CDK16作为靶标在制备用于治疗三阴性乳腺癌的药物中的应用

cdk16作为靶标在制备用于治疗三阴性乳腺癌的药物中的应用
技术领域
1.本发明涉及生物医学技术领域，特别涉及cdk16作为靶标在制备用于治疗三阴性乳腺癌的药物中的应用。


背景技术：

2.乳腺癌已经成为目前女性发病率最高的恶性肿瘤，严重威胁着女性的生命健康。三阴性乳腺癌(tnbc)是指病理染色报告中，雌激素受体(er)、孕激素受体(pr)及人表皮生长因子受体2(her2)都是阴性的乳腺癌亚型，约占所有乳腺癌的10％-15％，也是目前乳腺癌治疗中最棘手的一种亚型。目前针对tnbc的治疗缺乏靶向药物，仍以化疗为主，死亡率高且极易复发和转移，因此，寻找新的有效的tnbc治疗靶点是当下亟待解决的问题。
3.因此，亟需开发有效的tnbc治疗靶点以及用于治疗三阴性乳腺癌的药物。


技术实现要素：

4.本发明目的是提供cdk16作为靶标在制备用于治疗三阴性乳腺癌的药物中的应用，本发明经过试验发现在tnbc肿瘤异种移植、pdx和pdo模型中，靶向cdk16(敲低)或者cdk16抑制剂可以抑制tnbc肿瘤的发生、发展和转移。
5.在本发明的第一方面，提供了cdk16作为靶标在制备用于治疗三阴性乳腺癌的药物中的应用。
6.进一步地，所述用于治疗三阴性乳腺癌的药物为抑制三阴性乳腺癌的发生、生长和转移的药物。
7.进一步地，所述用于治疗三阴性乳腺癌的药物包括以下成分中的至少一种：
8.cdk16抑制剂；
9.cdk16的敲除试剂。
10.进一步地，所述cdk16的敲除试剂为抑制三阴性乳腺癌细胞体外增殖、抑制三阴性乳腺癌异种移植肿瘤、pdx和pdo的生长的药物；所述cdk16抑制剂为抑制三阴性乳腺癌肿瘤的生长的药物。
11.进一步地，所述cdk16抑制剂包括小分子抑制剂rebastinib。
12.进一步地，所述cdk16敲除试剂包括：靶向目标基因的shrna和/或grna，所述shrna核苷酸序列如sedidno.1-sedidno.2所示或sedidno.3-sedidno.4所示或sedidno.5-sedidno.6所示。
13.在本发明的第二方面，提供了cdk16的敲除试剂或/和cdk16抑制剂在制备用于治疗三阴性乳腺癌的药物中的应用。
14.在本发明的第三方面，提供了一种用于治疗三阴性乳腺癌的药物，所述药物包括cdk16抑制剂和cdk16的敲除试剂中的至少一种。
15.所述药物还包括药学上可接受的辅料和载体。所述辅料包括填充剂、崩解剂、粘合
剂、赋形剂、稀释剂、润滑剂、甜味剂或着色剂中的至少一种。所述药物的剂型包括颗粒剂、片剂、丸剂、胶囊剂、注射剂或分散剂中的至少一种。
16.本发明实施例中的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：
17.本发明提供cdk16作为靶标在制备用于治疗三阴性乳腺癌的药物中的应用，本发明通过研究中发现，cdk16的敲低可以显著抑制tnbc异种移植肿瘤、pdx和pdo的生长，其机制主要是通过敲低cdk16可以抑制prc1(t481)的磷酸化，阻止细胞有丝分裂期纺锤体的形成，使细胞不能进行正常分裂，进而抑制tnbc肿瘤的发生、发展和转移。同时，研究发现cdk16的共价小分子抑制剂rebastinib在抑制tnbc肿瘤发展方面表现出非常好的效果，是一种潜在的用于tnbc治疗的新型药。
附图说明
18.为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
19.图1为cdk16在乳腺癌不同临床数据库中的表达水平及临床相关性；其中：图1a为cdk16 在tcga数据库中不同类型乳腺癌中的mrna水平；图1b为cdk16与患者总生存率相关；图1c为cdk16与患者无进展生存率相关；图1d为cdk16与患者无病生存率相关；图1e、图1f为cdk16在metabric数据库中不同类型乳腺癌中的mrna水平和总生存率；图 1g为cdk16在gse76250中正常组织和tnbc中的mrna表达水平；图1h为cdk16 在cptac数据库中正常组织和乳腺癌中蛋白表达水平；
20.图2为cdk16被敲低后，体外抑制tnbc细胞系增殖并导致细胞凋亡的结果；其中：图2a 为敲低cdk16显著抑制tnbc细胞系体外增殖；图2b为敲低cdk16显著促进tnbc细胞系的凋亡；
21.图3为cdk16被敲低后显著抑制tnbc异种移植肿瘤、pdx和pdo的生长的结果；其中：图3a为敲低cdk16显著延迟mda-mb-231肿瘤的发生；图3b为敲低cdk16显著减小 mda-mb-231肿瘤的体积；图3c、3d为敲低cdk16显著降低mda-mb-231肿瘤的重量和大小；图3e为敲低cdk16显著降低tnbc类型的pdo的大小和数量；图3f为敲低cdk16 显著抑制tnbc类型的pdo的增殖；图3g为敲低cdk16显著延迟tnbc类型的pdx肿瘤的发生；图3h为敲低cdk16显著减小tnbc类型的pdx肿瘤的体积；图3i、3j敲低 cdk16显著降低tnbc类型的pdx肿瘤的重量和大小；
22.图4为敲低cdk16抑制tnbc转移，过表达cdk16促进tnbc转移的结果；其中：图4a 为敲低cdk16抑制4t1细胞的全身转移；图4b为过表达cdk16促进emt6细胞的全身转移；
23.图5为cdk16小分子抑制剂rebastinib显著抑制tnbc异种移植肿瘤、pdx和pdo 的生长的结果；其中：图5a、5b、5c、5d为rebastinib显著抑制mda-mb-231肿瘤的体积、重量和大小；图5e为rebastinib显著抑制tnbc类型的pdo的大小；图5f为rebastinib显著降低tnbc类型的pdo的数量；图5g为rebastinib显著抑制tnbc类型的pdo的增殖，促进tnbc类型的pdo的凋亡；图5h、5i、5j、5k为rebastinib显著抑制tnbc类型的 pdx肿瘤的体积、重量和大小。
具体实施方式
24.下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。
25.在整个说明书中，除非另有特别说明，本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此，除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾，本说明书优先。
26.除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等，均可通过市场购买获得或者可通过现有方法获得。
27.本技术实施例的技术方案为解决上述技术问题，总体思路如下：
28.第一部分是在tnbc肿瘤细胞(mda-mb-231,pdx,pdo)中敲低cdk16，体外3d培养及体内成瘤实验发现，敲低cdk16可以显著抑制tnbc肿瘤的发生发展。
29.第二部分是在tnbc肿瘤异种移植、pdo及pdx模型中，发现cdk16小分子抑制剂rebastinib可以显著抑制tnbc肿瘤的生长。
30.下面将结合实施例及实验数据对本技术的cdk16作为靶标在制备用于治疗三阴性乳腺癌的药物中的应用进行详细说明。
31.实施例1、在tnbc肿瘤细胞中敲低cdk16，在肿瘤细胞系异种移植、pdx和pdo模型中考察肿瘤的发生发展情况
32.1、载体构建
33.(1)shrna
34.①
scrambleshrna(作为干扰的阴性对照组):
35.正义链：
36.5'-ccggcaacaagatgaagagcaccaactcgagttggtgctcttcatcttgttgtttttg-3'(sedidno.7)
37.反义链：
38.5'-aattcaaaaacaacaagatgaagagcaccaactcgagttggtgctcttcatcttgttg-3'(sedidno.8)
39.②
cdk16-shrna-1:
40.正义链：
41.5'-cgggacctacattaagctggacaactcgagttgtccagcttaatgtaggtctttttg-3'(sedidno.1)
42.反义链：
43.5'-aattcaaaaagacctacattaagctggacaactcgagttgtccagcttaatgtaggtc-3'(sedidno.2)
44.③
cdk16-shrna-2:
45.正义链：
46.5'-ccggcgaggagttcaagacatacaactcgagttgtatgtcttgaactcctcgtttttg-3'(sedidno.3)
47.反义链：
48.5'-aattcaaaaacgaggagttcaagacatacaactcgagttgtatgtcttgaactcctcg-3' (sed id no.4)
49.④
cdk16-shrna-3:
50.正义链：
51.5'-ccgggctctcatcactccttcacttctcgagaagtgaaggagtgatgagagctttttg-3' (sed id no.5)
52.反义链：
53.5'-aattcaaaaagctctcatcactccttcacttctcgagaagtgaaggagtgatgagagc-3' (sed id no.6)
54.(2)将每个shrna的正义链和反义链进行退火，退火后58bp的寡核苷酸双链插入到 plko.1载体上(plko.1载体通过ecor1和age1内切酶双酶切线性化，后酶连)，得到 cdk16的shrna敲低质粒，plko.1载体上含有gfp或mcherry基因序列。
55.2、慢病毒包装和细胞转导
56.质粒的提取使用了dp118(tiangen biotech)试剂盒。用hek293t细胞进行慢病毒的包装。具体方法如下：
57.(1)将hek293t细胞铺于10cm培养板中，用dmem完全培养基培养，确保第二天转染时细胞达到80％-90％的汇合度；
58.(2)将vesicular stomatitis virus g质粒，pcmv-δ8.9包装质粒及目的质粒共20μg按5： 3：2的质量比加入到950μl opti-mem中，混匀后加入60μl pei转染试剂，再次震荡混匀后静置15min；
59.(3)转染hek293t细胞：将质粒均匀地滴入hek293t培养液中，6-8h后吸去培养基，再加入10ml新鲜的dmem完全培养基，然后继续培养至转染48小时后，收集细胞上清。经4000rpm离心10min后，上清用0.45μm的滤膜过滤即得到慢病毒溶液。
60.(4)慢病毒感染肿瘤细胞：对于细胞系的感染，将细胞铺于6孔板中培养24h，细胞贴壁后吸去培养基，换成慢病毒溶液，24h后换成新鲜培养基继续培养24h，荧光显微镜下观察细胞荧光，用流式细胞仪将阳性细胞分选出来建系扩增用于后续实验。对于病人原代细胞的感染，从病人组织中分离出原代肿瘤单细胞，将细胞铺于6孔板或培养皿中，加入慢病毒溶液，悬浮感染24h后，离心收集细胞，流式细胞仪分选出阳性细胞用于pdx或pdo 的构建。
61.3、tnbc肿瘤细胞系的原位移植成瘤
62.经慢病毒感染的乳腺肿瘤细胞用50％fbs(pbs稀释)重悬，以1：1的体积比加入 matrigel，再加入0.04％的台盼蓝，混匀后置于冰上直至接种小鼠。将小鼠麻醉后，将其腹部朝上置于实验台上，沿中线和两侧下肢的方向用剪刀将其腹部表皮剪出“y”型开口(勿剪开腹膜)。用棉签和镊子向两侧剥离，暴露出第4对乳腺脂肪垫并用针头固定表皮。用注射器吸取10-20μl细胞悬液并注入乳腺脂肪垫内，最后合拢两侧皮肤并用手术钉进行缝合，待伤口愈合后可拆除手术钉。自手术起，每天观察记录小鼠肿瘤的发生情况。约一周左右，用游标卡尺测量并记录肿瘤的长宽并监测小鼠体重的变化。肿瘤体积通过以下公式计算：体积(mm3)＝长
×
宽
×
宽
×
0.52。
63.4、pdx模型的构建
64.经慢病毒感染的病人原代肿瘤细胞按照3中所述方法原位注射到nsg小鼠第四对乳腺脂肪垫中，观察并记录肿瘤的发生情况。
65.5、pdo模型的建立
66.将慢病毒感染的病人原代肿瘤细胞用预冷matrigel重悬至浓度为2
×
104cells/50μlmatrigel，将matrigel滴加到24孔培养板中，37℃静置15-20min，待其聚合后，加入乳腺癌肿瘤类器官培养基培养，每三天更换一次新鲜培养基，统计类器官生长数量和大小。
67.结果如图1-图4所述；
68.由图1可知，cdk16在乳腺癌中尤其是三阴性乳腺癌中高表达且与临床生存率相关。
69.由图2可知，cdk16被敲低后，体外抑制tnbc细胞系增殖并导致细胞凋亡；
70.由图3可知，cdk16被敲低后显著抑制tnbc异种移植肿瘤、pdx和pdo的生长；
71.由图4可知，敲低cdk16抑制tnbc转移，过表达cdk16促进tnbc转移。
72.实施例2、考察cdk16抑制剂rebastinib对肿瘤生长和转移的抑制作用
73.1、rebastinib抑制mda-mb-231移植瘤和pdx生长
74.同实施例1中肿瘤细胞系原位移植操作，待肿瘤大小长至50cm3，将小鼠分为对照组 (溶剂)和rebastinib给药组(80mg/kg)，每组3只，连续灌胃给药(mda-mb-231移植瘤给药13天，pdx给药11天)，中间每天称量小鼠体重，每三天测量肿瘤大小，给药完成后处死小鼠称量肿瘤重量。
75.2、rebastinib抑制tnb pdo生长
76.与实施例1中pdo模型建立操作相似，将tnbc病人来源的原代肿瘤细胞用预冷的 matrigel重悬至浓度为2
×
104cells/50μl matrigel，将matrigel滴加到24孔培养板中，37℃静置15-20min，待其聚合后，加入乳腺癌肿瘤类器官培养基培养，每三天更换一次新鲜培养基，将pdo分成不处理组、溶剂对照组、abemaciclib低、高剂量组(剂量分别为1μm、 5μm)和rebastinib低、高剂量组(剂量分别为1μm、5μm)共6组，pdo培养三天后开始按组别加药处理，一周后统计类器官的大小和数目。结果如图5所示；
77.由图5可知，cdk16小分子抑制剂rebastinib显著抑制tnbc异种移植肿瘤、pdx和 pdo的生长。
78.最后，还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
79.尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
80.显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。