确定已感染冠状病毒或已接种冠状病毒疫苗的对象是否已发生免疫反应的方法与流程

本发明涉及医疗领域。特别地，涉及一种确定已感染冠状病毒或已接种冠状病毒疫苗的对象是否已发生免疫反应的方法。

背景技术：

1、由新型严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2(sars-cov-2)引起的冠状病毒疾病-19(covid-19)目前处于大流行状态，自2019年底报告第一个病例起已在全球迅速传播。目前，全球已克服感染的人数为约7800万，并且可能大量无症状感染者未被相应的卫生系统捕获。

2、检测出所有已克服感染后对病毒产生免疫的人的策略之一，是评估对sars-cov-2蛋白的血清抗体水平，特别是蛋白s或刺突蛋白的抗体水平。因此，检测这种抗体反应(称为体液免疫)的测试已迅速发展。通过跟踪已产生免疫的人所提供的信息有助于估计疾病负担、传播动态和传染病模型。

3、然而，基于不同研究中报告的结果，已经可能证实igm和igg的体液反应都会显示出峰值并随后下降，不会保持在长期预期水平。因此，症状消失4至10周后，抗体水平显示igg值迅速减半。此证据引起了对后恢复期中体液免疫反应的稳健性和持续性的严重担忧，后恢复期被认为是免疫策略和疫苗开发的关键时期。

4、此外，报告了一些人的covid-19的pcr(聚合酶链反应)为阳性且保护性igg抗体水平不可检测或中和抗体滴度很低。

5、另一方面，针对尚未完全了解的疾病开发疫苗接种策略这一紧急事件已揭示了为高特应性过敏风险个体接种疫苗的风险。大量的人患有过敏反应，其程度从轻度不便到导致迅速死亡不等。由于i型超敏反应引起的过敏反应通常被称为速发型超敏反应或特应性过敏，并且是由与组织肥大细胞和与循环血液嗜碱性粒细胞结合的ige类抗体介导的。ige与抗原(在这种情况下称为过敏原)交联导致过量炎症介质的释放，其导致症状。如果过敏原进入血流，则潜在死亡风险增加。虽然严重的超敏事件是罕见的，但是由于世界上许多国家现在都建议和实施强制性疫苗接种以提高covid-19疫苗接种覆盖率，这些疫苗的超敏反应数量可能显示出增加。ige介导反应的确认意味着建议对象不应该接种疫苗。

6、因此，在某种意义上，存在如下未满足的医疗需求，即发现具有成本效益的方法以判断已感染冠状病毒或已接种冠状病毒疫苗的对象是否引发适当的免疫反应，例如细胞或体液免疫反应。另一方面，目前没有方法可以检测出易对冠状病毒疫苗产生过敏反应的对象。这些具有成本效益的方法可用于检测已克服感染的对象、评估新疫苗的功效、建立接受疫苗接种的人选的优先顺序、确定感染期间细胞免疫反应的预后价值或在建议特定对象是否应该接种疫苗之前评估可能的对疫苗的严重i型超敏反应。

7、本发明专注于解决上述问题，并在本文中描述了一种用于鉴定已感染冠状病毒或已接种冠状病毒疫苗的对象的免疫反应的方法。请注意，我们没有了解到在呼吸道病毒感染的情况下用于评估免疫反应的皮肤测试。因此，据我们所知，sars-cov-2病毒的反应性皮内反应(intradermal reaction，idr)的发现将是使用这种技术来评估呼吸道病毒感染的免疫反应的第一个案例。此外，我们的技术还具有能够检测具有i型超敏反应的个体的优势，在这些个体中疫苗是潜在禁忌的。

技术实现思路

1、发明简述

2、如上所述，本发明涉及一种确定已感染冠状病毒或已接种冠状病毒疫苗的对象是否已发生免疫反应的方法(在下文称本发明的方法)。

3、本发明的方法是一种具有成本效益的程序，其可用于包括即时检验(point-of-care testing)在内的不同场景。通过本发明的方法提供的关于对象是否引发针对冠状病毒损伤的免疫反应的信息可用于不同目的，例如：检测已克服感染的对象、评估新疫苗的功效、建立接受疫苗接种的人选的优先顺序、确定感染期间细胞免疫反应的预后价值、或在建议特定对象是否应该接种疫苗之前评估可能的对疫苗的严重i型超敏反应。

4、因此，本发明的第一实施方式涉及冠状病毒衍生抗原，其用于确定已感染冠状病毒或已接种冠状病毒疫苗的对象是否已发生免疫反应的方法，该方法包括：a)确定皮内施用冠状病毒衍生抗原后风团或皮肤硬结的存在，以及b)其中风团或皮肤硬结存在则表明该对象已对冠状病毒感染产生免疫反应。此外，此实施方式还涉及确定已感染冠状病毒或已接种冠状病毒疫苗的对象是否已发生免疫反应的方法，该方法包括：a)皮内施用冠状病毒衍生抗原，b)确定皮内施用冠状病毒衍生抗原后风团或皮肤硬结的存在，以及c)其中风团或皮肤硬结存在则表明该对象已对冠状病毒感染产生免疫反应。

5、因此，本发明可用于检测对象已感染冠状病毒或已接种冠状病毒疫苗后可能出现的任何类型的免疫反应，例如(非详尽清单)：由抗体分子介导的体液免疫反应、优选地ige介导的免疫反应，或主要由t细胞介导的细胞免疫反应(细胞介导免疫)。

6、在优选的实施方式中，本发明涉及冠状病毒衍生抗原，其用于确定已感染冠状病毒或已接种冠状病毒疫苗的对象是否已发生ige介导的免疫反应的方法，该方法包括：a)确定皮内施用冠状病毒衍生抗原后风团的存在，以及b)其中抗原施用后10-30分钟内风团存在则表明该对象已对冠状病毒衍生抗原产生ige介导的免疫反应。通过对施用后10-30分钟内风团的观察，评估可能出现的ige介导的对施用抗原的超敏反应(也称为速发型超敏反应、i型超敏反应或特应性过敏)。

7、在优选的实施方式中，本发明涉及冠状病毒衍生抗原，其用于建议对象是否应该接种冠状病毒疫苗的方法，该方法包括：a)确定皮内施用冠状病毒衍生抗原后风团的存在，以及b)其中抗原施用后10-30分钟内风团存在则表明该对象已对冠状病毒衍生抗原产生ige介导的免疫反应以及对这些对象进行疫苗接种是潜在禁忌的。因此，本发明还涉及通过施用冠状病毒疫苗的方式对对象进行预防性治疗的方法，该方法包括根据上述程序确定是否已发生ige介导的免疫反应的第一或前置步骤。在这方面，虽然在已经鉴定出ige介导的免疫反应的情况下疫苗接种通常是禁忌的，但只要疫苗是由有经验的工作人员应用并采取了特定的预防措施，对象甚至可以接种疫苗。

8、在优选的实施方式中，本发明涉及冠状病毒衍生抗原，其用于确定已感染冠状病毒或已接种冠状病毒疫苗的对象是否已发生细胞介导的免疫反应的方法，该方法包括：a)确定皮内施用冠状病毒衍生抗原后皮肤硬结的存在，以及b)其中抗原施用后24-72小时内皮肤硬结存在则表明该对象已对冠状病毒感染产生细胞免疫反应。

9、在优选的实施方式中，本发明涉及冠状病毒衍生抗原，其用于确定已感染冠状病毒或已接种冠状病毒疫苗的对象是否已发生细胞介导的免疫反应的方法，该方法包括：a)确定皮内施用冠状病毒衍生抗原后皮肤硬结的存在，以及b)其中皮肤硬结存在并且皮肤硬结的长轴直径(排除通常在皮肤硬结周围形成的红斑)长于在未产生细胞免疫反应的对照对象中确定的预先设定的阈值，优选长轴直径至少为4.00mm则表明该对象已对冠状病毒感染产生细胞免疫反应。

10、在本发明的优选实施方式中，冠状病毒感染是由sars-cov-2导致的，并且抗原是由其衍生的能够引起宿主的免疫反应的分子，包括(非详尽清单)：选自刺突蛋白(s)、核衣壳蛋白(n)、膜蛋白(m)或包膜蛋白(e)的结构蛋白；灭活或减毒的病毒颗粒；分离的遗传物质或病毒样颗粒。

11、在本发明的优选实施方式中，抗原包括在药物组合物中，该药物组合物包含有效量的冠状病毒衍生抗原，以及可选地包含药学上可接受的赋形剂和/或载体。在优选的实施方式中，应用于患者的冠状病毒衍生抗原的剂量为0.050μg/0.1ml至0.500μg/0.1ml。

12、在优选的实施方式中，冠状病毒衍生抗原以任何能够到达皮内空间的方式施用，例如通过皮内注射或贴片测试的手段。

13、在优选的实施方式中，本发明包括：a)向计算机或设备中输入在皮内施用冠状病毒衍生抗原后风团或皮肤硬结的长轴直径(排除通常在风团或皮肤硬结周围形成的红斑)；优选通过从皮肤上获得的图像，以及b)通过计算机或设备系统基于根据步骤a)输入的信息和先前存储在计算机中的预先设定的阈值，提供有关发生免疫反应的结果，其中该结果由计算机系统传达给对象和/或授权的卫生人员和/或卫生系统。

14、本发明的第二实施方式涉及获得有关已感染冠状病毒或已接种冠状病毒疫苗的对象是否已发生免疫反应的信息的方法，该方法包括执行上述公开的步骤。

15、本发明的第三实施方式涉及数据处理装置、设备或系统，其包括用于实施本发明的方法的手段。

16、本发明的第四实施方式涉及配置用于实施本发明的方法的计算机程序产品。

17、本发明的第五实施方式涉及试剂盒，其包含：a)医疗设备，例如注射器，用于皮内施用冠状病毒衍生抗原，以及b)用于确定风团或皮肤硬结的存在的说明。

18、在优选的实施方式中，本发明涉及试剂盒，其包含：a)用于皮内施用冠状病毒衍生抗原的医疗设备，以及b)用于确定施用抗原后10-30分钟内风团的存在的说明。本发明还涉及这种试剂盒用于确定已感染冠状病毒或已接种冠状病毒疫苗的对象是否已发生ige介导的免疫反应，或用于建议对象是否应该接种冠状病毒疫苗的用途。

19、在优选的实施方式中，本发明涉及试剂盒，其包含：a)用于皮内施用冠状病毒衍生抗原的医疗设备，以及b)用于确定施用抗原后24-72小时内形成的皮肤硬结的长轴直径的说明。本发明还涉及这种试剂盒用于确定已感染冠状病毒或已接种冠状病毒疫苗的对象是否已发生细胞介导的免疫反应的用途。

20、本发明的第六实施方式涉及sars-cov-2衍生抗原，其用于确定已感染sars-cov-2或已接种sars-cov-2疫苗的对象是否已发生细胞和/或体液免疫反应的方法，该方法包括：

21、a.确定皮内施用sars-cov-2衍生抗原后在施用位置或其周围包括风团、皮肤硬结和/或红斑在内的局部皮肤免疫反应的存在，

22、b.其中在施用位置或其周围包括风团、皮肤硬结和/或红斑在内的局部皮肤免疫反应存在则表明该对象已对sars-cov-2产生细胞和/或体液免疫反应。

23、在本发明的优选的实施方式中，在施用位置或其周围包括风团、皮肤硬结和/或红斑在内的局部皮肤免疫反应存在并且其直径长于预先设定的阈值则表明该对象已对sars-cov-2产生细胞和/或体液免疫反应。

24、在本发明的优选的实施方式中，在施用位置或其周围包括风团、皮肤硬结和/或红斑在内的皮肤免疫反应存在并且其长轴直径长于预先设定的阈值则表明该对象已对sars-cov-2产生细胞和/或体液免疫反应。

25、在本发明的优选的实施方式中，在施用位置或其周围包括皮肤硬结和/或红斑在内的皮肤免疫反应存在并且其长轴直径为至少4.0mm则表明该对象已对sars-cov-2产生细胞和/或体液免疫反应。

26、在优选的实施方式中，本发明包括评估从风团、皮肤硬结和/或红斑的区域获得的生物样本中浸润免疫细胞(包括其祖细胞、未成熟的、成熟的、活化的和/或耗竭的亚群)和/或相关标志物(包括分化簇[cd，例如作为cd4+t细胞标志物的cd4、作为cd8+t细胞标志物的cd8和作为b细胞标志物的cd20]、细胞因子、趋化因子、受体、转运体、酶、转录因子、蛋白质、配体、mirna、代谢物、警报素和防御素)的存在或量，其中，与预先设定的阈值相比，浸润免疫细胞和/或其相关标志物的量存在增加则表明该对象已对sars-cov-2产生细胞和/或体液免疫反应。

27、在优选的实施方式中，本发明包括评估从风团、硬结和/或红斑的区域获得的生物样本中浸润淋巴细胞(包括cd4+t细胞、cd8+t细胞和b细胞)、其他单个核细胞(包括单核细胞/巨噬细胞和nk细胞)、多形核细胞(中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞)、肥大细胞和/或相关标志物的存在或量，其中，与预先设定的阈值相比，浸润淋巴细胞、其他单个核细胞、多形核细胞、肥大细胞和/或相关标志物的量存在增加则表明该对象已对sars-cov-2产生细胞和/或体液免疫反应。

28、在优选的实施方式中，本发明包括评估从硬结和/或红斑的区域获得的生物样本中浸润t细胞、其他单个核细胞(包括nk细胞、单核细胞/巨噬细胞和其他抗原呈递细胞)、多形核细胞(包括中性粒细胞)和/或相关标志物(包括cd4和cd8)的存在或量，其中，与预先设定的阈值相比，浸润t细胞、其他单个核细胞、多形核细胞和/或相关标志物的量存在增加则表明该对象已对sars-cov-2产生细胞免疫反应。

29、在优选的实施方式中，本发明包括评估从硬结和/或红斑的区域获得的生物样本中浸润细胞中cd4+/cd8+t细胞比值，其中，鉴定出cd4+/cd8+t细胞比值不同于预先设定的阈值则表明该对象已对sars-cov-2产生细胞免疫反应。

30、在优选的实施方式中，本发明包括评估从硬结和/或红斑的区域获得的生物样本中浸润细胞中cd4+/cd8+t细胞比值，其中，鉴定出cd4+/cd8+t细胞比值不同于1/1则表明该对象已对sars-cov-2产生细胞免疫反应。

31、在优选的实施方式中，本发明包括评估从硬结和/或红斑的区域获得的生物样本中浸润b细胞和/或相关标志物(包括cd20、bcr和免疫球蛋白)的存在或量，其中，与预先设定的阈值相比，浸润b细胞和/或其相关标志物(包括cd20、bcr和免疫球蛋白)的量存在增加则表明该对象已对sars-cov-2产生体液免疫反应。

32、在优选的实施方式中，本发明包括评估从硬结和/或红斑的区域获得的生物样本中浸润固有单个核细胞(包括单核细胞/巨噬细胞、nk细胞、nkt细胞和固有淋巴细胞)、多形核细胞和/或相关标志物的存在或量，其中，与预先设定的阈值相比，浸润固有单个核细胞、多形核细胞和/或其相关标志物的量存在增加则表明该对象已对sars-cov-2产生固有细胞免疫反应。

33、在优选的实施方式中，本发明包括评估从风团、硬结和/或红斑的区域获得的生物样本中浸润嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、肥大细胞和/或相关标志物的存在或量，其中，与预先设定的阈值相比，浸润嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、肥大细胞和/或其相关标志物的量存在增加则表明该对象已对sars-cov-2产生ige介导的免疫反应。

34、在优选的实施方式中，本发明包括在抗原施用区域或其周围的区域执行图像检查，以评估真皮和皮下细胞组织的特性，其中，鉴定出图像模式与预先设定的图像模式不同(例如，通常是蜂窝织炎存在)则表明该对象已对sars-cov-2产生细胞和/或体液免疫反应。

35、在优选的实施方式中，本发明包括在抗原施用区域或其周围的区域执行图像检查，以评估真皮和皮下细胞组织的厚度，其中，鉴定出厚度值高于预先设定的厚度阈值则表明该对象已对sars-cov-2产生细胞和/或体液免疫反应。

36、在优选的实施方式中，本发明包括在抗原施用区域或其周围的区域执行图像检查，以评估真皮和皮下细胞组织的厚度，其中，鉴定出厚度值是预先设定的阈值的至少两倍，优选厚度值为至少2mm则表明该对象已对sars-cov-2产生细胞和/或体液免疫反应。

37、在优选的实施方式中，本发明包括通过确定已皮内施用sars-cov-2衍生抗原的区域或其周围的区域中风团的存在，来确定已感染sars-cov-2或已接种sars-cov-2疫苗的对象是否已发生ige介导的免疫反应，其中，抗原施用后10-30分钟内风团存在且风团的直径高于预先设定的阈值则表明该对象已对sars-cov-2产生ige介导的免疫反应，以及对这些对象进行疫苗接种是潜在禁忌的。

38、本发明还涉及sars-cov-2衍生抗原，其用于通过确定已皮内施用sars-cov-2衍生抗原后在施用区域或其周围的区域中风团的存在，来建议对象是否应该接种sars-cov-2疫苗的方法，其中，抗原施用后10-30分钟内风团存在并且风团的直径高于预先设定的阈值的存在则表明该对象已对sars-cov-2感染产生ige介导的免疫反应，以及对这些对象进行疫苗接种是潜在禁忌的。

39、在优选的实施方式中，本发明包括通过确定已皮内施用sars-cov-2衍生抗原后在施用区域或其周围的区域中皮肤硬结和/或红斑的存在，来确定已感染sars-cov-2或已接种sars-cov-2疫苗的对象是否已发生细胞免疫反应，其中，抗原施用后18-72小时内皮肤硬结和/或红斑存在则表明该对象已对sars-cov-2产生细胞介导的免疫反应。

40、在优选的实施方式中，本发明包括通过确定已皮内施用sars-cov-2衍生抗原后在施用区域或其周围的区域中皮肤硬结和/或红斑的存在，来确定已感染sars-cov-2或已接种sars-cov-2疫苗的对象是否已发生igg和/或igm介导的免疫反应，其中，抗原施用后4-24小时内皮肤硬结和/或红斑存在则表明该对象已对sars-cov-2产生igg和/或igm介导的免疫反应。

41、在优选的实施方式中，上述变量具有诊断和/或预后价值，因此它们可用于体外和/或离体方法，该体外和/或离体方法用于诊断或鉴定先前暴露于sars-cov-2感染的未接种疫苗的康复患者、或正在经历sars-cov-2感染的患者；已遭受sars-cov-2感染的患者的预后和/或接种疫苗的对象未来感染sars-cov-2时疾病严重程度的预后。

42、在优选的实施方式中，抗原为衍生自sars-cov-2的能够在宿主中引发免疫反应的分子，包括：选自刺突蛋白(s)、核衣壳蛋白(n)、膜蛋白(m)或包膜蛋白(e)的结构蛋白或衍生自它们的多肽；灭活或减毒的病毒颗粒；分离的遗传物质或病毒样颗粒。

43、在优选的实施方式中，抗原包括在药物组合物中，该药物组合物可选地包含药学上可接受的赋形剂和/或载体。

44、在优选的实施方式中，本发明还涉及计算机实现的方法，其包括：

45、a.通过计算机程序接收在皮内施用sars-cov-2衍生抗原后的根据本发明评估的变量；优选借助于从皮肤获取的图像；

46、b.处理根据步骤a)的数值，以发现统计学上的显著变化或偏差；

47、c.基于根据步骤a)输入的信息和已存储在计算机中的预先设定的阈值，通过计算机系统提供有关发生免疫反应的结果，其中，该结果通过计算机系统传达给对象和/或授权的卫生人员和/或卫生系统。

48、本发明还涉及数据处理装置、设备或系统，包括用于实施上述计算机实现的方法的手段。

49、本发明还涉及配置用于实施上述计算机实现的方法的计算机程序产品。

50、本发明还涉及试剂盒，其包含：

51、a.用于皮内施用sars-cov-2衍生抗原的医疗设备，以及

52、b.用于确定在施用位置或其周围风团、皮肤硬结和/或红斑的存在的说明。

53、在优选的实施方式中，试剂盒包含用于确定抗原施用后10-30分钟内在施用位置或其周围风团的存在的说明。

54、在优选的实施方式中，试剂盒包含用于确定抗原施用后18-72小时或4-24小时内在施用位置或其周围形成的皮肤硬结和/或红斑的长轴直径的说明。

55、为了解释本发明的目的，以下术语定义为：

56、●术语“包含”是指包括，但不限于跟随在词语“包含”之后的内容。因此，使用术语“包含”，表示所列出的元素是必须的或强制性的，但是其他元素是任选的，且可以存在或者可以不存在。

57、●“由......组成”是指包括且限于跟随在词语“由......组成”后的任何内容。因此，短语“由……组成”表示所列出的元素是必须的或强制性的，并且不可以存在其他元素。

58、●“有效剂量或有效量”是指当如本文所述施用时，在宿主中产生可测量的免疫反应的量。所需的确切量因对象而异，取决于对象的年龄、以及对象的一般状况、疾病进展的严重程度、施用方式等等。在任何个案中，适当的“有效”量可由本领域普通技术人员根据本文中提供的信息使用常规实验确定。

59、●当提及本发明中评估的任何变量，例如风团、皮肤硬结和/或红斑的直径、浸润免疫细胞的存在或量、图像检查等时，本文中提到了参考对照水平。特别地，当提及从风团、皮肤硬结和/或红斑区域获得的生物样本中浸润免疫细胞和/或其相关标志物的存在或量、以及浸润细胞中cd4+/cd8+t细胞比值时，以及当提及抗原施用区域或其周围区域中真皮和皮下细胞组织的图像模式和厚度时，提到了参考对照水平。如果评估的变量不同，优选高于或低于所述参考对照水平，则对象在给定灵敏度和特异性下有可能引发细胞和/或体液免疫反应。参考值可以是“阈值”或“截止值”。通常，“阈值”或“截止值”可以通过实验、经验或理论来确定。根据本发明，“预先设定的阈值”是指先前在未产生细胞或体液免疫反应的对象中或在接受了皮内溶媒/对照施用的对象中确定的值。如果测量的患者变量不同，高于或低于所述“预先设定的阈值水平”，则对象在给定灵敏度和特异性下有可能产生具有免疫反应。如本领域普通技术人员已知的，“阈值”也可以根据现有的实验和/或临床条件任意选择。为了获得最佳灵敏度和特异性，必须根据测试的功能和收益/风险平衡(假阳性和假阴性的临床结果)来确定“阈值”。通常，可以使用基于实验数据的接受者工作特征(receiver operatingcharacteristic，roc)曲线来确定最佳灵敏度和特异性(以及“阈值”)。例如，在确定一组参照中的生物标志物水平后，可以使用算法分析对待测生物样本中生物标志物的测量浓度进行统计处理，并从而获得对样本分类具有意义的分类标准。roc曲线的全称是接受者工作特征曲线(receiver operator characteristic curve)，也称为接受者操作特性曲线(receiveroperation characteristic curve)。其主要用于临床生化诊断试验。roc曲线是反映连续变量真阳性率(灵敏度)和假阳性率(1-特异性)的综合指标。它通过图像合成方法揭示了灵敏度和特异性之间的关系。将一系列不同的截止值(阈值或临界值，即诊断试验的正常与异常结果的边界值)设置为连续变量，以计算出一系列的灵敏度值和特异性值。然后以灵敏度为纵坐标，以特异性为横坐标绘制曲线。曲线下面积(auc)越大，诊断的准确性越高。在roc曲线上，最靠近坐标图最左上角的点是同时具有高灵敏度值和高特异性值的临界点。roc曲线的auc值在1.0到0.5之间。当auc＞0.5时，随着auc接近1，诊断结果越来越好。当auc在0.5到0.7之间时，准确度低。当auc在0.7到0.9之间时，准确度中等。当auc高于0.9时，准确度很高。这种算法方法最好用计算机来完成。可以使用本领域现有的软件或系统来绘制roc曲线。

60、●“风团、皮肤硬结和/或红斑的长轴”理解为冠状病毒衍生抗原施用于对象的区域或其周围的区域中形成的风团、皮肤硬结和/或红斑上两个相对点之间的最大距离。