括轻链恒定区序列。

188、术语“vh片段”可以指人单克隆抗体的重链的片段，其包括重链可变区的全部或部分，包括cdrs。

189、术语“fd片段”可以指耦合到第一重链恒定区的重链可变区，即vh和ch-i。“fd片段”不包括轻链，或重链的第二和第三恒定区。

190、术语“fv片段”可以指人类单克隆抗体的单价抗原结合片段，包括重链和轻链的可变区的全部或部分，并且不具有重链和轻链的恒定区。重链和轻链的可变区包括例如cdrs。例如，fv片段包括重链和轻链大约没有氨基酸的氨基末端可变区的全部或部分。

191、术语“fab片段”可以指大于fv片段的人类单克隆抗体的单价抗原结合片段。例如，fab片段包括可变区，以及重链和轻链的第一恒定结构域的全部或部分。

192、术语“fab'片段”可以指大于fab片段的人类单克隆抗体的单价抗原结合片段。例如，fab'片段包括轻链的全部、重链的可变区的全部，以及重链的第一和第二恒定结构域的全部或部分。例如，fab'片段可以另外包括重链220至330的部分或全部氨基酸残基。所述抗体片段可选地包含fab'2片段，该片段包含抗体的铰链部分。

193、术语“f(ab)片段”可以指人类单克隆抗体的二价抗原结合片段。例如，f(ab)片段包括两个重链和两个轻链的可变区的全部或部分，并且可以进一步包括两个重链和两个轻链的第一恒定结构域的全部或部分。

194、术语“单链fv(scfv)”可以指与短接头肽连接的重链(vh)和轻链(vl)的可变区的融合物。

195、术语“双特异性抗体(bsab)”可以指通过两个较短的连接肽相互连接的包含两个scfv的双特异性抗体。

196、本领域技术人员理解，抗体的片段的确切边界并不重要，只要该片段保持功能活性即可，例如靶结合活性。使用公知的重组方法，本领域技术人员可以工程化多核苷酸序列以表达具有特定应用所需的任何端点的功能片段。抗体的功能片段可包含具有与人类抗体基本上相同的重链和轻链可变区的片段或由具有与人类抗体基本上相同的重链和轻链可变区的片段组成。

197、所述抗原结合片段可包含或由以下组成：vl的抗原结合区序列中的任一个、vh的抗原结合区序列中的任一个、或人类抗体的vl和vh抗原结合区的组合。vh和vl抗原结合区序列的适当数目和组合可由本领域技术人员根据抗原结合片段的期望的亲和力和特异性以及预期用途来确定。抗体的功能片段或抗原结合片段可以使用本领域技术人员熟知的方法容易地产生和分离，这些方法包括例如蛋白水解方法、重组方法和化学合成。用于分离功能片段的蛋白水解方法包括使用人类抗体作为原料。适用于人类免疫球的蛋白水解的酶可包括例如木瓜蛋白酶和胃蛋白酶。本领域技术人员可以容易地选择适当的酶，这取决于例如是否需要单价或二价片段。

198、通过蛋白水解产生的抗体的功能片段或抗原结合片段可通过亲和色谱及柱色谱程序纯化。例如，未消化的抗体和fc片段可通过与蛋白a结合来除去。此外，功能片段可凭借其电荷和大小通过使用例如离子交换和凝胶过滤色谱法，进行纯化。这些方法是本领域技术人员所熟知的。

199、抗体或其抗原结合片段可通过重组方法产生。优选地，最初分离编码抗体重链和轻链所需区域的多核苷酸。这些区域可以包括，例如重链和轻链的可变区的全部或部分。优选地，这些区域可以特别包括重链和轻链的抗原结合区，优选抗原结合位点，最优选cdrs。

200、编码根据本发明的抗体或其抗原结合片段的多核苷酸可使用本领域技术人员已知的方法制备。编码所述抗体或其抗原结合片段的多核苷酸可通过本领域已知的寡核苷酸合成方法直接合成。可选地，可使用本领域已知的重组方法合成和连接较小的片段以形成较大的功能片段。

201、如本文所用，术语“免疫特异性”可以指结合区能够通过与抗原或其变体或片段发生特异性结合而与抗原免疫反应。

202、术语“免疫反应”可以指结合区能够在与抗原或其表位结合时引发免疫响应。

203、发明人已经发现蛋白质颗粒可以被工程化，使它们包含目的蛋白。这是通过创建转录特定rna(例如mrna或trna或mirna)和/或表达某些蛋白质的修饰细胞来实现的，这些蛋白质又被并入细胞内的蛋白质颗粒中。因此，细胞(例如cd8 t细胞/细胞毒性t细胞或nk细胞)可以经基因修饰以包含核酸序列，其编码能够在蛋白质颗粒的外壳上表达的异源蛋白质，例如配体，并且其对于在靶细胞/组织上表达的蛋白质(例如受体)也是特异性的，以便能够将所述蛋白质颗粒靶向递送到其上。

204、因此，根据本发明的另一方面，提供了一种能够产生根据本发明的工程化蛋白质颗粒的修饰细胞，该修饰细胞包括，或包含的核酸编码：

205、·穿孔素和/或颗粒酶；

206、·血小板反应蛋白-1(tsp-1)或其片段、其变体或其直系同源物；和

207、·异源多肽，例如具有血小板反应蛋白、半乳糖凝集素或颗粒酶融合蛋白形式的转基因配体。

208、在一种实施方式中，融合蛋白包含血小板反应蛋白和异源多肽，所述血小板反应蛋白可包含tsp-1。特别地，tsp-1可以是具有异源多肽(例如配体)的融合蛋白。

209、所述细胞还可以包含选自包含半乳糖凝集素-1、半乳糖凝集素-7、tsp-4、其片段、其变体或其直系同源物的组的壳蛋白。

210、不天然产生根据本发明的蛋白质颗粒的细胞也可被修饰以产生天然存在的(即非工程化的)蛋白质颗粒。

211、因此，根据本发明的另一方面，提供了一种能够产生本发明蛋白质颗粒的修饰细胞，该修饰细胞包含，或包含的核酸编码：

212、·穿孔素和/或颗粒酶；

213、·血小板反应蛋白-1(tsp-1)或其片段、其变体或其直系同源物。

214、穿孔素、颗粒酶和/或tsp-1可能是重组的。穿孔素、颗粒酶和/或tsp-1可能与细胞异源。

215、根据本发明的另一方面，提供了一种制备能够产生根据本发明的工程化蛋白质颗粒的修饰细胞的方法，该方法包括将编码融合蛋白的核苷酸序列引入细胞中以产生表达由所述核苷酸序列编码的所述融合蛋白的修饰细胞；该细胞包含或能够表达：

216、·穿孔素和/或颗粒酶；和

217、·血小板反应蛋白-1(tsp-1)或其片段、其变体或其直系同源物；

218、其中所述融合蛋白包括血小板反应蛋白、半乳糖凝集素或颗粒酶和异源多肽，例如转基因配体。

219、根据本发明的另一方面，提供了一种能够产生根据本发明的工程化蛋白质颗粒的修饰细胞的方法，该方法包括提供能够产生根据本发明的蛋白质颗粒的细胞，并引入编码融合蛋白的核苷酸序列；其中所述融合蛋白包含异源多肽，如转基因配体、血小板反应蛋白、半乳糖凝集素或颗粒酶。

220、根据本发明的另一方面，提供了一种制备能够产生根据本发明的工程化蛋白质颗粒的修饰细胞的方法，该方法包括引入核苷酸序列进入细胞以在其中表达，该核苷酸序列编码：

221、·异源多肽，例如转基因配体；和/或

222、·穿孔素和/或颗粒酶；和/或

223、·血小板反应蛋白-1(tsp-1)或其片段、其变体或其直系同源物；

224、其中，可选地将所述异源多肽编码为包含血小板反应蛋白、半乳糖凝集素和/或颗粒酶的融合蛋白。

225、根据本发明的另一方面，提供了一种制备本发明的修饰细胞的方法，该方法包括引入核苷酸序列进入细胞以在其中表达：所述核苷酸序列编码：

226、·穿孔素和/或颗粒酶；和

227、·血小板反应蛋白-1(tsp-1)或其片段，其变体或其直系同源物。

228、所述异源多肽，例如转基因配体，可以编码为具有血小板反应蛋白和/或颗粒酶的融合蛋白。在一种实施方式中，所述异源多肽，例如转基因配体，可以编码为具有血小板反应蛋白的融合蛋白。在另一种实施方式中，所述异源多肽，例如转基因配体，可以编码为具有颗粒酶的融合蛋白。具有血小板反应蛋白的融合蛋白可以是具有tsp-1的异源多肽(例如转基因配体)的融合蛋白。

229、在本发明提供融合多肽/蛋白质的实施方式中，异源多肽(如转基因肽)可能是对于其融合伴侣的c-末端。例如血小板反应蛋白可能是对于异源多肽(如转基因肽)的n-末端。半乳糖凝集素可能是对于异源多肽(如转基因肽)的n末端。所述颗粒酶可能是对于异源多肽的n-末端(如转基因肽)。

230、根据本发明的另一方面，提供了一种修饰的细胞，其中，所述修饰的细胞包括编码根据本发明的工程化蛋白质颗粒组分的核酸。

231、根据本发明的另一方面，提供了一种修饰的细胞，其中，所述修饰的细胞包括编码本发明的蛋白质颗粒组分的核酸。

232、引入细胞的核苷酸序列可能包含dna。在一种实施方式中，引入细胞的核苷酸序列以用于转染到细胞中的载体的形式提供。引入细胞的核苷酸序列可以被稳定地转化(例如染色体整合)到细胞中。在一种实施方式中，引入细胞的核苷酸序列是具有血小板反应蛋白、半凝集素或颗粒酶的融合蛋白，所述核苷酸序列可以分别取代或敲除(例如通过插入)血小板反应蛋白、半凝、半乳糖凝集素或颗粒酶的任何现有序列。特别地，编码野生型血小板反应蛋白、半乳糖凝集素或颗粒酶的现有核苷酸序列(基因)可以被融合蛋白等价物替换或敲除(例如通过插入)，其中融合蛋白是异源多肽。核苷酸序列的插入可能包括使用同源重组，例如通过提供与待插入核苷酸序列侧面的插入位点同源的序列。本领域技术人员将熟知使用核苷酸序列转化细胞的若干技术和方法，以在细胞中表达。

233、配体是指与靶细胞上的蛋白质(例如受体或离子通道)或标记物(特异性)结合的试剂或试剂的一部分。优选地，配体与蛋白质或标记物特异性结合。配体可能是蛋白质或肽。配体可能是转基因配体(例如转基因多肽)。转基因配体可能是抗体、抗体片段(例如scfv)或融合蛋白。配体可能是氯毒素或t1-scfv。

234、所述细胞可能是t细胞(t淋巴细胞)，cd3+细胞、cd8+细胞或自然杀伤(nk)细胞。优选地，所述细胞为cd8+t细胞(细胞毒性t细胞或cd3+cd8+细胞)，所述细胞可能是cd57+细胞。最优选地，所述细胞为cd3+cd8+cd57+t细胞，所述细胞可能是活化cd3+细胞、活化cd8+细胞或活化自然杀伤(nk)细胞。最优选地，细胞是活化cd3+cd8+t细胞，或活化cd3+cd8+cd57+t细胞。所述细胞可能是包含蛋白质颗粒的细胞。所述细胞可能是人胚肾(hek)细胞，中国仓鼠卵巢(cho)细胞，包括nk92和yt在内的自然杀伤样细胞系。所述细胞可能是能够产生或包含本发明的蛋白质颗粒的细胞。

235、所述核苷酸序列可能编码异源配体，例如转基因配体。因此，所述核苷酸序列可能编码seq id nos.28至31中的一个或多个的氨基酸序列。

236、优选地，所述方法用于来产生根据本发明的修饰细胞。

237、根据本发明的蛋白质颗粒具有与外泌体相似的大小。因此，它们通常与来自nk细胞和t细胞的上清液的外泌体共同纯化。因此发明人开发了一种分离和纯化根据本发明蛋白质颗粒的方法。

238、根据本发明的另一方面，提供了一种从细胞中分离根据本发明的蛋白质颗粒的方法，该方法包括：

239、(i)提供在液体中细胞；

240、(ii)离心细胞和液体以沉淀细胞，或过滤掉细胞，从而形成无细胞液体；

241、(iii)通过离心或过滤无细胞液体来收集被释放的蛋白质颗粒；

242、其中，在离心或过滤无细胞液体以收集蛋白质颗粒之前或之后，由细胞释放的任何外泌体被耗尽。

243、产生本发明的蛋白质颗粒的细胞也可能产生外泌体。然而，外泌体可以与本发明蛋白质颗粒在相同的离心力下，或在相同的过滤器中共同纯化。因此，外泌体的耗尽对于基本上纯或更纯的收集蛋白质颗粒可能是必要的。在蛋白质颗粒的离心或过滤以收集蛋白质颗粒之后的外泌体耗尽，可有利地增加任何外泌体的浓度，这可使耗尽，例如免疫缺失，更有效和方便。

244、所述蛋白质颗粒可能是根据本发明的天然/野生型蛋白质颗粒或根据本发明的工程化蛋白质颗粒。

245、所述细胞可能是能够产生根据本发明的蛋白质颗粒或根据本发明的工程化蛋白质颗粒的细胞。所述细胞可能是根据本发明的工程化细胞，其已被修饰以产生天然或工程化蛋白质颗粒。所述细胞可以是t细胞(t淋巴细胞)、cd3+细胞、cd8+细胞或自然杀伤(nk)细胞。所述细胞可能是cd57+细胞。最优选地，所述细胞为cd3+cd8+cd57+t细胞，所述细胞可能是活化cd3+细胞、活化cd8+细胞或活化自然杀伤(nk)细胞。最优选地，细胞是活化cd3+cd8+t细胞，或活化cd3+cd8+cd57+t细胞。该细胞可能是人胚肾(hek)细胞、中国仓鼠卵巢(cho)细胞，包括nk92和yt在内的自然杀伤样细胞系。所述细胞可能是包含或表达本发明的蛋白质颗粒的细胞。

246、所述细胞可能自发释放蛋白质颗粒。然而，根据本发明的方法可以包括激活所述细胞以增加蛋白质颗粒释放的步骤。可以使用本领域已知的任何技术激活细胞。然而，本领域技术人员将理解，细胞被激活的方式取决于细胞的类型。例如，cd3+细胞可能被抗-cd3抗体激活；可选地，采用抗-cd28抗体和/或fas激活。nk细胞可能被抗-cd16抗体激活。

247、液体可能是培养基，例如细胞培养基。优选步骤(i)包括提供在培养基中的细胞。控制培养基的组成，使其不含外泌体和其他与蛋白质颗粒大小相似的颗粒。培养基可能是具有低蛋白的全限定配方，以促进蛋白质颗粒纯化。

248、步骤(ii)包括离心液体(例如培养基)中的细胞以产生离心的无细胞液体。离心细胞(例如培养基)可能包含足以使细胞在液体内沉淀的速度的旋转，使得它们可以与上清液内的蛋白质颗粒和外泌体分离。离心以沉淀细胞可能在100-1000g下进行。在缓慢除去细胞后，上清液可经受额外的10,000g离心以除去亚细胞颗粒，这些颗粒由于大于500nm而被沉淀。可选地，步骤(ii)可包括从液体中过滤出细胞。例如，可以通过使液体通过具有阻止细胞通过但不阻止蛋白质颗粒通过或者阻碍大于蛋白质颗粒的细胞通过的孔径的过滤器来过滤细胞，这样可使它们被分级。更具体地，细胞可以通过在中空纤维细胞培养系统中培养而来从液体中过滤出来，所述中空纤维细胞培养系统具有足够大的孔径以使蛋白质颗粒可以通过，但又足够小以至于细胞无法通过，使得蛋白质颗粒被收集在中空纤维细胞培养系统的滤液中。孔径将为约0.45μm，优选地，直径大于约0.2μm但小于约1μm。

249、离心所述无细胞液体以收集释放的蛋白质颗粒可能包括离心以沉淀所述蛋白质颗粒。在无细胞液体被丢弃之后，这种颗粒可能随后被重新悬浮，例如在缓冲液或其它介质中。离心无细胞液体以收集/沉淀释放的蛋白质颗粒可包括超速离心。所述超速离心可能以足够的速度和时间来沉淀根据本发明的蛋白质颗粒。例如，超速离心可能足以沉淀尺寸在50至100nm之间的蛋白质颗粒。在一种实施方式中，超速离心可能是约25,000g至约400,000g，或约50,000g至约200,000g。最优选地，超速离心为100,000g。在一种实施方式中，超速离心至少为25,000g。

250、所述超速离心可以持续至少约15分钟、至少约30分钟、至少约1小时、至少约2小时。所述超速离心可持续约15分钟至约4小时、约30分钟至约2小时或至少约1小时。

251、在一种实施方式中，所述超速离心是在约50,000g至约200,000g下进行约30分钟至2小时。最优选地，所述超速离心是在100,000g下进行至少约1小时。

252、在一种实施方式中，步骤(ii)(即过滤细胞以形成无细胞液体)包括超滤。在一种实施方式中，步骤(iii)(即过滤无细胞液体以收集释放的蛋白质颗粒)包括凝胶过滤，使得蛋白质颗粒被分离成不含较小组分(即直径小于约80nm的组分)的一部分。在另一种实施方式中，步骤(ii)包括超滤，以及步骤(iii)包括凝胶过滤。

253、超滤涉及过滤无细胞液体以收集释放的蛋白质颗粒，可能包括过滤蛋白质颗粒以将它们截留在过滤器上。例如，过滤器的孔径可以调整尺寸以允许液体和小于蛋白质颗粒的分子通过，但阻止蛋白质颗粒通过。例如，孔的直径可能小于50nm。过滤所述无细胞液体以收集释放的蛋白质颗粒可能包括使用尺寸排除色谱法。在另一种实施方式中，可以组合使用结合洗脱和尺寸排除色谱法。本领域技术人员将熟知用于分离蛋白质颗粒的过滤技术，例如基于它们的尺寸、电荷和/或结合特性。corso等人(2017scientific reports|7:11561|doi:10.1038/s41598-017-10646-x 3，其在此引入作为参考)和vader等人(2017.andrew f.hill(ed.),exosomes andmicrovesicles:methods andprotocols.methods in molecular biology,vol.1545,doi：10.1007/978-1-4939-6728-5_14)描述了用于分离相似尺寸的外泌体的方法，可应用于本发明的蛋白质颗粒。

254、例如，这种技术可能使用液相色谱，例如核心珠色谱法(core beadchromatography)。

255、可以通过使用本领域已知的任何技术来耗尽外泌体。本领域技术人员将理解，有多种技术可用于耗尽外泌体，例如在离心培养基中。在一种实施方式中，外泌体被免疫耗竭。优选地，使用针对外泌体标志物(例如cd81，cd63和/或cd9)的抗体耗尽外泌体。外泌体可使用涂覆有外泌体标志物(如cd8l、cd63和/或cd9)免疫特异性抗体的磁珠来耗尽。由于外泌体是膜基的，它们也可以被温和的非离子洗涤剂破坏，这些洗涤剂对蛋白质颗粒无损且易于去除(例如辛基-β-d-吡喃葡萄糖苷)。因此，在一种实施方式中，外泌体通过使用洗涤剂扰乱(即破坏)外泌体的膜而被耗尽。在一种实施方式中，洗涤剂包含辛基-β-d-吡喃葡萄糖苷或由辛基-β-d-吡喃葡萄糖苷组成。本领域技术人员将容易地识别可破坏外泌体膜但不会影响(例如变性)蛋白质颗粒的替代洗涤剂。

256、根据本发明的方法可进一步包括离心耗尽外泌体的液体以沉淀蛋白质颗粒，例如用于收集。可以以足够的速度和时间旋转所述耗尽外泌体的液体以沉淀本发明的蛋白质颗粒。例如，离心可能足以将尺寸在50至100nm之间的蛋白质颗粒沉淀。在一种实施方案中，耗尽外泌体的液体可能在约25,000g至约400,000g，或约50,000g至约200,000g下旋转。最优选地，所述液体在100,000g下旋转。在一种实施方式中，耗尽外泌体的液体可能在至少25,000g下离心。

257、耗尽外泌体的液体可以离心(旋转)至少约15分钟、至少约30分钟、至少约1小时、至少约2小时。耗尽外泌体的液体可以旋转约15分钟至约4小时，约30分钟至约2小时，或至少约1小时。

258、在一种实施方式中，耗尽外泌体的液体以约50,000g至约200,000g旋转约30分钟至2小时。最优选地，将耗尽外泌体的液体在100,000g下旋转至少约1小时。

259、在步骤(i)之前，细胞(例如活化的cd3+cd8+t细胞)可以在培养基中培养至少约6小时，至少约12小时，至少约24小时，至少约48小时。细胞可在培养基中培养约6小时至192小时，或约12小时至96小时，或约24小时至48小时。

260、发明人已经开发出一种分离根据本发明的蛋白质颗粒的替代方法。

261、因此，根据本发明的另一方面，提供了一种从细胞中分离根据本发明的蛋白质颗粒的方法，该方法包括：

262、(a)将细胞黏附在基质上，由此从细胞释放的蛋白质颗粒也黏附在基质上；

263、(b)将细胞与基质分离，以留下黏附的蛋白质颗粒；和

264、(c)通过从基质中洗脱蛋白质颗粒来收集蛋白质颗粒。

265、有利地，已经发现黏附在基质上(如脂质双层)的细胞可被激活并释放出根据本发明的蛋白质颗粒，所述蛋白质颗粒可黏附在基质(如脂质双层)上。然后可以收集黏附的蛋白质颗粒。该过程的优点是能够快速产生和分离所需的蛋白质颗粒，例如在数小时(不到一天)内。

266、步骤(a)将细胞黏附到基质上

267、该步骤可能包括使细胞与基质接触。所述细胞可能是如在前方面所述的细胞(即前述从细胞中分离蛋白质颗粒的方法)。

268、所述基质可以是细胞(例如t细胞或nk细胞)可以黏附和不黏附的表面。所述基质可能是脂质双层模型，例如支撑脂质双层膜(slb)，或玻璃表面，优选地，平面玻璃表面，或玻璃珠，以便可以在玻璃珠上形成slb。

269、所述基质可能涂覆有一种或多种、两种或多种、或三种或多种用于细胞黏附和/或活化的蛋白质，例如icam-1和mica。优选地，当细胞是nk细胞时，用icam-1和mica涂覆基质(例如slb或分离珠)。优选地，当细胞是t细胞(t淋巴细胞)、cd3+细胞或cd8+细胞时，用icam-1涂覆基底(例如slb)。基质(例如slb或分离珠)可能涂覆有cd47。所述基质(例如slb或分离珠)可能涂覆有cd47、icam-1和mica，或者可以涂覆有cd47和icam-1。

270、所述基质(例如slb)可进一步涂覆有一种、两种、三种或更多种细胞活化剂，例如抗-cd16(针对nk细胞)和/或抗-cd3(针对t细胞)，以使所述基质具有活化性。细胞活化剂促进蛋白质颗粒的胞外分泌。优选地，将活化性基质(例如slb)涂覆有icam-1和抗-cd3(针对t细胞)。所述活化性基质可以进一步包含抗cd28。所述活化基质可以进一步包含fas受体，使得所述核心和/或杂化颗粒包含fasl。因此，针对t细胞的活化基质可以包含icam-1和抗-cd3和/或fas受体。优选地，所述活化基质(例如slb)包含icam-1、mica和抗-cd16(针对nk细胞)。更优选地，所述活化基质是包含icam-1、mica和抗-cd16(针对活化nk细胞)或cd3(针对活化t细胞)的脂质双层表面。活化基质可能进一步涂覆有cd58，以改善t细胞和/或nk细胞的活化。cd58与黏附分子结合，可增加t细胞和/或nk细胞的活化以及促进蛋白质颗粒的释放。

271、将细胞黏附到基质上的步骤可以至少约20分钟、至少约30分钟、至少约45分钟、至少约60分钟或至少约90分钟。将细胞黏附到基质上的步骤可以为约20分钟至约4小时、约30分钟至约3小时、约45分钟至约3小时、约60分钟至约2小时或约90分钟。优选地，将细胞黏附到基质上的步骤进行约90分钟。

272、将细胞黏附到基质上的步骤可以在至少约20℃、至少约30℃、至少约35℃或至少约37℃下进行。优选地，将细胞黏附到基质上的步骤在约37℃下进行。

273、在一种实施方式中，将细胞黏附到基质上的步骤在约37℃下至少进行约60分钟(例如进行约60分钟至约2小时或进行约90分钟)或在约37℃下进行至少约90分钟。

274、优选地，在约6.5-7.5的ph下进行将细胞(以及随后的蛋白质颗粒)黏附到基质上的步骤。

275、步骤(b)将细胞从基质上剥离

276、所述细胞可以通过洗涤从所述基质上剥离。所述蛋白质颗粒可保持黏附于表面，例如与icam-1和/cd47结合。洗涤步骤可能包括冲击和机械冲洗机制以释放细胞，这是本领域技术人员熟知的。洗涤可以用缓冲液进行，例如磷酸盐缓冲盐水(pbs)，优选冷pbs。冷pbs可以是温度低于约15℃、低于约14℃、低于约13℃、低于约12℃、低于约11℃、低于约l0℃、低于约9℃、低于约8℃、低于约7℃、低于约6℃、低于约5℃、低于约4℃、低于约3℃、低于约2℃、低于约1℃的pbs。优选地，所述pbs低于约4℃。

277、步骤(c)从基质上洗脱蛋白质颗粒

278、从基质上洗脱所述蛋白质颗粒的步骤可以包括用溶剂洗涤所述基质以获得所述蛋白质颗粒的洗脱液。所述溶剂可以包含能够从基质表面释放所述蛋白质颗粒的试剂。在一种实施方式中，基质表面用咪唑处理。螯合剂也可能用于将蛋白质颗粒从基质表面释放。所述螯合剂可以是螯合ca2+的药剂，因此，所述螯合剂可以是edta。另外地或可选地，从基质(例如分离珠)洗脱蛋白质颗粒的步骤可能包括ph值的变化。例如，ph值可能增加至低于约ph 5.5、低于约ph 5、低于约ph 4.5、低于约ph 4、低于约ph 3.5或低于约ph 3，以从基质洗脱蛋白质颗粒，优选地，ph增加至约ph 5.5和约ph3之间。

279、有利地，咪唑能够从基质表面释放icam-1，其保留待洗脱的蛋白质颗粒。然后可以通过超速离心或凝胶过滤将共洗脱的icam-1和蛋白质颗粒分离。即使icam-1与蛋白质颗粒上的tsp-1结合，但亲和性低(kd>1μm)，而且在系统中存在的icam-1浓度(<10nm)下，绝大多数icam-1不会与tsp-1结合。

280、从基质洗脱所述蛋白质颗粒的步骤可以包括例如用能够释放蛋白质颗粒的试剂(例如咪唑)洗涤基质，进行至少约5分钟、至少约10分钟、至少约10分钟、至少约15分钟、至少约20分钟、至少约25分钟、至少约30分钟、至少约35分钟、至少约40分钟或至少约45分钟。

281、从基质中洗脱所述蛋白质颗粒的步骤可以包括洗涤所述基质，例如用能够释放所述蛋白质颗粒的试剂(例如咪唑)洗涤所述基质，进行不超过约5分钟，不超过约10分钟，不超过约15分钟，不超过约20分钟，不超过约25分钟，不超过约30分钟，不超过约35分钟，不超过40分钟，不超过45分钟。优选地，将蛋白质颗粒从基质上洗脱的步骤包括例如用能够释放蛋白质颗粒的试剂(例如咪唑)洗涤基质约10分钟、20分钟或30分钟。

282、将蛋白质颗粒从基质上洗脱的步骤之后可能是离心洗脱液和/或耗尽洗脱液的步骤。离心可能包括超速离心。所述洗脱液可以旋转(离心)至少约15分钟、至少约30分钟、至少约1小时、至少约2小时。洗脱液可以旋转约15分钟至约4小时，约30分钟至约2小时，或约1小时。

283、在步骤(a)之前，所述细胞(例如活化的cd3+cd8+t细胞)可以在培养基中培养至少约6小时、至少约12小时、至少约24小时、至少约48小时。所述细胞可在培养基中培养约6小时至192小时，或约12小时至96小时，或约24小时至48小时。

284、通过这些方法之一分离本发明的蛋白质颗粒可能增加其杀死癌细胞、感染细胞或细菌的能力(无需进一步工程化)。根据本发明的方法可用于生产纯度范围为约10％至约100％的蛋白质颗粒。因此，根据本发明的方法可用于生产蛋白质颗粒，蛋白质颗粒纯度为约10％至约100％、约20％至约100％、约30％至约100％、约40％至约100％、约50％至约100％、约60％至约100％、约70％至约100％、约80％至约100％或者约90％至约100％。在一种实施方式中，所述方法可用于生产纯度至少约90％或纯度至少约95％的蛋白质颗粒。优选地，根据本发明的方法用于生产基本上纯的蛋白质颗粒。然而，在一些实施方式中，少量杂质(例如外泌体)可能存在于蛋白质颗粒的组合物中。可能存在少于30％的外泌体。优选地，存在少于20％或更优选少于10％的外泌体。分离的蛋白质颗粒可以不含细胞。因此，已经使用根据本发明的方法分离/纯化的蛋白质颗粒可用于治疗。

285、根据本发明的蛋白质颗粒的分离和制备也可以适用于对杂化颗粒的分离和制备，例如从cd8+细胞。包含含有fasl的囊泡/磷脂颗粒的杂化颗粒的纯化不包括使用抗-cd81、抗-cd63或抗-cd9的免疫耗尽。

286、根据另一个方面，提供了一种包含本发明蛋白质颗粒的组合物。可选地，所述组合物是药物组合物。

287、根据另一个方面，提供了包含根据本发明的细胞和基质的试剂盒。

288、根据另一个方面，提供了根据本发明的蛋白质颗粒或根据本发明的组合物在药物中的用途。

289、根据另一个方面，提供了根据本发明的蛋白质颗粒或根据本发明的组合物在治疗受试者的疾病或病症中的用途。

290、根据另一个方面，提供了根据本发明的蛋白质颗粒或根据本发明的组合物在治疗癌症中的用途。

291、所述癌症可以是选自包含肾癌、膀胱癌、卵巢癌、乳腺癌、子宫内膜癌、胰腺癌、淋巴瘤、甲状腺癌、骨癌、cns癌、白血病、肝癌、前列腺癌、肺癌、食道癌、结肠癌、直肠癌、脑癌(例如胶质母细胞瘤)或黑色素瘤的组的癌症。

292、根据另一个方面，提供了根据本发明的工程化蛋白质颗粒或根据本发明的组合物在受试者的靶向细胞杀伤中的用途。

293、所述组合物的蛋白质颗粒，或根据本发明的用途中的蛋白质颗粒可以通过根据本发明的方法分离。

294、根据另一个方面，提供了一种治疗癌症的方法，所述方法包括向受试者施用根据本发明的蛋白质颗粒或根据本发明的组合物。

295、根据另一个方面，提供了一种靶向细胞杀伤的方法，所述方法包括向受试者施用根据本发明的工程化蛋白质颗粒或根据本发明的组合物。

296、应当理解的是，本文所用的术语"疗法"和"治疗"是指以对抗病症，例如疾病或障碍，为目的对受试者的管理和护理。该术语旨在包括针对受试者所患的特定病症的全方位治疗，包括缓解症状或并发症，延迟疾病、障碍或病症的进展，缓解或缓解症状和并发症，和/或治愈或消除疾病、障碍或病症以及预防病症。其中预防应理解为：为了防止症状或并发症的发作，管理和护理受试者以对抗疾病、病症或障碍，以及包括施用配体。

297、待治疗的受试者优选是哺乳动物，特别是人；但也可以包括动物，例如狗、猫、马、牛、羊和猪。

298、根据本发明的药物组合物可以进一步包含药学上可接受的盐或其其它形式。根据本发明的药物组合物可以包含一种或多种药学上可接受的赋形剂，例如载体、稀释剂、填充剂、崩解剂、润滑剂、粘合剂、着色剂、颜料、稳定剂、防腐剂、抗氧化剂和/溶解度增强剂。根据本发明的药物组合物可以包含药学上可接受的盐和一种或多种药学上可接受的赋形剂。

299、所述药物组合物可以通过本领域已知的技术配制。所述药物组合物可以配制成用于口服、肠胃外，例如肌肉内、静脉内、皮下、皮内、动脉内、心内、鼻内或气雾剂给药的剂型。所述药物组合物可能配制成口服给药的剂型。

300、暴露于根据本发明的细胞毒性蛋白质颗粒可以引起igfbp-3从细胞中释放。在一种实施方式中，igfbp-3可用作暴露于根据本发明的细胞毒性蛋白质颗粒的细胞的标记物。因此，在与根据本发明的蛋白质颗粒接触或给药后，可确定由细胞产生的igfbp-3的存在和/或水平。

301、术语“分离的”可以指已经从其自然环境中分离出来的生物材料，优选是借助于技术手段。术语分离可以包括从细胞(即生产细胞)的胞外分泌物分离。

302、术语“基因修饰的”可以指具有改变的核苷酸(例如蛋白质)和/或氨基酸序列的生物分子或细胞，使得所述分子或细胞在自然界中不是天然发现的。

303、形容词“转基因”可以指包含来自另一生物体的遗传信息的生物体、组织或细胞。因此，转基因核苷酸序列是指已经从一种生物体转移到本发明的细胞、组织或生物体的核苷酸序列。类似地，转基因配体是指其核苷酸序列已从一种生物体转移到本发明的细胞、组织或生物体中的配体。

304、术语“同源物”可以指的是由于物种形成(即当一个种群变成不同的物种时)而与另一个基因不同的基因。

305、本发明遗传构建体内的核苷酸序列可能是dna(如cdna)或rna(如mrna)。优选地，本文所指的第一和第二核苷酸序列是相同类型的核苷酸序列，例如，两者都是dna或两者都是rna。

306、术语“包含”是一个开放的术语，它指的是跟随该术语的所有特征，但不限于那些特征。然而，术语“包含”也包括术语“由……组成”，这是一个封闭的术语，和“基本上由”组成。“由……组成”是指该术语之后的所有特征，并且仅限于那些特征。“基本上由……组成”是指后面的所有特征，但也可以包括没有明确提及的特征，这些特征不会实质性地影响本发明的本质特征。因此，术语“包括”可指“由……组成”或“基本上由……组成”。

307、术语蛋白质颗粒可以指杂化颗粒。

308、应当理解的是，本发明延伸到任何核酸或肽或其变体、其衍生物或类似物，其基本上包含本文所指的任何序列的氨基酸或核酸序列，包括其变体或片段。术语“基本上氨基酸/核苷酸/肽序列”、“变体”和“片段”，可以是与本文所述序列中任何一个的氨基酸/核苷酸/肽序列具有至少40％序列同一性的序列，例如与本文所述的核酸或多肽具有40％同一性。还设想了与所提及的任何氨基酸/多核苷酸/多肽具有大于50％、更优选大于65％、70％、75％和更优选大于80％的序列同一性的氨基酸/多核苷酸/多肽。优选地，所述氨基酸/多核苷酸/多肽与本文所述的任何序列具有至少85％的同一性；更优选地与本文所指的任何序列具有至少90％、92％、95％、97％、98％，以及最优选至少99％的同一性。所述氨基酸/多核苷酸/多肽与本文所述的任何序列具有100％的同一性。

309、当涉及变体多肽或核苷酸序列情况下，本领域技术人员将理解，可以允许一个或多个氨基酸残基或核苷酸取代、缺失或添加。可选地，在序列中可以允许两个取代，以使得其保持其功能。本领域技术人员将理解，1、2、3、4、5或更多个氨基酸残基或核苷酸可以被取代、添加或去除而不影响功能。对序列同一性的引用可通过使用标准/默认参数的blast序列比对来确定(www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)。例如，所述序列可以具有至少99％的同一性且仍根据本发明起作用。在其它实施方式中，所述序列可能具有至少98％的同一性且仍根据本发明起作用。在其它实施方式中，所述序列可能具有至少95％的同一性且仍根据本发明起作用。在另一个实施方式中，所述序列可能具有至少90％、85％或80％的同一性并且仍然根据本发明起作用。在一种实施方式中，变异和序列同一性可能根据全长序列。在其它实施方式中，变异可限于非保守序列和/或活性位点之外的序列，例如结合结构域。因此，蛋白质的活性位点或结合位点可以是100％相同的，而侧翼序列可以包括所述的同一性变体。此类变体可能被称为“保守活性位点变体”。

310、氨基酸取代可以是保守的取代。例如，修饰的残基可以包含与野生型取代的残基基本相似的性质。例如，取代的残基可以包含与野生型取代的残基基本相似或相等的电荷或疏水性。例如，取代的残基可能包含与野生型取代残基基本相似的分子量或空间位阻。关于“变体”核酸序列，本领域技术人员将理解，1、2、3、4、5或更多密码子可以在不影响功能的情况下被取代、添加或去除。例如，可以考虑保守取代。

311、优选地，术语“片段”是指“功能片段”。功能片段可以指具有对于执行全长片段/多肽的功能所必需的氨基酸/核苷酸的片段。

312、本领域技术人员将理解如何计算两个氨基酸/多核苷酸/多肽序列之间的百分比同一性。为了计算两个氨基酸/多核苷酸/多肽序列之间的百分比同一性，必须首先准备两个序列的比对，然后计算序列同一性值。两个序列的百分比同一性可以取不同的值，这取决于：-(i)用于比对序列的方法，例如，clustalw、blast、pasta、smith-waterman(在不同的程序中实现)或3d比较中的结构比对；(ii)比对方法使用的参数，例如局部与全局比对，使用的配对分数矩阵(例如blosum62，pam250，gonnet等)和空位罚分，例如函数形式和常数。

313、在进行比对后，有许多不同的方法来计算两个序列之间的百分比同一性。例如，可能将同一性的数通过以下方法划分开：(i)最短序列的长度；(ii)对齐的长度；(iii)序列的平均长度；(iv)非空位的数量；或(iv)不包括悬垂的等价位的数量。此外，可以理解的是，百分比同一性也与长度密切相关。因此，一对序列越短，人们可以期望偶然出现的序列同一性越高。

314、因此，将认识到，蛋白质或dna序列的精确比对是一个复杂的过程。普遍的多序列比对程序clustalw(thompson等，1994,nucleic acids research,22,4673-4680；thompson等,1997,nucleic acids research,24,4876-4882)是根据本发明产生蛋白质或dna的多序列比对的优选方式。用于clustalw的合适参数可以如下：对于dna的比对：空位开放罚分＝15.0，空位扩展罚分＝6.66，以及矩阵＝同一性。对于蛋白质的比对：空位开放罚分＝10.0，空位扩展罚分＝0.2，和矩阵＝gonnet。对于dna和蛋白质的比对：endgap＝-1，gapdist＝4。本领域技术人员将认识到，可能需要改变这些和其它参数以用于最佳序列比对。

315、优选地，两个氨基酸/多核苷酸/多肽序列之间的百分比同一性的计算可以根据(n/t)*100这样的比对来计算，其中n是序列共享相同残基的位置数，t是包括空位但不包括悬垂的比较的位置总数。因此，用于计算两个序列之间的百分比同一性的最优选方法包括：(i)使用clustalw程序使用一组合适的参数制备序列比对，例如，如上文所述的；和(ii)将n和t的值插入下式中：-序列同一性＝(n/t)*100。用于鉴定相似序列的替代方法将是本领域技术人员已知的。例如，基本上相似的核苷酸序列将由在严格条件下与本文所述的任何序列或其互补物杂交的序列编码。在严格的条件下，我们指的是核苷酸在大约45℃的3x氯化钠/柠檬酸钠(ssc)中与过滤结合的dna或rna杂交，然后在大约20-65℃的o.2x ssc/0.1％sds中至少一次洗涤。可选地，与本文描述的多肽序列相比，基本相似的多肽可能相差至少1个但少于5个、少于10个、少于20个、少于50个或少于100个氨基酸。

316、由于遗传密码的简并性，很明显，本文所述的任何核酸序列可以在基本上不影响由此编码的蛋白质的序列的情况下变化或改变，以提供其变体。合适的核苷酸变体是那些具有通过替换编码序列中相同氨基酸的不同密码子而改变的序列的变体，从而产生悄然变化的核苷酸变体。其他合适的变体是那些具有同源核苷酸序列但包含全部或部分序列的变体，其通过替换编码具有与其所替代的氨基酸相似生物物理性质的侧链的氨基酸的不同密码子而改变，以产生保守变化。例如，小的非极性、疏水性氨基酸包括甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸和蛋氨酸。大的非极性、疏水性氨基酸包括苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸。极性中性氨基酸包括丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。带正电荷的(碱性)氨基酸包括赖氨酸、精氨酸和组氨酸。带负电荷的(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。因此，可以理解哪些氨基酸可能被具有相似生物物理性质的氨基酸取代，并且熟练的技术人员将知道编码这些氨基酸的核苷酸序列。

317、在对多肽序列的引用是指包含前体或前肽序列的序列情况下，本领域技术人员将认识到，在一些实施方式中，对序列的引用可能仅指成熟的多肽。例如，前体残基和信号肽可能不是根据本发明的蛋白质颗粒中的成熟多肽的一部分。因此，对此类序列的变体的引用，可能仅指给定序列的成熟多肽部分。

318、本文所述的所有实施方式和特征(包括任何随附的权利要求、摘要和附图)，和/或如此公开的任何方法或过程的所有步骤，可以与上述任何方面或实施方式的任意组合，除非参考特定组合另有说明，例如，其中至少一些这样的特征和/或步骤是互斥的组合。