含蛭弧菌组合物

文档序号:31053928发布日期:2022-08-06 10:14阅读:128来源:国知局
含蛭弧菌组合物

1.本发明涉及医药领域,具体涉及含蛭弧菌组合物。


背景技术:

2.蛭弧菌(bdellovibrio bacteriovorus)为革兰氏阴性菌,最早由stolp和petold于1962年发现。它的菌体较小,能通过细菌滤器,通常为0.25~0.5μm宽和0.75~1.25μm长,弧状或杆状,端生单鞭毛,专性需氧,属于三角洲变形菌纲。
3.蛭弧菌具有捕食的特性,是一类以捕食细菌为生的寄生性细菌。其宿主范围广,能够裂解大部分革兰氏阴性细菌(如大肠杆菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、创伤弧菌等)和一部分革兰氏阳性菌(如金黄色葡萄球菌),具有独特的生物学特性即“寄生”和“裂解”宿主菌。当蛭弧菌吸附在宿主菌细胞壁上后,通过“钻孔”效应,进入宿主细胞的周质空间,蛭弧菌侵入周质空间的同时失去鞭毛,受到感染的宿主细胞开始膨胀,形成“蛭质体”。“蛭质体”利用宿主细胞的营养物质增长,并完成分裂,形成许多带鞭毛的子代细胞。最后宿主细胞壁被裂解,释放子代蛭弧菌,寻找下一个目标。因而蛭弧菌被叫作“寄生者”或“捕食者”。
4.蛭弧菌不侵染真核细胞,对生物体不产生影响,用蛭弧菌对小鼠、豚鼠和家兔等动物各种途径(包括肺吸入、静脉注射、腹腔注射)侵染,均呈现无毒性,安全性好;将其用于猴肾、hela细胞组织培养亦不引起任何细胞病变。蛭弧菌作为一种新型的绿色微生态制剂已得到了初步的开发利用,但传统给药方式,如口服、注射,使蛭弧菌进入人体后较快被免疫系统清除,并不能有效到达感染部位,限制了蛭弧菌作为治疗剂的应用。
5.水凝胶(hydrogels)是一种亲水性的具有三维空间网络结构的体系。空间中含有大量水分,与人体组织相似,生物相容性好,体内可降解,可用作隐形眼镜、组织工程支架、药物缓释工具、伤口敷料和角膜移植等。水凝胶可通过物理方式载药,也可通过共价结合的方式载药,可装载小分子药物、大分子蛋白、基因药物等。原位凝胶(in situ gels)作为水凝胶的一种,除了具有传统水凝胶的亲水性三维网络结构及良好的组织相容性外,有其自身的特点,即以溶液状态给药,在用药部位对环境刺激响应,立即发生相转变,形成非化学交联的半固体制剂。这种溶液-凝胶转变性质使其兼有制备简单、使用方便、与用药部位特别是粘膜组织亲和力强、滞留时间长等优点。
6.由于肺复杂而特殊的生理结构,使得肺部给药制剂需满足一定的条件:一般认为空气动力学粒径为1~5μm的微粒较适合肺部给药;当微粒的空气动力学粒径小于1μm时容易被肺泡做气体交换时呼出;而当微粒的空气动力学粒径大于10μm时,将被呼吸道粘膜排出。大多孔微球通过减小单个颗粒的密度,减小空气动力学粒径,提高肺内分布,使其有效沉积于肺部。
7.感染性疾病的暴发和流行严重威胁着公共卫生安全,造成的死亡占全部死因的25%以上。临床细菌感染性疾病的常见致病菌包括大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、表皮葡萄球菌、流感嗜血杆菌、肺炎链球菌等。皮肤和眼睛是直接暴露在空气中的组织,一旦发生损伤,创伤部位很容易被细菌感染而导致疾病;
呼吸系统是人体与外界环境进行气体交换的器官系统,同样易遭受病原微生物的侵袭,肺部感染是发病率较高的呼吸系统感染性疾病。
8.创伤包括物理性(机械力、声波、射线、热力等因素所致)、化学性(化学制剂、毒气、药物等所致)和生物性创伤(动物或生物咬伤)。受损的皮肤由于失去其自我保护机制,因而积累组织液导致伤口处病原体和微生物的大量入侵和繁殖,从而导致严重的伤口感染,延缓伤口愈合过程,引发伤口溃烂不愈,甚至会引起脓毒血症、截肢等不良并发症,严重时会导致死亡。因此,伤口感染是创伤后最常出现、影响最大的一个严重问题。世界卫生组织调查统计显示,每年全球因为伤口感染死亡的人数较高,已经达到了500万人。据报道战后死亡的人员中有2/3~3/4的死因与严重感染有关。伤口感染具体是指病原微生物通过伤口侵入机体后,在体内生长、繁殖,致机体的正常功能、代谢、组织结构受到破坏,引起组织损伤性病变的病理反应。临床伤口感染常见的病原菌有铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、表皮葡萄球菌等。随着气候变暖、海上作业活动及海产品消费的不断增加,病原性海洋弧菌感染事件和病例越来越多,其中创伤弧菌被归为最危险的细菌之列。伤口一旦被创伤弧菌感染,如得不到及时有效的治疗,会快速发展为伤口坏死、导致严重脓毒症、甚至截肢,严重危害人类健康。目前临床对伤口感染采取常规抗菌药物干预的方法。尽管抗生素治疗在创伤救治中发挥了重要作用,但是随着慢性伤口感染,特别是细菌生物膜感染的出现,加上长期大量广泛使用抗生素导致的耐药问题,使伤口感染的有效治疗变得越来越困难。
9.角膜是位于眼球最前方的透明组织。角膜没有血管,处于免疫赦免状态,营养成分和氧气主要来自于空气、泪液及房水。角膜直接与外界接触,容易受到外伤、病原微生物、理化因素的损伤而导致角膜炎。细菌性角膜炎是临床最常见的致盲性角膜病变之一,约占感染性角膜炎的90%。铜绿假单胞菌是细菌性角膜炎的主要病原菌,细菌毒力强,能迅速引起严重炎症反应,破坏角膜基质形成溃疡。若是没有得到及时诊断和治疗,容易发展成角膜穿孔,甚至发展为眼内炎,更甚者需要摘除眼球。目前铜绿假单胞菌性角膜炎的治疗方案以抗菌治疗为主,氨基糖苷类和氟喹诺酮类抗生素是临床常用药物。但是近年来随着耐药菌株的出现,抗生素逐渐失效,所以亟需寻找新的有效的抗菌方法。
10.细菌性肺炎是最常见的肺部感染性疾病之一,主要的致病菌有肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌等,常见症状为咳嗽、高热、脓性痰等,对免疫力差的群体(儿童、老人)威胁极大。采用抗生素的抗菌治疗是临床的一线方案,对普通细菌性肺炎具有良好疗效。然而,抗生素的不合理使用造成病原菌的耐药性不断增加,普通抗生素已无法满足临床需要,常用多种二、三线抗生素联用克服细菌耐药性,而细菌不断变异,产生新的耐药菌,形成恶性循环,最终导致“无药可用”。另外,抗生素通过口服或静注的方式进行全身给药,易造成过敏反应、毒性反应、特异质反应等副作用。据估计,目前每年全球范围内耐药菌至少造成700000人死亡。耐药菌的出现给临床用药和感染防控带来巨大挑战,如何有效防治耐药细菌性肺炎已经成为临床面临的重要问题。


技术实现要素:

11.本发明公开了含蛭弧菌组合物,并且发现其用于不同组织的抗细菌感染有特殊效果。
12.含蛭弧菌组合物选自含蛭弧菌水凝胶、含蛭弧菌原位凝胶、含蛭弧菌大多孔微球。
13.蛭弧菌常以蛭弧菌冻干粉或蛭弧菌混悬液形态保存,优选的是蛭弧菌混悬液。
14.含蛭弧菌水凝胶可以采用以下步骤制备:制备水凝胶,将水凝胶和蛭弧菌混悬液混合,利用凝胶的高吸水性将蛭弧菌载入凝胶,得到含蛭弧菌水凝胶。
15.含蛭弧菌水凝胶还可以采用以下步骤制备:制备水凝胶,进一步制备成干凝胶,将干凝胶和蛭弧菌混悬液混合,利用干凝胶的强吸水性将蛭弧菌载入凝胶,得到含蛭弧菌水凝胶。
16.含蛭弧菌原位凝胶可以采用以下步骤制备:制备原位凝胶,将原位凝胶和蛭弧菌混悬液混合,利用原位凝胶的亲水性将蛭弧菌载入凝胶,得到含蛭弧菌原位凝胶。
17.含蛭弧菌大多孔微球可以采用以下步骤制备:制备大多孔微球混悬液,将大多孔微球混悬液和蛭弧菌混悬液混合,利用大多孔微球的几何效应和电荷吸附效应,将蛭弧菌载入微球中,得到含蛭弧菌大多孔微球。
18.含蛭弧菌大多孔微球还可以采用以下步骤制备:制备大多孔微球混悬液,进一步制备成大多孔微球固体,将大多孔微球固体和蛭弧菌混悬液混合,利用大多孔微球的几何效应和电荷吸附效应,将蛭弧菌载入微球中,得到含蛭弧菌大多孔微球。
19.水凝胶的制备方法,可以参考相关专业书籍和文献制备得到,具体地,其制备方法选自溶解法和交联法。交联法选自辐射交联法、戊二醛交联法、硼酸交联法、环氧氯丙烷交联法、冷冻-解冻交联法、离子交联法,优选自冷冻-解冻交联法、离子交联法。本发明中的水凝胶,具有多孔结构,其孔径为1μm~500μm。
20.原位凝胶的制备方法,可以参考相关专业书籍和文献制备得到,具体地,其制备方法选自离子交联法、酶催化交联法、嵌段共聚物相转化法等方法,优选的是离子交联结合嵌段共聚物相转化法。本发明中的原位凝胶,其触发形成凝胶的条件包括温度和离子浓度,分别称为温度敏感性原位凝胶和离子敏感性原位凝胶,也可以同时具有温敏性和离子敏感性,即获得温度/离子双重敏感性原位凝胶。
21.大多孔微球的制备方法,可以参考相关专业书籍和文献制备得到,具体地,其制备方法选自乳化溶剂挥发法、超临界流体技术、喷雾干燥法、界面缩聚法、静电喷射法、微流控技术等方法,优选的是乳化溶剂挥发法。本发明中的大多孔微球,具有大多孔结构,其粒径为1μm~50μm,孔径为0.5μm~10μm。
22.本发明中水凝胶的基质材料选自透明质酸、海藻酸盐、果胶、角叉菜胶、葡聚糖硫酸盐、壳聚糖、聚赖氨酸、聚多巴胺、胶原蛋白、明胶、弹性蛋白、蚕丝蛋白、羧甲基壳聚糖、纤维素、普鲁兰、肝素、葡聚糖、琼脂糖、硫酸软骨素、支链淀粉、核苷酸、聚乙二醇、聚乳酸、聚己内酯、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚乙二醇-聚乳酸-聚乙二醇共聚物、聚乙二醇-聚己内酯-聚乙二醇共聚物、聚乳酸-聚乙二醇-聚乳酸共聚物、聚n-丙基/异丙基/环丙基丙烯酰胺、聚乙烯乙酸酯、聚乙烯醇、泊洛沙姆、聚有机磷腈、甲基丙烯酸甲酯-甲基丙烯酸羟乙酯共聚物、聚(乙二醇-缩氨酸)、藻朊酸盐接枝聚环氧烷、胶原蛋白接枝聚丙烯酸酯、透明质酸接枝异丙基丙烯酰胺的一种或多种,优选自透明质酸、海藻酸盐、壳聚糖、明胶、聚乙二醇、聚乳酸、聚乙烯醇的一种或多种,更优选自海藻酸盐、明胶、聚乙二醇、聚乙烯醇的一种或多种,最优选的是海藻酸盐和聚乙烯醇的组合。当采用海藻酸盐和聚乙烯醇的组合作为水凝胶基质材料时,采用以下步骤制备水凝胶:分别配制聚乙烯醇水溶液和海藻酸钠水溶液,混
合得到聚乙烯醇-海藻酸钠混合溶液,采用冷冻-熔融法使聚乙烯醇交联,然后将其浸泡在氯化钙溶液中,使海藻酸钠交联,用水洗去多余氯化钙,制得聚乙烯醇-海藻酸钙凝胶。上述制备步骤中的海藻酸钠和聚乙烯醇的质量比选自1∶20~4∶1,优选自1∶10~2∶1,更优选自1∶5~1∶1;氯化钙溶液的摩尔浓度选自0.01mol/l~2mol/l,优选自0.05mol/l~1mol/l,更优选自0.1mol/l~0.5mol/l。
23.本发明中原位凝胶的基质材料选自泊洛沙姆、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚卡波菲、聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物、聚乙二醇-聚己内酯嵌段共聚物、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、甲基纤维素、羟丙甲基纤维素、乙基羟乙基纤维素、木聚糖、透明质酸、壳聚糖、普鲁兰多糖、卡波姆、葡聚糖、海藻酸盐、结冷胶、去乙酰结冷胶、异丙基丙烯酰胺壳聚糖、聚维酮碘、丙烯酸衍生物的一种或多种,优选自泊洛沙姆、聚卡波菲、卡波姆、海藻酸盐、结冷胶、去乙酰结冷胶的一种或多种,更优选自泊洛沙姆、海藻酸盐、结冷胶、去乙酰结冷胶的一种或多种,最优选的是泊洛沙姆和去乙酰结冷胶的组合。当采用泊洛沙姆和去乙酰结冷胶的组合制备原位凝胶时,泊洛沙姆和去乙酰结冷胶的质量比选自100∶1~10∶1,优选自80∶1~20∶1,更优选自60∶1~40∶1。
24.本发明中大多孔微球的基质材料选自甲壳素、壳聚糖、羧甲基壳聚糖、聚多巴胺、聚氨基酸、甲基纤维素、纤维素、淀粉、海藻酸盐、琼脂糖、葡甘聚糖、纤维蛋白、蚕丝蛋白、丙烯酸树脂、聚(n-异丙基丙烯酰胺)、聚己内酯、聚乳酸、聚羟基乙酸、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚原酸酯、聚乳酸-聚乙二醇-聚乳酸共聚物的一种或多种,优选自壳聚糖、聚多巴胺、海藻酸盐、聚乳酸、聚乳酸-羟基乙酸共聚物的一种或多种。当采用乳化溶剂挥发法制备大多孔微球时,采用以下步骤制备:取大多孔微球的基质材料溶于有机溶剂中,得到基质材料的有机溶液,称取正电荷材料溶于上述溶液中,得到含电荷材料的基质材料有机溶液作为油相;取致孔剂溶于水作为内水相;取防粘连剂溶于水作为外水相;将内水相加到油相中,剪切形成油包水初乳;将初乳注入到外水相中,剪切形成水包油包水复乳,持续搅拌挥去有机溶剂;继续在热水中搅拌,离心后用水洗,制得大多孔微球混悬液,冻干后得到大多孔微球固体。致孔剂选自碳酸氢铵、明胶。正电荷材料选自十八胺、十六烷基三甲基溴化铵。防粘连剂为聚乙烯醇。当采用明胶、聚乙烯醇、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、十八胺的组合制备大多孔微球时,聚乳酸-羟基乙酸共聚物和十八胺的质量比选自2∶1~40∶1,优选自5∶1~30∶1,更优选自10∶1~20∶1;制备过程中明胶所占的质量百分比选自10%~80%,优选自20%~60%,更优选自30%~50%;制备过程中聚乙烯醇溶液的质量体积浓度选自0.2%~5%,优选自0.5%~3%,更优选自1%~2%。
25.含蛭弧菌水凝胶制备步骤中的干凝胶制备方法是采用已制备好的水凝胶干燥后得到。含蛭弧菌大多孔微球制备步骤中的大多孔微球固体制备方法是采用已制备好的大多孔微球混悬液干燥后得到。干燥的方法选自常压加热干燥法、减压加热干燥法、冷冻干燥法、超临界干燥法,优选自冷冻干燥法、超临界干燥法,最优选的是冷冻干燥法。
26.含蛭弧菌组合物制备步骤中的蛭弧菌混悬液可以从市场上直接购买,也可以将购买的含蛭弧菌的固体粉末剂或混悬剂通过加工得到。加工的过程涉及到的步骤主要包括蛭弧菌的扩增及蛭弧菌的纯化。蛭弧菌的扩增是将蛭弧菌混悬液与宿主菌混合培养。宿主菌选自革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌,优选的是革兰氏阴性菌。革兰氏阴性菌选自大肠杆菌、创伤弧菌、溶藻弧菌、副溶血性弧菌、铜绿假单胞菌、沙门氏菌、变形杆菌、痢疾杆菌、肺炎杆
菌、布氏杆菌、流感(嗜血)杆菌、副流感(嗜血)杆菌、卡他(摩拉)菌、不动杆菌、耶尔森菌、嗜肺军团、志贺菌、巴斯德菌、类志贺吡邻单胞菌,优选自大肠杆菌、创伤弧菌、副溶血性弧菌,最优选自大肠杆菌。蛭弧菌的纯化是从蛭弧菌混悬液中分离出纯度较高的蛭弧菌。分离方法选自离心法、过滤法。离心法选自普通离心法、差速离心法、密度梯度离心法,优选的是普通离心法。过滤法采用的滤膜孔径选自1.2μm、0.45μm、0.22μm,优选的是0.45μm。
27.制备含蛭弧菌组合物时,蛭弧菌的装载方法可以采用吸附法、包埋法、交联法和共价结合法。吸附法,也称为载体结合法,一般通过自然附着力(物理吸附、离子结合等)的方法将细菌固定在载体的表面与内部,此方法操作简单,对细菌活性的影响很小。包埋法是将细菌包埋在聚合物中,可以将细菌截留在紧密的聚合物网络结构中,防止微生物渗漏。交联法是指双官能团或多官能团试剂与细菌细胞分子中的基团(如氨基、羧基等)发生反应形成共价键,从而达到固定细胞的目的。交联法化学反应激烈,对细菌活性具有很大影响。共价结合法是载体表面上的反应性基团与细菌反应,从而达到固定细菌的目的,该方法的特点是细菌与载体结合牢固,不易脱落,反应剧烈,细菌活性受损较大,操作复杂,反应条件不易控制。本发明中优选采用吸附法制备含蛭弧菌水凝胶和含蛭弧菌大多孔微球,优选采用包埋法制备含蛭弧菌原位凝胶。采用上述优选方法制备的含蛭弧菌组合物中的蛭弧菌存活率高,方法简单,适合批量生产。
28.含蛭弧菌组合物用于治疗不同组织的各种细菌感染。相比传统的抗生素,蛭弧菌具有突出优势:一,蛭弧菌是可以复制的“活药”,只需小剂量给药;二,抗生素的使用容易引起细菌的耐药性,而蛭弧菌与耐药性无关,其对宿主的侵染、裂解过程不受宿主细菌耐药性的影响;三,抗生素会对人体产生很多副作用,而蛭弧菌仅作用于细菌这种具有细胞壁的微生物,对真核细胞无影响,安全性高。蛭弧菌用于防治细菌感染尤其是耐药细菌感染性疾病具有很大的应用前景。将蛭弧菌载入水凝胶和原位凝胶中,由于凝胶突出的生物安全性、亲水性、透气性,可以充分保证蛭弧菌的活力。含蛭弧菌水凝胶用于伤口感染的治疗时,蛭弧菌可裂解伤口处的致病菌,水凝胶能与伤口紧密贴合不粘连,减少伤口与外界细菌的接触,而且能吸收伤口渗出液,保持伤口的湿润环境,有很好的促伤口修复作用。含蛭弧菌原位凝胶用于细菌性角膜炎的治疗时,原位凝胶可减少蛭弧菌的流失,延长其在眼部的滞留时间,提高蛭弧菌的抗菌效果。将蛭弧菌载入大多孔微球中,大多孔微球具有好的生物相容性、大孔径、高孔隙率,对蛭弧菌的活性无影响。含蛭弧菌大多孔微球用于细菌感染性肺炎的防治时,大多孔微球可以有效地将蛭弧菌递送到肺部,并使蛭弧菌免受肺泡巨噬细胞的吞噬,从而长时间发挥抗菌作用;大多孔微球作为蛭弧菌的储库,具有一定的缓释效果。含蛭弧菌大多孔微球吸入制剂的肺吸入方式可以是经口吸入,也可以结合呼吸机和肺灌洗装置灌入。
附图说明
29.图1.蛭弧菌的透射电镜图。(a)蛭弧菌;(b)蛭弧菌(短箭头指示)正在侵染创伤弧菌(长箭头指示)。
30.图2.含蛭弧菌水凝胶的扫描电镜图(a)及其孔径分布(b)。
31.图3.蛭弧菌混悬液、空白水凝胶、含蛭弧菌水凝胶和银敷料的体外生物相容性。(a)各组l929细胞(小鼠成纤维细胞)的活/死染色图;(b)蛭弧菌、空白水凝胶浸提液、含蛭弧菌水凝胶浸提液、银敷料浸提液与l929细胞共孵育后的细胞生存率;(c)曲拉通x-100(阳
性对照)、蛭弧菌、空白水凝胶、含蛭弧菌水凝胶、生理盐水(阴性对照)和银敷料与红细胞共孵育后的上清液照片;(d)各组的溶血率。(n=3,ns:无显著性差异)。
32.图4.含蛭弧菌水凝胶对不同细菌产生的抑菌圈(a:创伤弧菌,b:大肠杆菌,c:铜绿假单胞菌,d:耐美罗培南铜绿假单胞菌,e:上述四种菌的混合菌);含蛭弧菌水凝胶和美罗培南对普通铜绿假单胞菌(f)和耐美罗培南铜绿假单胞菌(g)的抑菌圈实验。
33.图5.含蛭弧菌水凝胶对创伤弧菌的杀菌能力。(a)蛭弧菌对创伤弧菌的裂解曲线;(b)各组的抑菌圈比较;(c)对b中抑菌圈的统计分析;(d)含蛭弧菌水凝胶在4℃放置不同天数后的抑菌圈比较;(e)对d中抑菌圈的统计分析。(n=3,***p<0.001,ns:无显著性差异)。
34.图6.各组的创面愈合情况。(a)未感染对照组、感染对照组、银敷料组和含蛭弧菌水凝胶组在第0天、3天、7天和10天的创面愈合图;(b)图a对应的创面愈合率。(n=3,**p<0.01,***p<0.001)。
35.图7.各组在第7天和10天创面h&e染色病理切片照片。标尺代表500μm。
36.图8.各组在第7天和10天创面masson染色病理切片照片。标尺代表500μm。
37.图9.感染对照组、银敷料组和含蛭弧菌水凝胶组在第3天时创面处的菌落铺板图(a)及菌落数的统计分析(b)。(n=3,*p<0.05,***p<0.001)。
38.图10.各组创面组织中tnf-α(a)、il-6(b)的含量变化。(n=3,*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001)。
39.图11.各组创面组织中cd31的免疫组化染色病理切片照片(a)及统计分析(b)。(n=3,*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001)。
40.图12.各组创面组织中f4/80的免疫组化染色病理切片照片(a)及统计分析(b)。(n=3,**p<0.01,***p<0.001)。
41.图13.含蛭弧菌原位凝胶外观(a:溶液态,b:胶凝态)及其粘度随温度的变化曲线(c)。
42.图14.含蛭弧菌原位凝胶在大鼠眼睛的滞留外观图(a)及光学相干断层扫描图像(b)。
43.图15.含蛭弧菌原位凝胶组角膜荧光素钠染色图(a)及h&e染色病理切片图(c),物理损伤组角膜荧光素钠染色图(b)及h&e染色病理切片图(d)。
44.图16.蛭弧菌、空白原位凝胶、含蛭弧菌原位凝胶与hcec细胞(人角膜上皮细胞)共孵育后的细胞存活率(n=3)。
45.图17.各组hcec细胞的活/死染色图。
46.图18.单纯的铜绿假单胞菌(样品1)和加入含蛭弧菌原位凝胶的铜绿假单胞菌(样品2)培养24小时后的菌液外观图(a)和菌液铺板图(b)。
47.图19.模型组、美罗培南治疗组、蛭弧菌混悬液治疗组、含蛭弧菌原位凝胶治疗组第0、1、3、5天的角膜外观图。
48.图20.感染5天后各组角膜h&e染色病理切片图。
49.图21.蛭弧菌的透射电镜图(a);空白大多孔微球(b)和含蛭弧菌大多孔微球(c)的扫描电镜图;含蛭弧菌大多孔微球的孔径分布图(d)。箭头指示蛭弧菌。
50.图22.普通微球和大多孔微粒在肺部的沉积情况。
51.图23.不同时间段巨噬细胞对荧光大多孔微球的吞噬及微球的形貌。细箭头指示
巨噬细胞,粗箭头指示荧光大多孔微球。
52.图24.蛭弧菌、空白大多孔微球、含蛭弧菌大多孔微球与beas-2b细胞(人支气管上皮细胞)共孵育后的细胞存活率(n=3)。
53.图25.蛭弧菌、空白大多孔微球、含蛭弧菌大多孔微球的肺部给药后的肺外观。
54.图26.单纯的大肠杆菌(样品1)和加入含蛭弧菌大多孔微球的大肠杆菌(样品2)培养24小时后的菌液外观图(a)和菌液铺板图(b)。
55.图27.不同组的小鼠肺组织外观图。
56.图28.不同组的小鼠肺组织h&e染色病理切片图。
57.图29.不同组的小鼠肺组织中tnf-α(a)、il-6(b)的含量。(n=3,*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001,ns:无显著性差异)。
具体实施方式
58.实施例1.含蛭弧菌水凝胶
59.取适量聚乙烯醇溶于水制得10%聚乙烯醇水溶液;取适量海藻酸钠溶于水制得4%海藻酸钠水溶液;取等体积聚乙烯醇水溶液和海藻酸钠水溶液混匀,制备成聚乙烯醇-海藻酸钠混合溶液;将一定量混合溶液倒入培养皿中,置于-20℃冰箱中冷冻20小时,然后在室温下解冻4小时,循环5次,使聚乙烯醇交联;然后将其浸泡在0.1mol/l氯化钙溶液中,使海藻酸钠交联;用水冲洗掉凝胶中多余的氯化钙,制得聚乙烯醇-海藻酸钙凝胶;在冷冻干燥机中冻干后,得到干凝胶;将蛭弧菌混悬液在4℃、1800
×
g条件下离心10分钟,收集上清液,将此上清液在4℃、10000
×
g条件下离心20分钟,弃去上清液,将沉淀用生理盐水重新混悬,经0.45μm滤器过滤,收集滤液,即得蛭弧菌混悬液;将蛭弧菌混悬液滴加到干凝胶上,利用干凝胶的强吸水性将蛭弧菌载入凝胶,得到含蛭弧菌水凝胶。
60.实施例2.含蛭弧菌原位凝胶
61.取适量去乙酰结冷胶加水,在70℃~80℃水浴中充分溶胀,4℃冷却完全得到去乙酰结冷胶溶液;另取适量泊洛沙姆407,加入上述去乙酰结冷胶溶液中,4℃静置,待溶胀完全,加入蛭弧菌混悬液,缓慢搅拌混合均匀;补充水至一定体积使最终去乙酰结冷胶和泊洛沙姆407的浓度分别为0.3%、14.4%,即得含蛭弧菌原位凝胶。
62.实施例3.含蛭弧菌大多孔微球
63.取适量聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶于二氯甲烷,得到浓度为5%的聚乳酸-羟基乙酸共聚物二氯甲烷溶液;称取适量十八胺溶于上述溶液,得到0.3%十八胺-5%聚乳酸-羟基乙酸共聚物的二氯甲烷溶液作为油相;取明胶加水,加热搅拌溶解,得到浓度为7.5%的明胶溶液作为内水相;取聚乙烯醇加水,加热搅拌溶解,得到浓度为1%的聚乙烯醇溶液作为外水相;按照1∶3的体积比将内水相加到油相中,在冰浴中超声处理形成油包水初乳;按照1∶10的体积比将初乳注入到外水相中,高速剪切形成水包油包水复乳,搅拌过夜,挥去有机溶剂;然后转移至40℃水中,搅拌3小时溶解除去明胶,离心后用水洗3遍,即得大多孔微球混悬液;在冷冻干燥机中冻干后,得到大多孔微球固体;将蛭弧菌混悬液与大多孔微球固体混合,利用大多孔微球的几何效应和电荷吸附效应将蛭弧菌载入大多孔微球,得到含蛭弧菌大多孔微球。
64.实验例1.含蛭弧菌水凝胶的性质
65.材料:蛭弧菌混悬液,创伤弧菌混悬液,按实施例1制备的含蛭弧菌水凝胶。
66.方法:分别取5μl蛭弧菌混悬液以及蛭弧菌与创伤弧菌共培养菌液滴于铜网上,用滤纸吸去多余液体,用5%磷钨酸溶液(ph 7.0)染色,在透射电镜下观察。将含蛭弧菌水凝胶冷冻干燥后,进行扫描电镜观察。
67.结果:在透射电镜下,蛭弧菌形态微小,呈弧状,大小约为0.4μm
×
1.4μm,具有长的鞭毛(图1a),利于快速游动。蛭弧菌与创伤弧菌共培养时,吸附并侵染创伤弧菌(图1b)。
68.含蛭弧菌水凝胶呈多孔状,类似于海绵(图2a)。经imagej软件统计分析,平均孔径为90
±
25μm(图2b)。凝胶的多孔结构利于蛭弧菌的生存及游动。
69.实验例2.含蛭弧菌水凝胶的细胞学研究
70.材料:小鼠成纤维细胞l929;小鼠红细胞;按实施例1制备的聚乙烯醇-海藻酸钙凝胶作为空白水凝胶;按实施例1制备的含蛭弧菌水凝胶;蛭弧菌混悬液;银敷料来自convatec公司;样品浸提液:分别将空白水凝胶、含蛭弧菌水凝胶、银敷料置于完全培养基中浸提24小时后,得到100%浸提液,分别用完全培养基稀释2倍,得到50%浸提液,用于cell counting kit-8(cck-8)实验。
71.方法:通过细胞活死染色考察样品直接接触对细胞活力的影响。收集对数生长期的l929细胞,调整细胞浓度后,以1.0
×
105cells/孔的浓度接种于六孔板中,孔底预先放置细胞爬片。细胞培养贴壁后,吸弃旧培养基,分别将蛭弧菌混悬液、空白水凝胶、含蛭弧菌水凝胶、银敷料置于细胞表面,向六孔板中加入2ml完全培养基,继续常规孵育24小时。孵育完成后,吸弃培养基,小心除去细胞表面的样品,磷酸盐缓冲液(pbs)漂洗3遍。配制fda(5μg/ml)及pi(5μg/ml)的工作液,室温下避光染色5分钟。染色完成后pbs充分洗涤细胞爬片,晾干后封片,采用共聚焦荧光显微镜观察细胞荧光情况,绿色为活细胞,红色为死细胞。
72.通过cck-8实验考察凝胶材料的细胞毒性。收集对数生长期的l929细胞,重悬得到细胞混悬液,计数后调整细胞浓度为5
×
104cells/ml,96孔板中每孔接种0.1ml,细胞培养贴壁后,分别加入蛭弧菌混悬液及50%浸提液、100%浸提液,与细胞共同孵育24小时。孵育完成后,吸弃旧培养基,向培养孔中加入含有10%cck-8试剂的培养基0.1ml,继续孵育2小时,酶标仪450nm波长下检测光密度值(od
样品
)。没种细胞的孔作为空白组测得光密度值(od
空白
),种细胞后正常培养的孔作为对照组测得光密度值(od
对照
)。根据下式计算细胞生存率。
73.细胞生存率=(od
样品-od
空白
)/(od
对照-od
空白
)
×
100%
74.通过溶血实验考察凝胶的血液相容性。小鼠心脏取血,2000rpm低温离心10分钟收集红细胞,生理盐水洗涤3遍,将红细胞稀释至2%的浓度。分别将蛭弧菌混悬液、空白水凝胶、含蛭弧菌水凝胶、银敷料置于1ml红细胞混悬液中,轻微晃动后置于37℃水浴中孵育4小时,再次2000rpm低温离心10分钟,观察上清颜色并检测其在540nm处的光密度值(od
样品
)。生理盐水作为阴性对照测得光密度值(od
阴性对照
),1%的triton x-100溶液作为阳性对照测得光密度值(od
阳性对照
)。根据下式计算溶血率。
75.溶血率=(od
样品-od
阴性对照
)/(od
阳性对照-od
阴性对照
)
×
100%
76.结果:活死细胞染色实验中,二乙酸荧光素(fda)能够被活细胞中的酯酶活化产生绿荧光性物质,因此活细胞被染成绿色,pi与死细胞的dna结合后产生红色荧光。图3a显示,与对照组一致,蛭弧菌混悬液组、空白水凝胶组、含蛭弧菌水凝胶组显示绿色荧光,几乎没
有红色荧光出现,说明蛭弧菌、空白水凝胶及含蛭弧菌水凝胶直接接触不会导致细胞死亡,无细胞毒性。但是银敷料组细胞显示较多红色荧光,说明银敷料有细胞毒性。
77.cck-8实验中,蛭弧菌混悬液、空白水凝胶浸提液、含蛭弧菌水凝胶浸提液对细胞增殖生长几乎没有影响,细胞活力均接近于100%,且不同浓度之间没有显著性差异(图3b);而银敷料浸提液组的l929细胞生存率为50%左右,说明含蛭弧菌水凝胶几乎没有细胞毒性,银敷料对l929细胞有一定毒性。
78.通过溶血外观图可以看出蛭弧菌混悬液组、空白水凝胶组、含蛭弧菌水凝胶组与阴性对照生理盐水组相似,上清呈清澈透明状,没有出现明显红色,而银敷料组与阳性对照triton x-100组上清明显因为发生溶血而变红(图3c)。进一步检测上清液在540nm处的光密度值,并计算溶血率,蛭弧菌混悬液组、空白水凝胶组、含蛭弧菌水凝胶组的溶血率均低于2%,而银敷料组的溶血率高达94%左右,与阳性对照组无显著性差异(图3d),说明含蛭弧菌水凝胶不会导致溶血,血液相容性良好。
79.实验例3.含蛭弧菌水凝胶的体外抗菌研究
80.材料:按实施例1制备的聚乙烯醇-海藻酸钙凝胶作为空白水凝胶;按实施例1制备的含蛭弧菌水凝胶;蛭弧菌混悬液;银敷料来自convatec公司;16μg/ml美罗培南溶液:称取适量美罗培南粉末,用生理盐水配制成浓度为16μg/ml的美罗培南溶液。美罗培南粉末来自深圳市海滨制药有限公司。
81.方法:采用抑菌圈方法考察样品的抗菌能力。分别取适量创伤弧菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌、耐美罗培南铜绿假单胞菌及上述四种菌的混合物在lb板上涂布均匀,然后将直径为1cm的含蛭弧菌水凝胶放在板上,以浸泡生理盐水的灭菌滤纸片(直径1cm)作阴性对照;将平板置于培养箱中37℃培养,定期观察。另外,分别用铜绿假单胞菌、耐美罗培南铜绿假单胞菌涂板,然后将直径为1cm的含蛭弧菌水凝胶放在板上,以浸泡16μg/ml美罗培南溶液的同样大小的灭菌滤纸片作阳性对照,以浸泡生理盐水的灭菌滤纸片作阴性对照;将平板置于培养箱中37℃培养,定期观察。
82.将蛭弧菌与创伤弧菌共培养考察蛭弧菌的裂解动力学。将蛭弧菌与创伤弧菌混悬液混合后置于96孔板中,以不加蛭弧菌的创伤弧菌作为对照,将孔板置于摇床中200rpm、37℃孵育,分别于12、16、20、24、30、48、60、72小时用酶标仪测定600nm处的光密度值。
83.采用抑菌圈方法比较不同样品的抗菌能力。取适量创伤弧菌在lb板上涂布均匀,然后分别将直径为1cm的空白水凝胶、含蛭弧菌水凝胶、银敷料放在板上,以浸泡生理盐水的灭菌滤纸片(直径1cm)作阴性对照;将平板置于培养箱中37℃培养,定期观察。
84.通过考察不同放置时间含蛭弧菌水凝胶的抗菌能力对稳定性进行评价。将新鲜制备的含蛭弧菌水凝胶放在4℃保存,分别于第0、1、3、5、7天取出,进行抑菌圈实验,考察样品的抗菌能力,进而评价其稳定性。
85.结果:含蛭弧菌水凝胶对创伤弧菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌、耐美罗培南铜绿假单胞菌及它们的混合物均显示良好的抗菌效果(图4a~e),美罗培南仅对普通铜绿假单胞菌有杀菌效果,对耐药菌无效(图4f,4g)。
86.裂解动力学实验中,单纯创伤弧菌在24小时内迅速生长,变得混浊,光密度值上升较快,随后由于空间限制,光密度值缓慢下降;而蛭弧菌与创伤弧菌的混合物则几乎保持透明状态,光密度始终呈下降趋势(图5a),表明创伤弧菌逐渐消失,蛭弧菌对其有良好的杀灭
作用。
87.含蛭弧菌水凝胶对创伤弧菌的抑菌圈明显大于银敷料(图5b,5c),这与蛭弧菌是一种活的抗菌剂,具有好的游动性密切相关。将含蛭弧菌水凝胶放在4℃,一周内其抗菌能力无显著性变化(图5d,5e),表明该制剂稳定性好。
88.实验例4.含蛭弧菌水凝胶治疗小鼠创伤感染药效研究
89.材料:按实施例1制备的含蛭弧菌水凝胶;银敷料来自convatec公司。
90.方法:将72只雄性小鼠(体重18~20g)随机分为4组(未感染对照组、感染对照组、银敷料治疗组、含蛭弧菌水凝胶治疗组),每组18只。4%水合氯醛按体重10ml/kg腹腔注射,待其麻醉后使用剃毛器将小鼠背部脊柱两侧的毛剃除干净,再使用脱毛膏脱去背部短毛,自然恢复24小时后,4%水合氯醛按体重10ml/kg腹腔注射,待其麻醉后使用灭菌手术剪在小鼠背部脊柱一侧剪一直径为1cm的圆形切口,全皮肤层切除,伤口深至皮肤粘膜层。将纱布放在伤口处,用人工海水浸湿纱布,进而达到不断润湿伤口的效果。一小时后移除纱布,用无菌棉将伤口处残留的海水擦干。其中的18只小鼠伤口用无菌纱布覆盖,并用医用绷带固定,作为未感染对照组。剩余54只小鼠伤口用创伤弧菌感染,待小鼠伤口出现黄色脓状物,确认为感染成功;其中,银敷料治疗组、含蛭弧菌水凝胶治疗组小鼠伤口分别用直径1cm的银敷料、含蛭弧菌水凝胶覆盖伤口,然后用医用绷带固定;感染对照组小鼠伤口用无菌纱布覆盖,并用医用绷带固定。各组分别于第3天、第7天更换敷料。分别于第0、3、7、10天拍摄创面照片,取0天时小鼠创面面积为初始创伤面积,采用imagej图像分析软件计算创伤面积,按照下式计算创面愈合率。
91.创面愈合率=(初始创伤面积-各时间点创面面积)/初始创伤面积
×
100%
92.第3天分别从感染对照组、银敷料组和含蛭弧菌水凝胶组的小鼠创口采集渗出液(2μl)。用pbs稀释100倍。将稀释液(50μl)均匀涂于营养琼脂平板上。放入二氧化碳培养箱37℃培养24小时,计数菌落数。各组分别于第3、7、10天处死6只小鼠,取创面皮肤组织,各组取3个切除的伤口组织,用适量无菌生理盐水匀浆,得到10%创面组织匀浆。将创面匀浆在5,000
×
g、4℃下离心15分钟,收集上清液,用酶联免疫吸附试剂盒(elisa)检测肿瘤坏死因子(tnf-α)、白介素-6(il-6)。取各组剩余的3个伤口组织,置于4%多聚甲醛中固定,常规脱水、包埋、苏木素-伊红(h&e)及masson染色,同时免疫组化标记cd31、f4/80蛋白,显微镜下进行组织病理学观察并拍照。
93.结果:感染对照组随着时间的延长创面有愈合趋势,但愈合速度低于未感染对照组(图6a,6b)。在创面愈合早期(第3天),与有黄色渗出物分泌感染对照组相比,银敷料组伤口愈合优势显著;但在创面愈合的整个过程中,银敷料组与未感染对照组相比,差异不显著(图6a,6b);这与银敷料对细菌的快速杀灭作用相关。含蛭弧菌水凝胶组与其他组(包括未感染对照组)相比,伤口愈合速度明显加快,且具有显著性差异(p<0.01或p<0.001)。在第10天,含蛭弧菌水凝胶组创面愈合率接近100%,而未感染对照组和银敷料组创面愈合率为80%左右,感染对照组创面愈合率约为70%。
94.由于细菌感染的严重阻碍,感染的伤口通常比未感染的伤口愈合得慢。如果感染被控制,伤口愈合速度将与未感染伤口类似,如银敷料组与未感染对照组(图6b)。值得注意的是,含蛭弧菌水凝胶对感染创面愈合的促进作用明显优于未感染创面,前者在第3、7、10天的愈合率分别为48%、85%和94%,后者为18%、52%和81%。含蛭弧菌水凝胶良好的创
面愈合效果,不仅与其较强的抗菌能力有关,还与聚乙烯醇-海藻酸钙水凝胶独特的双网络结构有关。
95.伤口病理切片显示第7天,除含蛭弧菌水凝胶组外,其余各组均出现局部组织坏死、表皮损伤、炎症细胞聚集(图7)。含蛭弧菌水凝胶组上皮完整,仅有少量炎症细胞浸润。而感染对照组和银敷料组炎症细胞大量聚集,提示细菌感染后炎症严重。未感染对照组创面表皮与真皮层间隙较大。含蛭弧菌水凝胶组肉芽组织被一层新的表皮覆盖,创面间隙缩小,未见明显坏死。在第10天,含蛭弧菌水凝胶形成了连续完整的表皮,皮脂腺、毛囊等皮肤附件出现。而感染对照组和银敷料组仍有炎症和坏死细胞存在,真皮组织紊乱,创面愈合过程缓慢。此外,创面组织的masson染色进一步显示了各组间胶原纤维形成和沉积的差异(图8)。第7天,含蛭弧菌水凝胶组出现大面积浅蓝色胶原纤维,感染对照组和银敷料组出现红色坏死组织,胶原少量蓝染。第10天,含蛭弧菌水凝胶组胶原沉积均匀有序排列,与正常真皮结构相似。虽然银敷料组胶原形成较致密,但胶原纤维紊乱。
96.收集第3天时各组创面渗出液并进行细菌计数,发现感染对照组的细菌数量明显多于银敷料组和含蛭弧菌水凝胶组(图9a,9b)。此外,含蛭弧菌水凝胶组的细菌数量远低于银敷料组。表明含蛭弧菌水凝胶具有好的体内抗菌能力。
97.感染对照组的tnf-α和il-6在伤口整个愈合过程中的表达均是最高水平(图10a,10b),说明创面感染后炎症反应严重。含蛭弧菌水凝胶组的tnf-α、il-6水平始终较低,且在第7天和第10天显著低于银敷料组(p<0.05或p<0.01)。细菌内毒素会促进促炎细胞因子(如tnf-α和il-6)的表达,而促炎细胞因子会上调炎症反应,从而阻碍伤口愈合。含蛭弧菌水凝胶的高抗菌能力使炎症反应减弱,进而促进伤口愈合。
98.新生血管的形成反映了组织重建和皮肤功能恢复的程度。伤口修复需要在新皮肤组织中形成血管来提供氧气和营养。一般来说,血管生成涉及内皮细胞的增殖和迁移。因此,内皮细胞的生物标志物cd31的表达常被用来分析创面处的新生血管。在第7天,含蛭弧菌水凝胶组cd31的表达高于其他组;在第10天,含蛭弧菌水凝胶组cd31的表达进一步增强(图11)。因此,含蛭弧菌水凝胶能够促进新生血管形成,具有良好的创面愈合效果。
99.f4/80作为巨噬细胞的主要标志物,指示巨噬细胞的成熟和活化。伤口感染会诱导巨噬细胞大量增殖和浸润,活化的巨噬细胞可促进促炎细胞因子的产生,导致组织损伤。棕染的f4/80的表达可代表创面巨噬细胞的水平。在第7天和第10天,含蛭弧菌水凝胶组始终保持较低的f4/80水平,与未感染对照组相似。而在第7天,感染对照组和银敷料组的f4/80水平均明显高于未感染对照组和含蛭弧菌水凝胶组(图12)。在第10天,虽然银敷料组的f4/80水平显著下降,但依然高于含蛭弧菌水凝胶组。因此,含蛭弧菌水凝胶可降低巨噬细胞的活化和炎症反应。
100.实验例5.含蛭弧菌原位凝胶的性质
101.材料:按实施例2制备的含蛭弧菌原位凝胶;参考实施例2制备的含伊文思蓝的含蛭弧菌原位凝胶。含伊文思蓝的含蛭弧菌原位凝胶的制备过程参考实施例2,具体制备如下:取适量去乙酰结冷胶加水,在70℃~80℃水浴中充分溶胀,4℃冷却完全得到去乙酰结冷胶溶液;另取适量泊洛沙姆407,加入上述去乙酰结冷胶溶液中,4℃静置,待溶胀完全,加入蛭弧菌混悬液,缓慢搅拌混合均匀;加入适量伊文思蓝水溶液,混匀;补充水至一定体积使最终去乙酰结冷胶和泊洛沙姆407的浓度分别为0.3%、14.4%,即得含伊文思蓝的含蛭
弧菌原位凝胶。伊文思蓝来自acros organics。
102.方法:取适量含蛭弧菌原位凝胶置于10ml塑料离心管中,加入人工泪液,含蛭弧菌原位凝胶和人工泪液的体积比为25∶7,在34℃水浴锅中放置2分钟,观察凝胶前后的状态变化。将含蛭弧菌原位凝胶与人工泪液按体积比25∶7混合,使用旋转流变仪在频率1hz、升温速率1℃/min的条件下测定凝胶黏度随温度的变化。
103.大鼠腹腔注射1%戊巴比妥钠(40mg/kg)麻醉后,固定在检测平台上,保持左眼向上,眼轴垂直平台。滴加50μl含伊文思蓝的含蛭弧菌原位凝胶在角膜表面,定时拍照并采集角膜前段光学相干断层扫描(oct)图像,考察凝胶滞留情况。
104.结果:含蛭弧菌原位凝胶充分溶胀后,是澄清透明状液体、流动性较好(图13a);当在34℃的条件下放置2分钟后,转变为澄清透明状的半固体、流动性差(图13b)。当温度大于24℃时,随着温度的升高,凝胶粘度持续增长;并在33℃时达到平衡。因此,将含蛭弧菌原位凝胶滴在角膜表面,会转变为半固体状态粘附于角膜,延长滞留时间(图13c)。
105.含蛭弧菌原位凝胶给药后,能在大鼠角膜表面分散形成一层薄膜。给药60分钟时,凝胶仍粘附在角膜表面(图14a),其厚度与开始比,无明显变化(图14b)。
106.实验例6.含蛭弧菌原位凝胶的安全性研究
107.材料:蛭弧菌混悬液;按实施例2制备的含蛭弧菌原位凝胶;参考实施例2制备的空白原位凝胶,不含蛭弧菌。空白原位凝胶的制备过程参考实施例2,除了不加蛭弧菌外,其他步骤和实施例2相同。
108.方法:裂隙灯检查排除有眼前节病变的大鼠,含蛭弧菌原位凝胶组大鼠每日给予一次(50μl),连续5天;物理损伤组在第5天时,用眼科手术刀机械刮擦角膜上皮致其损伤。采用荧光素钠眼科试纸检测两组大鼠角膜上皮完整性并拍照。腹腔注射过量1%戊巴比妥钠处死大鼠后,分离大鼠角膜组织,剔除多余的虹膜和巩膜,生理盐水冲洗三次后10%的甲醛溶液固定,进行h&e染色,采用倒置荧光显微镜观察并记录。
109.通过cck-8实验考察凝胶材料的细胞毒性。收集对数生长期的人角膜上皮细胞(hcec),重悬得到细胞混悬液,计数后调整细胞浓度为5
×
104cells/ml,96孔板中每孔接种0.1ml,细胞培养贴壁后,移除培养基,分别加入0.1ml用培养基配制的蛭弧菌混悬液、不同浓度的(16、80、400、2000μg/ml)空白原位凝胶溶液和含蛭弧菌原位凝胶溶液,与细胞共同孵育24小时。孵育完成后,吸弃旧培养基,向培养孔中加入含有10%cck-8试剂的培养基0.1ml,继续孵育2小时,酶标仪在450nm检测光密度值(od
样品
)。无细胞孔作为空白组光密度值(od
空白
),种细胞后正常培养的孔作为对照组测得光密度值(od对照)。根据下式计算细胞生存率。
110.细胞生存率=(od
样品-od
空白
)/(od
对照-od
空白
)
×
100%
111.通过细胞活死染色考察凝胶直接接触对细胞活力的影响。收集对数生长期的hcec细胞,调整细胞浓度后,以1.0
×
105cells/孔的浓度接种于六孔板中,孔底预先放置细胞爬片。细胞培养贴壁后,吸弃旧培养基,分别将蛭弧菌混悬液、空白原位凝胶溶液、含蛭弧菌原位凝胶溶液置于细胞表面,向六孔板中加入2ml完全培养基,继续常规孵育24小时。孵育完成后,吸弃培养基,小心除去细胞表面的样品,pbs漂洗3遍。配制fda(5μg/ml)及pi(5μg/ml)的工作液,室温下避光染色5分钟。染色完成后pbs充分洗涤细胞爬片,晾干后封片,采用荧光显微镜观察细胞荧光情况,绿色为活细胞,红色为死细胞。
112.结果:荧光素钠试纸染色后,含蛭弧菌原位凝胶组角膜光滑,未见染色(图15a),而物理损伤组的角膜被染成黄绿色(图15b)。大鼠角膜h&e切片可见含蛭弧菌原位凝胶组角膜结构完整且规则(图15c),物理损伤组的角膜上皮不完整,基质层结构紊乱(图15d)。
113.cck-8实验中,蛭弧菌混悬液、空白原位凝胶、含蛭弧菌原位凝胶对hcec细胞增殖生长几乎没有影响,细胞活力均接近100%,且不同浓度之间没有显著性差异(图16)。
114.活死细胞染色实验中,二乙酸荧光素(fda)能够被活细胞中的酯酶活化产生绿荧光性物质,因此活细胞被染成绿色,pi与死细胞的dna结合后产生红色荧光。对照组、蛭弧菌组、空白原位凝胶组、含蛭弧菌原位凝胶组均显示绿色荧光,几乎没有红色荧光(图17),说明蛭弧菌、空白原位凝胶及含蛭弧菌原位凝胶直接接触不会导致细胞死亡,无细胞毒性。
115.实验例7.含蛭弧菌原位凝胶的体外抗菌研究
116.材料:按实施例2制备的含蛭弧菌原位凝胶。
117.方法:将含蛭弧菌原位凝胶与铜绿假单胞菌共培养,以不加含蛭弧菌原位凝胶的铜绿假单胞菌作为对照,置于摇床中150rpm、37℃孵育,24小时后观察菌液外观。取0.1ml菌液进行铺板,考察菌落数。
118.结果:含蛭弧菌原位凝胶对铜绿假单胞菌具有良好的抗菌效果,共培养菌液外观较对照组澄清(图18a),菌液铺板结果显示含蛭弧菌原位凝胶组菌落数较对照组显著减少(图18b)。
119.实验例8.含蛭弧菌原位凝胶治疗大鼠细菌性角膜炎药效研究
120.材料:蛭弧菌混悬液;按实施例2制备的含蛭弧菌原位凝胶;0.5mg/ml美罗培南溶液:称取适量美罗培南粉末,用生理盐水配制成浓度为0.5mg/ml的美罗培南溶液。
121.方法:将雄性大鼠(体重180~200g)随机分为4组(生理盐水组、美罗培南组、蛭弧菌混悬液组、含蛭弧菌原位凝胶组),每组5只。腹腔注射1%戊巴比妥钠(40mg/kg)麻醉大鼠后,将大鼠左侧卧位固定于操作台上,充分暴露大鼠右眼。使用眼科镊固定,眼科手术刀机械刮擦角膜上皮,将5μl、107cfu/ml的铜绿假单胞菌液滴在上述区域表面,保持大鼠姿势,使混悬液停留在角膜表面,直至大鼠醒来。所有大鼠均选择右眼为术眼,所有操作均由一人完成。大鼠细菌性角膜炎模型构建成功后,生理盐水组、美罗培南(0.5mg/ml)组、蛭弧菌混悬液组及含蛭弧菌原位凝胶组分别给予相应药物50μl/次,1次/日,共5天。于造模后的第0、1、3、5天,在体视镜下观察各组大鼠角膜感染情况并拍照。造模后的第5天腹腔注射过量1%戊巴比妥钠处死大鼠,分离角膜组织,固定于10%的甲醛溶液中,制备成石蜡切片(约5μm),并进行h&e染色,于倒置显微镜下观察并拍照。
122.结果:造模1天时,每组均表现为角膜炎体征,感染程度接近。角膜表面粗糙且不规则,角膜基质雾状混浊伴水肿,透过病灶可见虹膜纹理。第3天炎症最重,生理盐水组溃疡病灶迅速扩大,中间角膜致密混浊伴高度水肿,部分大鼠角膜明显溶解,出现角膜穿孔。美罗培南组、蛭弧菌混悬液组及含蛭弧菌原位凝胶组均较生理盐水组病灶面积小,症状轻;其中,美罗培南和原位凝胶组仅中间角膜基质呈云雾状混浊,症状较蛭弧菌混悬液组轻。第5天,生理盐水组角膜肿胀,基质深层混浊,窥不清虹膜,混浊范围最大;其余三组症状均有所减轻,尤以含蛭弧菌原位凝胶突出,表现为中央角膜轻度混浊,表面较为光滑(图19)。
123.第5天,角膜上皮细胞部分再生,形成多层扁平细胞层,生理盐水组上皮细胞生长紊乱,大小不一,个别细胞拥挤生长突向基质层,基质层水肿增厚,结构严重紊乱,炎症细胞
浸润角膜全层;美罗培南组和蛭弧菌混悬液组角膜上皮细胞排列轻度紊乱,基质层增厚,蛭弧菌混悬液组的炎症细胞较美罗培南组少;含蛭弧菌原位凝胶组的基质层轻度水肿,角膜上皮细胞及基质结构均较为整齐,基本无炎症细胞的浸润(图20)。因此,含蛭弧菌原位凝胶可降低炎症反应。
124.实验例9.含蛭弧菌大多孔微球的性质
125.材料:蛭弧菌混悬液;按实施例3制备的大多孔微球固体作为空白大多孔微球;含蛭弧菌大多孔微球冻干粉末:按实施例3制备的含蛭弧菌大多孔微球,经冷冻干燥机冻干后得含蛭弧菌大多孔微球冻干粉末。参考实施例3制备的载cy7大多孔微球粉末,具体制备如下:取适量聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶于二氯甲烷,得到浓度为5%的聚乳酸-羟基乙酸共聚物二氯甲烷溶液;称取适量十八胺及cy7溶于上述溶液,得到含cy7的0.3%十八胺-5%聚乳酸-羟基乙酸共聚物的二氯甲烷溶液作为油相;取明胶加水,加热搅拌溶解,得到浓度为7.5%的明胶溶液作为内水相;取聚乙烯醇加水,加热搅拌溶解,得到浓度为1%的聚乙烯醇溶液作为外水相;按照1∶3的体积比将内水相加到油相中,在冰浴中超声处理形成油包水初乳;按照1∶10的体积比将初乳注入到外水相中,高速剪切形成水包油包水复乳,搅拌过夜,挥去有机溶剂;然后转移至40℃水中,搅拌3小时溶解除去明胶,离心后用水洗3遍,即得载cy7大多孔微球混悬液;在冷冻干燥机中冻干后,得到载cy7大多孔微球粉末。参考实施例3制备的普通微球粉末,具体制备如下:取适量聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶于二氯甲烷,得到浓度为5%的聚乳酸-羟基乙酸共聚物二氯甲烷溶液;称取适量十八胺溶于上述溶液,得到0.3%十八胺-5%聚乳酸-羟基乙酸共聚物的二氯甲烷溶液作为油相;水作为内水相;取聚乙烯醇加水,加热搅拌溶解,得到浓度为1%的聚乙烯醇溶液作为外水相;按照1∶3的体积比将内水相加到油相中,在冰浴中超声处理形成油包水初乳;按照1∶10的体积比将初乳注入到外水相中,高速剪切形成水包油包水复乳,搅拌过夜,挥去有机溶剂;离心后用水洗3遍,即得普通微球混悬液;在冷冻干燥机中冻干后,得到普通微球粉末。参考实施例3制备的载尼罗红荧光大多孔微球,具体制备如下:取适量聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶于二氯甲烷,得到浓度为5%的聚乳酸-羟基乙酸共聚物二氯甲烷溶液;称取适量十八胺及尼罗红溶于上述溶液,得到含尼罗红的0.3%十八胺-5%聚乳酸-羟基乙酸共聚物的二氯甲烷溶液作为油相;取明胶加水,加热搅拌溶解,得到浓度为7.5%的明胶溶液作为内水相;取聚乙烯醇加水,加热搅拌溶解,得到浓度为1%的聚乙烯醇溶液作为外水相;按照1∶3的体积比将内水相加到油相中,在冰浴中超声处理形成油包水初乳;按照1∶10的体积比将初乳注入到外水相中,高速剪切形成水包油包水复乳,搅拌过夜,挥去有机溶剂;然后转移至40℃水中,搅拌3小时溶解除去明胶,离心后用水洗3遍,即得载尼罗红荧光大多孔微球混悬液;在冷冻干燥机中冻干后,得到载尼罗红荧光大多孔微球。cy7来自西安瑞禧生物科技有限公司;尼罗红来自北京百灵威科技有限公司。
126.方法:取5μl蛭弧菌混悬液滴于铜网上,用滤纸吸去多余液体,用5%磷钨酸溶液(ph 7.0)染色,在透射电镜下观察。取适量空白大多孔微球及含蛭弧菌大多孔微球冻干粉末,粘在导电胶上,吹掉未粘紧的粉末,喷金后进行扫描电镜观察。使用压汞仪对大多孔微球的孔径分布进行测定。
127.分别取等量的载cy7大多孔微球粉末和普通微球粉末,通过自制装置打入大鼠气管中,给药1小时后,将大鼠处死,取出肺组织于冰盒上荧光动物成像。将制备好的载尼罗红
荧光大多孔微球加入到含有巨噬细胞raw264.7的6孔板内,置于37℃、5%二氧化碳培养箱中培养,分别于1、4、12、24小时取出,荧光显微镜下观察巨噬细胞对大多孔微球的吞噬情况;离心收集微球,冷冻干燥后用扫描电镜(sem)观察形貌变化。
128.结果:在透射电镜下,蛭弧菌形态微小,呈弧状,大小约为0.4μm
×
1.4μm,具有长的鞭毛(图21a)。扫描电镜图可看出空白大多孔微球粒径约10~15μm,球上孔较多(图21b);含蛭弧菌大多孔微球上吸附有蛭弧菌(图21c)。经压汞法测定,大多孔微球孔径分布较广,范围为1~10μm,其中6μm的孔较多(图21d)。微球的大多孔结构利于蛭弧菌的装载、生存及游动。
129.荧光成像图可看出,普通微球的荧光面积较大多孔微球小,普通微球的荧光强度多集中在肺中部,而大多孔微球的荧光分布多沉积在全肺深处(图22)。可能是由于大多孔微球粉末质量轻,能够很好的到达肺深处,实现全肺分布。巨噬细胞对大多孔微球的吞噬实验表明,24小时内巨噬细胞对大多孔微球吞噬较差,24小时内大多孔微球结构依然较完整(图23)。大多孔微球为蛭弧菌在肺部能够长时间的滞留提供了物质基础。
130.实验例10.含蛭弧菌大多孔微球的安全性研究
131.材料:蛭弧菌混悬液;按实施例3制备的大多孔微球固体作为空白大多孔微球;按实施例3制备的含蛭弧菌大多孔微球。
132.方法:通过cck-8实验考察微球的细胞毒性。收集对数生长期的人支气管上皮(beas-2b)细胞,重悬得到细胞混悬液,计数后调整细胞浓度为5
×
104cells/ml,96孔板中每孔接种0.1ml,细胞培养贴壁后,移除培养基,分别加入0.1ml用培养基配制的蛭弧菌混悬液、不同浓度(0.125、0.25、0.5、1mg/ml)的空白大多孔微球混悬液和含蛭弧菌大多孔微球混悬液,与细胞共同孵育24小时。孵育完成后,吸弃旧培养基,向培养孔中加入含有10%cck-8试剂的培养基0.1ml,继续孵育2小时,酶标仪450nm波长下检测光密度(od
样品
)。没种细胞的孔作为空白组测得光密度值(od
空白
),种细胞后正常培养的孔作为对照组测得光密度值(od
对照
)。根据下式计算细胞生存率。
133.细胞生存率=(od
样品-od
空白
)/(od
对照-od
空白
)
×
100%
134.通过直接肺部给药考察微球的体内安全性。用喉镜撬开小鼠嘴,暴露气管,分别将蛭弧菌混悬液、空白大多孔微球混悬液(12、36mg/ml)、含蛭弧菌大多孔微球混悬液(12、36mg/ml)通过雾化给药针经气管喷入小鼠肺部,给药体积为25μl。分别于给药12小时及24小时后腹腔注射4%水合氯醛麻醉小鼠,解剖取出肺组织,观察肺部外观并拍照,正常小鼠的肺组织作为对照。
135.结果:cck-8实验中,蛭弧菌混悬液、0.125mg/ml空白大多孔微球混悬液及0.125mg/ml含蛭弧菌大多孔微球混悬液对beas-2b细胞增殖生长几乎没有影响,细胞活力均接近于100%;但是随着微球混悬液浓度的增大,细胞存活率呈下降趋势(图24),表明微球在使用时需在其安全剂量范围内。
136.体内安全性实验中,各组的肺组织均较为光滑、红润、有光泽,质地柔软;给药12小时与24小时无明显区别;与正常肺组织无显著性差异(图25)。表明当给药体积为25μl时,浓度低于36mg/ml的含蛭弧菌大多孔微球肺部给药是安全的。
137.实验例11.含蛭弧菌大多孔微球的体外抗菌研究
138.材料:按实施例3制备的含蛭弧菌大多孔微球。
139.方法:将含蛭弧菌大多孔微球与大肠杆菌共培养,以不加含蛭弧菌大多孔微球的大肠杆菌作为对照,置于摇床中150rpm、37℃孵育,24小时后观察菌液外观。取0.1ml菌液进行铺板,考察菌落数。
140.结果:含蛭弧菌大多孔微球对大肠杆菌具有好的杀菌效果,共培养菌液外观较对照组澄清(图26a);菌液铺板结果显示,含蛭弧菌大多孔微球组基本无菌落长出,杀菌效果显著(图26b)。
141.实验例12.含蛭弧菌大多孔微球防治小鼠细菌性肺炎药效研究
142.材料:蛭弧菌混悬液;按实施例3制备的含蛭弧菌大多孔微球;0.5mg/ml美罗培南溶液:称取适量美罗培南粉末,用生理盐水配制成浓度为0.5mg/ml的美罗培南溶液。美罗培南来自深圳市海滨制药有限公司。地塞米松磷酸钠注射液作为免疫抑制剂,来自山西省芮城科龙兽药有限公司。
143.方法:将雄性小鼠(体重18~20g)随机分为8组:正常组、模型组、美罗培南组a、美罗培南组b、蛭弧菌混悬液组a、蛭弧菌混悬液组b、含蛭弧菌大多孔微球组a、含蛭弧菌大多孔微球组b(a:铜绿假单胞菌,b:耐美罗培南铜绿假单胞菌),每组4只。免疫抑制:除正常组外,其余各组小鼠每日腹腔注射0.1ml地塞米松磷酸钠注射液(5mg/ml),连续5日,造成小鼠免疫功能低下;给菌造模:在末次注射地塞米松6小时后,除正常组外,其余各组利用小动物肺部给药针经小鼠气管喷入25μl菌液(1
×
107cfu/ml),建立细菌性肺炎模型。在造模2小时后,模型组给予25μl生理盐水,蛭弧菌混悬液组给予25μl蛭弧菌混悬液,美罗培南组给予25μl美罗培南溶液(0.5mg/ml),正常组不做处理。含蛭弧菌大多孔微球组,在造模前4小时,给予25μl含蛭弧菌大多孔微球混悬液(10mg/ml)。
144.给药24小时后,小鼠用水合氯醛麻醉后,解剖取肺组织,观察肺部外观并拍照;右肺上叶放入生理盐水中漂洗后,4%甲醛溶液固定24小时,进行h&e染色病理切片观察;右肺中、下叶放入生理盐水中漂洗称重,加入9倍量(w/w)的生理盐水(4℃),于高速组织研磨仪中进行组织研磨,研磨液用低温高速离心机5000
×
g离心10分钟,收集上清液,用elisa试剂盒测定炎症因子。
145.结果:正常组小鼠肺组织颜色粉红,质地柔软,无出血;模型组及美罗培南组b左右肺组织均可见明显的出血;两蛭弧菌混悬液组小鼠肺部有轻微出血,美罗培南组a、两含蛭弧菌大多孔微球组的肺组织均未见明显出血现象(图27)。h&e病理切片显示正常组小鼠肺组织结构清晰、排列整齐,肺泡腔完整、肺泡腔内未见出血、肺泡间隔无明显增厚,无炎性细胞浸润;模型组及美罗培南组b可见肺部明显出血,肺泡间隔增宽,有明显炎性细胞浸润;两蛭弧菌混悬液组肺组织损伤稍微减轻,无明显出血现象,但肺泡间隔有增厚,有炎性细胞浸润;美罗培南组a及两个含蛭弧菌大多孔微球组的肺组织仅有少量炎性细胞浸润(图28)。elisa试剂盒测定的肺组织中的tnf-α和il-6水平进一步定量说明了以上各组的炎症浸润情况(图29)。综上,美罗培南仅对非耐药铜绿假单胞菌感染性肺炎有治疗作用,而含蛭弧菌大多孔微球对耐药及非耐药铜绿假单胞菌感染性肺炎均有良好的防治作用。
146.将蛭弧菌装载到大多孔微球中制备成肺吸入制剂,用于肺部细菌(尤其是耐药菌)感染性疾病的防治,既避免了直接肺吸蛭弧菌易被巨噬细胞吞噬的问题,大多孔微球作为蛭弧菌的贮库,又可以起到一定的缓释作用,具有广阔的应用前景。
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