一种雨生红球藻提取物的制备及其应用

1.本发明涉及医药技术领域，尤其是涉及一种雨生红球藻提取物的制备及其以rxrα为靶点治疗阿尔兹海默症的应用。


背景技术：

2.阿尔兹海默病(alzheimer’s disease,ad)，又称老年痴呆症，是一种神经退行性疾病。随着社会发展，老龄化速度加快，阿尔茨海默症的患病率逐年上升，有数据显示，全球ad死亡率居第三位，仅次于癌症和心脑血管疾病。该疾病以进行性记忆减退和认知功能障碍为主要临床特征，最主要的病理特征是神经元淀粉样蛋白(aβ)在神经元胞外大量聚集形成淀粉样斑及tau蛋白在胞内过度神经纤维化缠结(reitz c,brayne c,mayeux r..nature reviews neurology,2011,7:137-152)。长期以来，阿尔茨海默症的发病机制被认为与aβ聚集有较大的相关性，该蛋白聚集形成斑块将会引起一系列反应包括促使神经细胞凋亡，激活神经小胶质细胞，释放细胞因子和炎症因子，引发炎症反应以及诱导tau蛋白过度磷酸化，引起神经纤维缠结，因此减少aβ的生成或增加其清除对于阿尔茨海默症有重要的意义。
3.载脂蛋白(apoe)是一种血浆蛋白其参与胆固醇类物质运输，是大脑内主要的脂质转运蛋白。apoe携带的脂质的量决定aβ清除的速度和量。atp结合盒转运蛋白a1(abca1)是一种整合膜蛋白，该蛋白可促进胞内游离胆固醇和磷脂的流出，大脑中的apoe负责接收。有研究表明敲除小鼠的abca1基因会导致中枢神经系统中apoe吸收脂类的能力下降，进而加剧小鼠脑中淀粉样蛋白斑块的沉积。核受体rxrα是一种配体激活的核受体，在多个重要的生物过程中充当转录因子。研究表明治疗皮肤t细胞淋巴瘤的rxrα激动剂bexarotene，可通过增强lxr/rxr、ppar/rxr的所调控的靶蛋白abca1、apoe和其它参与脂质代谢的蛋白表达，增加aβ清除，减少淀粉样蛋白斑块在app小鼠脑中形成，改善小鼠的认知缺陷。同时近期临床数据表明rxrα激动剂bexarotene对其它脑部疾病入帕金森疾病和精神疾病分裂症均有积极的治疗作用，且长期服用安全有效。因此，以rxrα为靶点寻找治疗ad的药物具有一定的开发前景。
4.雨生红球藻是天然虾青素的最佳来源，其中虾青素可清理大脑内的自由基；目前，雨生红球藻提取物具有抗老年痴呆药物因为靶向性不明，而无法作为候选药物应用。


技术实现要素：

5.本发明的第一目的在于提供一种雨生红球藻提取物。该提取物可以通过与核受体rxrα相结合、上调abca1和appe蛋白，以及促进可溶性aβ的清除。
6.本发明的第二目的在于提供纯度较高的一种雨生红球藻提取物的制备方法。
7.本发明的第三目的在于提供该雨生红球藻提取物可靶向rxrα作为抗阿尔兹海默症候选药物的应用。该雨生红球藻提取物的作用靶点明确，可靶向rxrα发挥抗老年痴呆作用，可以作为rxrα为靶点的抗ad的药物。
8.所述雨生红球藻提取物的制备方法，包括以下步骤：
9.1)破壁浸提：将雨生红球藻藻粉原料将放入容器中，加入2～4倍量无水乙醇破壁浸渍提取，沉淀后用过滤，得提取液，减压浓缩，得雨生红球藻粗提物；
10.在步骤1)中，所述提取可重复提取2次；沉淀的时间可为6～24h；所述过滤可用300目蚕丝布两层过滤；所述减压浓缩可将提取液使用旋转蒸发仪减压浓缩，期间注意避光处理，仪器参数设置可为转速40rpm，温度35℃。
11.2)将步骤1)得到的雨生红球藻粗提物经高速逆流色谱分离，采用乙酸乙酯-乙醇-水等混合溶剂体系溶剂，尾-头洗脱(下相为固定相)模式，紫外检测器480nm处检测收样，浓缩得浓缩液；
12.3)将步骤2)得到的浓缩液进行快速中压制备色谱分离，中压柱加入硅胶，使用溶剂浸泡，用流动相平衡至硅胶压实，得雨生红球藻提取物。
13.虾青素含量测定：
14.色谱条件与系统适应性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂。以色谱乙腈为流动相a，水为色谱相b，检测波长为480nm，按下表中的规定进行梯度洗脱；检测波长为480nm。理论板数按虾青素峰计算应不低于6000。
15.液相色谱分析条件
[0016][0017]
对照品溶液的制备：精密称取虾青素标准品2.7mg，加200μl二氯甲烷，用色谱甲醇定容至10ml棕色容量瓶中；超声10min，放冷，摇匀，过0.45μm滤膜，即得。
[0018]
供试品溶液制备，取供试品0.1g于50ml棕色容量瓶中，加200μl二氯甲烷，用色谱甲醇溶解并定容，超声20min，放冷，摇匀，过0.45μm滤膜，即得。
[0019]
将对照品及供试品溶液吸取20μl注入液相色谱仪，流速1.0ml/min，柱温30℃，测定，即得。
[0020]
按照上述方法，对测试样品进行分析，计算虾青素含量。本发明所制备的雨生红球藻提取物中虾青素含量＞20％。
[0021]
本发明还提供一种雨生红球藻提取物可靶向rxrα作为抗阿尔兹海默症候选药物的应用。
[0022]
所述雨生红球藻提取物可在制备以rxrα为靶点药物中的应用。
[0023]
所述雨生红球藻提取物可在制备抗阿尔兹海默症(ad)药物中的应用。
[0024]
抗老年痴呆活性评价结果显示，本发明制备的雨生红球藻提取物可靶向核受体rxrα，上调abca1和appe蛋白，促进可溶性aβ的清除，对抗阿尔兹海默症药物的开发具有重要意义。
[0025]
与现有技术相比，本发明的创新点和突出技术效果在于：
[0026]
本发明通过联用高速逆流色谱及中压硅胶柱色谱，得到纯度较高的雨生红球藻提取物，其所含虾青素的纯度可高于20％。进一步的实验研究的结果显示，该提取物可以通过
与核受体rxrα相结合、上调abca1和appe蛋白，以及促进可溶性aβ的清除。由于该提取物的作用靶点明确，促进阿尔兹海默症疾病相关的蛋白产生明显的正向调节作用及病灶蛋白清除作用，显示本发明得到的雨生红球藻提取物可以通过靶向核受体rxrα而发挥抗阿尔兹海默症的作用，从而为该提取物作为治疗阿尔兹海默症的候选药物提供条件。
附图说明
[0027]
图1为雨生红球藻提取物(1μμ)不同作用时间对bv2细胞中abca1和apoe蛋白表达的影响。
[0028]
图2为雨生红球藻提取物不同作用浓度对bv2细胞中abca1和apoe蛋白表达的影响。其中，*为p《0.05,vs con组；**为p《0.01,vs con组。
[0029]
图3为雨生红球藻提取物与粗提物的活性对比。其中，*为p《0.05,vs con组；**为p《0.01,vs con组；#为p《0.05,vs雨生红球藻粗提物组。
[0030]
图4为雨生红球藻提取物在1μμ浓度下对rxrα蛋白热稳定性的影响。
具体实施方式
[0031]
以下实施例将结合附图对本发明作进一步说明。
[0032]
本发明将雨生红球藻粉乙醇浸提、破壁得到粗提物，经高速逆流色谱-快速中压制备色谱联用技术得到雨生红球藻提取物。具体制备方法如下：
[0033]
1)将雨生红球藻粉，加入2～4倍量的乙醇浸提破壁，将破壁完成后的样品进行沉淀6～24h后用300目蚕丝布两层过滤得提取液。合并提取液，实验人员将提取液使用旋转蒸发仪进行减压浓缩，期间注意避光处理，仪器参数设置为转速40rpm，温度35℃。得雨生红球藻粗提物，并称其重量。
[0034]
2)将步骤1)得到的雨生红球藻粗提物300g经高速逆流色谱分离，采用乙酸乙酯-乙醇-水等混合溶剂体系(乙酸乙酯/乙醇/水＝5/3/2)溶剂2l，尾-头洗脱(下相为固定相)模式，紫外检测器480nm处检测收样，浓缩。
[0035]
3)将步骤2)得到的浓缩液进行快速中压制备色谱分离，中压柱加入约1.5kg 200～300目硅胶，使用起步溶剂浸泡，用流动相平衡至硅胶压实。取250g雨生红球藻提取物，加入石油醚/丙酮＝9/1、4/1、2/1的起步溶剂溶解至500ml。湿法上样，a为石油醚，b为丙酮；取90～150min为目标提取液。平行取两份，每份取300ml；进行液相检测。
[0036]
以下给出具体制备实施例。
[0037]
实施例1：
[0038]
1)将雨生红球藻藻粉原料将放入一定量的容器中，加入2倍量无水乙醇利用破壁机进行破壁浸渍提取，重复提取1次，将破壁完成后的样品进行沉淀6h后用300目蚕丝布两层过滤，得提取液；旋干备用。提取液体积2.50l，提取物重量320g
[0039]
2)将步骤1)得到的雨生红球藻粗提物300g经高速逆流色谱分离，采用乙酸乙酯-乙醇-水等混合溶剂体系溶剂2l，尾-头洗脱(下相为固定相)模式，紫外检测器480nm处检测收样，浓缩；
[0040]
3)将得到的浓缩液进行快速中压制备色谱分离，选用有机溶剂进行洗脱，紫外检测器480nm处检测收样，得到雨生红球藻提取物；具体的，可将步骤2)得到的浓缩液进行快
速中压制备色谱分离，中压柱加入约1.5kg 200～300目硅胶，使用起步溶剂浸泡，用流动相平衡至硅胶压实。取250g雨生红球藻提取物，加入石油醚/丙酮＝9/1的起步溶剂溶解至500ml。湿法上样，a为石油醚，b为丙酮；取90～150min为目标提取液。平行取两份，每份取300ml。进行液相检测。测得虾青素含量25.2％。
[0041]
中压柱时间条件
[0042][0043]
实施例2：
[0044]
与实施例1类似，其区别在于：加入2倍量无水乙醇沉淀12h，提取液体积2.46l，提取物重量336g。快速中压制备色谱起步溶剂为石油醚/丙酮＝9/1，测得虾青素含量22.1％
[0045]
实施例3：
[0046]
与实施例1类似，其区别在于：加入2倍量无水乙醇沉淀24h，提取液体积2.85l，提取物重量340g，快速中压制备色谱起步溶剂为石油醚/丙酮＝9/1，测得虾青素含量24.8％
[0047]
实施例4：
[0048]
与实施例1类似，其区别在于：加入3倍量无水乙醇沉淀6h，提取液体积3.60l，提取物重量406g，快速中压制备色谱起步溶剂为石油醚/丙酮＝4/1，测得虾青素含量22.1％
[0049]
实施例5：
[0050]
与实施例1类似，其区别在于：加入3倍量无水乙醇沉淀12h，提取液体积3.75l，提取物重量420g，快速中压制备色谱起步溶剂为石油醚/丙酮＝4/1，测得虾青素含量22.1％
[0051]
实施例6：
[0052]
与实施例1类似，其区别在于：加入3倍量无水乙醇沉淀24h，提取液体积3.68l，提取物重量418g，快速中压制备色谱起步溶剂为石油醚/丙酮＝4/1，测得虾青素含量25.9％。
[0053]
实施例7：
[0054]
与实施例1类似，其区别在于：加入4倍量无水乙醇沉淀6h，提取液体积4.80l，提取物重量480g，快速中压制备色谱起步溶剂为石油醚/丙酮＝2/1，测得虾青素含量26.4％。
[0055]
实施例8：
[0056]
与实施例1类似，其区别在于：加入4倍量无水乙醇沉淀12h，提取液体积4.92l，提取物重量492g，快速中压制备色谱起步溶剂为石油醚/丙酮＝2/1，虾青素含量24.5％。
[0057]
实施例9：
[0058]
与实施例1类似，其区别在于：加入4倍量无水乙醇沉淀24h，提取液体积4.88l，提取物重量485g，快速中压制备色谱起步溶剂为石油醚/丙酮＝2/1，虾青素含量26.1％。
[0059]
以下给出本发明制备的雨生红球藻提取物以rxrα为靶点的抗阿尔兹海默症作用验证。
[0060]
1材料与仪器
[0061]
1.1实验细胞：
[0062]
小鼠小胶质细胞bv2
[0063]
1.2实验仪器
[0064]
倒置显微镜日本olympus leica公司
[0065]
细胞培养箱美国thermo公司
[0066]
millipore纯水仪美国millipore公司
[0067]
高速冷冻离心机美国beckman coulter有限公司
[0068]
微量移液器美国eppendorf公司
[0069]
蛋白垂直电泳仪美国bio-rad公司
[0070]
湿式转移槽美国bio-rad公司
[0071]
一次性培养皿百朗德(广州)生物科技有限公司
[0072]
6孔培养板比利时orange scientific公司
[0073]
96孔培养板比利时orange scientific公司
[0074]
立式自动电热压力蒸汽灭菌锅上海申安医疗器械厂电热恒温水浴锅上海精宏实验设备有限公司
[0075]
酶标仪上海精宏实验设备有限公司
[0076]
wh-3涡旋仪上海沪西分析仪器有限公司
[0077]
超净工作台苏州安泰空气技术有限公司
[0078]
1.3试剂
[0079][0080]
1.4溶液的配置
[0081]
pbs缓冲溶液：
[0082]
137mmnacl,2.7mmkcl,10mm na2hpo4,2mm kh2po4,用盐酸调ph至7.4。
[0083]
蛋白质电泳相关试剂：
[0084]
1)1.0m tris-hcl缓冲液
[0085]
取tris 12.12g，滴加盐酸将ph调至6.8，加入去离子水，定容至100ml，再次将ph调至6.8，高温灭菌后室温保存。
[0086]
2)1.5m tris-hcl缓冲液
[0087]
取tris 18.2g，滴加盐酸将ph调至8.8，加入去离子水，定容至100ml，再次将ph调至8.8，高温灭菌后室温保存。
[0088]
3)电泳缓冲液
[0089]
分别取tris-hcl 3.03g，甘氨酸18.77g，sds 1g溶于1000ml蒸馏水中。
[0090]
4)2
×
sds loading buffer
[0091]
dd h2o 6ml,0.5m tris ph 6.8 5ml,20％sds 4ml，溴酚蓝(bromophenol blue)4mg，50％甘油4ml，β-巯基乙醇(2-mercaptoethanol)1ml。
[0092]
5)1
×
tbst
[0093]
10mmtris-hcl(ph 7.5),150mmnacl,0.1％ tween-20。
[0094]
6)封闭液
[0095]
5％(w/v)脱脂奶粉溶于1
×
tbst中。
[0096]
7)电转液
[0097]
tris 3.03g，甘氨酸14.4g，溶于900ml蒸馏水中，最后加入100ml甲醇溶液，混匀。
[0098]
8)10％ sds
[0099]
10g sds，加蒸馏水至100ml，50℃水浴下溶解，室温保存。
[0100]
9)10％过硫酸铵(aps)
[0101]
0.1g过硫酸铵，加超纯水1.0ml，溶解后，4℃保存。
[0102]
2.实验方法
[0103]
2.1雨生红球藻提取物对abca1和apoe蛋白表达的影响
[0104]
采用免疫印迹法检测在雨生红球藻提取物干预下小鼠小胶质细胞bv2中相关蛋白的表达情况，取对数生长期bv2细胞，按2
×
105个/ml接种于6孔培养板，置于37℃，5％co2培养箱培养过夜，之后在实验组中加入雨生红球藻提取物或粗样，作用终浓度为0.1、1μmol/l或1μmol/l。以不加药细胞为空白对照组。培养48h，收集细胞，加入ripa细胞裂解液提取总蛋白质，应用bca法测定裂解液中总蛋白质浓度。经sds-page后，转移至pvdf膜上，用5％脱脂奶粉室温封闭1h，用对应的一抗4度孵育过夜，用tbst洗涤8min/次，共3次。加入辣根过氧化物酶标记的二抗，再用tbst洗涤3次后显影，以β-tublin为内参。imagej 1.53软件进行数据分析。
[0105]
2.2雨生红球藻提取物对rxrα蛋白热稳定性的影响
[0106]
药物通过与一个或多个细胞靶标蛋白结合，调控细胞或组织的多种生物学反应。细胞热转变分析(cetsa)实验的原理是靶蛋白与药物分子结合后结构会变得稳定，不易发生热变性。将化合物与细胞裂解液或与细胞进行孵育后，分别进行梯度加热一定时间。加热后，孵育体系中仍保持折叠状态的配体结合蛋白相对稳定，而没有结合配体的蛋白会迅速变性产生沉淀。实验过程：将bv2细胞接种至10cm培养皿中，于次日贴壁后给药，雨生红球藻提取物作用浓度为1um，1％ dmso为对照组，置于37℃，5％ co2培养箱孵育3h；孵育结束后，用pbs清洗细胞两次，胰酶消化收集细胞，室温300g离心2min。各组加入1ml含蛋白酶抑制剂(1
×
)pbs悬浮细胞，将两实验组各均分成十等份，每份100ul，加入到1.5mlep管中并做好标记，煮样器温度提前加热至实验温度，将ep管放到仪器上加热3min后，取出放置室温冷却3min后，放回冰上。温度差设为3℃，从40℃开始设置，所有温度反应结束后，离心机18000g，4℃，离心20min，bca定量，剩余步骤同2.1。
[0107]
3.实验结果
[0108]
3.1雨生红球藻上调abca1和appe的蛋白
[0109]
如图1所示，雨生红球藻提取在1μm浓度下可显著上调bv2细胞中abca1和apoe蛋白的表达，作用呈现时间依赖性增强，其中48h时上调最强。此外，在48h作用时间下，雨生红球藻提取物在0.1及1μm作用浓度下与对照组相比均显著性上调abca1和apoe蛋白表达(图2)。
与雨生红球藻粗提物相比，经工艺技术纯化后的雨生红球藻提取物能显著性上调abca1蛋白的表达，对apoe具有一定程度上调的作用(图3)，提示雨生红球藻提取物可促进可溶性aβ的清除，发挥抗阿尔兹海默症作用。
[0110]
3.2雨生红球藻提取物稳定rxrα蛋白结构
[0111]
cetsa实验结果显示，与阴性对照dmso相比，雨生红球藻提取物可显著提高rxrα蛋白的热稳定性，提示雨生红球藻提取物可靶向rxrα发挥抗阿尔兹海默症作用(图4)。
[0112]
本发明通过系列的研究结果证实，本发明制备得到的雨生红球藻提取物，可以通过靶向核受体rxrα作为抗老年痴呆的候选药物应用。
[0113]
上述实施例仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。