1.本发明涉及医用组织胶黏剂技术领域，具体来说涉及一种丝素蛋白医用组织胶黏剂及其制备方法和应用。
背景技术：
2.外伤性或手术性创伤常出现大量且持续的出血现象，是导致患者死亡的主要原因之一。快速、高效地控制伤口出血对挽救患者生命至关重要，大幅度地提高患者生存几率。由于从伤口止血、密封到组织修复的广泛应用范围，引发了研究医用组织胶黏剂的需求。然而，目前已有的临床组织胶黏剂，如氰基丙烯酸酯胶和纤维蛋白密封胶，在接触血液后血液中的水在胶黏剂与出血组织之间的界面上会形成水化层，破坏胶黏剂与组织之间的粘合作用，造成胶黏剂的粘附失败，不适合用于大面积的创面或者动脉破损出血的止血和密封，严重限制了其临床应用。因此，开发能够在湿态生理环境下形成牢固而持久粘附的医用组织胶黏剂具有重要意义。
3.丝素蛋白是从蚕丝中提取的天然高分子纤维蛋白，含量约占蚕丝的70%-80%，含有18种氨基酸。从结构上，丝素蛋白是天然的亲水性/疏水性嵌段共聚物。重链（390kda）、轻链（26kda）和糖蛋白（p25）共同组成了丝素蛋白，其中轻重链之间的连接主要是依靠二硫键，而糖蛋白与它们则主要借助疏水作用相连。重链主要由不断重复的疏水性氨基酸重复序列片段组成，如（gagags）。轻链则主要包含非重复性的亲水性氨基酸片段。丝素蛋白具有良好的生物相容性，生物可降解性、形状可加工性和功能可塑性等特点，广泛应用于生物医药领域，是最具研发潜力的组织修复材料，可用于各种应用的组织胶黏剂、止血剂或伤口敷料。但目前，由丝素蛋白制备的医用组织胶黏剂不能克服血液界面水化层的阻碍，与出血创面组织的粘附强度较低，不能满足湿态生理环境下的组织粘附需求，在大面积出血过程中容易被冲散，造成止血时间较长。并且，现有的丝素蛋白医用组织胶黏剂还存在功能单一、只具备止血功能等缺点。因此，需要研发一种在湿态生理环境下组织粘附性能强、止血速度快的丝素蛋白医用组织胶黏剂，以适用于湿态生理环境下组织创伤的快速止血、伤口液体泄漏的快速密封、创伤组织愈合修复、伤口抑菌。
技术实现要素：
4.本发明的目的在于提供一种丝素蛋白医用组织胶黏剂及其制备方法和应用，制备的丝素蛋白医用组织胶黏剂疏水性能强，在湿态生理环境下组织粘附强度高、止血密封速度快，以满足湿态多样性和动态复杂性出血环境的止血密封需求。
5.为此，本发明提供了一种丝素蛋白医用组织胶黏剂的制备方法，以经过硫醇类还原剂还原反应处理后得到的丝素蛋白为原料，与多酚化合物均匀混合制备而成；经过硫醇类还原剂还原反应处理后得到的丝素蛋白的zeta电位值大于+5mv。
6.优选的，包括以下步骤：（1）将脱胶蚕丝溶解于溴化锂或氯化钙/无水乙醇/水三元溶液中，用去离子水透
析，透析后的溶液经过离心过滤、真空冷冻干燥得到丝素蛋白粉末；（2）将步骤（1）丝素蛋白粉末溶解于含有硫醇类还原剂的水溶液中，维持ph值为5.0，放置于室温条件下进行还原反应处理，获得还原反应处理的丝素蛋白溶液；（3）将多酚化合物溶解于去离子水中，氮气保护环境下搅拌使之溶解均匀，得到多酚化合物溶液；（4）将相同体积的步骤（2）还原反应处理的丝素蛋白溶液和步骤（3）多酚化合物溶液在室温条件下进行混合，维持ph值为4.0-6.0，得到丝素蛋白医用组织胶黏剂。
7.优选的，所述步骤（2）中，还原反应处理的丝素蛋白溶液的浓度为1-10 wt%。
8.优选的，所述步骤（2）中，硫醇类还原剂包括但不限定于三(2-羧乙基)膦盐酸盐。
9.优选的，所述步骤（2）中，硫醇类还原剂的浓度为10.0-50.0 mg/ml；室温条件下还原反应处理时间为5-20分钟。
10.优选的，所述步骤（3）中，多酚化合物包括但不限定于表儿茶素没食子酸酯、儿茶素、表儿茶素、表没食子儿茶素、没食子酸、儿茶素没食子酸酯、表没食子儿茶素没食子酸酯和单宁酸；多酚化合物的浓度为50.0-500.0 mg/ml。
11.优选的，所述步骤（4）中，室温条件下进行混合时还加入生物活性分子，生物活性分子占医用组织胶黏剂重量的0.1-10 %。
12.优选的，所述的生物活性分子包括羟基磷灰石、生物玻璃、胶原蛋白、明胶、抗菌药物、生长因子、壳聚糖、海藻酸、透明质酸中的一种或多种。
13.本发明还提供了一种丝素蛋白医用组织胶黏剂，根据所述的丝素蛋白医用组织胶黏剂的制备方法制备而成。
14.本发明的丝素蛋白医用组织胶黏剂应用于湿态生理环境下组织创伤的快速止血、伤口液体泄漏密封、创伤组织愈合修复、伤口抑菌。
15.与现有技术相比，本发明的优点和积极效果包括：1）本发明利用硫醇类还原剂对丝素蛋白进行还原反应处理，可以有效分解丝素蛋白中的二硫键并维持蛋白质游离-sh基团，得到还原反应处理的丝素蛋白，其zeta电位值大于+5mv。通过分解丝素蛋白中的二硫键可以诱导疏水性氨基酸的暴露，暴露出来的疏水性氨基酸可以提高丝素蛋白医用组织胶黏剂的疏水性作用，从而通过高疏水性能来有效驱离排斥大面积组织创伤或者动脉破损处的血液界面水化层的阻碍，提高丝素蛋白医用组织胶黏剂和创伤组织之间的界面粘合作用。
16.2）还原反应处理的丝素蛋白与多酚化合物共组装，实现湿态生理环境下医用组织胶黏剂的高疏水性作用和强组织粘附性的协同，利于粘附基团与出血组织界面的粘附，赋予丝素蛋白医用组织胶黏剂在湿态生理环境下强、稳健和持久的湿态组织粘附性能，实现湿态生理环境下快速、高效的组织止血密封效果、止血密封速度快、组织出血量少，可以适应大面积创面出血以及内脏组织器官出血等动态复杂的出血环境。
17.3）本发明的丝素蛋白医用组织胶黏剂含有生物活性分子，在生物活性分子的协同作用下，可以使得丝素蛋白医用组织胶黏剂的抗菌性能优异、减少细菌的感染和炎症的发生，从而促进创伤组织的愈合和再生修复。
18.4）本发明的丝素蛋白医用组织胶黏剂的主要成分为丝素蛋白和多酚化合物，均来自天然化合物。因此，本发明具有良好的生物相容性和生物降解性、制备工艺简单、成本低，
具有巨大的应用潜力。
19.5）本发明制得的丝素蛋白医用组织胶黏剂能够安全、快速地封闭皮肤切口和内伤缺损以及液体渗漏，促进愈合效果好等优点。本发明的丝素蛋白医用组织胶黏剂在湿态生理环境下组织粘附强度高，对湿态猪皮组织的粘附强度可以达到400kpa以上，湿态组织粘附强度明显高于现有的丝素蛋白制备的医用组织胶黏剂。本发明的丝素蛋白医用组织胶黏剂可在5秒内实现肝脏出血组织的快速止血，止血速度明显快于现有的丝素蛋白制备的医用组织胶黏剂。
20.本发明提供了结合附图阅读本发明的具体实施方式后，本发明的其他特点和优点将变得更加清楚。
附图说明
21.图1是本发明实施例1和对比例1的丝素蛋白的游离-sh基团值图；图2是本发明实施例1和对比例1的丝素蛋白的zeta电位值图；图3是本发明实施例1和对比例1的丝素蛋白医用组织胶黏剂的水接触角值图。
具体实施方式
22.以下对本发明的具体实施方式进行详细说明，应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
23.本发明提供了一种丝素蛋白医用组织胶黏剂的制备方法，以硫醇类还原剂还原反应处理的丝素蛋白为原料，与多酚化合物均匀混合制备而成；所述硫醇类还原剂还原反应处理的丝素蛋白的zeta电位值大于+5mv。
24.具体的，丝素蛋白医用组织胶黏剂的制备方法包括如下步骤：（1）将脱胶蚕丝溶解于溴化锂或氯化钙/无水乙醇/水三元溶液中，用去离子水透析，透析后的溶液经过离心过滤、真空冷冻干燥得到丝素蛋白粉末；（2）将步骤（1）丝素蛋白粉末溶解于含有硫醇类还原剂的水溶液中，维持ph值为5.0，放置于室温条件下进行还原反应处理，获得还原反应处理的丝素蛋白溶液；还原反应处理的丝素蛋白溶液的浓度为1-10 wt%，其zeta电位值大于+5mv；zeta电位值数值越高说明丝素蛋白中疏水性氨基酸暴露的越多，通过疏水作用来驱离排斥大面积组织创伤或者动脉破损处的血液界面水化层的能力就越大，这样可以显著提高丝素蛋白医用组织胶黏剂和创伤组织之间的界面粘合作用。
25.硫醇类还原剂包括但不限定于三(2-羧乙基)膦盐酸盐，硫醇类还原剂的浓度为10.0-50.0 mg/ml；三(2-羧乙基)膦盐酸盐是一种高效的二硫键还原剂，在水溶液中的稳定性和溶解性很好，可以对丝素蛋白溶液进行充分有效的还原。
26.维持ph值为5.0，可以使得三(2-羧乙基)膦盐酸盐对丝素蛋白的还原反应处理的更加充分，提高丝素蛋白中疏水性氨基酸暴露的数量，增强丝素蛋白医用组织胶黏剂的疏水性作用。
27.（3）将多酚化合物溶解于去离子水中，氮气保护环境下搅拌使之溶解均匀，得到多酚化合物溶液；多酚化合物包括但不限定于表儿茶素没食子酸酯、儿茶素、表儿茶素、表没食子儿茶素、没食子酸、儿茶素没食子酸酯、表没食子儿茶素没食子酸酯和单宁酸；多酚化
合物的浓度为50.0-500.0 mg/ml。
28.（4）将相同体积的步骤（2）还原反应处理的丝素蛋白溶液和步骤（3）多酚化合物溶液在室温条件下进行混合，维持ph值为4.0-6.0，得到丝素蛋白医用组织胶黏剂。
29.室温条件下维持ph值为4.0-6.0，使得丝素蛋白溶液和多酚化合物溶液混合时更加有利于形成均匀的丝素蛋白医用组织胶黏剂。此外，室温条件下维持ph值为4.0-6.0，有利于得到的丝素蛋白医用组织胶黏剂的湿态粘附性能。
30.步骤（4）中室温条件下进行混合时还包含有一种或多种生物活性分子，生物活性分子占医用组织胶黏剂重量的0.1-10%。生物活性分子包括羟基磷灰石、生物玻璃、胶原蛋白、明胶、抗菌药物、生长因子、壳聚糖、海藻酸、透明质酸等中的一种或多种。
31.1）本发明利用硫醇类还原剂对丝素蛋白进行还原反应处理，可以有效分解丝素蛋白中的二硫键并维持蛋白质游离-sh基团，得到还原反应处理的丝素蛋白，其zeta电位值大于+5mv。通过分解丝素蛋白中的二硫键可以诱导疏水性氨基酸的暴露，暴露出来的疏水性氨基酸可以提高丝素蛋白医用组织胶黏剂的疏水性作用，从而通过高疏水性能来有效驱离排斥大面积组织创伤或者动脉破损处血液界面水化层的阻碍，提高丝素蛋白医用组织胶黏剂和创伤组织之间的界面粘合作用。
32.2）还原反应处理的丝素蛋白与多酚化合物共组装，实现湿态生理环境下医用组织胶黏剂的高疏水性作用和强组织粘附性的协同，利于粘附基团与出血组织界面的粘附，赋予丝素蛋白医用组织胶黏剂在湿态生理环境下强、稳健和持久的湿态组织粘附性能，实现湿态生理环境下快速、高效的组织止血密封效果、止血密封速度快、组织出血量少，可以适应大面积创面出血以及内脏组织器官出血等动态复杂的出血环境。
33.3）本发明的丝素蛋白医用组织胶黏剂含有生物活性分子，在生物活性分子的协同作用下，可以使得丝素蛋白医用组织胶黏剂的抗菌性能优异、减少细菌的感染和炎症的发生，从而促进创伤组织的愈合和再生修复。
34.4）本发明的丝素蛋白医用组织胶黏剂的主要成分为丝素蛋白和多酚化合物，均来自天然化合物。因此，本发明具有良好的生物相容性和生物降解性、制备工艺简单、成本低，具有巨大的应用潜力。
35.5）本发明制得的丝素蛋白医用组织胶黏剂能够安全、快速地封闭皮肤切口和内伤缺损以及液体渗漏，促进愈合效果好等优点。本发明的丝素蛋白医用组织胶黏剂在湿态生理环境下组织粘附强度高，对湿态猪皮组织的粘附强度可以达到400kpa以上，湿态组织粘附强度明显高于现有的丝素蛋白制备的医用组织胶黏剂。本发明的丝素蛋白医用组织胶黏剂可在5秒内实现肝脏出血组织的快速止血，止血速度明显快于现有的丝素蛋白制备的医用组织胶黏剂。
36.本发明的丝素蛋白医用组织胶黏剂还可以应用于湿态生理环境下组织创伤的快速止血、伤口液体泄漏密封、创伤组织愈合修复、伤口抑菌等方面。
37.实施例1本实施例的丝素蛋白医用组织胶黏剂的制备方法包括：（1）将50.0g家蚕生丝放入20.0 l、0.02mol/l的碳酸钠溶液中100℃煮沸20分钟后，用去离子水充分洗涤，去除丝胶蛋白，于50 ℃烘箱中烘干，得到脱胶蚕丝。将27g脱胶蚕丝溶解于100.0ml、9.3mol/l的溴化锂溶液中60℃处理240分钟，待脱胶蚕丝完全溶解，将溶
解后的溶液装入透析袋中，用去离子水进行透析，透析后的溶液经过离心过滤后放置于冻干机中-80℃真空冷冻干燥72小时得到丝素蛋白粉末。
38.（2）将300mg三(2-羧乙基)膦盐酸盐溶于10ml的去离子水中充分溶解，维持ph值为5.0；然后，将0.5g丝素蛋白粉末溶解于10ml的含有三(2-羧乙基)膦盐酸盐的水溶液中，放置于室温条件下进行还原反应处理10分钟，获得浓度为5.0 wt%的还原反应处理的丝素蛋白溶液。
39.（3）将5.0g单宁酸溶解于10.0ml去离子水中，氮气保护环境下搅拌使之溶解均匀，得到浓度为500 mg/ml的单宁酸溶液。
40.（4）将相同体积的上述还原反应处理的丝素蛋白溶液和单宁酸溶液在室温条件下进行混合，维持ph值为4.5，快速搅拌混匀，得到丝素蛋白医用组织胶黏剂。
41.对步骤（2）的还原反应处理的丝素蛋白溶液的游离-sh基团含量进行测试，如图1所示，还原反应处理的丝素蛋白的游离-sh基团含量为126.5μmol/g。对步骤（2）的还原反应处理的丝素蛋白溶液的zeta电位值进行测试，如图2所示，还原反应处理的丝素蛋白的zeta电位值为+7.5mv。由此可以表明通过三(2-羧乙基)膦盐酸盐对丝素蛋白进行还原反应处理，可以有效分解丝素蛋白中的二硫键并维持蛋白质游离-sh基团，从而诱导疏水性氨基酸的暴露，进而提高丝素蛋白的疏水性作用，对步骤（4）的丝素蛋白医用组织胶黏剂的水接触角进行测试，如图3所示，丝素蛋白医用组织胶黏剂的水接触角值为150
°
，说明具有优异的高疏水性能。
42.本实施例的丝素蛋白医用组织胶黏剂在湿态生理环境下对湿态猪皮组织的粘附强度为460kpa，以wistar大鼠为动物止血模型，将该丝素蛋白医用组织胶黏剂用于wistar大鼠肝脏止血试验，可以实现5秒内完全止血。
43.对比例1本对比例的丝素蛋白医用组织胶黏剂的制备方法包括：（1）将50.0g家蚕生丝放入20.0 l、0.02mol/l的碳酸钠溶液中100℃煮沸20分钟后，用去离子水充分洗涤，去除丝胶蛋白，于50 ℃烘箱中烘干，得到脱胶蚕丝。将27g脱胶蚕丝溶解于100.0ml、9.3mol/l的溴化锂溶液中60℃处理240分钟，待脱胶蚕丝完全溶解，将溶解后的溶液装入透析袋中，用去离子水进行透析，透析后的溶液经过离心过滤后得到浓度为5.0 wt%的丝素蛋白溶液。
44.（2）将5.0g单宁酸溶解于10.0ml去离子水中，氮气保护环境下搅拌使之溶解均匀，得到浓度为500 mg/ml的单宁酸溶液。
45.（3）将相同体积的上述丝素蛋白溶液和单宁酸溶液在室温条件下进行混合，维持ph值为4.5，快速搅拌混匀，得到丝素蛋白医用组织胶黏剂。
46.如图1、图2所示，本对比例的丝素蛋白的游离-sh基团含量为3.8μmol/g、zeta电位值为
−
12mv。如图3所示，本对比例的丝素蛋白医用组织胶黏剂的水接触角值为80
°
。由此可以说明，与实施例1相比，本对比例未通过三(2-羧乙基)膦盐酸盐对丝素蛋白进行还原反应处理，并不能诱导丝素蛋白的疏水性氨基酸的暴露，无法提高丝素蛋白医用组织胶黏剂的疏水作用。
47.本对比例的丝素蛋白医用组织胶黏剂在湿态生理环境下对湿态猪皮组织的粘附强度为37 kpa。以wistar大鼠为动物止血模型，将该丝素蛋白医用组织胶黏剂用于wistar
大鼠肝脏止血试验，可以实现52秒止血。
48.实施例2本实施例的丝素蛋白医用组织胶黏剂的制备方法包括以下步骤：（1）将25.0g家蚕生丝放入10.0 l、0.02mol/l的碳酸钠溶液中100℃煮沸20分钟后，用去离子水充分洗涤，去除丝胶蛋白，于30℃烘箱中烘干，得到脱胶蚕丝。将13.5g脱胶蚕丝溶解于50.0ml、9.3mol/l的溴化锂溶液中70℃处理180分钟，待脱胶蚕丝完全溶解，将溶解后的溶液装入透析袋中，用去离子水进行透析，透析后的溶液经过离心过滤后放置于冻干机中-80℃真空冷冻干燥48小时得到丝素蛋白粉末。
49.（2）将500mg三(2-羧乙基)膦盐酸盐溶于10ml的去离子水中充分溶解，维持ph值为5.0；然后，将1.0g丝素蛋白粉末溶解于10ml的含有三(2-羧乙基)膦盐酸盐的水溶液中,放置于室温条件下进行还原反应处理20分钟，获得浓度为10.0 wt%的还原反应处理的丝素蛋白溶液。
50.（3）将1.0g单宁酸溶解于10.0ml去离子水中，氮气保护环境下搅拌使之溶解均匀，得到浓度为100 mg/ml的单宁酸溶液；（4）将相同体积的上述还原反应处理的丝素蛋白溶液和单宁酸溶液在室温条件下进行混合，向其中加入抗菌药物，抗菌药物占医用组织胶黏剂重量的0.5%，维持ph值为5.0，快速搅拌混匀，得到丝素蛋白医用组织胶黏剂。
51.对步骤（2）的还原反应处理的丝素蛋白溶液的游离-sh基团含量进行测试，还原反应处理的丝素蛋白的游离-sh基团含量为135.9μmol/g。对步骤（2）的还原反应处理的丝素蛋白溶液的zeta电位值进行测试，还原反应处理的丝素蛋白的zeta电位值为+8.5mv。由此可以表明通过三(2-羧乙基)膦盐酸盐对丝素蛋白进行还原反应处理，可以有效分解丝素蛋白中的二硫键并维持蛋白质游离-sh基团，从而诱导疏水性氨基酸的暴露，进而提高丝素蛋白的疏水性作用。
52.对步骤（4）的丝素蛋白医用组织胶黏剂的水接触角进行测试，丝素蛋白医用组织胶黏剂水接触角值为155
°
，说明具有优异的高疏水性能。
53.本实施例的丝素蛋白医用组织胶黏剂在湿态生理环境下对湿态猪皮组织的粘附强度为450 kpa。以wistar大鼠为动物止血模型，将该丝素蛋白医用组织胶黏剂用于wistar大鼠肝脏止血试验，可以实现5秒内完全止血。
54.实施例3本实施例的丝素蛋白医用组织胶黏剂的制备方法包括以下步骤：（1）将30.0g家蚕生丝放入12.0 l、0.02mol/l的碳酸钠溶液中100℃煮沸20分钟后，用去离子水充分洗涤，去除丝胶蛋白，于60 ℃烘箱中烘干，得到脱胶蚕丝。将13.5g脱胶蚕丝溶解于50.0ml 氯化钙/乙醇/水摩尔比为1:2:8的三元溶液体系中60℃处理360分钟，待脱胶蚕丝完全溶解，将溶解后的溶液装入透析袋中，用去离子水进行透析，透析后的溶液经过离心过滤后放置于冻干机中-80℃真空冷冻干燥72小时得到丝素蛋白粉末。
55.（2）将100mg三(2-羧乙基)膦盐酸盐溶于10ml的去离子水中充分溶解，维持ph值为5.0；然后，将0.1g丝素蛋白粉末溶解于10ml的含有三(2-羧乙基)膦盐酸盐的水溶液中，放置于室温条件下进行还原反应处理5分钟，获得浓度为1.0 wt%的还原反应处理的丝素蛋白溶液。
56.（3）将3.0g表儿茶素没食子酸酯溶解于10.0ml去离子水中，氮气保护环境下搅拌使之溶解均匀，得到浓度为300 mg/ml的表儿茶素没食子酸酯溶液；（4）将相同体积的上述还原反应处理的丝素蛋白溶液和表儿茶素没食子酸酯溶液在室温条件下进行混合，向其中加入壳聚糖，壳聚糖占医用组织胶黏剂重量的10%，维持ph值为4.0，快速搅拌混匀，得到丝素蛋白医用组织胶黏剂。
57.对步骤（2）的还原反应处理的丝素蛋白溶液的游离-sh基团含量进行测试，还原反应处理的丝素蛋白的游离-sh基团含量为116.2μmol/g。对步骤（2）的还原反应处理的丝素蛋白溶液的zeta电位值进行测试，还原反应处理的丝素蛋白的zeta电位值为+6.5mv。由此可以表明通过三(2-羧乙基)膦盐酸盐对丝素蛋白进行还原反应处理，可以有效分解丝素蛋白中的二硫键并维持蛋白质游离-sh基团，从而诱导疏水性氨基酸的暴露，进而提高丝素蛋白的疏水性作用。
58.对步骤（4）的丝素蛋白医用组织胶黏剂的水接触角进行测试，丝素蛋白医用组织胶黏剂水接触角值为149
°
，说明具有优异的高疏水性能。
59.本实施例的丝素蛋白医用组织胶黏剂在湿态生理环境下对湿态猪皮组织的粘附强度为430 kpa。以wistar大鼠为动物止血模型，将该丝素蛋白医用组织胶黏剂用于wistar大鼠肝脏止血试验，可以实现5秒内完全止血。
60.以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。