2,2’-二吡啶酮腙二硫代甲酸丁酯的医药新用途

2,2
’‑
二吡啶酮腙二硫代甲酸丁酯的医药新用途
技术领域
1.本发明属于二硫代甲酸衍生物的医药新用途技术领域，具体涉及2,2
’‑
二吡啶酮腙二硫代甲酸丁酯在制备抑制黑色素瘤细胞增殖药物中的应用。


背景技术：

2.黑色素瘤仅占所有皮肤癌的1%，但它却是最具侵袭和危险性的，在皮肤癌中90%来自黑色素瘤[1]。黑色素瘤是由良性病变（如黑色素细胞痣）到恶性肿瘤（称为黑色素瘤）转变而来。黑色素细胞是神经嵴衍生的细胞，在发育过程中会定植于皮肤、眼睛，在较小程度上，还会分布在全身范围的其它组织[2]。不对称、边界不规则、色斑、直径大于6mm、病变演变（大小、颜色、形状或痣发生变化）和“看起来有点怪是黑色素瘤诊断的准则。黑色素瘤分为两类：皮肤性黑色素瘤和非皮肤性黑色素瘤。非皮肤性黑色素瘤又分为：紫外线引起csd黑色素瘤、非csd黑色素瘤及四种常见基因亚型（braf、 ras、 nf1基因突变及三野生型）； 而皮肤性黑色素瘤分为：葡萄膜的、肢端的及粘膜的黑色素瘤[3]。流行病学研究表明皮肤白皙的人更容易患皮肤黑色素瘤，而皮肤较深的人更易患非皮肤黑色素癌。非皮肤黑色素瘤发生在紫外线暴露程度低的区域，如葡萄膜、粘膜组织和肢端组织，而皮肤黑色素癌发生在更容易受到有害紫外线辐射损害的区域。早期阶段的黑色素瘤是“可治愈的”，然而，转移后的难以治疗，五年生存率仅为25%。黑色素瘤转移常见位点有肺、肝、脑、骨和皮肤[4]；葡萄膜黑色素瘤转移第一个位点是肝脏，也是唯一转移灶[5-7]。
[0003]
从分子角度上看，braf、ras、nf1基因突变引起功能丧失；另外，在三阴的亚型里发现gnaq、gna11、kit、ctnnb1及ezh2基因或促进子突变，这些突变均导致mapk及pi3k/akt通路活化，刺激黑色素瘤细胞快速增值[8]。
[0004]
黑色素瘤的治疗包括：手术治疗：无论黑色素瘤的诊断阶段如何，原发肿瘤都可通过局部广泛切除手术切除，以控制局部疾病并防止癌症进一步扩散。对于原位黑色素瘤，手术被认为是有效的。化疗：紫杉醇、顺铂、替莫唑胺、达卡巴嗪、卡铂是临床常用的化疗药物。肝导向治疗是将肝动脉栓塞与浓缩剂量的化疗药物（包括顺铂和1,3-双(2-氯乙基)-1-亚硝基脲（bcnu））的灌注相结合治疗手段[9]。化疗也是晚期黑色素瘤患者难治性、进行性或复发性黑色素瘤的姑息性/挽救性治疗[10-11]。放射治疗：通常黑色素瘤是一种抗辐射的肿瘤，但在某些情况下，辐射可用于治疗黑色素瘤。靶向治疗： 主要有braf、ras、nf1抑制剂，如vemurafenib用于braf v600e激活突变的黑色素瘤，机制上该药物是通过抑制过度激活mapk通路的激酶活性[12]。免疫治疗：主要是一类免疫检查点抗体，如pd-l1阳性黑色素瘤患者，使用pd-1抗体治疗的有效率为50%-60%，比pd-l1阴性黑色素瘤存活率高（10%-20%），然而，在一些pd-l1阳性肿瘤患者中，他们对抗pd-1治疗没有反应。
[0005]
目前困境：细胞毒性抗癌药物顺铂、紫杉醇、阿霉素、5-氟尿嘧啶（5-fu）以及靶向药物伊马替尼、埃洛替尼和尼沃单抗在临床癌症治疗中发挥着关键作用。然而，药物处理肿瘤细胞时，也导致宿主细胞逐渐适应，由此降低了药物得敏感性，即产生耐药性，这严重影响了它们的抗癌功效[13]。药物抗性与多种基因改变有关。许多研究表明，耐药性除了减少
anticancer chemotherapy, 2021;57: 100770。
[0019]
14. sulkowska m, famulski w, bakunowicz-lazarczyk a, chyczewski l, sulkowski s. bcl-2 expression in primary uveal melanoma. tumori. 2001; 87:54
–
57。
[0020]
15. ubellacker j. m, tasdogan a, ramesh v, shen b, et al., lymph protects metastasizing melanoma cells from ferroptosis. nature, 2020; 585(7823): 113-118。


技术实现要素：

[0021]
本发明的目的是提供了2,2
’‑
二吡啶酮腙二硫代甲酸丁酯的医药新用途。
[0022]
本发明为实现上述目的采用如下技术方案，2,2
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二吡啶酮腙二硫代甲酸丁酯在制备抑制黑色素瘤细胞增殖药物中的应用，该2,2
’‑
二吡啶酮腙二硫代甲酸丁酯的结构式为：。
[0023]
进一步限定，所述2,2
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二吡啶酮腙二硫代甲酸丁酯能够诱导黑色素瘤细胞副调亡，尤其是具有调亡抗性的黑色素瘤细胞。
[0024]
进一步限定，所述黑色素瘤细胞为具有铁死亡抗性的黑色素瘤细胞。
[0025]
本发明具有以下优点和有益效果：（1）2,2
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二吡啶酮腙二硫代甲酸丁酯对黑色素瘤具有极好的抑制作用， 优于临床常用的顺铂；（2）本发明首次发现2,2
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二吡啶酮腙二硫代甲酸丁酯能够诱导副凋亡（paraptosis），可有效地对抗凋亡（apoptosis）抗性（缺陷）的癌细胞；（3）2,2
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二吡啶酮腙二硫代甲酸丁酯对铁死亡抗性的黑色素瘤细胞具有很好抑制活性。
附图说明
[0026]
图1为2,2
’ꢀ‑
二吡啶酮腙硫代甲酸丁酸酯及顺铂对黑色素肿瘤细胞的生长抑制作用，其中（a）sk-mel-28细胞；（b）a375细胞。
[0027]
图2为2,2
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二吡啶酮腙二硫代甲酸丁酯使sk-mel-28细胞发生副凋亡，其中（a）dmso（n,n-二甲基亚砜）；（b）二吡啶酮腙二硫代甲酸丁酯的囊泡形成（显微镜下观）；（c）囊泡统计；（d）alix的变化；（e）chx对2,2
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二吡啶酮腙二硫代甲酸丁酯诱导囊泡化的影响；（f）chx对2,2
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二吡啶酮腙二硫代甲酸丁酯诱导alix的影响； （g）alix变化的统计学分析。
[0028]
图3为2,2
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二吡啶酮腙二硫代甲酸丁酯诱导sk-mel-28的囊泡形成的位置，内质网染料：（a）dmso；（b）2,2
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二吡啶酮腙二硫代甲酸丁酯透射电子显微镜；（c）dmso；（d）2,2
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二吡啶酮腙二硫代甲酸丁酯。
[0029]
图4为2,2
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二吡啶酮腙二硫代甲酸丁酯诱导的生长抑制部分地涉及凋亡，（a、b）药物处理前后的形态学变化；（c）mtt法测定浓度依赖性生长抑制；（d）凋亡抑制剂可减弱药
物引起的生长抑制；（e）凋亡相关蛋白的改变；（f）凋亡相关蛋白的定量分析；（g）流式细胞分析，p《0.05 vs对照组，p《0.01 vs对照组。
[0030]
图5为2,2
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二吡啶酮腙二硫代甲酸丁酯及erastin对a375细胞的生长抑制。
具体实施方式
[0031]
以下通过实施例对本发明的上述内容做进一步详细说明，但不应该将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明上述内容实现的技术均属于本发明的范围。
实施例
[0032]
2,2
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二吡啶酮腙二硫代甲酸丁酯对黑色素瘤细胞的生长抑制作用1、试剂及检测仪器：mtt（sigma），胰酶（北京拜尔迪生物技术有限公司）。培养基（北京索莱宝生物技术有限公司），血清（浙江天杭生物科技有限公司），dmso（天津市德恩化学试剂有限公司）；酶标仪（theromo scientific）。
[0033]
2、mtt法评估目标化合物的抗黑色素瘤细胞的生物活性以人源黑色素瘤sk-mel-28，a375及鼠源b16细胞为测试细胞株，选用对数生长期的贴壁肿瘤细胞，经胰酶消化后，用10wt%胎牛血清的rpmi 1640培养基配成5
×
103个/ml的细胞悬液，接种到96孔培养板，每孔接种100μl，37℃，体积分数5% co2培养24小时。设立阴性对照组、阳性对照组及实验组。细胞贴壁后实验组更换新的含有不同浓度被测样品的培养基。阳性组对照给予顺铂，阴性对照组则换为含有等体积溶剂的培养基。每组设三个复孔，37℃，体积分数5% co2培养48小时。弃去上清液，每孔加入10μl新鲜配制的10mg/ml mtt 的无血清培养基。37℃继续培养4小时。小心弃上清，并加入100μl dmso，在平板震荡器震荡均匀后，在酶标仪上测定每孔在570nm的吸光度（od）值。按下列公式计算药物对肿瘤细胞生长的抑制率：抑制率（%）=（对照组的od值-实验组的od值）/对照组的od值
ꢀ×ꢀ
100%，并计算半数抑制浓度（ic50：50%细胞生长抑制时的浓度）。在形态上sk-mel-28细胞及a375细胞经不同浓度的待测药物处理48小时后，死细胞的数量随着药物浓度增加逐渐增加。细胞的增殖受到抑制。形态上随着药物浓度增加，贴壁性减弱，细胞逐渐变圆，个数随药物浓度增加变化上升。2,2
’ꢀ‑
二吡啶酮腙硫代甲酸丁酸酯对sk-mel-28细胞的半数抑制浓度（ic
50
）为：1.25
±
0.32
µ
m，顺铂为18.4
±
1.5
µ
m。对a375细胞为：2,2
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二吡啶酮腙硫代甲酸丁酸酯的ic
50
为 0.8
ꢀ±ꢀ
0.2μm；顺铂为10.3
ꢀ±ꢀ
0.4μm。
[0034]
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二吡啶酮腙硫代甲酸丁酸酯诱导sk-mel-28细胞副凋亡试剂：培养基（北京索莱宝生物技术有限公司），血清（浙江天杭生物科技有限公司），dmso（天津市德恩化学试剂有限公司），2,2
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二吡啶酮腙硫代甲酸丁酸酯能使sk-mel-28黑色素瘤细胞发生副凋亡，并需要新蛋白合成。
[0035]
2,2
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二吡啶酮腙硫代甲酸丁酸酯处理sk-mel-28黑色素瘤细胞24小时后，可见大量囊泡，位于细胞核周围（图2-b），提示可能发生了副凋亡。文献研究指出，副凋亡发生与其抑制剂alix减少有关。为此，又对alix的表达水平进行了评估。蛋白印迹（western blotting）显示（图2-d）：alix水平随着药物浓度增加而降低，支持该药物诱导了副凋亡。另
外，不少研究指出，副凋亡的发生需要新的蛋白质合成。于是，又利用蛋白合成抑制剂，来佐证该药诱导的副凋亡是否有蛋白合成参与。图2-e显示加入cycloheximide（chx，环己酰胺）药物能够诱导囊泡消失，说明药物诱导副凋亡需要蛋白质合成。蛋白印迹实验也支持上述结论，因为chx能抵消药物对alix的调控（图2-f，图2-g）。
[0036]
为进一步弄清囊泡的定位，我们利用内质网染料e02来确定囊泡是否位于内质网。如图3-b所示：囊泡位于绿色荧光的内质网上。接下来又进行了透射电镜分析，以进一步囊泡内质网上的分布。图3-d说明囊泡位于粗面内质网上。
[0037]
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二吡啶酮腙二硫代甲酸丁酯细胞毒性与诱导凋亡有关试剂：活性氧检测试剂-h2dcf-da（碧云天生物技术公司, 北京）；bcl-2, bax, caspase8, gapdh单抗, 二抗（博士德, 武汉）；仪器：amersham imager 600 (ge healthcare life sciences, usa)。
[0038]
考虑到细胞凋亡诱导涉及许多药物的抑制机制，而2,2
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二吡啶酮腙二硫代甲酸丁酯处理sk-mel-28细胞均导致皱缩（图4-b），猜测也许有凋亡发生。为此将泛半胱氨酸蛋白酶抑制剂z-vad-fmk引入mtt分析。如图4-d所示，添加z-vad-fmk可部分减弱药物的作用，提示凋亡可能参与生长抑制过程。为了证实上述推理，测定了凋亡相关蛋白的表达水平。bcl-2的下调和bax以及断裂的caspase 8的上调，清晰地支持药物具有诱导凋亡的能力（图4-e和图4-f）。同时还进行了流式细胞术分析。如图4-g所示，药物处理导致早期和晚期凋亡增加13%，约8%坏死，然而，添加z-vad-fmk几乎抵消了药物对凋亡诱导的影响。这些结果表明，2,2
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二吡啶酮腙二硫代甲酸丁酯药物的生长抑制作用部分地涉及凋亡诱导，在a375细胞中也有相似的结果。
[0039]
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二吡啶酮腙二硫代甲酸丁酯对黑色素瘤抑制作用优于铁死亡诱导剂erastin铁死亡是一种铁依赖的死亡形式。通常情况下，铁蛋白自噬导致铁死亡。2,2
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二吡啶酮腙二硫代甲酸丁酯处理胃癌细胞时，能诱导铁死亡。铁死亡涉及部分药物对癌症的生长抑制。然而，黑色素瘤细胞对铁死亡具诱导剂有一定抗性[15]，使之治疗的选项受到限制。与铁死亡标准诱导剂相比，2,2
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二吡啶酮腙二硫代甲酸丁酯半数抑制浓度约0.8μm，而erastin的半数抑制浓度为50μm，两者相差60倍（图5）。
[0040]
以上实施例描述了本发明的基本原理、主要特征及优点，本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明原理的范围下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进均落入本发明保护的范围内。