一种改造的外泌体制剂、其制备方法及应用

本发明属于医药生物，具体的，涉及一种改造的外泌体制剂、其制备方法及应用。

背景技术：

1、进入肿瘤免疫治疗时代以来，多种免疫检查点抑制剂(包括抗体和小分子)、car-t细胞治疗和治疗 性肿瘤疫苗进入临床试验，并在很多实体瘤和恶性血液癌症中发挥了显著的治疗作用。然而，患者的药物 反应率和治愈率均处于较低的水平，而且在治疗过程中还时常产生原发性或继发性抵抗效性，削弱免疫治 疗的效果。研究显示，有限的免疫治疗效果与肿瘤抗原的缺失或贫乏相关，同时肿瘤组织内部的免疫抑制 性特征也是抑制免疫治疗发挥功效的一道障碍[1-3]。dc细胞是人体内专业的抗原呈递细胞，能够激活辅 助t细胞，继而帮助cd8阳性t细胞活化，发挥抗肿瘤功效[4]。此外，dc还能通过辅助性t细胞或b细胞分泌抗体的方式强化nk细胞的抗肿瘤功能[5]。尽管dc疫苗(将dc细胞分离出来后，体外孵育肿 瘤抗原，并促进其成熟，再回输到患者体内)在临床上体现出一些治疗优势，但是并非所有的患者都能很 好的响应该疗法。究其原因，还是在肿瘤抗原的低免疫原性，免疫逃逸和肿瘤引起的免疫抑制等因素[6,7]。

2、所有细胞，包括原核细胞和真核细胞均可以释放细胞外囊泡。细胞外囊泡中直径为40-160nm的被称 为外泌体(平均直径100nm)。外泌体发源于细胞的内涵体，在分泌出细胞之前与各种细胞器进行相互作 用，因此其内部含有多种细胞质及细胞器来源的内含物，包括dna、rna、脂类分子、代谢产物、细胞 质和细胞膜上的各种蛋白质等等[8]。以往认为外泌体的功能是处理细胞废弃的物质，而近期的研究显示外 泌体具有非常丰富的功能，而且不同细胞产生的外泌体携带不同的内容物，这种异质性直接导致外泌体功 能导向性的差异[8]。

3、肿瘤细胞分泌的外泌体(简称为“肿瘤外泌体”)能被应用于肿瘤的免疫治疗主要基于其自身的几个 特点：首先，肿瘤外泌体携带了肿瘤细胞(分泌该外泌体的母细胞)自身的肿瘤抗原，能够激活肿瘤特异 性t细胞，引起抗肿瘤免疫应答[9,10]；其次，肿瘤外泌体表面携带大量组织相容性复合物(mhc-i和 mhc-ii)，而这些分子是抗原肽结合所必须的结构性分子[11]，同时能够避免产生免疫排斥反应；此外， 肿瘤外泌体表面还有大量促进其与受体细胞结合并被吞噬的蛋白，例如mfge8(milk fat globulin-e8)，rab7， lamp1(liposome-associated membrane protein 1)，cd9，cd81，annexin ii，cd54和cd63[12-14]；最后， 肿瘤外泌体还具有结构稳定的特点，其双层脂膜能够保护其内含物免受各种核酸酶或者蛋白酶的侵扰，适 用于小分子、核酸类药物的递送系统[15]。

4、近年来已经有研究证实了肿瘤外泌体作为肿瘤治疗性疫苗的可行性，包括临床前模型[16]和临床试验 [17]。肿瘤外泌体仅具备有限的免疫原性，但针对肿瘤微环境中其它免疫细胞类群会产生免疫抑制性，也 会限制其效能的发挥。而且，肿瘤外泌体能通过抑制凋亡、促进产生药物抗性、帮助肿瘤细胞扩散-迁移- 定殖、促进血管新生、肿瘤免疫逃脱以及免疫抑制等手段参与了肿瘤发生发展的各个阶段[8]。因此，单独 使用肿瘤外泌体进行免疫治疗时，往往无法产生令人满意的抗肿瘤免疫活性，这也解释了为什么该疗法目 前仍未在临床获批使用。

5、为了解决上述问题，目前发展出很多针对分泌肿瘤外泌体的母细胞的改造策略，例如增加肿瘤外泌体 的热休克蛋白含量，提供佐剂效果[18,19]；增加某种肿瘤特异性抗原的表达量，以此增加肿瘤外泌体中肿 瘤特异性抗原的丰度及免疫原性[20]；添加超抗原到肿瘤外泌体中，利用超抗原与mhc ii分子形成稳定复 合物的特性，促进肿瘤外泌体对dc细胞的激活作用[21)；通过在肿瘤细胞中高表达控制mhc ii分子的转 录因子ciita，增加肿瘤外泌体上mhc ii分子的丰度，提高抗原肽的呈递效率及有效的肿瘤抗原肽的丰 度[22]；整合一些病毒融合蛋白到肿瘤外泌体中，促进dc细胞对其的摄取量[23]；肿瘤细胞中高表达细胞 因子，增加肿瘤外泌体中细胞因子的含量以及肿瘤外泌体的免疫原性[24]；肿瘤细胞中高表达一些对产生 免疫抑制性有关基因具有负调控作用的mirna，那么肿瘤外泌体也会包含这些mirna，当这些肿瘤外泌 体被免疫细胞摄取后将通过mirna的机制避免产生很强的免疫抑制性，进而提升免疫原性[25]。

6、此外，还有一种策略：通过将肿瘤外泌体在体外与dc共培养，将肿瘤特异性抗原交给dc来呈递， 之后再以dc疫苗的形式来治疗肿瘤。这样可以避免游离的肿瘤外泌体引起的免疫抑制性以及激活更有效 的免疫反应[7]。

7、综上所述，由于携带大量肿瘤细胞的特异性抗原，肿瘤外泌体具有作为抗肿瘤疫苗开发的潜力，但是肿瘤外泌体能抑制肿瘤微环境，甚至引流淋巴结中免疫细胞功能的天然属性限制了它的临床转化应用。尽 管提出了多种基于改造肿瘤细胞(分泌外泌体的母细胞)的策略，但是此类方案耗时长，价格昂贵且操作 流程上难以统一，不便于在临床实践中的推广。

8、基于此，提出本发明

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技术实现思路

1、本发明首先涉及一种改造的肿瘤外泌体制剂，所述的制剂包含：

2、(1)浓度大于50ug/ml二硬脂酸磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(peg-dspe)；

3、(2)蛋白浓度大于10ug/ml的肿瘤外泌体成分；

4、(3)有效量的用于刺激免疫反应的免疫佐剂分子；

5、所述的peg-dspe的纯度≥95％，其中的peg链的分散度≤1.1；

6、优选的，所述的peg-dspe分子中的peg链长为1000～5000da；更优选的，所述的peg-dspe分子 中的peg链长为1500～2500da；最优选的，所述的peg-dspe分子中的peg链长为2000da (peg2000-dspe)；

7、所述的peg-dspe也可以使用其他类型的聚乙二醇化磷脂进行代替，具体的，

8、聚乙二醇化磷脂结构中，

9、磷脂部分的脂肪酸链包含的碳原子数为10～24个，脂肪酸链可以是饱和的，也可以是部分饱和的， 优选为为月桂酸(12碳)、肉豆蔻酸(14碳)、棕榈酸(16碳)、硬脂酸或油酸或亚油酸(18碳)、廿酸(20碳)、 山俞酸(22碳)、木焦油酸(lignocerate)(24碳)；

10、聚乙二醇化磷脂的磷脂部分可以是磷酯酰乙醇胺(pe)、磷脂酰胆碱(pc)、磷脂酰肌醇(pi)、磷脂酰丝氨 酸(ps)、二磷脂酰甘油、溶血磷脂胆碱(lpc)、溶血乙醇胺磷脂(lpe)等；优选为磷酯酰乙醇胺，尤其是二 硬脂酰磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、二油酰磷脂酰乙醇胺。

11、所述的蛋白浓度指制剂中所有的肿瘤外泌体中所包含的蛋白浓度，优选的，使用bca法对肿瘤外泌 体的蛋白浓度进行定量；

12、所述的免疫佐剂分子包括但不限于，mpla(monophosphoryl lipid a，单磷酰脂质a)、qs21(quillaja saponaria，皂树皂苷)、polyi:c(聚肌胞苷酸)；优选为mpla；

13、优选的，所述的免疫佐剂分子的用量为0.1～10ug/ml。

14、进一步的，所述的改造的肿瘤外泌体制剂中，peg-dspe、免疫佐剂分子、肿瘤外泌体中的总蛋白三 种成分的质量比为：100：0.1～5：2～50；优选的，所述的peg-dspe、免疫佐剂分子、肿瘤外泌体中的总 蛋白三种成分的质量比为：100：0.5～2：5～20。

15、所述的肿瘤外泌体来源于体外培养的肿瘤系或自肿瘤组织中分离的原代肿瘤细胞；

16、所述的肿瘤外泌体使用密度梯度离心、差速离心、体积排阻、免疫分离、聚合物沉淀法制备，或使用 商品化的试剂盒制备；

17、本发明还涉及所述的改造的肿瘤外泌体制剂的制备方法，其包括如下步骤：

18、(1)制备不含溶剂成分的peg-dspe和免疫佐剂混合物；

19、(2)向上述混合物中加入定量好的肿瘤外泌体溶液，常温下充分混匀即得所述改造的肿瘤外泌体制 剂；

20、以及可选的，

21、(3)对所述改造的肿瘤外泌体制剂进行除菌过滤。

22、优选的，步骤(1)所述的制备不含溶剂成分的peg-dspe和免疫佐剂混合物的方法为，将peg-dspe 和免疫佐剂分子溶于有机溶剂中并混匀，然后除去有机溶剂；更优选的，在惰性气体的保护下，使用减压 蒸馏法，在低于70℃下去除有机溶剂。

23、本发明还涉及所述的改造的肿瘤外泌体制剂在制备药物中的应用，所述的药物是抗肿瘤药物。

24、本发明还涉及所述的改造的肿瘤外泌体制剂在制备个体化抗肿瘤制剂中的应用；优选的，所述的个体 化抗肿瘤制剂中，所述的肿瘤外泌体来自于需要接受个体化治疗的患者自体的肿瘤组织或肿瘤细胞。

25、本发明还涉及含有所述的改造的肿瘤外泌体制剂的药物或药物组合物。

26、本发明还涉及含有所述的改造的肿瘤外泌体制剂的个体化药物制剂，所述的个体化药物制剂中，所述 的肿瘤外泌体来自于需要接受个体化治疗的患者自体的肿瘤组织或肿瘤细胞。

27、本发明还涉及使用所述的改造的肿瘤外泌体制剂治疗肿瘤的应用；优选的，使用来自于患者自体的肿 瘤组织或肿瘤细胞，制备所述的改造的肿瘤外泌体制剂。

28、本发明的有益效果在于：

29、(1)聚乙二醇化磷脂(peg2000-dspe，以下简称pp)改造的肿瘤外泌体与游离的肿瘤外泌体相比， 入胞的途径也发生了改变，pp改造肿瘤外泌体能直接进入内质网(图6)，便于引起更强的肿瘤抗原特异 性t细胞应答(图7，8，9，10和11)；而与此对应的，游离的肿瘤外泌体被dc细胞内吞之后，快速进 入溶酶体，其所含抗原将由mhc ii途径呈递[14,19,20]。

30、(2)在野生型小鼠中，给予pp改造的肿瘤外泌体能引起肿瘤抗原特异性ctl反应，而且在荷瘤小 鼠中pp改造的肿瘤外泌体同样展现出良好的抗肿瘤效应。

31、(3)pp改造的肿瘤外泌体还能改善肿瘤微环境中的免疫细胞浸润情况，增加dc、巨噬细胞、具有 抗肿瘤活性的cd4+，cd8+t细胞的比例，为与其它抗肿瘤免疫治疗方案的联用奠定了良好的基础。

32、(4)治疗方案具有一定普适性：只要使用的肿瘤外泌体来源于同样的组织来源，那么即使基因突变 频率或特点不一致，也应具有一定的治疗效果。

33、(5)针对个体特异性有很好的疗效：在体内免疫编辑的作用下，或者接受了能够引起基因突变的治 疗方式，包括并不仅限于放射治疗、化疗、免疫治疗等之后，部分肿瘤组织来源的外泌体用于制备pp改 造的肿瘤外泌体对剩余肿瘤组织具有治疗作用，甚至可以预防肿瘤的远端器官转移。