一种双氢青蒿素-羧甲基纤维素钠溶液的制备方法及其应用

1.本发明涉及医药技术领域，主要涉及一种双氢青蒿素-羧甲基纤维素钠溶液的制备方法及双氢青蒿素通过调节t细胞免疫应用于预防疟疾和缓解免疫抑制。


背景技术：

2.疟疾是一种由疟原虫引起的急性发热性疾病，通过受感染的雌性按蚊叮咬传播给人类。有5种寄生虫会导致人类感染疟疾，其中2种恶性疟原虫和间日疟原虫构成的威胁最大。恶性疟原虫是最致命的疟疾寄生虫，也是非洲大陆最流行的寄生虫。间日疟原虫是撒哈拉以南非洲以外大多数国家的主要疟原虫。最初的症状发烧、头痛和发冷通常在感染性蚊虫叮咬后10-15天出现，可能很轻微，难以识别为疟疾。如果不及时治疗，恶性疟原虫疟疾会在24小时内发展为严重疾病和死亡。2020年，世界上近一半的人口面临疟疾风险。一些人群感染疟疾和患上严重疾病的风险要高得多：婴儿、5岁以下儿童、孕妇和艾滋病毒/艾滋病患者，以及移居到疟疾传播严重地区的免疫力低下的人，例如移徙工人、流动人口和旅行者。由于疟疾没有疫苗，所以目前仍没有可以预防疟疾发生、发展的药物。所以急需一种能够在感染疟疾情况下激活t细胞的药物同时能够预防疟疾的进展。


技术实现要素：

3.本发明的目的在于提供一种双氢青蒿素-羧甲基纤维素钠溶液的制备方法，以期望能够从多个水平同时调节免疫系统，到达预防疟疾的效果。
4.本发明的另一目的在于提供双氢青蒿素-羧甲基纤维素钠溶液在预防疟疾药物中的应用。
5.一种双氢青蒿素-羧甲基纤维素钠溶液的制备方法，包括如下步骤：
6.步骤1，将0.5g羧甲基纤维素钠溶解在100ml蒸馏水中并用磁力搅拌器均质化3-5小时，制备得0.5％羧甲基纤维素钠溶液；
7.步骤2，待上述步骤1所得0.5％羧甲基纤维素钠溶液恢复至室温后，将双氢青蒿素加入到0.5％羧甲基纤维素钠中，并在避光下连续搅拌；得双氢青蒿素-羧甲基纤维素钠溶液。
8.所述的步骤2中，取双氢青蒿素0.2g加入到20ml 0.5％羧甲基纤维素钠中，并在4℃避光下连续搅拌12小时。
9.双氢青蒿素-羧甲基纤维素钠溶液在预防疟疾药物中的应用。
10.所述的应用具体包括下述步骤，给小鼠连续灌胃100mg/kg/d双氢青蒿素-羧甲基纤维素钠溶液26天后，取小鼠脾脏研磨至单细胞从而制备双氢青蒿素诱导的免疫细胞亚群悬浊液。
11.所述的小鼠选体重18-20g的健康雌性balb/c小鼠，所有小鼠均饲养于无特定微生物的小动物房中，保持黑暗12小时和光照12小时。
12.本发明的优点效果如下：
13.使用单细胞技术解析双氢青蒿素诱导的免疫细胞亚群悬浊液成分，并使用流式细胞仪分离t细胞亚群。将灌胃双氢青蒿素-羧甲基纤维素钠溶液26天后模型小鼠注射1*105含有疟原虫感染的红细胞，计算生存曲线和染虫率；从而研究并验证了双氢青蒿素可显著刺激t细胞亚群增殖和分化，在正常、感染疟疾条件下，双氢青蒿素所刺激的t细胞亚群具有显著性预防疟疾的作用。同时，预先灌胃双氢青蒿素可以有效地缓解疟疾的进展，延长患疟小鼠的生存周期。本研究为探究双氢青蒿素的免疫治疗提供了新的靶标，也为预防疟疾提供了新的药物。
14.本发明的意义在于：双氢青蒿素能够激活效应性调节性t细胞(tregs)、干扰素
ꢀ‑
γ(ifn-γ)
+
细胞毒性cd8
+
t细胞，而疟疾患者的免疫抑制及其死亡的重要发病机制之一就是cd4+t细胞被持续性抑制，使cd4+t细胞的数量和功能耗竭。所以双氢青蒿素所激活的t细胞亚群可以有效地预防疟疾进展。
附图说明
15.图1a为t细胞亚群被定义为初始(cd45ra+、ccr7+)、中央记忆(cm) (cd45ra-、ccr7+)、效应记忆(em)(cd45ra-、ccr7-)和末端效应(emra) (cd45ra+、ccr7-)的示意图。
16.图1b-1c为图1a对应的细胞比例柱形图。
17.图1d为调节性t细胞(tregs)免疫组化图及其对应比例示意图。
18.图1e为从在双氢青蒿素-羧甲基纤维素钠和在羧甲基纤维素钠处理的小鼠脾脏分离的cd4+cd25+foxp3+调节性t细胞亚群中cd44和cd62l的流式细胞术分析示意图。
19.图1f为图1e对应性细胞比例柱形图。
20.图2a为t细胞亚群的单细胞图。
21.图2b是每个细胞亚群对应的细胞表面标志物变化示意图。
22.图2c各个t细胞亚群比例变化示意图。
23.图2d为显示了ifng、gzma和gzmb基因的表达水平的小提琴图。
24.图2e，f和g为流式揭示双氢青蒿素(dha)改变ifn-γ表达示意图。
25.图3a为不同组血液疟原虫染虫率变化示意图。
26.图3b对应小鼠生存时间变化示意图。
具体实施方式
27.以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
28.实施例1、使用双氢青蒿素-羧甲基纤维素钠溶液制备药物处理的小鼠
29.制备100毫克/千克/天的双氢青蒿素-羧甲基纤维素钠溶液
30.0.5％羧甲基纤维素钠溶液的制备，步骤如下：
31.(1)称取羧甲基纤维素钠粉末0.5g至150ml的螺口瓶中；
32.(2)使用微波炉将实验室所用的100ml去离子水加热至沸腾状态，并持续 30s；
33.(3)将步骤(1)中所称取的0.5g羧甲基纤维素钠粉末溶解于步骤(2)中所述的去离
子水中；
34.(4)将螺口瓶中放入一个磁力转子；
35.(5)将步骤(4)的螺口瓶放入预热的磁力架中搅拌5个小时，直至溶液完全溶解。
36.双氢青蒿素-羧甲基纤维素钠溶液的制备，步骤如下：
37.(1)称取双氢青蒿素粉末0.2g至150ml的螺口瓶中；
38.(2)取20ml上述步骤(1)所制得的0.5％羧甲基纤维素钠溶液加入150ml 的螺口瓶中；
39.(3)将螺口瓶中放入一个磁力转子；
40.(4)将螺口瓶周围用锡箔纸包裹住，使内部溶液一直处于黑暗环境中；
41.(5)将步骤(4)中的螺口瓶放入4℃层析柜中，在磁力架中搅拌12小时，直至双氢青蒿素粉末溶解于0.5％羧甲基纤维素钠溶液。
42.使用双氢青蒿素-羧甲基纤维素钠溶液灌胃健康balb/c小鼠，步骤如下：
43.(1)从辽宁长生生物有限公司购买体重18至20g的健康雌性balb/c小鼠，所有小鼠均饲养于无特定微生物的小动物房中，保持黑暗12小时和光照12小时；
44.(2)待小鼠适应了小动物房饲养环境(约1周时间)后，使用0.2g灌胃针吸取双氢青蒿素-羧甲基纤维素钠溶液0.2ml灌胃至小鼠；
45.(3)分别连续灌胃小鼠8和26天；
46.(4)在灌胃结束后，称量小鼠体重并进行记录；
47.(5)使用麻醉剂将小鼠麻醉后，处死小鼠。取出脾脏后使用0.7微米的细胞筛将脾脏组织研磨成单细胞。
48.实施例2、双氢青蒿素-羧甲基纤维素钠溶液诱导的脾脏免疫细胞亚群的鉴定方式1使用单细胞方法测定双氢青蒿素诱导的免疫细胞亚群。
49.细胞捕获和cdna合成，步骤如下：
50.(1)将上述所获得的脾脏单细胞悬浮在含有0.04％bsa的pbs中；
51.(2)在芯片的每个通道加入约6,000个细胞，预计回收的目标细胞约为3,000 个细胞；
52.(3)捕获的细胞被裂解，释放的rna在单个gem中通过逆转录进行条形码标记；
53.(4)逆转录在s1000tm touch thermal cycler(bio rad)上在53℃下进行45分钟，然后在85℃，5分钟，在结束后保持在4℃；
54.生成的cdna在安捷伦4200分光光度计中确定质量。
55.单细胞文库的准备，步骤如下：
56.单细胞文库使用single cell 3’library andgel bead kit v3进行构建；
57.构建好的文库使用illumina novaseq6000测序仪进行测序。
58.数据处理，步骤如下：
59.上述获得原始测序文件使用cell ranger软件进行下游数据分析，cell ranger被用来进行数据对齐、过滤、条码计数，umi计数。使用cell ranger计数模块生成特征条码矩阵并确定聚类。使用pca和前十原则进行降维分别通过 k-means算法和基于图的算法使用组件生成集群；
60.另一种聚类方法是seurat 3.0。基因数小于200的细胞，或基因数排在前1％，或线
粒体基因比例超过25％被视为异常并过滤掉。pca降维，tsne实现可视化， umap。
61.方式2使用流式细胞术测定双氢青蒿素-羧甲基纤维素钠溶液诱导的免疫细胞亚群。
62.(1)将上述所获得的脾脏单细胞悬浮在含有0.04％bsa的pbs中；
63.(2)制备不同组合的流式抗体组合，流式抗体具体的材料以及放于上述表格中；
64.(3)优选地，第一组抗体中，抗cd45-pacific blue抗体、抗cd3-pe抗体、抗cd4-apc/750抗体、抗cd73-bv605抗体、抗cd73-bv605抗体、抗cd25-fitc 抗体、抗ccr7-594抗体、抗cd274(pd-l1)-pe/cy7抗体和抗ifn-γ-apc抗体；
65.(4)第二组抗体中，7aad、抗cd45-pacific blue抗体、抗cd3-pe抗体、抗 cd4-apc/750抗体、抗cd8-fitc抗体、抗cd45ra-apc抗体、抗cd49b-pe/cy7 抗体、抗ccr7-594抗体；
66.(5)将待测样本分别加入到流式管a和b中，使呈单个细胞悬液状态，并保证细胞量1
×
10 6/管-1
×
10 7/管；所述待测样本为脾脏；
67.(6)向步骤(5)处理得到的流式管a中加入本发明所述的试剂组合物中的第一组抗体，向步骤(5)处理得到的流式管b中加入本发明所述的试剂组合物中的第二组抗体，各流式管4度条件下避光孵育30分钟。抗体所用用量为商家推荐，按照制造商说明书进行；
68.(7)向步骤(6)孵育后的a管流式管中加入破膜剂a液，继续室温避光孵育；
69.(8)向步骤(6)孵育后的b管流式管中加入1
×
裂红溶液，向步骤(7)孵育后的乙管流式管中加入1
×
裂红溶液，继续冰上避光孵育5分钟。；
70.(9)将步骤(8)孵育后的各流式管离心后去上清；
71.(10)向步骤(9)去上清后的流式管中，分别加入pbs缓冲液洗涤，离心后去上清，用pbs缓冲液重悬细胞，即得到流式细胞上机样品。
72.实施例3、构建疟疾模型并使用双氢青蒿素-羧甲基纤维素钠溶液诱导抗疟t 细胞亚群
73.疟原虫伯氏疟原虫(plasmodium berghei)anka株，由沈阳农业大学畜牧兽医学院预防兽医学教研室保存，均在本实验室以血传或冷冻保种。待子代c57小鼠感染率水平达到15～30％时，按1
×
105个染虫红细胞腹腔注射接种于实验小鼠，记为接种第0天，即d0，次日为d1以此类推。
74.实验分3组，模型组(m)，复合双氢青蒿素-羧甲基纤维素钠溶液组、单药羧甲基纤维素钠组，每组10只。除模型组以外，其他两组小鼠在接种染虫红细胞前预先灌胃实施例1所获得100mg/千克/天的双氢青蒿素-羧甲基纤维素钠溶液或0.5％羧甲基纤维素钠。腹腔接种小鼠1
×
105个染虫红细胞即为d 0。每组动物定量取血涂制薄血膜，甲醇固定，giemsa染色后镜检，记录各组感染率情况。观察记录各组死亡率直至死亡。
75.结果
76.在这项发明中，我们发现双氢青蒿素-羧甲基纤维素钠组cd4+中央记忆t和中央记忆cd8+t细胞比例明显低于羧甲基纤维素钠组(图1a-c，双氢青蒿素
‑ꢀ
羧甲基纤维素钠组vs.羧甲基纤维素钠组：cd4+中央记忆t细胞，4.43
±
1.06vs. 7.19
±
2.51，p《0.05；cd8+中央记忆t细胞，0.59
±
0.27与1.51
±
0.85， p《0.05)。此外，在cd45+免疫细胞亚群中，与羧甲基纤维素钠组相比，双氢青蒿素-羧甲基纤维素钠组中效应记忆或终末效应记忆细胞和幼稚cd4+t细胞亚群的比例增加；相反，与羧甲基纤维素钠组相比，双氢青蒿素-羧甲基纤维素
钠组中cd8+效应记忆、终末效应记忆细胞细胞亚群和幼稚t细胞亚群的比例降低(图1a-c)。此外，双氢青蒿素-羧甲基纤维素钠能够激活脾脏中treg细胞的活性(图1d-f)。
77.单细胞结果显示cd8+幼稚t细胞和cd8+记忆t细胞的频率降低，而cd4+ 幼稚t细胞、细胞毒性cd8+t细胞和调节性t细胞的频率在双氢青蒿素-羧甲基纤维素钠处理后增加(图2a-d)，这与流式细胞术结果一致。
78.为了进一步验证上述结果，我们使用流式细胞术检测了细胞毒性cd8+t细胞中ifn-γ+cd8+t细胞的比例和ifn-γ的蛋白质表达水平。与羧甲基纤维素钠处理的小鼠相比，双氢青蒿素-羧甲基纤维素钠处理的小鼠中ifn-γ+cd8+ t细胞的比例增加(图2e，双氢青蒿素-羧甲基纤维素钠组与羧甲基纤维素钠组：37.47
±
3.01与28.83
±
4.03，p《0.05)。此外，双氢青蒿素-羧甲基纤维素钠组的cd8+t细胞表达的ifn-γ蛋白比羧甲基纤维素钠组多约2.5 倍(图2f，双氢青蒿素-羧甲基纤维素钠组与羧甲基纤维素钠组：222.25
±ꢀ
25.86与123.30
±
41.23，p《0.001)。
79.用羧甲基纤维素钠或双氢青蒿素-羧甲基纤维素钠预处理的小鼠(如图1e所示感染了伯氏疟原虫(anka株)。发现与对照组相比，用双氢青蒿素-羧甲基纤维素钠预处理可以显着减少寄生虫血症并延长p.berghei(anka)感染小鼠的存活时间(图3a和b，p《0.001)。这些结果表明双氢青蒿素-羧甲基纤维素钠可以特异性调节脾免疫细胞的一个子集并促进对寄生虫感染的先天免疫。
80.实验材料
81.82.