一种具有增强免疫力作用的黄芪多糖及其在疫苗佐剂中的应用

本技术属于中医药领域，更具体地涉及黄芪多糖在制备疫苗佐剂中的应用。

背景技术：

0、技术背景

1、黄芪多糖(astragalus polysaccharide，aps)是中药黄芪(astragali radix) 的主要活性成分之一，具有抗肿瘤、抗衰老、抗病毒、调节血糖、降血脂等多种药理作用。

2、疫苗是预防新型冠状病毒肺炎(covid-19)的有效方式。新型冠状病毒(sars-cov-2)的持续传播和不断变异促进了疫苗行业前所未有的快速发展。据世卫组织公布的全球新冠疫苗“紧急使用清单”(emergencying use listing， eul)显示，目前共授权使用11款疫苗，其在预防重症和降低死亡率等方面有显著效果。

3、但是，疫苗接种后可能存在效价不一，保护效力参差不齐，特异性抗体水平维持时间短，需多剂次接种，或对突变株预防能力未知等问题，部分国外疫苗还出现比较严重的副反应。随着新冠毒株的不断变异，各疫苗保护效力还有待考察。因此，在新冠疫苗中加入佐剂不但可以减少接种次数或接种剂量，更可提高疫苗效果或交叉中和保护。

4、流感病毒和新冠病毒类似，均是传染性病毒，可引起呼吸道疾病，疫苗预防是关键。流感和新冠症状有一定的相似性，如发烧、咳嗽、乏力等，但程度不同，同时病毒的传播能力、感染风险等方面存在差异，接种流感疫苗可以减少流感相关疾病带来的危害及对医疗资源的占用。但同样存在某些类型疫苗如灭活疫苗、亚单位疫苗等抗原免疫原性弱等问题，因此需添加佐剂来增强和调节免疫反应。

5、佐剂能够辅助疫苗抗原应答，调节免疫反应强度和类型，提高疫苗效果。目前已批准的人用疫苗佐剂主要为铝盐佐剂、mf59、cpg1018、as系列(as04、 as03、as01)类病毒颗粒等，在批准上市和正在研发的新冠和流感疫苗中都有应用。其中以铝佐剂应用最为广泛，在我国80％以上人用疫苗使用铝佐剂。但这些已上市的疫苗佐剂在使用过程中也逐渐暴露出一定的缺点和不足，主要在安全性、有效性及作用机制等方面，包括：(1)安全性：油乳类佐剂的副作用主要包括强烈的疼痛感，在接种位点处形成炎症反应、肉芽肿以及溃疡等；(2)有效性：应用广泛的铝佐剂不能引起th1和杀伤性cd8+ t细胞反应；同时铝佐剂也并不适合所有的抗原尤其不适合多肽类抗原的应用；(3)作用机制未知：截至目前，很多佐剂的作用机制还未知，例如qs-21和免疫刺激复合物机理的未知，制约了这类佐剂的发展；(4)其他问题：含有铝佐剂的疫苗不可冻融，细胞因子佐剂生产、储存、运输困难等实际问题都影响佐剂的广泛应用。

6、因此，开发新型高效、安全的疫苗佐剂对于新冠病毒和流感病毒的防控至关重要。

技术实现思路

1、针对疫苗保护性效价不一、佐剂数量少、应用局限等现存问题，本技术的一个或多个实施方式提供黄芪多糖疫苗佐剂，其可提高呼吸道病毒疫苗的免疫效果，为开发安全高效的新型疫苗佐剂提供了新方向。

2、本技术的一个或多个实施方式提供了黄芪多糖在制备呼吸道病毒疫苗佐剂中的用途。

3、在一个或多个实施方式中，所述呼吸道病毒疫苗为人呼吸道病毒疫苗。

4、在一个或多个实施方式中，所述呼吸道病毒疫苗为流感病毒疫苗。

5、在一个或多个实施方式中，所述呼吸道病毒疫苗为人流感病毒疫苗。

6、在一个或多个实施方式中，所述流感病毒疫苗为流感病毒裂解疫苗或流感病毒灭活疫苗。

7、在一个或多个实施方式中，所述流感病毒疫苗为人流感病毒裂解疫苗或人流感病毒灭活疫苗。

8、在一个或多个实施方式中，所述流感病毒疫苗为一价、二价、三价或四价流感病毒疫苗。

9、在一个或多个实施方式中，所述流感病毒疫苗为四价流感病毒疫苗。

10、在一个或多个实施方式中，所述流感病毒疫苗为甲型h1n1流感病毒疫苗和乙型by流感病毒疫苗流感病毒疫苗。

11、在一个或多个实施方式中，所述流感病毒疫苗为甲型h1n1流感病毒疫苗或乙型by流感病毒疫苗流感病毒疫苗。

12、在一个或多个实施方式中，所述流感病毒疫苗为甲型h1n1流感病毒疫苗。

13、在一个或多个实施方式中，所述流感病毒疫苗为乙型by流感病毒疫苗流感病毒疫苗。

14、在一个或多个实施方式中，所述呼吸道病毒疫苗为冠状病毒疫苗。

15、在一个或多个实施方式中，所述呼吸道病毒疫苗为sars-cov-2疫苗。

16、在一个或多个实施方式中，所述sars-cov-2疫苗为重组蛋白sars- cov-2疫苗。

17、在一个或多个实施方式中，每剂疫苗中所述黄芪多糖的量为 500μg～1100μg，例如500、600、700、800、900、1000、或1100μg。

18、在一个或多个实施方式中，所述黄芪多糖为黄芪经过水提醇沉的方法获得的沉淀物。

19、在一个或多个实施方式中，所述黄芪多糖通过以下方法制备：

20、(1)将黄芪饮片用水煎煮提取，向提取液的浓缩液加乙醇，过滤去除上清液，得到第一沉淀物；

21、(2)任选地，向所述第一沉淀物加乙醇，过滤去除上清液，得到第二沉淀物；

22、(3)任选地，向所述第二沉淀物加水溶解后再加乙醇，取上清液加乙醇，再过滤去除上清液，得到第三沉淀物；

23、(4)任选地，向所述第三沉淀物加水，超滤，将滤液经过阳离子和阴离子交换层析柱、洗脱液过滤膜、和超滤系统两级超滤，将得到的两级超滤液冷冻、复融、离心，将上清液浓缩，再加乙醇后离心去除上清液，得到第四沉淀物；

24、(5)任选地，将所述第四沉淀物干燥、粉碎、混合，即得。

25、在一个或多个实施方式中，所述黄芪多糖的重均分子量(mw)为48,000～140,000(例如50,000、60,000、70,000、80,000、90,000、100,000、110,000、 120,000、130,000、或140,000)，分布系数d(mw/mn)≤23.0(例如1、2、3、 4、5、6、7、8、9、10、15或20)。

26、在一个或多个实施方式中，采用高效液相色谱法测定，以d-无水葡萄糖计，所述黄芪多糖的总糖含量为85％～115％(例如90％、95％、100％或110％)。

27、在一个或多个实施方式中，提供黄芪多糖在制备新冠病毒疫苗和流感疫苗的佐剂中的用途，其中免疫动物为小鼠。

28、在一个或多个实施方式中，提供黄芪多糖在制备新冠病毒疫苗和流感疫苗的佐剂中的用途，其中免疫方法为将黄芪多糖和疫苗混合后进行肌肉注射。

29、在一个或多个实施方式中，本技术的技术方案可获得如下有益效果的至少一种：

30、黄芪多糖作为新冠疫苗和流感疫苗的佐剂，其小鼠实验结果证明，血清中特异性抗体水平含量较单用疫苗组明显升高；

31、可提高对流感病毒攻击小鼠的保护作用，效果优于铝佐剂；

32、黄芪多糖作为新冠疫苗和流感疫苗的佐剂，免疫效果显著，且对机体免疫系统不产生过度的刺激反应，具有更高的安全性；和

33、通过小鼠免疫实验发现，黄芪多糖与疫苗联用时，血清中igg特异性抗体水平、血凝抑制抗体效价较单用疫苗组明显升高，同时可促进脾细胞增殖、淋巴细胞亚型分化、调节细胞因子，增强机体体液免疫和细胞免疫，且具有免疫保护作用时间长、不引发强烈免疫反应、安全性高等优势，为黄芪多糖提供了新的应用领域。。

34、在一个或多个实施方式中，黄芪为豆科黄芪属植物蒙古黄芪astragalusmemeranaceus(fisch.)bge.var.mongholicus(bge.)hsiao或膜荚黄芪a. membranaceus(fisch.)bge.的根。

35、在一个或多个实施方式中，黄芪多糖的制备方法可以参考中国专利cn110551230b中的内容，其全部内容以引用的方式合并入本文。

36、在一个或多个实施方式中，提供黄芪多糖的制备方法，该方法包括如下步骤：

37、1)取黄芪饮片适量，加水煎煮三次，第一次10倍量(v/w)、第二次8倍量、第三次6倍量，煎液合并后滤过，滤液浓缩至25℃相对密度为1.14～1.18％，浓缩液放置至室温，加乙醇使含醇量为70％，边加边搅拌，室温放置；

38、2)除去上清液，沉淀加乙醇至上清液乙醇含量＞94％，除去上清液，按沉淀溶解后18％的浓度计算加水量，加水溶解沉淀；

39、3)溶液加乙醇使含醇量为35％，搅拌均匀，离心，除去沉淀；上清液再加乙醇使含醇量为70％，放置，除去上清液，沉淀加水溶解、过滤，滤液加水定容到糖度20～26％，超滤至透过液电导率≤350μs/cm，继续超滤至保留液体积为超滤前溶液加水定容体积的25％～30％；

40、4)保留液分别通过阳离子和阴离子交换层析柱，以20mmol/l醋酸-醋酸钠缓冲液洗脱，洗脱液经过三级串联微孔滤膜滤过，滤液经分级超滤系统分两级超滤，分别收集不同极性及分子量的超滤保留液i和超滤保留液ii，滤液加水超滤至透过液电导率≤150μs/cm，继续超滤至保留液体积为洗脱液体积的 10％～15％；

41、5)分级超滤所得的保留液i和ii分别经-30至-70℃冷冻1-10天后室温复融，使用高速离心机离心，上清液在温度35-45℃、真空度小于1000mbar条件下用真空薄膜浓缩机浓缩至药液糖度为20％～26％，浓缩液加乙醇使含醇量为 90％，离心，除去上清液，沉淀用乙醇搅拌至完全溶解、离心、除去上清液，反复2-3次，沉淀低温干燥、粉碎，得到两种不同极性及分子量的黄芪多糖粉末i 和黄芪多糖粉末ii，将两者混合后，得到重均分子量分布范围在48000～140000、分布系数不大于23.0的黄芪多糖；

42、其中，步骤4)保留液分别通过pharmacia公司生产的serharose sp bigbeads 和sepharose q big beads规格为ge-g300×500×500的阳离子、阴离子交换层析柱，滤液经millipore公司生产的型号为pzb008a系列超滤系统分级超滤；选用100k及8k的膜包；

43、其中，步骤5)在温度35-45℃、真空度小于1000mbar条件下，上清液用真空薄膜浓缩机浓缩至药液糖度为20％～26％。