牛磺酸在制备预防和治疗耐药结核病药物中的应用的制作方法

1.本发明涉及生物医药领域，具体涉及牛磺酸在制备预防和治疗耐药结核病药物中的应用。


背景技术：

2.结核病(tuberculosis，tb)是一种由常见的胞内菌结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis，mtb)感染引起的传染性呼吸道疾病，根据世界卫生组织统计数据显示，2018年全球约1,000万人患有tb，145万人因tb而死亡，所以tb仍是严重危害人民健康的公共卫生问题。耐多药结核病(mdr-tb)，是指结核病人感染的mtb至少对一线抗结核药物异烟肼、利福平耐药。耐药结核病尤其是耐多药结核病已成为结核病控制工作的三大挑战之一，严重威胁人们在结核病控制领域取得的成就，尤其是广泛耐药结核病(xdr-tb)已然成为一种新的不治之症。目前药物的治愈率低，死亡率高，成为结核病疫情控制的主要难点，而我国耐药结核病的疫情更是严峻，急需开发新的治疗药物和手段，以实现国家降低结核病发病率、死亡率的迫切要求。
3.目前研究认为肉芽肿是所有mtb感染的典型特征，是宿主抑制mtb的主要防御机制。然而mtb通过适应宿主肉芽肿不利环境，长期存活并伺机增殖促进肉芽肿恶化，形成活动性结核病。研究结核性肉芽肿的关键调节因子，将有助于研发针对结核病，尤其是耐药结核病的有效药物，为结核病的预防和根治提供策略依据。
4.宿主对mtb的免疫反应起始于肺泡巨噬细胞和树突状细胞将结核菌吞噬，然后通过自噬体成熟、抗菌肽的产生和活性氧/活性氮(ros/rns)的产生，直接清除胞内结核菌。在巨噬细胞中，诱导型一氧化氮合酶(induced nitrogen monoxide synthase，inos)通过将l-精氨酸转化为l-瓜氨酸，进而生成一氧化氮(no)，对胞内mtb的细胞壁脂质、蛋白质、核酸产生破坏性影响进而实现细菌的清除。促进inos的表达，可以加强对胞内mtb的清除，有可能实现对结核病的控制。研究已发现，一种抗结核新药pretomanid可以通过促进不同种rns的产生来杀死休眠的mtb,用于耐药结核病的治疗。更多基于ros/rns杀菌机制的药物仍有待于进一步的开发。
5.宿主靶向治疗(host-directed therapy，hdt)不直接杀死结核菌，而是通过调节宿主的免疫功能，控制结核菌感染。多个临床研究表明hdt药物辅助治疗可以有效缩短患者用药时间，尤其对于mdr-tb患者具有明显疗效。目前，hdt在结核病领域还是一种新兴的治疗方案，已经报道并开发的药物还非常有限。因此找到更多靶向宿主抗结核免疫通路，尤其是靶向肉芽肿进展的hdt药物迫在眉睫，对于临床开发治疗新手段具有重要意义。近年来，越来越多的研究表明绝大多数疾病的发生发展都伴随着局部或整体的代谢异常，而通过干预相关代谢通路或人工添加具有保护作用的代谢产物，可以直接影响很多疾病，尤其是癌症的转归，有可能作为新的治疗方法应用于临床。但是代谢产物在抗耐药结核病治疗中的应用还缺乏相关研究和报道。
6.前期发明人通过mtb感染肉芽肿小鼠的肺脏和外周血比较代谢组学分析，发现牛
磺酸(taurine)和亚牛磺酸代谢通路的主要代谢产物牛磺酸在小鼠肺脏肉芽肿和外周血中的含量都显著下调，提示牛磺酸可能参与到结核病的发生和发展过程中，但其在制备治疗耐药结核病药物中的应用未见报道。


技术实现要素：

7.为了克服现有技术中的缺陷，本发明提供了牛磺酸在制备预防和治疗耐药结核病药物中的应用。
8.为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
9.本发明的第一方面是提供牛磺酸在制备预防和治疗耐药结核病药物中的应用，该药物的有效成分包括牛磺酸。
10.本发明的第二方面是提供牛磺酸在制备预防和治疗耐多药结核病药物中的应用，该药物的有效成分包括牛磺酸。
11.进一步地，该药物的有效成分由牛磺酸组成。
12.进一步地，该药物的有效成分包括牛磺酸和一线抗mdr-tb药物。
13.进一步地，该药物的有效成分包括牛磺酸、贝达喹啉(bedaquiline，bdq)和利奈唑胺(linezolid，lzd)。
14.进一步地，该药物的有效成分包括牛磺酸、贝达喹啉、利奈唑胺、左氧氟沙星、氯法齐明和环丝氨酸。
15.进一步地，该药物的有效成分包括牛磺酸、贝达喹啉、利奈唑胺、莫西沙星、氯法齐明和环丝氨酸。
16.进一步地，上述药物还包括药学上可接受的载体或赋形剂，其包括粘合剂、填充剂、稀释剂、压片剂、润滑剂、崩解剂、着色剂、调味剂、湿润剂中的一种或几种。
17.进一步地，上述药物的剂型为片剂、胶囊剂、口服液、口含剂、颗粒剂、冲剂、丸剂、散剂、膏剂、丹剂、混悬剂、粉剂、溶液剂、注射剂、栓剂、霜剂、喷雾剂或滴剂。
18.本发明的第三方面是提供一种预防和治疗耐药结核病的药物组合物，包括牛磺酸、贝达喹啉和利奈唑胺。
19.进一步地，上述药物组合物还包括左氧氟沙星、氯法齐明和环丝氨酸。
20.进一步地，上述药物组合物包括如下质量份数的药物：贝达喹啉3-6份、利奈唑胺10-16份、牛磺酸15-25份、左氧氟沙星8-12份、氯法齐明1-4份、环丝氨酸8-12份。
21.进一步地，上述药物组合物还包括莫西沙星、氯法齐明和环丝氨酸。
22.进一步地，上述药物组合物包括如下质量份数的药物：贝达喹啉3-6份、利奈唑胺10-16份、牛磺酸15-25份、莫西沙星6-12份、氯法齐明1-4份、环丝氨酸8-12份。
23.本发明采用以上技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：
24.本发明验证了牛磺酸可以减轻病理变化、抑制结核菌的胞内/体内存活、促进巨噬细胞对结核菌的杀伤和清除，且能显著增强一线抗耐多药结核病(mdr-tb)药物组合的杀菌效果，因此牛磺酸有望作为新的有效代谢分子，单独或结合一线抗mdr-tb药物用于制备预防和治疗结核病的药物。
附图说明
25.图1显示了本发明一实施例中mdr感染小鼠不同处理后肺脏荷菌量检测结果；
26.图2显示了本发明一实施例中mdr感染小鼠不同处理后肺脏h&e染色结果；
27.图3显示了本发明一实施例中mdr感染小鼠用对照、bdq+lzd或bdq+lzd+taurine处理前、后荷菌量检测结果；
28.图4显示了本发明一实施例中mdr感染小鼠用对照、bdq+lzd或bdq+lzd+taurine处理后肺脏h&e染色结果；
29.图5显示了本发明一实施例中mdr感染巨噬细胞用对照、牛磺酸或emb处理后胞内cfu结果；
30.图6显示了本发明一实施例中mdr感染巨噬细胞用对照或牛磺酸处理后inos基因表达结果。
具体实施方式
31.本发明提供了牛磺酸在制备治疗耐药结核病，特别是耐多药结核病药物中的应用，该药物的有效成分包括牛磺酸。
32.在本发明一优选的实施方式中，该药物的有效成分由牛磺酸组成。
33.在本发明一优选的实施方式中，该药物的有效成分包括牛磺酸和一线抗mdr-tb药物。
34.在本发明一优选的实施方式中，该药物的有效成分包括牛磺酸、贝达喹啉和利奈唑胺。
35.在本发明一优选的实施方式中，该药物的有效成分包括牛磺酸、贝达喹啉、利奈唑胺、左氧氟沙星、氯法齐明和环丝氨酸。
36.在本发明一优选的实施方式中，该药物的有效成分包括牛磺酸、贝达喹啉、利奈唑胺、莫西沙星、氯法齐明和环丝氨酸。
37.在本发明一优选的实施方式中，上述药物还包括药学上可接受的载体或赋形剂，其包括粘合剂、填充剂、稀释剂、压片剂、润滑剂、崩解剂、着色剂、调味剂、湿润剂中的一种或几种。
38.在本发明一优选的实施方式中，上述药物的剂型为片剂、胶囊剂、口服液、口含剂、颗粒剂、冲剂、丸剂、散剂、膏剂、丹剂、混悬剂、粉剂、溶液剂、注射剂、栓剂、霜剂、喷雾剂或滴剂。
39.本发明还提供了一种治疗耐药结核病的药物组合物，包括牛磺酸、贝达喹啉和利奈唑胺。
40.在本发明一优选的实施方式中，上述药物组合物还包括左氧氟沙星、氯法齐明和环丝氨酸。
41.在本发明一优选的实施方式中，上述药物组合物包括如下质量份数的药物：贝达喹啉3-6份、利奈唑胺10-16份、牛磺酸15-25份、左氧氟沙星8-12份、氯法齐明1-4份、环丝氨酸8-12份；更优选包括如下质量份数的药物：贝达喹啉4份、利奈唑胺12份、牛磺酸24份、左氧氟沙10份、氯法齐明2份、环丝氨酸9份。
42.在本发明一优选的实施方式中，上述药物组合物还包括莫西沙星、氯法齐明和环
丝氨酸。
43.在本发明一优选的实施方式中，上述药物组合物包括如下质量份数的药物：贝达喹啉3-6份、利奈唑胺10-16份、牛磺酸15-25份、莫西沙星6-12份、氯法齐明1-4份、环丝氨酸8-12份；更优选包括如下质量份数的药物：贝达喹啉4份、利奈唑胺12份、牛磺酸24份、莫西沙星8份、氯法齐明8份、环丝氨酸9份。
44.下面通过具体实施例和附图对本发明进行详细和具体的介绍，以使更好的理解本发明，但是下述实施例并不限制本发明范围。
45.实施例中方法如无特殊说明的采用常规方法，使用的试剂如无特殊说明的使用常规市售试剂或按常规方法配制的试剂。
46.实施例1
47.本实施例利用c57bl/6小鼠感染模型，分析牛磺酸对耐药结核病的作用，具体的操作步骤和结果如下：
48.将6-8周雌性c57bl/6小鼠，每组6只，放入absl-3适应1周后，通过气溶胶途径感染mdr菌株，约200cfu/鼠。感染3周后，对照组(mock组)给予饮水，药物对照组给予乙胺丁醇(emb)灌胃给药(10mg/kg)，牛磺酸组(taurine组)在饮水中添加牛磺酸(1％)，给药4周后处死小鼠。通过检测以下指标，分析牛磺酸对耐药结核病的作用：
49.1)肺脏荷菌量：无菌条件下收集肺脏，加入pbs匀浆，10倍稀释后接种于7h10琼脂培养基上，37℃培养4周，观察mtb生长情况，计算活菌cfu数，统计肺脏荷菌量，结果发现饮用牛磺酸的小鼠，感染mdr的肺脏荷菌量显著降低，且显著低于emb给药组(图1)。
50.2)肺部组织病理学检测：无菌条件下收集肺脏，取部分肺组织用4％多聚甲醛固定，脱水、浸蜡、包埋、切片，h&e染色，显微镜观察肺部组织病理学变化，结果发现饮用牛磺酸的小鼠肺部病理改变与对照组相比明显减轻，免疫细胞浸润和肺组织损伤也明显减少，优于emb给药组(图2)。
51.上述结果表明，牛磺酸可以显著降低mdr菌感染小鼠肺脏、脾脏的荷菌量，减轻病理变化，效果优于一线抗结核药物乙胺丁醇。
52.实施例2
53.本实施例利用balb/c小鼠感染模型，分析牛磺酸联合一线抗mdr-tb药物组合对耐药结核病的作用，具体的操作步骤和结果如下：
54.将6-8周雌性balb/c小鼠，每组6只，放入absl-3适应1周后，通过气溶胶途径感染mdr菌株，约200cfu/鼠。感染3周后，处死一组小鼠，检测给药前荷菌量，另外3组小鼠，对照组给予溶剂灌胃及饮用水，药物对照组给予bdq(25mg/kg)+lzd(45mg/kg)灌胃给药及饮用水，牛磺酸组给予bdq(25mg/kg)+lzd(45mg/kg)灌胃，同时饮水中添加牛磺酸(1％)，给药4周后处死小鼠。通过检测以下指标，分析牛磺酸与一线抗mdr-tb药物组合联合使用的作用：
55.①
肺脏荷菌量：无菌条件下收集肺脏，加入pbs匀浆，10倍稀释后接种于7h10琼脂培养基上，37℃培养4周，观察mtb生长情况，计算活菌cfu数，统计肺脏荷菌量，结果发现bdq+lzd+taurine给药组的小鼠，感染mdr的肺脏荷菌量显著降低，且显著低于bdq+lzd药物对照组(图3)。
56.②
肺部组织病理学检测：无菌条件下收集肺脏，取部分肺组织用4％多聚甲醛固定，脱水、浸蜡、包埋、切片，h&e染色，显微镜观察肺部组织病理学变化，结果发现bdq+lzd+
taurine给药组的小鼠肺部病理改变与对照组相比明显减轻，免疫细胞浸润和肺组织损伤也明显减少，优于bdq+lzd药物对照组(图4)。
57.上述结果表明，牛磺酸可以显著增强一线抗mdr结核药物组合的杀菌效果，进一步显著降低mdr菌感染小鼠肺脏的荷菌量，减轻病理变化。
58.实施例3
59.本实施例利用巨噬细胞体外感染模型，分析牛磺酸对巨噬细胞胞内耐药结核菌存活的影响，具体的操作步骤和结果如下：
60.取野生型小鼠腹腔原代巨噬细胞，用完全1640培养基(含10％fbs+1％青霉素-链霉素)37℃培养过夜，感染mdr，moi＝2。感染3小时后，去上清，pbs清洗细胞三次去除胞外菌，分别加入对照、含牛磺酸(10mm)或emb(10μg/ml)的1640培养基继续培养24小时后，通过cfu检测胞内菌的存活情况。结果发现，牛磺酸显著促进巨噬细胞对mdr的胞内清除，效果与emb相当(见图5)。
61.实施例4
62.本实施例利用巨噬细胞感染模型，分析牛磺酸对巨噬细胞杀菌功能的影响，具体的操作步骤和结果如下：
63.取野生型小鼠腹腔巨噬细胞，加入终浓度为10mm的牛磺酸处理12小时后，给予mdr感染，moi＝2。分别感染0、4、8小时后，去上清，用1ml trizol裂解细胞，提取rna，通过qrt-pcr检测inos基因表达水平的变化，确定牛磺酸对巨噬细胞rns产生的影响。结果发现牛磺酸可以显著促进inos的产生(图6)。
64.以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。