糖尿病的预防和/或治疗剂

1.本发明涉及糖尿病的预防和/或治疗剂。


背景技术：

2.免疫检查点抑制剂适用于各种恶性肿瘤，其用途正在不断扩展。抗ctla-4抗体中的易普利姆玛(yervoy(注册商标))应用于恶性黑素瘤，抗pd-1抗体中的纳武单抗(opdivo(注册商标))用于恶性黑素瘤、非小细胞肺癌、肾细胞癌、霍奇金淋巴瘤、头颈部癌、胃癌，抗pd-1抗体中的派姆单抗(可瑞达(注册商标))应用于恶性黑素瘤、非小细胞肺癌、尿路上皮癌，抗pd-l1抗体中的阿维鲁单抗(bavencio(注册商标))应用于默克尔(merkel)细胞癌，抗pd-l1抗体中的阿特珠单抗(tecentriq(注册商标))应用于非小细胞肺癌，这些应用在日本已被保险覆盖。
3.这些药剂通过活化免疫反应而显示抗肿瘤效果，但是认为根据其作用机制而存在引起自身免疫疾病的可能性，实际中已报道了各种免疫相关不良事件的发生。其一为内分泌障碍，迄今为止已报道了垂体功能低下症、肾上腺皮质功能低下症、甲状腺功能异常症、甲状旁腺功能下降症、1型糖尿病。“免疫检查点抑制剂引起的内分泌障碍的诊疗指南”指出，1型糖尿病由于胰腺β细胞功能丧失不可逆转且血糖会急剧升高，如果不进行适当的治疗则会影响到预后存活期，因此需要早诊断和早开始治疗(胰岛素治疗)，需要对在利用胰岛素治疗而改善血糖控制之前中止免疫检查点抑制剂的给药进行研究(非专利文献1)。
4.已经使用作为1型糖尿病自然发病模型的nod小鼠阐明了免疫检查点抑制剂引发糖尿病的机制(非专利文献2)。即，认为免疫检查点抑制剂抑制pd-1，由此t细胞、巨噬细胞被活化并攻击自身的β细胞，由此发生1型糖尿病。因此认为，难以在保持免疫检查点抑制剂对恶性肿瘤的效果的同时抑制1型糖尿病的发生。在这种状况下，迫切需要能够在保持检查点抑制剂的效果的状态下抑制副作用的治疗方法。
5.近年来，对人体各种部位的组织、细胞、受精卵等进行细胞培养并将培养而得的细胞用于再生医疗等的技术已经实用化。其一是间充质干细胞。间充质干细胞是弗里登施泰因(friedenstein)首次从骨髓中分离出的具有分化多能性的祖细胞(参照非专利文献3)。已明确了间充质干细胞存在于骨髓、脐带、脂肪等各种组织中，间充质干细胞移植作为针对各种难治性疾病的新颖治疗方法而备受期待(参照专利文献1～2)。最近获知，脂肪组织、胎盘、脐带、卵膜等间质细胞中存在具有同等功能的细胞。因此，有时也将间充质干细胞称为间质细胞(mesenchymal stromal cell)。
6.现有技术文献
7.专利文献
8.专利文献1:日本特开2012-157263号公报
9.专利文献2:日本特表2012-508733号公报
10.非专利文献
11.非专利文献1:日本内分泌学会杂志、2018、vol.94、suppl.november、pp.1-11
12.非专利文献2:proc.natl.acad.sci.usa、2020、vol.49、no.117、pp.31319-31330
13.非专利文献3:pittenger f.m.et al.，science，1999，284，pp.143-147


技术实现要素：

14.发明要解决的问题
15.本发明是基于上述情况而作出的，目的在于提供一种糖尿病治疗药，其对因给予免疫检查点抑制剂而作为副作用发生的糖尿病发挥优异效果，并且对很多患者得到一定的效果。
16.用于解决问题的方案
17.本发明人们为了解决上述课题进行了深入研究，结果发现，对于因免疫检查点抑制剂而发生的糖尿病，通过给予间充质干细胞能够抑制糖尿病的发生、另外能够显著改善发生的糖尿病的症状。本发明是基于这些见解而完成的。即，为了解决上述课题而作出的发明如下所述。
18.[1]一种糖尿病的预防和/或治疗剂，其含有间充质干细胞。
[0019]
[2]根据权利要求1所述的糖尿病的预防和/或治疗剂，其中，上述糖尿病为因免疫检查点抑制剂而发生的糖尿病。
[0020]
[3]根据[1]或[2]所述的糖尿病的预防和/或治疗剂，其中，上述糖尿病为因抗pd-1抗体或抗pd-l1抗体而发生的糖尿病。
[0021]
[4]根据[1]至[3]中任一项所述的糖尿病的预防和/或治疗剂，其中，上述间充质干细胞相对于被检体为同种异体。
[0022]
[5]根据[1]至[4]中任一项所述的糖尿病的预防和/或治疗剂，其中，上述间充质干细胞来自脂肪、来自脐带或来自骨髓。
[0023]
[6]一种糖尿病的预防和/或治疗用试剂盒，其包含[1]至[5]中任一项所述的糖尿病治疗剂、容器及标签。
[0024]
发明的效果
[0025]
根据本发明的糖尿病的预防和/或治疗药，通过给予间充质干细胞而能够抑制由免疫检查点抑制剂导致的糖尿病的发生，另外对因免疫检查点抑制剂而发生的糖尿病而言，能够显著改善症状。上述间充质干细胞即使对于同种异体的被检体也不易引发排斥反应，因此能够将对预先制备的供体细胞进行扩大培养并冷冻保存的细胞作为本发明的糖尿病的预防和/或治疗剂中的间充质干细胞使用。因此，与制备自身间充质干细胞并使用的情况相比，还具有容易商品化且容易稳定地得到一定的效果的优点。
附图说明
[0026]
图1为示出给予了抗pd-l1抗体(ctrl)、抗pd-l1抗体及admsc(msc)的小鼠的血糖值的变化的图。
[0027]
图2为示出给予了抗pd-l1抗体(ctrl)、抗pd-l1抗体及admsc(msc)的小鼠的糖尿病发生的变化的图。
[0028]
图3为示出给予了抗pd-l1抗体(ctrl)、抗pd-l1抗体及admsc(msc)的小鼠的体重的变化的图。
[0029]
图4为示出给予了抗pd-l1抗体的小鼠(ctrl)的胰腺的苏木精-伊红染色(左)及胰岛素免疫染色(右)的图。
[0030]
图5为示出给予了抗pd-l1抗体及admsc的小鼠(msc)的胰腺的苏木精-伊红染色(左)及胰岛素免疫染色(右)的图。
[0031]
图6为示出给予了抗pd-l1抗体(ctrl)、抗pd-l1抗体及admsc(msc)的小鼠的胰切片中的胰岛面积的比较的图。
[0032]
图7为示出实施例1中未发生糖尿病的cntl组及msc组的胰切片中的胰岛面积的比较的图。
具体实施方式
[0033]
以下对本发明的糖尿病的预防和/或治疗剂进行详细说明。
[0034]
＜糖尿病的预防和/或治疗剂＞
[0035]
本发明的糖尿病的预防和/或治疗剂含有间充质干细胞。另外，本发明的糖尿病的预防和/或治疗剂所针对的糖尿病为因为给予免疫检查点抑制剂而发生的糖尿病。本发明的糖尿病的预防和/或治疗剂能够抑制由免疫检查点抑制剂导致的糖尿病的发生，另外对于因免疫检查点抑制剂而发生的糖尿病能够显著改善症状。
[0036]
所谓免疫检查点抑制剂，是指以抑制免疫细胞的活动的“免疫检查点”为靶标的癌症治疗药。免疫检查点抑制剂只要是抑制免疫检查点的药剂即可，可列举对pd-1与其配体(pd-l1、pd-l2)的结合进行抑制的药剂、对pd-l1与作为其受体的pd-1的结合进行抑制的药剂、对ctla-4与作为其配体的抗原呈递细胞上的b7.1(cd80)及b7.2(cd86)分子的结合进行抑制的药剂等。作为免疫检查点抑制剂，可例示pd-1抗体、pd-l1抗体及细胞杀伤性t淋巴细胞抗原-4(ctla-4)抗体，具体而言，可例示纳武单抗(nivolumab、opdivo(注册商标)、opdivo(注册商标)、小野药品工业)、派姆单抗(pembrolizumab、可瑞达(注册商标)、keytruda(注册商标)、msd)、斯巴达珠单抗(spartalizumab、诺华制药)、西米普利单抗(cemiplimab、sanofi)、阿维鲁单抗(avelumab、bavencio(注册商标)、bavencio(注册商标)、merck biopharma)、阿特珠单抗(atezolizumab、tecentriq(注册商标)、tecentriq(注册商标)、中外制药)、度伐单抗(durvalumab、英飞凡(注册商标)、imfinzi(注册商标)、阿斯利康)、易普利姆玛(ipilimumab、yervoy(注册商标)、yervoy(注册商标)、bristol-myers squibb)及曲美木(tremelimumab、阿斯利康)等。
[0037]
〈间充质干细胞〉
[0038]
本发明中，所谓间充质干细胞是指：具有分化为属于间充质的细胞(骨细胞、心肌细胞、软骨细胞、肌腱细胞、脂肪细胞等)的分化能力、并且能够在维持该能力的状态下增殖的细胞。本发明中使用的间充质干细胞这一术语是指与间质细胞相同的细胞，对两者不特意进行区分。作为包含间充质干细胞的组织，可列举例如脂肪组织、脐带、骨髓、脐带血、胎盘、牙髓等。因此，例如来自脂肪组织的间充质干细胞是指包含于脂肪组织的间充质干细胞，也可以称为来自脂肪组织的间质细胞。这些中，从本发明的糖尿病的预防和/或治疗剂的作用效果的观点及获得容易性的观点等出发，优选来自脂肪组织的间充质干细胞、来自脐带的间充质干细胞、来自骨髓的间充质干细胞、来自胎盘的间充质干细胞、来自牙髓的间充质干细胞，更优选来自脂肪组织的间充质干细胞、来自脐带的间充质干细胞、来自骨髓的
间充质干细胞，进一步优选来自脂肪组织的间充质干细胞、来自脐带的间充质干细胞，特别优选来自脐带的间充质干细胞。
[0039]
本发明中的间充质干细胞优选相对于被检体为同种同体或同种异体。间充质干细胞即使对于同种异体的被检体也不易引起排斥反应，因此可以将对预先制备的供体细胞进行扩大培养并冷冻保存的细胞作为本发明的糖尿病的预防和/或治疗剂中的间充质干细胞使用。因此，与制备自身间充质干细胞并使用的情况相比，商品化也容易，并且容易稳定地得到一定的效果，从该观点出发，本发明中的间充质干细胞更优选为同种异体。
[0040]
本发明中，所谓间充质干细胞是指包含间充质干细胞的任意细胞群。该细胞群的至少20％以上、优选30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、93％、96％、97％、98％或99％以上为间充质干细胞。
[0041]
本发明中，所谓脂肪组织是指包含脂肪细胞及包括微血管细胞等在内的间质细胞的组织，例如为对哺乳动物的皮下脂肪进行手术切除或抽吸而得到的组织。脂肪组织可由皮下脂肪获得。优选由与后述的来自脂肪组织的间充质干细胞的给予对象同种的动物获得，若考虑到对人进行给予这一点，更优选为人的皮下脂肪。皮下脂肪的供给个体是存活状态也可以是死亡状态，本发明中使用的脂肪组织优选为从存活个体收集的组织。从个体收集时，脂肪抽吸例如可例示出：pal(动力辅助)吸脂、erchonia激光吸脂或body-jet吸脂等，从维持细胞的状态的观点出发，优选不使用超声波。
[0042]
本发明中，所谓脐带是连接胎儿与胎盘的白色管状组织，由脐带静脉、脐带动脉、胶状组织(华顿氏胶；wharton’s jelly)、脐带基质本身等构成，富含间充质干细胞。脐带优选从与使用本发明的糖尿病的预防和/或治疗剂的被检体(给予对象)为同种的动物获得，若考虑到将本发明的糖尿病的预防和/或治疗剂对人进行给予，更优选为人的脐带。
[0043]
本发明中，所谓骨髓是指充满了骨的内腔的软组织，为造血器官。骨髓中存在骨髓液，将其中存在的细胞称为骨髓细胞。骨髓细胞中除了红细胞、粒细胞、巨核细胞、淋巴细胞、脂肪细胞等之外还包含间充质干细胞、造血干细胞、血管内皮祖细胞等。骨髓细胞例如可以由人髂骨、长骨或其它骨采集。
[0044]
本发明中，所谓的来自脂肪组织的间充质干细胞、来自脐带的间充质干细胞、来自骨髓的间充质干细胞之类的来自各组织的间充质干细胞，是指分别包含来自脂肪组织的间充质干细胞、来自脐带的间充质干细胞、来自骨髓的间充质干细胞之类的来自各组织的间充质干细胞的任意的细胞群。该细胞群的至少20％以上、优选为30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、93％、96％、97％、98％或99％以上为来自脂肪组织的间充质干细胞、来自脐带的间充质干细胞、来自骨髓的间充质干细胞之类的来自各组织的间充质干细胞。
[0045]
本发明中的间充质干细胞例如可以利用生长特征(例如，从传代至老化为止的群体倍增能力、倍增时间)、核型分析(例如，正常的核型、母体系统或新生儿系统)、通过流式细胞仪(例如，facs分析)进行的表面标记物表达、免疫组织化学和/或免疫细胞化学(例如，表位检测)、基因表达谱(例如，基因芯片阵列；逆转录pcr、实时pcr、传统型pcr等聚合酶链式反应)、mirna表达谱、蛋白质阵列、细胞因子等蛋白质分泌(例如，血浆凝血解析、elisa、细胞因子阵列)、代谢产物(代谢组学解析)、本领域中已知的其它方法等进行表征。
[0046]
〈间充质干细胞的制备方法〉
[0047]
本发明中的间充质干细胞可以通过本领域技术人员熟知的方法来制备。以下，对作为一例的、来自脂肪组织的间充质干细胞的制备方法进行说明。来自脂肪组织的间充质干细胞例如可以通过美国专利第6,777,231号记载的制造方法来得到，例如可以用包括以下的工序(i)～
[0048]
(iii)的方法来制造：
[0049]
(i)通过酶消化脂肪组织而得到细胞悬浮物的工序；
[0050]
(ii)使细胞沉淀，将细胞重悬浮于适当的培养基的工序；以及
[0051]
(iii)在固体表面培养细胞，去除与固体表面未显示出结合的细胞的工序。
[0052]
对于所选择的细胞，为了确认为本发明中的来自脂肪组织的间充质干细胞，可以使用流式细胞仪等利用现有方法对表面抗原进行分析。进而，还可以对分化为各细胞系列的能力进行检测，这样的分化可以利用现有的方法进行。
[0053]
本发明中的间充质干细胞可以如上所述进行制备，但还可以定义为具有以下特性的细胞；
[0054]
(1)在标准培养基中的培养条件下，对塑料显示出粘附性；
[0055]
(2)表面抗原cd44、cd73、cd90为阳性，cd31、cd45为阴性；及
[0056]
(3)在培养条件下能分化为骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞。
[0057]
本发明的间充质干细胞可以是任意状态的细胞，例如可以是将培养中的细胞剥离并回收而得的细胞，还可以是被冷冻在冷冻保存液中的状态的细胞。使用将扩大培养而得到的同批次的细胞分成小份并进行冷冻保存的细胞时，在稳定地得到作用效果方面、操作性优异方面等是优选的。冷冻保存状态的间充质干细胞可以在即将使用之前进行融解并以悬浮于冷冻保存液的状态直接给予，也可以输液或悬浮于培养基后进行给予。另外，可以利用离心分离等方法去除冷冻保存液后悬浮于输注液或培养基中。
[0058]
本发明的糖尿病治疗剂可以用于糖尿病的治疗。特别可以适宜用于因给予免疫检查点抑制剂而发生的糖尿病的治疗，更适宜用于因给予抗pd-1抗体或抗pd-l1抗体而发生的糖尿病。另外，本发明的糖尿病预防剂可以用于糖尿病的预防。特别地，可以适宜作为由免疫检查点抑制剂导致的糖尿病的发生的预防剂使用，更适宜作为因给予抗pd-1抗体或抗pd-l1抗体而发生的糖尿病的预防剂使用。
[0059]
从有效性的观点出发，本发明的糖尿病的预防和/或治疗剂的给予途径优选为静脉内给予、动脉内给予、肌肉内给予。
[0060]
本发明的糖尿病的预防和/或治疗剂中，间充质干细胞的用量(给予量)根据患者的状态(体重、年龄、症状、身体状况等)、及本发明的糖尿病的预防和/或治疗剂的剂形等而可能不同，从发挥充分的糖尿病的预防和/或治疗剂的治疗效果的观点出发，有优选间充质干细胞量较多的倾向，另一方面，从抑制副作用的表现的观点出发，有优选间充质干细胞的量较少的倾向。通常对成人进行给予时，以间充质干细胞的细胞数计，为1
×
103～1
×
10
12
个/次、优选为1
×
104～1
×
10
11
个/次、更优选为1
×
105～1
×
10
10
个/次、进一步优选为5
×
106～1
×
109个/次。另外，以相对于患者体重的间充质干细胞给予量计，为1
×
10～5
×
10
10
个/kg、优选为1
×
102～5
×
109个/kg、更优选为1
×
103～5
×
108个/kg、进一步优选为1
×
104～5
×
107个/kg。需要说明的是，可将本用量作为1次量而多次给予间充质干细胞，也可以将本用量分成多次进行给予。
[0061]
本发明的糖尿病的预防和/或治疗剂既可以在糖尿病发病前以预防方式使用，也可以在糖尿病发病后以治疗目的使用。即，对于患者而言，既可以与免疫检查点抑制剂的使用平行地使用本发明的糖尿病的预防和/或治疗剂，也可以在因给予免疫检查点抑制剂而发生糖尿症后使用本发明的糖尿病的预防和/或治疗剂。
[0062]
本发明的糖尿病的预防和/或治疗剂可以与1或2种以上其它药剂一起给予。作为其它药剂，可列举可以作为糖尿病的预防和/或治疗剂使用的任意药剂。需要说明的是，本发明的糖尿病的预防和/或治疗剂与1或2种以上其它药剂一起给予时，包括将本发明的糖尿病的预防和/或治疗剂和其它药剂同时使用的情况、在给予其中一者后经过一定时间再给予其它药剂的情况、这些的组合等各种情况。
[0063]
＜糖尿病的预防和/或治疗剂的制备方法＞
[0064]
本发明的糖尿病的预防和/或治疗剂可根据各自的剂型按照常规方法将利用上述制备方法准备的间充质干细胞和适当的细胞悬浮用液体等(包括药学上允许的载体、添加物)混合而得到。
[0065]
＜糖尿病的预防和/或治疗用试剂盒＞
[0066]
本发明还包括：包含上述本发明的糖尿病的预防和/或治疗剂、容器及标签的糖尿病治疗用的试剂盒。作为本发明的试剂盒所包含的适当的容器，没有特别限定，可列举例如间充质干细胞冷冻用的冻存管、间充质干细胞悬浮用溶液、管型瓶、试管等。这些容器可以由玻璃、金属、塑料或这些的组合等多样化的材料形成。这些容器上的标签中记载了对内容物进行说明的内容。
[0067]
本发明的试剂盒可以包括其它添加剂、其它药剂、稀释剂、过滤器、针、注射器、包括记载了使用方法的附带文件在内的从商业角度及使用者的观点出发而期望的其它材料。
[0068]
＜糖尿病的预防和/或治疗方法＞
[0069]
本发明的糖尿病的预防和/或治疗方法的特征在于，给予间充质干细胞。另外，本发明的糖尿病的预防和/或治疗方法所针对的糖尿病为由于给予免疫检查点抑制剂而发生的糖尿病。本发明的糖尿病的预防和/或治疗方法能够抑制由免疫检查点抑制剂引起的糖尿病的发生，另外对于因免疫检查点抑制剂而发生的糖尿病而言能够显著改善症状。需要说明的是，本发明的糖尿病的预防和/或治疗方法为包括对对象给予本发明的糖尿病的预防和/或治疗剂的步骤的方法，因此具体的内容请参照关于本发明的糖尿病的预防和/或治疗剂的项目的记载。
[0070]
实施例
[0071]
以下列举实施例详细地说明本发明，但是本发明不受这些实施例等限定。
[0072]
[msc对抗pd-l1抗体诱发糖尿病的效果1]
[0073]
实施例1
[0074]
对于小鼠(nod/shijcl、雄性、10周龄、n＝31)，在第0天腹腔内给予1000μg抗pd-l1抗体，在第2、5、7、9及12天腹腔内给予500μg抗pd-l1抗体。对于msc组，将来自脂肪的干细胞(lonza、以下称为“msc”)悬浮于dmem(低葡萄糖、p/s)，在第0、2、5、7、9及12天以1.0
×
106个细胞/只向尾静脉进行给予。对于cntl组，在第0、2、5、7、9及12天进行仅dmem的给予。使用简易血糖测定仪(dexter)进行血糖值的测定。需要说明的是，对于超过测定极限的个体，以600mg/dl进行计算。另外，血糖值为250mg/dl以上则作为糖尿病，求出糖尿病发生率。
[0075]
如图1所示，通过给予msc，在第14天确认到了明显的血糖值抑制效果。另外，通过给予msc，能够抑制糖尿病的发生(图2)。需要说明的是，cntl组及msc组的小鼠未观察到体重减轻，两者的体重变化方面未观察到差异(图3)。
[0076]
由以上的结果可明确，通过给予msc，能够抑制因给予抗pd-l1抗体而发生的血糖值的上升及糖尿病的发病。可知，间充质干细胞对因给予免疫检查点抑制剂而发生的糖尿病发挥优异的治疗效果。
[0077]
[msc对抗pd-l1抗体诱发糖尿病的效果2]
[0078]
对实施例1的cntl组及msc组的胰腺进行苏木精-伊红染色及胰岛素免疫染色(图4及图5)。需要说明的是，图5的箭头指示出胰岛。对照组中未观察到胰岛，与此相对地在msc组中明确确认到胰岛。
[0079]
[msc对抗pd-l1抗体诱发糖尿病的效果3]
[0080]
对实施例1的cntl组及msc组的胰切片中的胰岛面积进行了比较(图6)。与cntl组相比，msc组的胰岛面积显著大。另外，对实施例1中未发生糖尿病的cntl组(n＝5)与msc组(n＝9)的胰岛面积进行了比较(图7)。未发生糖尿病的组与cntl组相比，有msc组的胰岛面积大的倾向。
[0081]
产业上的可利用性
[0082]
根据本发明的糖尿病的预防和/或治疗剂，能够抑制由免疫检查点抑制剂引起的糖尿病的发生，另外能够显著改善因免疫检查点抑制剂而发生的糖尿病的各症状。上述间充质干细胞对同种异体的被检体也不易引发排斥反应，因此能够将对预先确认了治疗效果的供体细胞进行扩大培养并冷冻保存而得的细胞作为本发明的糖尿病的预防和/或治疗剂中的间充质干细胞使用。因此，与制备自身间充质干细胞并使用的情况相比，还有商品化也容易、并且容易得到一定的效果的优点。