一种纳米酶Mn3O4-PDA的制备方法与应用

一种纳米酶mn3o
4-pda的制备方法与应用
技术领域
1.本发明涉及一种纳米酶mn3o
4-pda的制备方法与应用。


背景技术：

2.ros是氧化磷酸化途径的重要产物之一，同时也是一种敏感的生物信号，它起着平衡细胞氧化还原反应的作用。过多的ros会激活胰岛素磷脂酰肌醇-3激酶蛋白激酶b (pi-3k/akt)和丝裂原活化蛋白激酶/细胞外信号调节激酶(mapk/erk)等信号通路，激活的信号通路可抑制细胞外基质合成、细胞迁移和抑制生长因子生物活性，造成细胞降解。因此，许多疾病的发生与细胞内ros的堆积密切相关，如：阿尔兹海默症、骨性关节炎、类风湿性关节炎等。
3.正常生理环境下，细胞内的ros主要可通过ros清除系统，如超氧化物歧化酶（sod）、谷胱甘肽歧化酶（gpx）、过氧化氢酶（cat）和其他小分子物质（谷胱甘肽）等来清除。但当细胞出现明显的炎症反应时，细胞的内环境发生改变，造成ros清除系统的酶活性降低，甚至失活，打破了细胞内ros平衡，导致ros大量堆积在细胞内，最终造成细胞凋亡。
4.近年来，随着对纳米科学的深入探索，一类具有高效酶活性、生物稳定性强、可代谢等特点的纳米材料（纳米酶）逐渐出现在人们的视野中，而且它们造价成本低，易合成，被广泛应用于各大领域。在动物实验中有学者发现纳米级的mn3o4对小鼠肝、肾、脑等没有组织毒性，甚至还能逆转帕金森模型小鼠的神经症状，达到了治疗改善颅脑疾病的目的。近几年，有研究团队报道mn3o4纳米颗粒具有抗氧化系统酶类的作用，可以通过清除过量的ros来修复神经细胞，从而治疗帕金森氏病（pd），并且该研究中制备mn3o4纳米颗粒的方法简便，合成后的纳米颗粒具有生物稳定性好、可降解、成本低廉等特点，是理想的ros清除剂。但在前期研究中我们还发现mn3o4的生物相容性差，细胞毒性强，粒径小易团聚，这严重限制了mn3o4作为纳米酶在疾病治疗中的应用。
5.多巴胺(da)是一种儿茶酚胺类物质，是神经传递正常进行的必备物质，其自聚合过程倾向于与通过共价和非共价结合的多种底物，它的聚合产物聚多巴胺(pda)能够在几乎所有材料包括陶瓷、半导体、金属甚至合成聚合物表面上形成和附着，具有生物安全性好、粘附性强以及光热效应等特点。


技术实现要素：

6.本发明要解决的技术问题是提供一种纳米酶mn3o
4-pda的制备方法，其将pda包裹在mn3o4的表面，可有效降低mn3o4的细胞毒性，而且使制得的纳米酶mn3o
4-pda同时具备pda的特性。
7.为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：一种纳米酶mn3o4-pda的制备方法，包括以下步骤：s1.将乙酸锰与水合肼同时加入超纯水中，搅拌16-20小时后离心8-12分钟，弃去上清液后将沉淀重悬，同样的方法离心2-4次，干燥24小时后得到mn3o4纳米颗粒；
s2.将步骤s1得到的mn3o4纳米颗粒加入超纯水中，超声震荡10-20分钟使mn3o4纳米颗粒均匀分散在超纯水中得到混悬液，将氨水和无水乙醇加入混悬液中，磁力搅拌25-35分钟得到混合液；s3.用超纯水溶解盐酸多巴胺后滴入步骤s2得到的混合液中，磁力搅拌22-26小时后离心8-12分钟，弃去上清液后将沉淀重悬，同样的方法离心2-4次，真空干燥至恒重后得到纳米酶mn3o
4-pda。
8.进一步地，本发明所述步骤s1中，乙酸锰、水合肼、超纯水的比例为（1-2）mmol:（18-20）mmol:60ml。
9.进一步地，本发明所述步骤s1中，重悬时使用的是超纯水。
10.进一步地，本发明所述步骤s1中，离心的速度为4000转/分。
11.进一步地，本发明所述步骤s2中，氨水的质量浓度为20%，mn3o4纳米颗粒、超纯水、氨水、无水乙醇的比例为（35-45）mg:18ml:150μl:8ml。
12.进一步地，本发明所述步骤s3中，超纯水、盐酸多巴胺的比例为6ml:（490-510）mg。
13.进一步地，本发明所述mn3o4纳米颗粒、盐酸多巴胺的比例为（35-45）mg:（490-510）mg。
14.进一步地，本发明所述步骤s3中，重悬时使用的是超纯水。
15.进一步地，本发明所述步骤s3中，离心的速度为4000转/分。
16.本发明要解决的另一技术问题是提供所述的纳米酶mn3o
4-pda在ros清除剂中的应用。
17.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：1）本发明所述纳米酶由mn3o4和盐酸多巴胺合成而得，加入的盐酸多巴胺在碱性条件下附着包裹在mn3o4表面，能有效降低mn3o4的细胞毒性，制得的纳米酶mn3o
4-pda同时具备pda的特性。
18.2）本发明利用水合肼的强还原性使得合成mn3o4在室温条件下即可进行，而且不需特意调节反应溶液的ph值，而现有的大多数合成方法需要在高温条件下进行，因此本发明操作简单且比较安全。
19.3）本发明两步反应的时间均较长，使得反应更可控也更安全。
附图说明
20.此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本技术的一部分，并不构成对本发明的不当限定，在附图中：图1为本发明的合成示意图；图2为本发明实施例1和对比例清除超氧阴离子的esr结果图；图3为本发明实施例1和对比例清除单线态氧的esr结果图；图4为本发明实施例1和对比例清除羟自由基的esr结果图；图5为本发明实施例1和对比例的细胞毒性检测结果图。
具体实施方式
21.下面将结合具体实施例来详细说明本发明，在此本发明的示意性实施例以及说明
用来解释本发明，但并不作为对本发明的限定。
22.实施例1按照以下步骤制备纳米酶mn3o
4-pda：s1.将乙酸锰与水合肼同时加入超纯水中，乙酸锰、水合肼、超纯水的比例为1mmol:19mmol:60ml，搅拌18小时后4000转/分速度下离心10分钟，弃去上清液后将沉淀用超纯水重悬，同样的方法离心3次，干燥24小时后得到mn3o4纳米颗粒；s2.将步骤s1得到的mn3o4纳米颗粒加入超纯水中，超声震荡15分钟使mn3o4纳米颗粒均匀分散在超纯水中得到混悬液，将质量浓度为20%的氨水和无水乙醇加入混悬液中，mn3o4纳米颗粒、超纯水、氨水、无水乙醇的比例为40mg:18ml:150μl:8ml，磁力搅拌30分钟得到混合液；s3.用超纯水溶解盐酸多巴胺后滴入步骤s2得到的混合液中，超纯水、盐酸多巴胺的比例为6ml:500mg，mn3o4纳米颗粒、盐酸多巴胺的比例为40mg:500mg，磁力搅拌24小时后4000转/分速度下离心10分钟，弃去上清液后将沉淀用超纯水重悬，同样的方法离心3次，真空干燥至恒重后得到纳米酶mn3o
4-pda。
23.实施例2按照以下步骤制备纳米酶mn3o
4-pda：s1.将乙酸锰与水合肼同时加入超纯水中，乙酸锰、水合肼、超纯水的比例为2mmol:20mmol:60ml，搅拌20小时后4000转/分速度下离心12分钟，弃去上清液后将沉淀用超纯水重悬，同样的方法离心2次，干燥24小时后得到mn3o4纳米颗粒；s2.将步骤s1得到的mn3o4纳米颗粒加入超纯水中，超声震荡20分钟使mn3o4纳米颗粒均匀分散在超纯水中得到混悬液，将质量浓度为20%的氨水和无水乙醇加入混悬液中，mn3o4纳米颗粒、超纯水、氨水、无水乙醇的比例为45mg:18ml:150μl:8ml，磁力搅拌35分钟得到混合液；s3.用超纯水溶解盐酸多巴胺后滴入步骤s2得到的混合液中，超纯水、盐酸多巴胺的比例为6ml:510mg，mn3o4纳米颗粒、盐酸多巴胺的比例为45mg:510mg，磁力搅拌26小时后4000转/分速度下离心12分钟，弃去上清液后将沉淀用超纯水重悬，同样的方法离心2次，真空干燥至恒重后得到纳米酶mn3o
4-pda。
24.实施例3按照以下步骤制备纳米酶mn3o
4-pda：s1.将乙酸锰与水合肼同时加入超纯水中，乙酸锰、水合肼、超纯水的比例为1.5mmol:18mmol:60ml，搅拌16小时后4000转/分速度下离心8分钟，弃去上清液后将沉淀用超纯水重悬，同样的方法离心4次，干燥24小时后得到mn3o4纳米颗粒；s2.将步骤s1得到的mn3o4纳米颗粒加入超纯水中，超声震荡10分钟使mn3o4纳米颗粒均匀分散在超纯水中得到混悬液，将质量浓度为20%的氨水和无水乙醇加入混悬液中，mn3o4纳米颗粒、超纯水、氨水、无水乙醇的比例为35mg:18ml:150μl:8ml，磁力搅拌25分钟得到混合液；s3.用超纯水溶解盐酸多巴胺后滴入步骤s2得到的混合液中，超纯水、盐酸多巴胺的比例为6ml:490mg，mn3o4纳米颗粒、盐酸多巴胺的比例为35mg:490mg，磁力搅拌22小时后4000转/分速度下离心8分钟，弃去上清液后将沉淀用超纯水重悬，同样的方法离心4次，真
空干燥至恒重后得到纳米酶mn3o
4-pda。
25.对比例：与实施例1不同之处为不包括步骤s2和s3，制得的是未被pda包裹的mn3o4纳米颗粒。
26.实验例1：清除ros能力测试使用esr检测仪器测试实施例1制得的纳米酶mn3o
4-pda和对比例制得的mn3o4纳米颗粒在相同的浓度下清除ros能力的差异，测试结果如图2-图4所示，图2-图4中最上方的曲线是空白组，中间的曲线是对比例，最下方的曲线是实施例1，由图2-图4可看出，本发明实施例1制得的纳米酶mn3o
4-pda有较强的ros清除能力，但略弱于对比例制得的mn3o4纳米颗粒，因为mn3o4的清除ros的能力强于pda，而相同质量的两种材料中，mn3o4的含量对比例更高，所以对比例清除ros能力略强于纳米酶mn3o
4-pda。
27.实验例2：细胞毒性测试测试方法为cck-8法：按每孔1万的软骨细胞量接种到24孔板中，24小时后细胞贴壁，将培养基换成含有不同浓度（0，5，10，20，50，100，200μg/ml）的实施例1制得的纳米酶mn3o
4-pda和对比例制得的mn3o4纳米颗粒的培养基，继续培养24小时。24小时后将培养基更换为正常培养基，更换时用pbs将大部分材料洗去。按说明书步骤加入cck-8试剂，37℃孵育1小时。孵育后吸取上清液至96孔板，用酶标仪测定在450nm处的吸光值，整个操作过程应避免剧烈摇晃孔板，防止剩余的材料被吸出，影响吸光度的测定，测试结果如图5所示，由图5可看出，本发明实施例1制得的纳米酶mn3o
4-pda的细胞毒性低于对比例制得的mn3o4纳米颗粒。
28.上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。