一种可活体动态监测小鼠血脑屏障破坏的方法

本发明属于动物实验，具体涉及一种可活体动态检测小鼠血脑屏障破坏的方法。

背景技术：

1、血脑屏障(bbb，brain-blood barrier)是脑组织血管特有的结构，主要由连续型血管内皮细胞、星形胶质细胞、周细胞及基底膜构成，血管内皮细胞间存在大量紧密连接(tjs,tight junctions),是其屏障功能的结构基础，tjs主要由claudin-5及occludin蛋白组成并通过闭锁小带家族(zo-1，zo-2，zo-3)连接到细胞骨架上。bbb构成细胞可直接遭受的损伤主要来源于两方面，即炎症损伤及微循环障碍，前者可造成bbb构成细胞的线粒体功能障碍、tjs分解等，而后者可直接造成局部组织缺血缺氧。但二者在bbb损伤中的作用时间、病理进程、造成的损伤是否具有可恢复性以及早期脓毒症中作用的强弱等目前尚未完全清楚。

2、完整的bbb结构对于维持稳定的神经组织内环境和保障中枢神经系统功能至关重要。bbb破坏及通透性异常增加是多种神经系统疾病如卒中、脑肿瘤及神经退行性疾病等的重要病理表型，也与神经元病变及神经组织炎症直接相关。故实现活体动态监测bbb通透性改变是目前基础研究的迫切需要，但既往研究中评估各组病理情况下bbb通透性改变的方法均无法在不影响模型动物病理状态的情况下解决动态监测的问题，已进行的尝试多为在单个时间点进行监测，无法形成自身前后对照，无法排除基线bbb通透性水平的影响且难以证明相关干预的有效性。

3、现有的bbb损伤检测方法针对的目标主要为bbb自身组成成分的变化和外源性对比剂分布两类。bbb自身组成成分改变的监测主要包括生物标志物和免疫组化、免疫荧光等组织样本检测方法，既往研究中开发的多种标志物包括外周血毛细血管内皮细胞计数、mirna-130a或mirna-143、外周金属蛋白酶(mmp-2、mmp-3、mmp-9)等多种分子，但此类指标的灵敏度及特异度仍不能令人满意，难以确定外周血中的标志物水平异常是否能特异性反映bbb病变；而组织样本检测意味着必须处死动物后取出脑组织操作，无法进行自身前后对照。

4、外源性对比剂分布检查包括影像学检查和脑组织染色两类，影像学检查方法为经静脉注射钆剂(gd-dtpa,m＝552da)后，通过对动态对比mri及ct灌注成像等影像学检查数据计算其渗出率，可在临床上应用于脑血管疾病患者，也可应用于颅脑疾病动物模型的bbb损伤程度评估，其可实现无创监测，但费用较高，易受到空间分辨率和信噪比等指标影响，且钆剂在体内代谢所需间期较长故难以对急性脓毒症模型进行动态监测；而脑组织染色方法由来已久，染色剂从分子量最小的荧光素钠(nafl，m＝376da)、吲哚菁绿(icg，m＝847da)到分子质量较大的evans蓝(m＝961da，结合白蛋白后可达68kda),以及可进行特定分子量定制的fitc-dextran等，可分别用于评估bbb损伤后可自由通过的分子量大小以衡量其严重程度，同时根据染色区域评估其累计范围，但大多数染色剂存在毒性，动物造模后难以正常排出体外，故单纯进行脑组织染色只能对离体组织进行操作。

5、鉴于对活体监测bbb功能的需要，近年来经光学颅窗对脑组织进行光学指标监测的方法日趋成熟，可分为持续性颅窗(保持颅骨完整性，可多次成像)及短期颅窗(需要颅骨钻孔及硬脑膜切除，直接观察脑组织)，均可实现动态指标检测，但后者由于存在颅内压改变等脑功能异常，仅能完成几小时到十几个小时的短时间监测，且开颅造成的影响无法排除，需在监测完成后处死。近年来在体双光子技术得到迅速发展，可实现经短期颅窗向目标脑区置入微型镜头后再次封补颅骨破损处实现长期生存，同时经微型镜头及信号转换器持续观察局部生理、生化及病理改变，但这类方法造价极为昂贵，实验技术要求较高，无法进行大规模推广。

6、而在临床前研究中，我们常需要针对病理探究、药物筛选等目标，在不影响正常病程的情况下，对bbb通透性在造模前后多个时间点进行大量动态活体监测，而既往的bbb通透性监测方法总体上均无法同时满足活体、动态可重复、对动物病程影响小、监测间期短、造价较低、可大规模推广的要求，而我们的方法将活体颅窗、荧光素钠活体组织染色和小动物活体荧光成像技术结合起来，解决了对一种可活体动态检测小鼠血脑屏障破坏方法的需求。

技术实现思路

1、为了解决上述技术问题，本发明提供了一种可活体动态检测小鼠血脑屏障破坏的方法，通过对c57小鼠进行颅骨盖板置换术得到可持续使用的脑组织光学观察窗，进而以荧光素钠(nafl)作为荧光对比剂经腹腔注射后，应用小动物活体荧光成像技术检测选定脑区的荧光强度值作为血脑屏障通透性改变程度的定量指标。

2、为了达到上述技术效果，本发明是采用以下技术方案实现的：一种可活体动态检测小鼠血脑屏障破坏的方法，具体包括以下步骤：

3、s1、对c57小鼠建立脑组织光学观察窗；

4、s2、在疾病模型造模前检测小鼠对荧光对比剂nafl的基础通透性；

5、s3、在疾病模型造模后检测小鼠对荧光对比剂nafl的实时通透性，并计算其前后差值，通透性前后差值越大，说明脓毒症造成的bbb损伤越大，其通透性异常升高越严重；

6、进一步的，所述s1中创建小鼠组织光学观察窗，具体包括以下步骤：

7、s1.1对小鼠颅骨进行3d扫描获取其外形，并以此为根据设计了3d平面盖板；

8、s1.2对小鼠头部进行脱毛；

9、s1.3将小鼠腹腔注射麻醉，并固定于颅脑立体定位架中，切除覆盖枕骨、顶骨及额骨的皮肤，用棉签擦去其上附着的骨膜；

10、s1.4颅骨表面干燥后，在暴露的颅骨表面均匀涂上口腔科粘合剂于30秒内迅速夹取预先经3d打印制作完成的平面盖板，置于粘合剂上，以前囟为标记，保证其覆盖范围包括整个大脑上方、前囟及小脑，摆正位置，左右对称，排除盖板下气泡；

11、s1.5取定向紫外线仪照射粘合剂覆盖范围40秒，促使其凝固；

12、s1.6在盖板周围用黑色mark笔将其侧面涂黑，防止成像时其他方向折射光干扰；

13、进一步的，所述s2、s3中检测小鼠对荧光对比剂nafl的基础通透性，具体包括以下步骤：

14、取nafl粉剂溶于生理盐水中配成溶液，并按照10mg/kg剂量对小鼠进行腹腔注射；

15、应用ivis spectrum小动物活体成像系统对小鼠脑组织感兴趣区域进行荧光强度检查；

16、进一步的，所述造模前小鼠bbb通透性量化值＝注射nafl后60分钟时的脑组织roi内总辐射效率-注射前同-roi内总辐射效率；

17、进一步的，所述进行脓毒症造模后小鼠通透性量化值＝该时间点注射nafl后60分钟时的脑组织roi内总辐射效率-此小鼠造模前注射nafl后60分钟时的脑组织roi内总辐射效率；

18、本发明的有益效果是：

19、本发明的提供的检测方法，在疾病模型造模前后小鼠脑组织荧光强度增加值值变化趋势与脑组织中bbb损伤对比剂eb浓度变化趋势一致；其中脑组织荧光强度增加值可作为一种评估bbb通透性损伤的生物标志物，相较于现有技术的bbb损伤监测，本发明的监测方法可实现动态监测、无毒无害，且可长期反复使用形成自身前后对照。