抗NME抗体及治疗癌症或癌症转移的方法与流程

1.本技术涉及nme蛋白、衍生自nme蛋白的肽和由其肽产生的抗体或根据其与所述肽结合的能力而选择的抗体或抗体片段。本技术还涉及治疗或预防与患者的nme表达相关的疾病。2.总体背景和现有技术：ndpk(核苷二磷酸蛋白激酶)蛋白是归类在一起的蛋白家族，因为它们都含有ndpk结构域。首先发现的nme蛋白，先前称为nm23蛋白，是nm23-h1和nm23-h2。数十年来，人们不清楚它们是诱导分化还是阻止造血细胞分化。本发明人先前发现，当nm23-h1是与muc1*生长因子受体结合的二聚体时，它会阻止分化，但在较高浓度下，nm23-h1变成不与muc1*结合的六聚体，而且它会诱导分化。nm23过去曾被称为转移抑制因子，当时发现它在一些极具侵袭性的癌症中表达不足。本发明人先前公开了nm23-h1二聚体与绝大多数癌症上过度表达的muc1*生长因子受体的胞外结构域结合并使之二聚化，并且这种结合促进了癌细胞的生长。相反，在较高浓度下，nm23形成不结合至muc1*且不促进肿瘤发生的四聚体和六聚体。最近，已经发现了更多的nme家族蛋白(nme 1-10)，但直到现在，还没有阐明它们的功能。nme7是新发现的nme家族蛋白，但与其他nme家族成员不同，它的ndpk结构域没有酶活性。nme7在成体组织中要么根本不表达，要么以极低的水平表达。

背景技术：

技术实现思路

1、本技术涉及一种治疗或预防对象的癌症的方法，包括向所述对象施用针对nme家族成员制造的抗体。nme家族可以是nme7家族。所述抗体可以结合至nme7。所述抗体可以结合至nme7ab或nme7ab样蛋白。所述抗体可以结合至nme7-x1。所述抗体可以抑制nme7与其同源结合伴侣之间的结合。所述同源结合伴侣可以是muc1*。所述同源结合伴侣可以是muc1*胞外结构域的psmgfr部分。在一个方面，所述抗体可能因其与选自图6至图9中所列肽(seqid no:88至145)中的肽结合的能力而被产生或选择。优选地，所述肽可以选自图9中所列出的那些肽(seq id no:141至145)。

2、所述肽可以与图6至图9中所列出的肽(seq id no:88至145)高度同源，或者在n末端或c末端添加或减去至多7个、至多6个、至多5个、至多4个、至多3个、至多2个或至多1个氨基酸残基。在一个方面，所述抗体可能因其与nme7ab或nme7-x1结合但不与nme1结合的能力而被选择。所述抗体可以是多克隆的、单克隆的、二价的、单价的、双特异性的、含有可变区的抗体片段或抗体模拟物。所述抗体可以是人的或人源化的。所述抗体可以是单链scfv。

3、在另一个方面，本发明涉及一种治疗或预防对象的癌症的方法，包括向所述对象施用与nme7ab的诸多区域高度同源或相同的肽。所述肽可以与图6中所列肽中的一种或多种至少80％同源。所述肽可以与图7中所列肽中的一种或多种至少80％同源。所述肽可以与图8中所列肽中的一种或多种至少80％同源。所述肽可以与图9中所列肽中的一种或多种至少80％同源。所述肽可以选自图6至图9中所列出的肽(seq id no:88至145)。所述肽可以选自图9中所列出的那些肽(seq id no:141至145)。或者，所述肽可以与图6至图9中所列出的肽(seq id no:88至145)高度同源，或者在n末端或c末端添加或减去至多7个、至多6个、至多5个、至多4个、至多3个、至多2个或至多1个氨基酸残基。所述肽可以通过间隔基或接头而连接至另一种肽。

4、在另一个方面，本发明涉及一种用于治疗或预防癌症的嵌合抗原受体(car)，其中所述car的靶向性胞外部分包含nme家族成员的至少一个肽片段。nme家族可以是nme7家族。所述nme7家族成员可以是nme7。或者，所述nme7家族成员可以是nme7ab或nme7ab样蛋白。所述nme7家族成员还可以是nme7-x1。所述car的靶向性胞外部分可以包括图6至图9中所列肽中的肽(seq id no:88至145)。所述肽可以选自图9中所列出的那些肽(seq id no:141至145)。所述肽可以包括一种肽，该肽与图6至图9中所列出的肽(seq id no:88至145)高度同源，或者在n末端或c末端添加或减去至多7个、至多6个、至多5个、至多4个、至多3个、至多2个或至多1个氨基酸残基。所述肽可以通过间隔基或接头而连接至另一种肽。

5、在又一个方面，本发明涉及一种治疗或预防癌症或癌症转移的方法，包括将根据权利要求3的嵌合抗原受体工程化至免疫系统细胞中以及将所述细胞施用至有需要的对象。

6、在另一个方面，本发明涉及一种用于治疗或预防癌症的嵌合抗原受体(car)，其中所述嵌合抗原受体的靶向性胞外部分包含抗体的与nme7ab、nme7ab样蛋白或nme7-x1结合的部分。所述抗体的所述部分可以是单链scfv，或者可以是人的或人源化的。

7、在又一个方面，本发明涉及一种给人接种疫苗以对抗癌症或转移性癌症的方法，包括用nme家族成员的肽片段使人免疫。nme家族可以是nme7家族。所述nme7家族成员可以是nme7或nme7b。所述nme7家族成员可以是nme7ab或nme7ab样蛋白。nme7家族可以是nme7-x1。免疫肽可以是来自图6至图9中所列肽(seq id no:88至145)的肽。优选地，所述肽可以选自图9中所列出的那些肽(seq id no:141至145)。所述免疫肽可以包括一种肽，该肽与图6至图9中所列出的肽(seq id no:88至145)高度同源，或者在n末端或c末端添加或减去至多7个、至多6个、至多5个、至多4个、至多3个、至多2个或至多1个氨基酸残基。所述免疫肽可以通过间隔基或接头而连接至另一种肽。

8、在又一个方面，本发明涉及一种治疗或预防对象的癌症的方法，包括向所述对象施用抑制nme7、nme7b、nme7ab样蛋白或nme7-x1的表达的核酸。所述核酸可以是抑制nme7、nme7ab样蛋白或nme7-x1的表达的反义核酸。所述核酸可以是抑制nme7、nme7ab样蛋白或nme7-x1的表达的抑制性rna、sirna、rnai或shrna。

9、在另一个方面，本发明涉及一种治疗或预防对象的癌症的方法，包括向所述对象施用抑制nme7、nme7b、nme7ab样蛋白或nme7-x1的表达的经基因编辑的核酸。可以将所述抑制nme7、nme7b、nme7ab样蛋白或nme7-x1的表达的经基因编辑的核酸插入细胞中，所述细胞然后可以施用于患者。可以使用病毒载体将所述抑制nme7、nme7b、nme7ab样蛋白或nme7-x1的表达的经基因编辑的核酸插入细胞中。所述病毒载体可以是慢病毒系统。

10、在另一个方面，本发明涉及一种使癌细胞生长的方法，包括使所述细胞与nme7ab、nme7b、nme7ab样蛋白或nme7-x1、2i或5i接触。所述方法可以包括在含有nme7ab、nme7b、nme7ab样蛋白或nme7-x1、2i或5i的培养基中培养所述细胞，或者使所述细胞在表达人nme7ab、nme7b、nme7ab样蛋白或nme7-x1的动物中或在被施用了nme7ab、nme7b、nme7ab样蛋白或nme7-x1的动物中生长。所述癌细胞可以是乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、结肠直肠癌、胰腺癌、肝癌、黑色素瘤或脑癌细胞。可以对所述细胞测试药物候选物。可以通过比较癌症生长与无药物对照、或比较转移性标记物或干细胞标记物的表达水平与无药物对照、或比较所得细胞相较于无药物对照在动物中从低细胞拷贝数形成肿瘤的能力并确定候选药物治疗癌症或转移的功效来评估药物的功效。所述细胞可能是从正进行癌症治疗评估的患者获得，并且使用上述方法基于结果来选择对该患者可能有效的药物。所述细胞可能不是从正进行癌症治疗评估的患者获得，但是使用上述方法基于结果来选择对该患者可能有效的药物。

11、在另一个方面，本发明涉及一种从具有衍生自nme序列的序列的肽或肽模拟物产生抗体或抗体样分子的方法。所述nme可以是nme7。所述肽可以用作免疫原以产生抗体或抗体样分子。所述肽可以施用于动物以产生抗nme7抗体。所述肽可以施用于人类以产生抗nme7抗体。所述肽可以具有图6至图9中所列出的序列(seq id no:88至145)。优选地，所述肽可以选自图9中所列出的那些肽(seq id no:141至145)。所述肽可以包括一种肽，该肽与图6至图9中所列出的肽(seq id no:88至145)高度同源，或者在n末端或c末端添加或减去至多7个、至多6个、至多5个、至多4个、至多3个、至多2个或至多1个氨基酸残基。

12、在另一个方面，本发明涉及一种检测癌症存在或癌症进展的方法，包括以下步骤：

13、1)从患有癌症或有罹患癌症风险的患者获得样品；

14、2)对该样品进行能够检测或测量nme7家族成员的水平或编码nme7家族成员的核酸的水平的测定；

15、3)将测试样品中所测量的nme7家族成员或nme7家族成员编码核酸的水平与对照患者或对照细胞中的水平相比较；

16、4)测定nme7家族成员或编码nme7家族成员的核酸的水平与对照相比有所升高；以及

17、5)如果与测试品相比较的对照来自先前诊断为患有癌症的供体，则得出结论，所述测试样品的供体患有癌症或存在癌症进展。在这种方法中，在循环或组织中检测到nme7家族成员可能指示患者中的癌症。所述nme7家族成员可以是nme7、nme7b、nme7-x1或nme7ab样蛋白。

18、在又一个方面，本发明涉及一种方法，包括：

19、在患者中检测nme7家族成员或muc1*的存在；以及

20、向表现出nme7家族成员或muc1*表达的患者施用一种或多种抗nme7或抗muc1*抗体。所述nme7家族成员可以是nme7、nme7b、nme7-x1或nme7ab样蛋白。

21、在又一个方面，本发明涉及一种治疗或预防癌症的方法，包括：

22、1)从疑似患有癌症或有罹患癌症风险或有罹患转移性癌症风险的患者获得样品；

23、2)测量nme7家族成员或nme7家族成员编码核酸的量，其中所测量的水平显著高于在对照样品中测量的水平；

24、3)确定所述患者患有癌症或已罹患更具侵袭性或转移性的癌症；

25、4)向所述患者施用有效量的治疗剂，所述治疗剂抑制nme7家族成员表达、抑制nme7切割或抑制nme7与其靶标结合。所述nme7家族成员的靶标可以是muc1*。所述nme7家族成员的靶标可以是muc1*胞外结构域的psmgfr部分。所述nme7家族成员可以是nme7、nme7b、nme7-x1或nme7ab样蛋白。

26、在以上关于癌症的任一种方法中，癌症可以包括乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、结肠直肠癌、胰腺癌、肝癌、黑色素瘤或脑癌。

27、在一个方面，本发明涉及一种与seq id no:145或seq id no:169的nme7 b3肽结合的nme7特异性抗体或其片段。所述抗体可以是单克隆抗体或二价的、单价的、fab或单链可变片段抗体(scfv)。所述抗体可以连接至抗体药物缀合物。所述药物可以连接至毒素或原毒素。

28、本发明还涉及一种编码所述抗体的分离的核酸。

29、本发明还涉及一种表达上述单克隆抗体的分离的杂交瘤。所述抗体可以特异性地结合至nme7ab或nme7-x1，但不结合至nme1。所述抗体可能会破坏nme7ab和muc1*胞外结构域之间或nme7-x1和muc1*胞外结构域之间的相互作用。或者，所述抗体可能会破坏nme7ab和psmgfr之间或nme7-x1和psmgfr之间的结合。此外，所述抗体可能会破坏nme7ab和n-10之间或nme7-x1和n-10之间的结合。

30、在另一方面，所述抗体可能不破坏nme7ab和muc1*胞外结构域之间或nme7-x1和muc1*胞外结构域之间的相互作用。nme7ab或nme7-x1可以结合至n-10肽(seq id no:170)，但不结合至c-10肽(seq id no:171)。具体地，抗体可以是5a1、4a3、5d4或4p3。

31、所述抗体可以包含重链可变区中的氨基酸序列，包括以下：

32、cdr1区中的ytftnygmn(seq id no:439)；

33、cdr2区中的wintytgeptyvddfkg(seq id no:440)；和

34、cdr3区中的lrgirpgplay(seq id no:441)；以及

35、轻链可变区中的氨基酸序列，包括

36、以下：

37、cdr1区中的sasssvsymn(seq id no:444)；

38、cdr2区中的gisnlas(seq id no:445)；和

39、cdr3区中的qqrssyppt(seq id no:446)。

40、上述这种抗体的一个示例是5a1。

41、在另一个方面，所述抗体可以包含重链可变区中的氨基酸序列，包括以下：

42、cdr1区中的ntfteytmh(seq id no:429)；

43、cdr2区中的gfnpnngvtnynqkfkg(seq id no:430)；和

44、cdr3区中的ryyhstyvfyfds(seq id no:431)；以及

45、轻链可变区中的氨基酸序列，包括

46、以下：

47、cdr1区中的sasqgisnyln(seq id no:434)；

48、cdr2区中的ytsslhs(seq id no:435)；和

49、cdr3区中的qqysklpyt(seq id no:436)。

50、上述这种抗体的一个示例是5d4。

51、在另一个方面，所述抗体可以包含重链可变区中的氨基酸序列，包括以下：

52、cdr1区中的ntfteytmh(seq id no:388)；

53、cdr2区中的gfnpnngvtnynqkfkg(seq id no:389)；和

54、cdr3区中的ryyhslyvfyfdy(seq id no:390)；以及

55、轻链可变区中的氨基酸序列，包括

56、以下：

57、cdr1区中的sasqgisnyln(seq id no:393)；

58、cdr2区中的ytsslhs(seq id no:394)；和

59、cdr3区中的qqysklpyt(seq id no:395)。

60、上述这种抗体的一个示例是4a3。

61、在另一方面，所述抗体可以包含重链可变区中的氨基酸序列，包括以下：

62、cdr1区中的ntfteytmh(seq id no:388)；

63、cdr2区中的gfnpnngvtnynqkfkg(seq id no:389)；和

64、cdr3区中的ryyhslyvfyfdy(seq id no:390)；以及

65、轻链可变区中的氨基酸序列，包括

66、以下：

67、cdr1区中的itstdidddmn(seq id no:)；

68、cdr2区中的egntlrp(seq id no:)；和

69、cdr3区中的lqsdnlplt(seq id no:)。

70、上述这种抗体的一个示例是4p3。

71、所述抗体可以是人的、人源化的或工程化的抗体模拟物。

72、所述抗体可以是非人的，诸如鼠的或骆驼的。

73、本发明还涉及一种向患者施用以预防或治疗癌症的方法，包括向所述患者施用包含上述抗体的组合物。

74、本发明还涉及一种用于在患者中预防或治疗癌症转移的方法，包括向所述患者施用包含上述抗体的组合物。

75、本发明还涉及一种用于诊断癌症或癌症转移的方法，包括使患者样本和正常样本与上述抗体接触，并比较来自两个样本的结果，其中所述患者样本中存在与所述抗体的阳性结合表明所述患者存在癌症或癌症转移。所述抗体可以连接至成像剂。所述患者样本可以是血液、体液、组织、循环细胞、体外的、体内的，包括手术中的。

76、本发明还涉及一种经工程化以表达抗nme7ab抗体或其片段的细胞。所述细胞可以是免疫细胞，诸如t细胞或nk细胞，或者干细胞或祖细胞，优选接下来分化成t细胞的干细胞或祖细胞。

77、所述细胞可以包含识别肿瘤相关抗原的嵌合抗原受体(car)。抗nme7抗体的表达可以是可诱导的。可以将编码抗nme7ab抗体的核酸插入foxp3增强子或启动子中。所述抗nme7ab抗体可以在nfat诱导型系统中。nfatc1应答元件可以插入到被插入foxp3增强子或启动子区域中的抗体序列的上游。

78、所述抗nme7ab抗体或其片段可以结合至nme7 b3肽，或者破坏nme7ab或nme7-x1与muc1*胞外结构域的psmgfr肽的结合。

79、所述car可以识别肿瘤相关抗原和抗nme7抗体。所述肿瘤相关抗原可以是muc1*。

80、本发明还涉及一种抗癌疫苗，该抗癌疫苗包含一种组合物，所述组合物包含衍生自图6至图9中所列出的nme7ab的一种或多种肽或与其具有至少80％、85％、90％、95％、97％序列同一性的肽作为免疫原性引发部分。所述肽可以是seq id no:141-145的肽或与其具有至少80％、85％、90％、95％、97％序列同一性的肽。所述肽可以是seq id no:145的肽或与其具有至少80％、85％、90％、95％、97％序列同一性的肽。

81、在另一个方面，本发明涉及一种包含上述抗体的bite。

82、在又一个方面，本发明涉及一种产生抗nme7ab抗体的方法，其中使nme7 b3肽中的半胱氨酸残基突变以避免二硫键形成。

83、在又一个方面，本发明涉及一种产生具有增强的转移潜能的细胞的方法，包括将所述细胞与nme7ab或nme7-x1一起培养。

84、本发明还涉及一种经工程化以表达nme7ab或nme7-x1的细胞、一种表达nme7ab或nme7-x1的转基因动物，其中nme7ab或nme7-x1可以是人的，而且其中nme7ab或nme7-x1的表达可以是可诱导的。