同时递送两亲活性物质的海藻酸钙微凝胶及其制备方法与应用与流程

1.本发明属于医药技术领域，特别涉及一种同时递送两亲活性物质的海藻酸钙微凝胶及其制备方法与应用。


背景技术：

2.炎症性肠病是一种特发性疾病，由机体对宿主肠道菌群的免疫反应失调引起，导致慢性复发性肠道炎症。溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，uc)是炎症性肠病的两种主要类型之一。uc会引起肠黏膜表面的炎症和溃疡，黏膜炎从直肠开始，并以连续的状态延伸到近端结肠，最常见的症状包括慢性复发性腹泻、便血、腹痛和炎症性质，可通过结肠镜检查和组织学检查确诊。uc的组织病理学特征包括黏膜的中性粒细胞和淋巴浆细胞严重浸润、上皮隐窝破坏和变形、隐窝炎和隐窝脓肿以及大面积的黏膜糜烂。uc在北美和欧洲很常见，在发达和城市化地区发病率最高。流行病学调查显示，欧洲和美国的患者数量占世界人口的0.5％。近年来，uc在西方发达国家的发病率和患病率已经开始趋于稳定。然而，在发展中国家，尤其是在南美和东亚，其发病率和流行率有所增加。例如，20世纪90年代初，日本的发病率已达到每10万人1.95例。由于uc在发达国家的高发病率和在发展中国家的发病率大幅增加，它已成为全球公共卫生负担。
3.白藜芦醇(resveratrol,res)是一种多酚二苯乙烯，具有连接两个酚环的双键。res的生物活性已被广泛认可，比如抗癌、炎症调节、心脏保护、降血糖、抗氧化、抗病毒和抗真菌以及植物抗毒素活性等。在生物系统中，res被迅速和广泛地代谢。为了发挥res的有益作用，它在血液中的浓度必须达到至少10mg/l，对于平均体重的人来说，这相当于需要吸收50mg res才能发挥其功效。可是，res在水中的溶解度很低，约为0.03mg/ml，直接摄入含res的食品难以达到其有效剂量。此外，res的胃肠稳定性差，严重地影响其吸收和生物利用度。同时，res已被证明对uc有效，但因其在上消化道中易被迅速吸收和广泛代谢导致其口服生物利用度较低。因此，在使用res用于缓解uc时，需构建res的结肠定位给药系统，以克服其低溶解性、有限的稳定性、上胃肠道的高代谢率的缺点，从而提高疗效和减少不良反应。
4.原花青素(oligomeric proanthocyanidins,opc)是由黄烷醇单体组成的低聚物，广泛存在于水果、种子、花卉、坚果和树皮等植物中。opc因其健康保护活性而被广泛研究。这些活性包括对抗病原体的抑菌活性、抑制消化酶以及炎症反应的酶、一般抗氧化活性、改善糖尿病、减少炎症、改善心血管功能和抑制致癌作用。opc的生物利用度与其分子大小有关系。黄烷-3-醇单体的生物利用度为5～50％，而低聚原花青素的吸收比单体黄烷-3-醇更慢更低。opc在小肠中生物利用度低及降解有限，很大一部分被结肠微生物群代谢，即大多数opc似乎是作为微生物衍生的代谢物或微生物代谢物的第二阶段结合物排出的。一小部分未代谢的opc二聚体通过尿液排出。opc已在动物模型中显示可以缓解结肠炎症状，此外，研究发现，在结肠炎小鼠的饮食中添加opc可改善炎症性肠病指标，改变紧密连接蛋白表达，增加结肠杯状细胞数量，并降低mpo水平。也有可能是通过改善炎症反应，抑制炎细胞浸
润和抗氧化损伤，促进损伤组织修复，改善结肠氧化应激，抑制诱导型一氧化氮合酶活性，减少一氧化氮的产生来对结肠炎的治疗起到缓解作用。
5.虫胶是天然树脂，具有良好的生物相容性与可食性，被美国食品药品管理局(fda)批准为一般公认的安全类添加剂。此外，还具有ph响应性，在酸性条件下不溶，在微碱性(ph》7.0)条件下可溶；因此，其对人体消化道的不同ph环境可作出响应。虫胶纳米颗粒(shellac nanoparticles,snp)具有高的比表面，负载效率高，可负载更多res等活性物质。但是，snp在酸性条件下不稳定，易发生明显的聚集，这使得snp不适用于口服递送活性物质。因此多层次结构的递送体系对于实现结肠控释及多药联用具有重要的意义。


技术实现要素：

6.为了克服上述现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种同时递送两亲活性物质的海藻酸钙微凝胶的制备方法，该方法创新地将疏水性的res包裹进snp制成r-snps，提高res溶解性与稳定性，进一步将r-snps与亲水性的opc共同裹入海藻酸钙微凝胶的方式实现两中极性相反的活性物质靶向递送，不仅释药性好也可规避纳米粒子可能会产生的纳米毒性。所构建微凝胶为极性相反的活性物质的靶向递送提供了一个新方向，为缓解溃疡性结肠炎开拓了新的前景。
7.本发明另一目的在于提供上述方法制备的同时递送两亲活性物质的海藻酸钙微凝胶，其对溃疡性结肠炎具有显著的缓解作用。
8.本发明再一目的在于提供上述同时递送两亲活性物质的海藻酸钙微凝胶在制备缓解溃疡性结肠炎药物中的应用。
9.本发明的目的通过下述方案实现：
10.一种同时递送两亲活性物质的海藻酸钙微凝胶的制备方法，包括如下步骤：
11.(1)将虫胶和白藜芦醇溶解于无水乙醇溶液中；
12.(2)过滤除去步骤(1)溶液中的不溶物；
13.(3)将步骤(2)所得滤液滴入水中，得到负载白藜芦醇的虫胶醇纳米颗粒分散液；
14.(4)将步骤(3)所得分散液过滤蒸发，得到去除乙醇的浓缩分散液；
15.(5)向步骤(4)中的浓缩分散液中加入水，得到虫胶纳米颗粒分散液；
16.(6)取步骤(5)所得的分散液，将原花青素溶于其中；
17.(7)在搅拌条件下将海藻酸钠加入步骤(6)所得的溶液，得到溶胶；
18.(8)离心去除步骤(7)所得溶胶中的气泡；
19.(9)将步骤(8)所得溶胶通过微流控设备滴入cacl2溶液中，形成微凝胶；
20.(10)静置固化微凝胶，得到海藻酸钙微凝胶。
21.步骤(1)中所述虫胶与白藜芦醇的质量比为9:1～4:1。
22.步骤(1)中所述无水乙醇的用量满足每60mg的白藜芦醇对应加入到20～45ml的无水乙醇溶液中。
23.步骤(2)中过滤使用的微孔滤膜的直径为0.22～0.45μm。
24.步骤(3)中滴加的速度为0.3～0.6ml/min，所采用针头内径为0.2～0.3mm。
25.步骤(4)中所述的过滤蒸发中的蒸发优选为采用旋转蒸发器(r-1001vn，郑州长城科工贸有限公司)进行蒸发，蒸发参数为80～120mpa、50～70r/min、45～55℃；过滤滤纸为
慢速滤纸。
26.所述步骤(5)中加入水的用量满足：所得虫胶纳米颗粒分散液的浓度为3～6g/l。
27.所述步骤(6)、(7)中原花青素(opc)、负载白藜芦醇的虫胶醇纳米颗粒(r-snps)与海藻酸钠(sodium alginate,sa)的质量比，即opc:r-snps:sa的比值为1:3:7～1:10:40。
28.步骤(7)中所述搅拌是指用机械搅拌器进行搅拌，搅拌速度为200～400r/min。
29.步骤(8)中所述离心是指在高速离心机(3-30k，德国sigma)以1000～1500r/min离心10～20min。
30.步骤(9)中所述将溶胶通过微流控设备滴入cacl2溶液中，具体操作为：使用注射泵(保定申辰泵业有限公司)将制成的溶胶用内径为0.25～0.35mm的针头以2～5ml/h的速度滴入的1.5～2.5％(m/v，g/ml)cacl2溶液，其中，溶胶中sa质量与cacl2的质量比，即sa:cacl2的比值为1:5～1.5:1。
31.所述步骤(10)中静置固化的时间为20～40min。
32.一种由上述方法制备得到的同时递送两亲活性物质的海藻酸钙微凝胶。
33.所述同时递送两亲活性物质的海藻酸钙微凝胶在改善小鼠体重减轻、dai上升、结肠萎缩、脾脏指数升高、结肠组织的隐窝丢失、杯状细胞丢失和中性粒细胞浸润方面达到缓解溃疡性结肠炎的目的。
34.本发明的机理为：
35.本发明首先通过反溶剂沉淀法将res负载到snp以提高res的溶解性和稳定性，然后通过液滴法,即在钙离子交联下，将负载res后的snp(r-snps)和opc共同填充到海藻酸钙微凝胶中。获得的微凝胶具有纳米级和微米级的多层次结构，在进入胃(酸性条件)后，海藻酸钙微凝胶的ca
2+
会被h
+
置换，形成的不溶性海藻酸会进一步聚集而保护r-snps和opc不被破坏。微凝胶在ph＝6.8的小肠环境中虽然会快速溶胀但依然可以保持完整的结构。当微凝胶进入弱碱性(ph＝7.4)结肠环境中后会转化为可溶性海藻酸盐，海藻酸分子链之间不再存在交联结构，表现为微凝胶破裂r-snps和opc被释放。r-snps则可以在微生物和ph(》7.0)的作用下使虫胶溶解从而释放出res。
36.本发明相对于现有技术，具有如下的优点及有益效果：
37.(1)通过虫胶对白藜芦醇的包埋，形成虫胶纳米颗粒。本发明中r-snps的包封率为99.03％，表明在最大程度上实现了疏水性活性物质的有效包埋。
38.(2)通过海藻酸钠对虫胶纳米颗粒和原花青素的交联，形成微凝胶，可应用于医药技术领域。本发明微凝胶在胃液中的药物释放率小于15％，说明微凝胶能有效抵御胃液的消化而顺利到达肠道。
39.(3)白藜芦醇与原花青素的包埋，实现了亲疏水活性物质协同作用，为极性相反的活性物质的使用开辟了新的道路。
40.(4)在目前海藻酸钙微凝胶的研究中，还没有同时递送白藜芦醇与原花青素的报道。
附图说明
41.图1为实施例1中r-snps扫描电镜图(左)，透射电镜图(右)；
42.图2为实施例1中包埋r-snps的凝胶及未包埋r-snps的凝胶表面在100倍、1000倍
及10000倍下sem结果；
43.图3为snps-gel、r-snps-gel、snps-p-gel和r-snps-p-gel在sgf和sif中溶胀48h后的溶胀率(左)，在scf中溶胀48h后的状态(右)；
44.图4为实施例2中r-snps-p-gel从溶胀到溶解的过程图；
45.图5为实施例2中r-snps-p-gel中res(左)和opc(右)累计释放曲线；
46.图6为实施例3中整个治疗期间各实验组小鼠体重(a)、dai(b)随时间的变化；
47.图7为实施例3中小鼠结肠照片(a)、结肠长度(b)；
48.图8为实施例3中用h&e染色的各组小鼠结肠的代表性图像；
49.图9为实施例3中小鼠脾脏照片(a)、脾脏指数(b)。
具体实施方式
50.下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
51.实施例中所用试剂如无特殊说明均可从市场常规购得。
52.在本发明中，所述同时递送两亲活性物质的海藻酸钙微凝胶的制备方法，主要步骤为使用反向溶剂沉淀法制备得到r-snps，再用液滴法制备得到r-snps-p-gel。
53.实施例1
54.1.制备r-snps-p-gel。
55.(1)将540mg虫胶和60mg白藜芦醇溶解于20ml浓度为99.5％(ml/ml)的无水乙醇溶液中；
56.(2)使用0.45μm微孔滤膜过滤除去步骤(1)溶液中的不溶物；
57.(3)将步骤(2)所得滤液导入hl-2b数显恒流泵中，使用0.25mm内径的针头以0.45ml/min的速度滴入100ml去离子水中，得到负载白藜芦醇的虫胶醇纳米颗粒分散液；
58.(4)将步骤(3)所得分散液用慢速滤纸过滤，用旋转蒸发器(r-1001vn，郑州长城科工贸有限公司)在100mpa、50℃、60r/min下蒸发而去除乙醇，得到浓缩纳米分散液；
59.(5)向步骤(4)中的浓缩分散液中加入去离子水直至总体积为100ml，得到负载白藜芦醇的虫胶纳米颗粒分散液；
60.(6)取40ml步骤(5)中的溶液，将80mg原花青素溶于该溶液；
61.(7)将0.6g海藻酸钠在300r/min的机械搅拌下加入步骤(6)所得的溶液，得到溶胶；
62.(8)以1000r/min的速度离心10min去除步骤(7)所得溶胶中的气泡；
63.(9)将步骤(8)所得溶胶通过微流控设备用内径为0.31mm的针头以5ml/h的速度滴入40ml的2％(g/ml)cacl2溶液中，形成微凝胶；
64.(10)静置30min固化微凝胶，得到海藻酸钙微凝胶。
65.2.将步骤(5)中的虫胶纳米颗粒分散液冻干后通过扫描电镜和透射电镜对其表面形貌和微观结构进行观察，结果如图1所示。通过扫描电镜图可以看出，r-snps具有球形结构和光滑的表面，且颗粒大小很均匀。通过透射电镜图可发现图中r-snps具有双层结构，内核明显，说明res的成功负载。
66.3.将步骤(10)中包埋r-snps的凝胶及未包埋r-snps的凝胶(即步骤(6)中不添加40ml步骤(5)中的溶液)冻干后在扫描电镜下使用100倍、1000倍及10000倍的倍率观察其表面形貌，结果如图2所示，从图中可看出，含有r-snps的凝胶表面较未含有r-snps的凝胶表面更为光滑，两者表面都具有明显的沟壑，而后者沟壑更多更深。说明r-snps的加入可能通过改变凝胶的结构而改变其凝胶特性，使得海藻酸钠的网状结构更为紧密。
67.实施例2：
68.1.制备r-snps-p-gel。
69.(1)将520mg虫胶和65mg白藜芦醇溶解于20ml浓度为99.5％(ml/ml)的无水乙醇溶液中；
70.(2)使用0.22μm微孔滤膜过滤除去步骤(1)溶液中的不溶物；
71.(3)将步骤(2)所得滤液导入hl-2b数显恒流泵中，使用0.28mm内径的针头以0.5ml/min的速度滴入110ml去离子水中，得到负载白藜芦醇的虫胶醇纳米颗粒分散液；
72.(4)将步骤(3)所得分散液用慢速滤纸过滤，用旋转蒸发器(r-1001vn，郑州长城科工贸有限公司)在90mpa、48℃、65r/min下蒸发而去除乙醇，得到浓缩纳米分散液；
73.(5)向步骤(4)中的浓缩分散液中加入去离子水直至总体积为110ml，得到负载白藜芦醇的虫胶纳米颗粒分散液；
74.(6)将80mg opc加入50ml r-snps分散液中混合均匀充分溶解，用机械搅拌器边搅拌(350r/min)边缓慢加入0.8g sa，待溶解成均匀溶胶后以1500r/min在高速离心机中离心15min以去除气泡。将上述制备的溶胶用内径为0.26mm的针头以3ml/h的挤出速度滴入40ml的2.5％(g/ml)cacl2溶液形成凝胶(r-snps-p-gel)，静置30min以固化微凝胶。
75.(7)用同样的方法制备snps-gel，采用反溶剂沉淀法来制备snps。具体而言，在300r/min的搅拌速度下将450mg的虫胶溶解在20ml浓度为99.5％(ml/ml)的无水乙醇中，以获得虫胶乙醇溶液，再在500w下超声2min，使虫胶完全溶解。通过0.45μm微孔滤膜去除少量虫胶不溶物后，使用内径为0.25mm的针头，以10r/min的速度通过恒流泵将过滤后的虫胶乙醇溶液滴入100ml去离子水中。为了确保几乎所有的虫胶都被转化为snps，实验过程中以350r/min的速度搅拌去离子水，直到虫胶乙醇溶液滴完。用慢速滤纸过滤原始snps分散液以除去少量聚集体，再用旋转蒸发器从原始分散液中蒸发出乙醇。向浓缩后的分散液中加入去离子水，以确保最终的分散液体积为100ml。用机械搅拌器边搅拌(350r/min)50ml snps分散液，边缓慢加入0.8g sa，待溶解成均匀溶胶后以1500r/min在高速离心机中离心15min以去除气泡。将上述制备的溶胶用内径为0.26mm的针头以3ml/h的挤出速度滴入40ml的2.5％(g/ml)cacl2溶液形成凝胶，静置30min以固化微凝胶。
76.(8)同理，制备snps-p-gel，即将80mg opc加入50ml snps分散液(实施例2中步骤(7)制备)中混合均匀充分溶解，用机械搅拌器边搅拌(350r/min)边缓慢加入0.8g sa，待溶解成均匀溶胶后以1500r/min在高速离心机中离心15min以去除气泡。将上述制备的溶胶用内径为0.26mm的针头以3ml/h的挤出速度滴入40ml的2.5％cacl2溶液形成凝胶，静置30min以固化微凝胶。
77.(9)同理，制备r-snps-gel，即用机械搅拌器边搅拌(350r/min)50ml r-snps分散液(实施例2中步骤(5)制备)，边缓慢加入0.8g sa，待溶解成均匀溶胶后以1500r/min在高速离心机中离心15min以去除气泡。将上述制备的溶胶用内径为0.26mm的针头以3ml/h的挤
出速度滴入40ml的2.5％cacl2溶液形成凝胶，静置30min以固化微凝胶。
78.2.采用重量分析法来测定同时递送两亲活性物质的海藻酸钙微凝胶的溶胀率，以及考察同时递送两亲活性物质的海藻酸钙微凝胶在人工结肠液(simulated colon fluid,scf)中的溶胀效果。溶胀率的测定方法如下：精密称取一定质量冻干后的水凝胶于烧杯中，向第一组烧杯中倒入20ml模拟胃液(simulated gastric fluid,sgf)，第二组烧杯中倒入20ml模拟小肠液(simulated intestine fluid,sif)，第三组烧杯中倒入20ml模拟结肠液(simulated colon fluid,scf)。按中国药典2005年版，人工胃液：取16.4ml浓度为1mol/ml的稀盐酸，加800ml水与10g胃蛋白酶，摇匀后，加水稀释至1000ml即得。人工小肠液：取6.8g磷酸二氢钾，加500ml水使溶解，用0.1mol/l氢氧化钠溶液调节ph值至6.8，取10g胰酶，加水适量使溶解，将两种液体混合后，加水稀释至1000ml即得。人工结肠液：5.59g磷酸氢二钾与0.41g磷酸二氢钾，加水溶成1000ml即得。让水凝胶在烧杯中溶胀，溶胀48h至平衡，之后，从烧杯中小心过滤出溶胀的凝胶珠，用滤纸擦干表面水分并称重，具体溶胀率的计算公式为：
[0079][0080]
式中w
eq
表示水凝胶的溶胀平衡时的质量(g)，wd表示冻干水凝胶的质量(g)，即溶胀前的质量，sw
eq
表示水凝胶的平衡溶胀率。结果如图3所示。具体溶胀过程见图4。聚合物的溶胀行为不仅由聚合物的组成决定的，同时也受物理张力和大分子链之间弹性能力的影响。snps-gel、r-snps-gel、snps-p-gel和r-snps-p-gel在scf及sif中的溶胀行为如图3中左边图所示。可见，微球在sgf中没有明显的溶胀，而在sif中明显地溶胀。图3右边的图显示了微球在scf中的情况，为溶解后的水凝胶在烧杯中的局部图，可见在结肠液中微球已经溶解。这是因为在酸性环境(sgf)中，-coo-转化为-cooh的形式存在，分子间排斥力小，微球包裹较少的水，所以溶胀率低。而在弱酸性环境(sif)中，微球内部网络结构充分吸水溶胀。在弱碱性环境(scf)中，oh-使-cooh解离，分子间失去交联结构，排斥力增加，分子链可以在溶液中自由扩散，表现为微球溶解。图4显示了r-snps从溶胀到溶解的过程。对比不同微球在sif中的溶胀情况可知，含有res或opc的微球要比不含res或opc的溶胀率小，这可能是res或opc后海藻酸钠微球的结构更加紧密。
[0081]
3.采用体外试验研究了同时递送两亲活性物质的海藻酸钙微凝胶在sgf、sif和scf中的释药行为。在37℃恒温下，将10mg r-snps-p-gel分别浸入10ml sgf、sif和scf中以60r/min的速度摇动。接下来，以预定的时间间隔40min、80min、2h、3h、4h、5h、7h、9h、20h取出200μl上述溶液，其中100μl在306nm处测量res释放量；另外100μl在500nm下测量opc释放量。每次取样后向消化液中加入200μl的新鲜样品(sgf、sif和scf)，以保持体积不变。结果以累积释放(cumulative release,cr)百分比表示。res和opc的累积释放率使用公式计算。
[0082][0083]cn
和c
n-1
分别表示在第n次和n-1次取样时释放介质中活性物质的浓度(mg/ml)，n表示取样次数，l表示水凝胶内负载活性物质的量(mg)。结果如图5所示。
[0084]
样品中res的测定方法为：首先绘制res标准曲线，称取0.1g res用浓度为99.5％(ml/ml)的无水乙醇溶液溶解，配成1mg/ml储备液。将1ml储备液移至10ml棕色容量瓶中，加入蒸馏水定容至刻度，摇匀得到浓度为100μg/ml的res溶液。分别量取0.1、0.2、0.3、0.4、
0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0ml溶液置于10ml容量瓶中，加入蒸馏水定容至刻度，摇匀得浓度分别为1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0μg/ml的不同浓度res溶液待用。利用酶标仪分别测定不同浓度的res溶液在306nm下其吸光值，以浓度(μg/ml)对吸光值进行线性拟合，以得到res标准曲线。将待测样品在306nm处的吸光值代入标准曲线，即可获得相应的释放量。
[0085]
样品中原花青素的测定方法为：首先绘制原花青素标准曲线，向烧杯中加入0.100g的原花青素标准品，用甲醇溶解后转移至100ml容量瓶中，用甲醇定容。精准量取0.5ml、1.0ml、1.5ml、2.0ml和2.5ml原花青素标准品溶液，加入25ml容量瓶，用甲醇定容。此时得到0.02、0.04、0.06、0.08、0.1mg/ml浓度的原花青素溶液。量取上述5个浓度的标准品溶液各0.1ml于试管中，向试管中加入0.3ml 5％(g/g)香草醛溶液和0.1ml浓度为40g/l的盐酸(w/v)。取0.1ml甲醇溶液加入5％(g/g)香草醛溶液0.3ml和浓度为40g/l的盐酸0.1ml作为空白对照。摇晃均匀后进行遮光处理，放入水浴锅中，30℃下反应30min。将上述反应完成的溶液，在500nm的波长下用酶标仪测量吸光值，绘制原花青素的标准曲线。然后量取待测样品0.1ml于试管中，向试管中加入0.3ml 5％(g/g)香草醛溶液和0.1ml浓度为40g/l的盐酸(w/v)。取0.1ml甲醇溶液加入5％(g/g)香草醛溶液0.3ml和浓度为40g/l的盐酸0.1ml作为空白对照。摇晃均匀后进行遮光处理，放入水浴锅中，30℃下反应30min。将上述反应完成的溶液，在500nm的波长下用酶标仪测量吸光值，然后代入标准曲线中即可得到原花青素的释放量。
[0086]
实施例3：
[0087]
1.制备r-snps-p-gel。
[0088]
(1)将420mg虫胶和60mg白藜芦醇溶解于20ml浓度为99.5％(ml/ml)的无水乙醇溶液中；
[0089]
(2)使用0.22μm微孔滤膜过滤除去步骤(1)溶液中的不溶物；
[0090]
(3)将步骤(2)所得滤液导入hl-2b数显恒流泵中，使用0.27mm内径的针头以0.55ml/min的速度滴入90ml去离子水中，得到负载白藜芦醇的虫胶醇纳米颗粒分散液；
[0091]
(4)将步骤(3)所得分散液用慢速滤纸过滤，用旋转蒸发器(r-1001vn，郑州长城科工贸有限公司)在110mpa、52℃、70r/min下蒸发而去除乙醇，得到浓缩纳米分散液；
[0092]
(5)向步骤(4)中的浓缩分散液中加入去离子水直至总体积为90ml，得到虫胶纳米颗粒分散液；
[0093]
(6)取80ml步骤(5)中的溶液，将80mg原花青素溶于该溶液；
[0094]
(7)将1.2g海藻酸钠在400r/min的机械搅拌下加入步骤(6)所得的溶液，得到溶胶；
[0095]
(8)以1200r/min的速度离心15min去除步骤(7)所得溶胶中的气泡；
[0096]
(9)将步骤(8)所得溶胶通过微流控设备用内径为0.3mm的针头以2ml/h的速度滴入40ml的2％(g/ml)cacl2溶液中，形成微凝胶；
[0097]
(10)静置30min固化微凝胶，得到海藻酸钙微凝胶。
[0098]
2.选用50只雄性c57bl/6小鼠适应一周后随机分5组，每组10只，分别记为health(空白对照)组、model(uc模型)组、5-asa(5-氨基水杨酸阳性对照)组、res(r-snps灌胃)组、res+opc(r-snps-p-gel灌胃)组。饲养环境清洁级，温度23～24℃，湿度50～60％，光/暗循
环(7:00～9:00)，可自由获取食物和水。动物的护理和使用程序得到了湖北省疾病预防控制中心伦理委员会的批准，并遵循了所有适用的有关动物伦理使用的机构和政府法规。所有小鼠在15天的试验周期内保证可自由获取标准颗粒饲料。其中，health组在15天的试验周期内保证自由饮水，其余4组小鼠均在前7天自由饮用30g/l葡聚糖硫酸钠(dextran sulfate sodium salt,dss)水溶液，然后在第8天更换为自由饮水。从第4天开始，5-asa组、res组和res+opc组分别持续灌胃5-氨基水杨酸溶液(200μl/kg/day)、r-snps溶液(200μl/kg/day)和r-snps-p-gel(30mg/kg/day)，其中r-snps-p-gel(30mg/kg/day)中的30mg指r-snps-p-gel的质量，200μl 5-氨基水杨酸溶液的5-氨基水杨酸的质量是2mg，200μl r-snps溶液中r-snps的质量是30mg，在保证灌胃量为200μl的前提下配制溶液或稀释溶液以保证给药量。
[0099]
(1)在整个治疗期间，每天记录小鼠体重，绘制出体重变化图。每天评估体重、可见大便稠度和粪便出血的变化。通过评分体重变化、大便粘稠度和出血的变化来确定疾病活动指数(disease activity index,dai)，其中，0分表示粪便普通，便血情况普通，体重没有变化；1分表示大便较软黏在笼壁，粪便中具有较少的血细胞斑点，体重减轻0.1～5％；2分表示中度的腹泻大便不均，粪便有直观可视的血液，体重减轻5.1～10％；3分表示腹泻(水样大便)，粪便有新鲜血液，体重减轻10.1～15％；4分表示体重减轻》15％。体重变化图及dai如图6所示，可看出health组小鼠的体重在15天中一直在增加，model组小鼠从第3天开始体重显著下降，在第8天时，res+opc组的小鼠体重逐渐回升，在第12天时，5-asa组和res组小鼠体重也开始上升，其中res+opc组上升效果最明显，其次是5-asa组和res组。表明使用5-asa、r-snps和r-snps-p-gel干预都对于缓解uc具有一定的效果，这其中，r-snps-p-gel表现最好。使用dss处理后的小鼠dai从第三天开始上升。从第七天开始，所有干预组的dai上升减慢，表现出了积极的干预效果。从第八天开始，所有dss处理后的小鼠的dai均开始出现下降趋势，但是model组小鼠的dai明显大于其它组，表明其uc症状更明显，结肠炎症程度更高。使用5-asa、r-snps和r-snps-p-gel干预均可以在一定程度上缓解uc的症状。
[0100]
(2)最后一次给药24小时后，戊巴比妥钠麻醉并取血，采用脱颈椎法处死各组小鼠，迅速剖开小鼠腹部，完整取出肛门处2cm处向上至8cm处的结肠，测量结肠长度，拍照保存，再沿肠系膜的纵轴方向剪开肠腔，用冰冻生理盐水快速冲洗干净，获取病变最严重处的结损，将其中一部分置于40g/l甲醛中固定，另一部分则立即置于液氮中后放入-70℃的冰箱中保存。所得结肠长度变化如图7，可看出与model对照组相比，res组与res+opc组的结肠长度明显更长。表明r-snps和r-snps-p-gel干预在uc的预防和治疗中具有潜在的应用价值。将保存的小鼠结肠组织进行石蜡包埋切片实验和苏木精-伊红染色组织学评估，所得结果如图8，可看出health组显示出正常的组织结构。而model组小鼠近端可见不规则形状的隐窝，而结肠远端可见隐窝脓肿和严重的免疫细胞浸润，视野内黏膜层上皮细胞全部糜烂脱落，固有层裸露，杯状细胞和黏膜层腺体结构几乎全部消失，黏膜下层水肿。res+opc组小鼠出现炎症明显改善的现象，在结肠的近端和远端区域都有大量的杯状细胞，有正常的隐窝结构，没有隐窝脓肿，未出现免疫细胞的累积现象，更接近健康小鼠的结肠组织。
[0101]
(3)收集脾脏拍照记录、称重并计算脾脏指数(脾脏相对于小鼠体重的重量)，结果如图9所示，结肠炎小鼠的脾显著增大，而r-snps-p-gel的治疗显著缩小了脾大小。说明r-snps-p-gel在小鼠溃疡性结肠炎上有较好的效果。
[0102]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。