针对HBV的RNA复制子疫苗的制作方法

本公开整体上涉及分子生物学和遗传工程领域，包括用于调节基因表达的核酸分子以及核酸分子例如用于在细胞培养中的合适宿主细胞或受试者中产生期望产物和赋予宿主细胞或受试者有益特征的用途。

背景技术：

1、乙型肝炎病毒(hbv)是一种小的3.2-kb的嗜肝dna病毒，编码四个开放阅读框和七种蛋白。约有20亿人感染有hbv，并且约有2.4亿人患有慢性乙型肝炎感染(慢性hbv)，其特点是血液中持续存在病毒和亚病毒颗粒超过6个月(cohen et al.j.viral hepat.(2011)18(6)，377-83)。持续的hbv感染通过病毒肽和循环抗原对hbv特异性t细胞受体的慢性刺激，导致循环和肝内hbv特异性cd4+和cd8+t细胞的t细胞衰竭。因此，t细胞的多功能性下降(即il-2、肿瘤坏死因子(tnf)-α、ifn-γ的水平下降，以及缺乏增殖)。

2、自20世纪80年代以来，一种安全有效的针对hbv感染的预防性疫苗已经问世，并且是乙型肝炎预防的主流(world health organization，hepatitis b：fact sheet no.204；2015 march)。世界卫生组织建议为所有婴儿接种疫苗，在乙型肝炎低度或中度流行的国家，为所有婴儿和儿童及青少年(<18岁)，以及某些高危人群接种疫苗。由于接种疫苗，全世界的感染率已大幅下降。然而，预防性疫苗并不能治愈已形成的hbv感染。

3、目前用ifn-α和核苷或核苷酸类似物治疗慢性hbv，但由于感染的肝细胞内持续存在称为共价闭合环状dna(cccdna)的细胞内病毒复制中间物，它作为病毒rna的模板起着基本作用，因此也是新的病毒体，因而无法彻底治愈。据认为，诱导的病毒特异性t细胞和b细胞应答可以有效地消除携带cccdna的肝细胞。目前靶向hbv聚合酶的疗法抑制病毒血症，但对驻留在细胞核中的cccdna和相关的循环抗原的产生作用有限。最严格的治愈形式可能是消除机体中的hbv cccdna，这既不是观察到的自然发生的结果，也不是任何治疗性干预的结果。然而，hbv表面抗原(hbsag)的丧失在临床上认为相当于治愈，因为只有在严重免疫抑制的情况下才会出现疾病复发，这然后可以通过预防性治疗来预防。因此，至少从临床角度来看，hbsag的丧失与最严格形式的抗hbv的免疫重建形式有关。

4、例如，用聚乙二醇干扰素(pegifn)-α进行免疫调节，据证实，与核苷或核苷酸治疗相比，在有限的治疗过程中获得持续的非治疗应答方面是更好的。除了直接的抗病毒作用，ifn-α据报道在细胞培养和人源化小鼠中对cccdna施加表观遗传抑制，从而导致病毒生产力和转录物的减少(belloni et al.j.clin.invest.(2012)122(2)，529-537)。然而，这种疗法仍然充满了副作用，而且总体应答相当低，部分地是因为ifn-α对hbv特异性t细胞仅有较差的调节影响。特别是，治愈率低(<10％)并且毒性高。同样，直接作用的hbv抗病毒药物，即hbv聚合酶抑制剂恩替卡韦和替诺福韦，作为单一疗法有效地诱导病毒抑制，对耐药突变体的出现具有高遗传屏障，并且连续预防肝病进展。然而，用这样的hbv聚合酶抑制剂很少实现治愈慢性乙型肝炎，所述治愈以hbsag丧失或血清转换所定义。因此，这些抗病毒药物理论上需要无限期地给药，以防止肝病的复发，类似于人免疫缺陷病毒(hiv)的抗逆转录病毒疗法。

5、治疗性疫苗接种有可能消除慢性感染患者的hbv(michel et al.j.hepatol.(2011)54(6)，1286-1296)。已经探索了许多策略，但迄今为止，治疗性疫苗接种尚未证明成功。

技术实现思路

1、因此，在治疗乙型肝炎病毒(hbv)，特别是慢性hbv方面，存在着未得到满足的医疗需求，需要具有较高治愈率的有限的良好耐受性。本发明通过提供用于诱导针对乙型肝炎病毒(hbv)感染的免疫应答的免疫原性组合物和方法来满足这一需求。本发明的免疫组合物和方法可用于向受试者，如患有慢性hbv感染的受试者提供治疗性免疫。

2、在一整体方面，本技术涉及一种核酸分子或组合，其包含非天然存在的多核苷酸序列。在一些实施方案中，非天然存在的多核苷酸序列包含，从5’-端至3’-端排列：

3、(1)编码第一乙型肝炎病毒(hbv)抗原的多核苷酸序列；

4、(2)第一内部核糖体进入序列(ires)元件或者编码第一自体蛋白酶肽的多核苷酸序列；以及

5、编码第二hbv抗原的多核苷酸序列。

6、其中第一hbv抗原和第二hbv抗原各自独立地选自hbv核心抗原、hbv聚合酶(pol)抗原和hbv表面抗原，并且第一hbv抗原和第二hbv抗原中的至少一个是hbv表面抗原，优选hbv pre-s1抗原或hbv pres2.s抗原。

7、在一实施方案中，第一hbv抗原或第二hbv抗原中的一个为hbv核心抗原或hbv pol抗原。

8、在一实施方案中，非天然存在的多核苷酸序列还包含，从5’-端至3’-端排列：

9、(4)第二ires元件或者编码第二自体蛋白酶肽的多核苷酸序列，其可操作地连接至编码第二hbv抗原的多核苷酸序列的3’端；和

10、(5)编码第三hbv抗原的多核苷酸序列，所述第三hbv抗原独立地选自hbv核心抗原、hbv pol抗原和hbv表面抗原。

11、在另一实施方案中，非天然存在的多核苷酸序列还包含，从5’-端至3’-端排列：

12、(6)第三ires元件或者编码第三自体蛋白酶肽的多核苷酸序列，其可操作地连接至编码第三hbv抗原的多核苷酸序列的3’端；和

13、(7)编码第四hbv抗原的多核苷酸序列，所述第四hbv抗原独立地选自hbv核心抗原、hbv pol抗原和hbv表面抗原。

14、在另一实施方案中，所述核酸分子或组合包含

15、第一非天然存在的多核苷酸序列，其包含，从5’-端至3’-端排列：

16、(1)编码第一乙型肝炎病毒(hbv)抗原的多核苷酸序列；

17、(2)第一内部核糖体进入序列(ires)元件或者编码第一自体蛋白酶肽的多核苷酸序列；和

18、(3)编码第二hbv抗原的多核苷酸序列；以及

19、第二非天然存在的多核苷酸序列，其包含，从5’-端至3’-端排列：

20、(1)编码第三乙型肝炎病毒(hbv)抗原的多核苷酸序列；

21、(2)第二内部核糖体进入序列(ires)元件或者编码第二自体蛋白酶肽的多核苷酸序列；和

22、(3)编码第四hbv抗原的多核苷酸序列，

23、其中第一非天然存在的多核苷酸序列和第二非天然存在的多核苷酸序列通过第三内部核糖体进入序列(ires)元件或者编码第三自体蛋白酶肽的多核苷酸序列连接，或者存在于不同的核酸分子中，并且

24、其中第一hbv抗原、第二hbv抗原、第三hbv抗原和第四hbv抗原独立地选自hbv核心抗原、hbv聚合酶(pol)抗原和hbv表面抗原，第一hbv抗原、第二hbv抗原、第三hbv抗原和第四hbv抗原中的至少一个是选自以下的hbv表面抗原：具有与seq id no：1或seq id no：1的氨基酸序列至少98％相同的氨基酸序列的hbvpre-s1抗原和具有与seq id no：5的氨基酸序列至少98％相同的氨基酸序列的hbvpres2.s抗原，优选地，第一hbv抗原、第二hbv抗原、第三hbv抗原或第四hbv抗原中的一个为hbv核心抗原或hbv pol抗原。

25、在另一实施方案中，第一hbv抗原、第二hbv抗原、第三hbv抗原和第四hbv抗原中的每一个互相不同。

26、在另一实施方案中，第一hbv抗原、第二hbv抗原、第三hbv抗原和第四hbv抗原中的每一个独立地选自：

27、(i)第一hbv pre-s1抗原，其包含以下氨基酸序列，优选由以下氨基酸序列组成：与seq id no：1的氨基酸序列至少98％相同的氨基酸序列，例如与seq id no：1的氨基酸序列至少98％、98.5％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％相同；

28、(ii)第二hbv pre-s1抗原，其包含以下氨基酸序列，优选由以下氨基酸序列组成：与seq id no：3的氨基酸序列至少98％相同的氨基酸序列，例如与seq id no：3的氨基酸序列至少98％、98.5％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％相同；

29、(iii)hbv pres2.s抗原，其包含以下氨基酸序列，优选由以下氨基酸序列组成：与seq id no：5的氨基酸序列至少98％相同的氨基酸序列，例如与seq id no：5的氨基酸序列至少98％、98.5％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％相同；

30、(iv)hbv核心抗原，其包含以下氨基酸序列，优选由以下氨基酸序列组成：与seqid no：7至少90％相同的氨基酸序列，例如与seq id no：7至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、95.5％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％相同；和

31、(v)hbv聚合酶抗原，其包含以下氨基酸序列，优选由以下氨基酸序列组成：与seqid no：9至少90％相同的氨基酸序列，例如与sed id no：9至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、95.5％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％相同，

32、优选地，第一hbv pre-s1抗原和第二hbv pre-s1抗原、hbv核心抗原和hbv pol抗原中的每一个独立地可操作地连接至信号肽，并且hbv pres2.s抗原包含内部信号肽。

33、在一些实施方案中，hbv核心抗原包含以下氨基酸序列，优选由以下氨基酸序列组成：与seq id no：84、85或86中的至少一个至少98％相同的氨基酸序列，例如与seq id no：84、85或86至少98％、至少99％或100％相同。在一些实施方案中，hbv核心抗原的最后5个c末端氨基酸包含vvr氨基酸序列，更特别地vvrr(seq id no：91)氨基酸序列，更特别地vvrrr(seq id no：92)氨基酸序列。

34、在一些实施方案中，hbv表面抗原、hbv核心抗原和hbv pol抗原中的每一个包含：

35、(i)hbv基因型a、b、c和d的共有序列；和/或

36、(ii)hla-a*11:01、hla-a*24:02、hla-a*02:01、hla-a*a2402、hla-a*a0101或hla-b*40:01的一个或多个表位。

37、在一些实施方案中，hbv表面抗原、hbv核心抗原和hbv pol抗原中的每一个包含hla-a*11:01的一个或多个表位。

38、在另一实施方案中，第一hbv抗原、第二hbv抗原、第三hbv抗原和第四hbv抗原中的每一个独立地选自：

39、(i)第一hbv pre-s1抗原，其由seq id no：1的氨基酸序列组成；

40、(ii)第二hbv pre-s1抗原，其由seq id no：3的氨基酸序列组成；

41、(iii)hbv pres2.s抗原，其由seq id no：5的氨基酸序列组成；

42、(iv)hbv核心抗原，其由seq id no：84、seq id no：85或seq id no：86的氨基酸序列组成；和

43、(v)hbv pol抗原，其由seq id no：9的氨基酸序列组成，

44、优选地，第一hbv pre-s1抗原和第二hbv pre-s1抗原、hbv核心抗原和hbv pol抗原中的每一个独立地可操作地连接至信号肽，例如包含seq id no：77的氨基酸序列的信号肽。

45、在另一实施方案中，编码第一hbv抗原、第二hbv抗原、第三hbv抗原和第四hbv抗原的多核苷酸序列中的每一个独立地选自：

46、(i)编码第一hbv pre-s1抗原的多核苷酸序列，其具有与seq id no：2至少90％相同的序列，例如与seq id no：2至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、95.5％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％相同；

47、(ii)编码第二hbv pre-s1抗原的多核苷酸序列，其具有与seq id no：4至少90％相同的序列，例如与seq id no：4至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、95.5％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％相同；

48、(iii)编码hbv pres2.s抗原的多核苷酸序列，其具有与seq id no：6至少90％相同的序列，例如与seq id no：6至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、95.5％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％相同；

49、(iv)编码hbv核心抗原的多核苷酸序列，其具有与seq id no：8至少90％相同的序列，例如与seq id no：8至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、95.5％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％相同；以及

50、(v)编码hbv pol抗原的多核苷酸序列，其具有与seq id no：10至少90％相同的序列，例如与seq id no：10至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、95.5％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％相同，

51、优选地，编码第一hbv pre-s1抗原和第二hbv pre-s1抗原、hbv核心抗原和hbvpol抗原中的每一个的多核苷酸序列独立地可操作地连接至编码信号肽的多核苷酸序列，并且hbv pres2.s抗原包含内部信号肽。

52、在一些实施方案中，编码第一hbv抗原、第二hbv抗原、第三hbv抗原和第四hbv抗原的多核苷酸序列中的每一个独立地选自：

53、(i)编码第一hbv pre-s1抗原的多核苷酸序列，其由seq id no：2的序列组成；

54、(ii)编码第二hbv pre-s1抗原的多核苷酸序列，其由seq id no：4的序列组成；

55、(iii)编码hbv pres2.s抗原的多核苷酸序列，其由seq id no：6的序列组成；

56、(iv)编码hbv核心抗原的多核苷酸序列，其由seq id no：87、seq id no：88或seqid no：89中任一个的序列组成；以及

57、(v)编码hbv pol抗原的多核苷酸序列，其由seq id no：10的序列组成，

58、优选地，编码第一pre-s1抗原和第二hbv pre-s1抗原、hbv核心抗原和hbv pol抗原中的每一个的多核苷酸序列独立地可操作地连接至编码信号肽的多核苷酸，例如包含seq id no：90的序列的多核苷酸。

59、在一实施方案中，第一自体蛋白酶肽、第二自体蛋白酶肽和第三自体蛋白酶肽中的每一个独立地包含选自以下的肽序列：猪捷申病毒(porcine teschovirus)-1 2a(p2a)、口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus)(fmdv)2a(f2a)、马鼻炎a病毒(equinerhinitis a virus)(erav)2a(e2a)、明脉扁刺蛾病毒(thosea adingna virus)2a(t2a)、质型多角体病毒(cytoplasmic polyhedrosis virus)2a(bmcpv2a)、软化病病毒(flacherievirus)2a(bmifv2a)及其组合。优选地，第一自体蛋白酶肽、第二自体蛋白酶肽和第三自体蛋白酶肽中的每一个包含p2a的肽序列，例如seq id no：11的p2a序列。

60、在另一实施方案中，第一ires、第二ires和第三ires中的每一个源自脑心肌炎病毒(encephalomyocarditis virus)(emcv)或肠道病毒71(enterovirs71)(ev71)。优选地，第一ires、第二ires和第三ires中的每一个包含seq id no：13或14的多核苷酸序列。

61、在一些实施方案中，所述核酸分子或组合包含非天然存在的多核苷酸序列，其包含，从5’-端至3’-端排列：

62、(1)编码具有seq id no：1或3的氨基酸序列的hbv pre-s1抗原的多核苷酸序列、编码seq id no：11的p2a氨基酸序列的多核苷酸序列或者具有seq id no：13或14的多核苷酸序列的ires、以及编码具有seq id no：5的氨基酸序列的hbv pres2.s抗原的多核苷酸序列；

63、(2)编码具有seq id no：5的氨基酸序列的hbv pres2.s抗原的多核苷酸序列、编码seq id no：11的p2a氨基酸序列的多核苷酸序列或者具有seq id no：13或14的多核苷酸序列的ires、以及编码具有seq id no：1或3的氨基酸序列的hbv pre-s1抗原的多核苷酸序列；

64、(3)编码具有seq id no：84、85或86中任一个的氨基酸序列的hbv核心抗原的多核苷酸序列、编码seq id no：11的p2a氨基酸序列的多核苷酸序列、编码具有seq seq id no：9的氨基酸序列的hbv聚合酶抗原的多核苷酸序列、编码seq id no：11的p2a氨基酸序列的多核苷酸序列、编码具有seq id no：5的氨基酸序列的hbv pres2.s抗原的多核苷酸序列、编码seq id no：11的p2a氨基酸序列的多核苷酸序列、以及编码具有seq id no：1或3的氨基酸序列的hbv pre-s1抗原的多核苷酸序列；

65、(4)编码具有seq id no：9的氨基酸序列的hbv聚合酶抗原的多核苷酸序列、编码seq id no：11的p2a氨基酸序列的多核苷酸序列、编码具有seq id no：84、85或86中任一个的氨基酸序列的hbv核心抗原的多核苷酸序列、编码seq id no：11的p2a氨基酸序列的多核苷酸序列、编码具有seq id no：5的氨基酸序列的hbv pres2.s抗原的多核苷酸序列、编码seq id no：11的p2a氨基酸序列的多核苷酸序列、以及编码具有seq id no：1或3的氨基酸序列的hbv pre-s1抗原的多核苷酸序列；

66、(5)编码具有seq id no：5的氨基酸序列的hbv pres2.s抗原的多核苷酸序列、编码seq id no：11的p2a氨基酸序列的多核苷酸序列、编码具有seq id no：1或3的氨基酸序列的hbv pre-s1抗原的多核苷酸序列、编码seq id no：11的p2a氨基酸序列的多核苷酸序列、编码具有seq id no：84、85或86中任一个的氨基酸序列的hbv核心抗原的多核苷酸序列、编码seq id no：11的p2a氨基酸序列的多核苷酸序列、以及编码具有seq id no：9的氨基酸序列的hbv聚合酶抗原的多核苷酸序列；

67、(6)编码具有seq id no：5的氨基酸序列的hbv pres2.s抗原的多核苷酸序列、编码seq id no：11的p2a氨基酸序列的多核苷酸序列、编码具有seq id no：1或3的氨基酸序列的hbv pre-s1抗原的多核苷酸序列、编码seq id no：11的p2a氨基酸序列的多核苷酸序列、编码具有seq id no：9的氨基酸序列的hbv聚合酶抗原的多核苷酸序列、编码seq idno：11的p2a氨基酸序列的多核苷酸序列、以及编码具有seq id no：84、85或86中任一个的氨基酸序列的hbv核心抗原的多核苷酸序列；

68、(7)编码具有seq id no：84、85或86中任一个的氨基酸序列的hbv核心抗原的多核苷酸序列、编码seq id no：11的p2a氨基酸序列的多核苷酸序列、编码具有seq id no：9的氨基酸序列的hbv聚合酶抗原的多核苷酸序列、具有seq id no：13的多核苷酸序列的ires、编码具有seq id no：5的氨基酸序列的hbv pres2.s抗原的多核苷酸序列、编码seq id no：11的p2a氨基酸序列的多核苷酸序列、以及编码具有seq id no：1或3的氨基酸序列的hbvpre-s1抗原的多核苷酸序列；

69、(8)编码具有seq id no：9的氨基酸序列的hbv聚合酶抗原的多核苷酸序列、编码seq id no：11的p2a氨基酸序列的多核苷酸序列、编码具有seq id no：84、85或86中任一个的氨基酸序列的hbv核心抗原的多核苷酸序列、具有seq id no：13的多核苷酸序列的ires、编码具有seq id no：5的氨基酸序列的hbv pres2.s抗原的多核苷酸序列、编码seq id no：11的p2a氨基酸序列的多核苷酸序列、以及编码具有seq id no：1或3的氨基酸序列的hbvpre-s1抗原的多核苷酸序列；

70、(9)编码具有seq id no：5的氨基酸序列的hbv pres2.s抗原的多核苷酸序列、编码seq id no：11的p2a氨基酸序列的多核苷酸序列、编码具有seq id no：11或3的氨基酸序列的hbv pre-s1抗原的多核苷酸序列、具有seq id no：13的多核苷酸序列的ires、编码具有seq id no：84、85或86中任一个的氨基酸序列的hbv核心抗原的多核苷酸序列、编码seqid no：11的p2a氨基酸序列的多核苷酸序列、以及编码具有seq id no：9的氨基酸序列的hbv聚合酶抗原的多核苷酸序列；

71、(10)编码具有seq id no：5的氨基酸序列的hbv pres2.s抗原的多核苷酸序列、编码seq id no：11的p2a氨基酸序列的多核苷酸序列、编码具有seq id no：1或3的氨基酸序列的hbv pre-s1抗原的多核苷酸序列、具有seq id no：13的多核苷酸序列的ires、编码具有seq id no：9的氨基酸序列的hbv聚合酶抗原的多核苷酸序列、编码seq id no：11的p2a氨基酸序列的多核苷酸序列、以及编码具有seq id no：84、85或86中任一个的氨基酸序列的hbv核心抗原的多核苷酸序列；

72、(11)编码具有seq id no：84、85或86中任一个的氨基酸序列的hbv核心抗原的多核苷酸序列、编码seq id no：11的p2a氨基酸序列的多核苷酸序列、编码具有seq id no：9的氨基酸序列的hbv聚合酶抗原的多核苷酸序列、具有seq id no：14的多核苷酸序列的ires、编码具有seq id no：5的氨基酸序列的hbv pres2.s抗原的多核苷酸序列、编码seqid no：11的p2a氨基酸序列的多核苷酸序列、以及编码具有seq id no：1或3的氨基酸序列的hbv pre-s1抗原的多核苷酸序列；

73、(12)编码具有seq id no：9的氨基酸序列的hbv聚合酶抗原的多核苷酸序列、编码seq id no：11的p2a氨基酸序列的多核苷酸序列、编码具有seq id no：84、85或86中任一个的氨基酸序列的hbv核心抗原的多核苷酸序列、具有seq id no：14的多核苷酸序列的ires、编码具有seq id no：5的氨基酸序列的hbv pres2.s抗原的多核苷酸序列、编码seq id no：11的p2a氨基酸序列的多核苷酸序列、以及编码具有seq id no：1或3的氨基酸序列的hbvpre-s1抗原的多核苷酸序列；

74、(13)编码具有seq id no：5的氨基酸序列的hbv pres2.s抗原的多核苷酸序列、编码seq id no：11的p2a氨基酸序列的多核苷酸序列、编码具有seq id no：1或3的氨基酸序列的hbv pre-s1抗原的多核苷酸序列、具有seq id no：14的多核苷酸序列的ires、编码具有seq id no：84、85或86中任一个的氨基酸序列的hbv核心抗原的多核苷酸序列、编码seqid no：11的p2a氨基酸序列的多核苷酸序列、以及编码具有seq id no：9的氨基酸序列的hbv聚合酶抗原的多核苷酸序列；

75、(14)编码具有seq id no：5的氨基酸序列的hbv pres2.s抗原的多核苷酸序列、编码seq id no：11的p2a氨基酸序列的多核苷酸序列、编码具有seq id no：1或3的氨基酸序列的hbv pre-s1抗原的多核苷酸序列、具有seq id no：14的多核苷酸序列的ires、编码具有seq id no：9的氨基酸序列的hbv聚合酶抗原的多核苷酸序列、编码seq id no：11的p2a氨基酸序列的多核苷酸序列、以及编码具有seq id no：84、85或86中任一个的氨基酸序列的hbv核心抗原的多核苷酸序列；

76、(15)编码具有seq id no：5的氨基酸序列的hbv pres2.s抗原的多核苷酸序列、具有seq id no：13或14的多核苷酸序列的ires、编码具有seq id no：9的氨基酸序列的hbv聚合酶抗原的多核苷酸序列、编码seq id no：11的p2a氨基酸序列的多核苷酸序列、以及编码具有seq id no：84、85或86中任一个的氨基酸序列的hbv核心抗原的多核苷酸序列；

77、(16)编码具有seq id no：5的氨基酸序列的hbv pres2.s抗原的多核苷酸序列、具有seq id no：14的多核苷酸序列的ires、编码具有seq id no：84、85或86中任一个的氨基酸序列的hbv核心抗原的多核苷酸序列、编码seq id no：11的p2a氨基酸序列的多核苷酸序列、以及编码具有seq id no：9的氨基酸序列的hbv聚合酶抗原的多核苷酸序列；

78、(17)编码具有seq id no：9的氨基酸序列的hbv聚合酶抗原的多核苷酸序列、编码seq id no：11的p2a氨基酸序列的多核苷酸序列、编码具有seq id no：84、85或86中任一个的氨基酸序列的hbv核心抗原的多核苷酸序列、具有seq id no：13或14的多核苷酸序列的ires、以及编码具有seq id no：5的氨基酸序列的hbv pres2.s抗原的多核苷酸序列；

79、(18)编码具有seq id no：84、85或86中任一个的氨基酸序列的hbv核心抗原的多核苷酸序列、编码seq id no：11的p2a氨基酸序列的多核苷酸序列、编码具有seq id no：9的氨基酸序列的hbv聚合酶抗原的多核苷酸序列、具有seq id no：13或14的多核苷酸序列的ires、以及编码具有seq id no：5的氨基酸序列的hbv pres2.s抗原的多核苷酸序列；

80、(19)编码具有seq id no：5的氨基酸序列的hbv pres2.s抗原的多核苷酸序列、编码seq id no：11的p2a氨基酸序列的多核苷酸序列、编码具有seq id no：9的氨基酸序列的hbv聚合酶抗原的多核苷酸序列、编码seq id no：11的p2a氨基酸序列的多核苷酸序列、以及编码具有seq id no：84、85或86中任一个的氨基酸序列的hbv核心抗原的多核苷酸序列；

81、(20)编码具有seq id no：5的氨基酸序列的hbv pres2.s抗原的多核苷酸序列、编码seq id no：11的p2a氨基酸序列的多核苷酸序列、编码具有seq id no：84、85或86中任一个的氨基酸序列的hbv核心抗原的多核苷酸序列、编码seq id no：11的p2a氨基酸序列的多核苷酸序列、以及编码具有seq id no：9的氨基酸序列的hbv聚合酶抗原的多核苷酸序列；

82、(21)编码具有seq id no：9的氨基酸序列的hbv聚合酶抗原的多核苷酸序列、编码seq id no：11的p2a氨基酸序列的多核苷酸序列、编码具有seq id no：84、85或86中任一个的氨基酸序列的hbv核心抗原的多核苷酸序列、编码seq id no：11的p2a氨基酸序列的多核苷酸序列、以及编码具有seq id no：5的氨基酸序列的hbv pres2.s抗原的多核苷酸序列；或者

83、(22)编码具有seq id no：84、85或86中任一个的氨基酸序列的hbv核心抗原的多核苷酸序列、编码seq id no：11的p2a氨基酸序列的多核苷酸序列、编码具有seq id no：9的氨基酸序列的hbv聚合酶抗原的多核苷酸序列、编码seq id no：11的p2a氨基酸序列的多核苷酸序列、以及编码具有seq id no：5的氨基酸序列的hbv pres2.s抗原的多核苷酸序列，

84、优选地，编码第一hbv pre-s1抗原和第二hbv pre-s1抗原、hbv核心抗原和hbvpol抗原中每一个的多核苷酸序列独立地可操作地连接至编码信号肽的多核苷酸序列，例如包含seq id no：77的氨基酸序列的信号肽。

85、在一实施方案中，所述核酸分子或组合包含seq id no：15-54中任一个的非天然存在的多核苷酸序列。

86、在另一整体的方面，本技术涉及一种载体，其包含本技术的核酸分子或组合。

87、在一实施方案中，载体为dna质粒。在另一实施方案中，载体为dna病毒载体或rna病毒载体。在一实施方案中，载体为修饰的安卡拉痘苗病毒(modified vaccinia ankara)(mva)载体或腺病毒载体。在一实施方案中，载体为ad26、ad35或mva-bn载体。

88、在另一整体的方面，本技术涉及一种rna复制子，其包含，从5’-端至3’-端排列：

89、(1)非结构蛋白介导的rna病毒扩增所需的5’非翻译区(5’-utr)；

90、(2)编码rna病毒的至少一种、优选全部非结构蛋白的多核苷酸序列；

91、(3)rna病毒的亚基因组启动子；

92、(4)本技术的核酸分子或组合；以及

93、(5)非结构蛋白介导的rna病毒扩增所需的3’非翻译区(3’-utr)。

94、在另一整体的方面，本技术涉及一种rna复制子，其包含，从5’-端至3’-端排列：

95、(1)甲病毒5’非翻译区(5’-utr)；

96、(2)甲病毒非结构基因nsp1的5’复制序列；

97、(3)病毒种的下游环(dlp)基序；

98、(4)编码第四自体蛋白酶肽的多核苷酸序列；

99、(5)编码甲病毒非结构蛋白nsp1、nsp2、nsp3和nsp4的核苷酸序列；

100、(6)甲病毒亚基因组启动子；

101、(7)本技术的核酸分子或组合；

102、(8)甲病毒3′非翻译区(3′utr)；以及

103、(9)任选地，多腺苷酸序列。

104、在一实施方案中，dlp基序来自选自以下的病毒种：东部马脑炎病毒(easternequine encephalitis virus)(eeev)、委内瑞拉马脑炎病毒(venezuelan equineencephalitis virus)(veev)、沼泽地病毒(everglades virus)(evev)、穆坎布病毒(mucambo virus)(mucv)、塞姆利基森林病毒(semliki forest viris)(sfv)、那皮舒纳病毒(pixuna virus)(pixv)、米德堡病毒(middleburg virus)(mtdv)、奇昆古尼亚病毒(chikungunya virus)(chikv)、阿尼昂-尼昂病毒(o'nyong-nyong virus)(onnv)、罗斯河病毒(ross river virus)(rrv)、巴马森林病毒(barmah forest virus)(bf)、盖塔病毒(getah virus)(get)、鹭山病毒(sagiyama virus)(sagv)、贝巴鲁病毒(bebaru virus)(bebv)、马雅罗病毒(mayaro virus)(mayv)、乌纳病毒(unavirus)(uav)、辛德毕斯病毒(sindbis virus)(sinv)、奥拉病毒(aura virus)(aurav)、沃达罗河病毒(whataroavirus)(whav)、巴班肯病毒(babanki virus)(babv)、库孜拉加奇病毒(kyzylagach virus)(kyzv)、西部马脑炎病毒(western equine encephalitis virus)(weev)、高地j病毒(highland j virus)(hjv)、摩根堡病毒(fort morgan virus)(fmv)、恩杜穆病毒(ndumu)(nduv)和博吉河病毒(buggy creek virus)。

105、在另一实施方案中，第四自体蛋白酶肽选自猪捷申病毒-1 2a(p2a)、口蹄疫病毒(fmdv)2a(f2a)、马鼻炎a病毒(erav)2a(e2a)、明脉扁刺蛾病毒2a(t2a)、质型多角体病毒2a(bmcpv2a)、软化病病毒2a(bmifv2a)及其组合。优选地，第四自体蛋白酶肽包含p2a的肽序列。

106、在另一整体的方面，本技术涉及一种rna复制子，其包含，从5’-端至3’-端排列：

107、(1)具有seq id no：55的多核苷酸序列的5’-utr；

108、(2)具有seq id no：56的多核苷酸序列的5’复制序列；

109、(3)包含seq id no：57的多核苷酸序列的dlp基序；

110、(4)编码seq id no：11的p2a序列的多核苷酸序列；

111、(5)编码甲病毒非结构蛋白nsp1、nsp2、nsp3和nsp4的多核苷酸序列，其分别具有seq id no：58、seq id no：59、seq id no：60和seq id no：61的核酸序列；

112、(6)具有seq id no：62的多核苷酸序列的亚基因组启动子；

113、(7)本技术的核酸分子或组合；以及

114、(8)具有seq id no：63的多核苷酸序列的3′utr。

115、在一实施方案中，编码p2a序列的多核苷酸序列包含seq id no：12，所述核酸分子或组合包含seq id no：15-54中任一个的多核苷酸序列，并且rna复制子在复制子的3’-端还包含多腺苷酸序列。优选地，多腺苷酸序列具有seq id no：64的序列。

116、在另一整体的方面，本技术涉及一种rna复制子，其包含seq id no：65-72中任一个的多核苷酸序列。

117、在另一整体的方面，本技术涉及一种核酸分子，其包含编码本技术的rna复制子的多核苷酸序列。

118、优选地，所述核酸还包含可操作地连接至dna序列的5’-端的t7启动子。更优选地，t7启动子包含seq id no：73的核苷酸序列。

119、在另一整体的方面，本技术涉及一种药物组合物，其包含本技术的核酸分子或组合、载体或者rna复制子，以及药学可接受的载剂。

120、在一实施方案中，药学可接受的载剂包含脂质纳米颗粒，优选地，脂质纳米颗粒包含以下的一种或多种：alc-0315、dotma、dotap、ddab、dogs、dsdma、dodma、dlindma、dlendma、γ-dlendma、dlin-k-dma、dlin-k-c2-dma、dlin-k-c3-dma、dlin-k-c4-dma、dlen-c2k-dma、y-dlen-c2k-dma、dlin-m-c2-dma、dlin-m-c3-dma、dlin-mp-dma或dcchol。

121、在另一实施方案中，药物组合物还包含：(1)编码具有seq id no：84、85或86中任一个的氨基酸序列的hbv核心抗原的多核苷酸序列、编码seq id no：11的p2a氨基酸序列的多核苷酸序列或者具有seq id no：13或14的多核苷酸序列的ires、以及编码具有seq idno：9的氨基酸序列，优选由seq id no：9的氨基酸序列组成的hbv聚合酶抗原的多核苷酸序列；或者(2)编码具有seq id no：9的氨基酸序列，优选由seq id no：9的氨基酸序列组成的hbv聚合酶抗原的多核苷酸序列、编码seq id no：11的p2a氨基酸序列的多核苷酸序列或者具有seq id no：13或14的多核苷酸序列的ires、以及编码具有seq id no：84、85或86中任一个的氨基酸序列的hbv核心抗原的多核苷酸序列。

122、在另一整体的方面，本技术涉及一种用于针对hbv对受试者进行疫苗接种的方法，所述方法包括向所述受试者给药本技术的药物组合物。在一实施方案中，所述方法还包括向受试者给药第二组合物作为初免-加强方案，所述第二组合物包含编码至少一种相同hbv抗原的核酸分子或组合。在一些实施方案中，初免-加强方案包括初免组合物和加强组合物，所述初免组合物包含本技术的rna复制子，所述加强组合物包含载体，所述载体不是rna复制子，并且编码与所述初免组合物相同的至少一种hbv表位，优选与所述初免组合物相同的至少一种hbv抗原。在一实施方案中，加强组合物包含修饰的安卡拉痘苗病毒(mva)载体、腺病毒载体或质粒载体。在一些实施方案中，加强组合物包含ad26、ad35或mva-bn载体。在一些实施方案中，初免-加强方案包括加强组合物和初免组合物，所述加强组合物包含本技术的rna复制子，所述初免组合物包含载体，所述载体不是rna复制子，并且编码与所述加强组合物相同的至少一种hbv表位，例如与所述加强组合物相同的至少一种hla表位，优选与所述加强组合物相同的至少一种hbv抗原。在一实施方案中，初免组合物包含修饰的安卡拉痘苗病毒(mva)载体、腺病毒载体或质粒载体。在一些实施方案中，初免组合物包含ad26、ad35或mva-bn载体。

123、在另一整体的方面，本技术涉及一种用于减少受试者中的hbv感染和/或复制的方法，其包括向所述受试者给药本技术的药物组合物，或者根据本技术的方法疫苗接种所述受试者。

124、在另一整体的方面，本技术涉及一种分离的宿主细胞，其包含本技术的核酸分子或组合、载体或者rna复制子。

125、在另一整体的方面，本技术涉及一种制备rna复制子的方法，其包括体内或体外转录本技术的核酸。

126、在另一整体的方面，本技术涉及本技术的药物组合物，用于在有需要的受试者中诱导针对乙型肝炎病毒(hbv)的免疫应答，优选地，所述受试者患有慢性hbv感染，任选地联合另一免疫原性剂，优选另一抗hbv剂。

127、在另一整体的方面，本技术涉及本技术的药物组合物，用于治疗有需要的受试者的乙型肝炎病毒(hbv)诱导的疾病，优选地，所述受试者患有慢性hbv感染，并且hbv-诱导的疾病选自晚期纤维化、肝硬化和肝细胞癌(hcc)，任选地联合另一治疗剂，优选另一抗hbv剂。

128、可以从以下公开内容明显看出本发明的其他方面、特征和优点，包括对本发明及其优选实施方案的详细描述和所附权利要求。