干细胞分化与聚合物的制作方法

干细胞分化与聚合物
1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求于2021年3月9日提交的美国临时专利申请第63/158,587号的权益，该申请通过引用以其整体特此并入。
3.背景
4.干细胞衍生的β细胞的产生可以为胰岛和胰腺器官的产生提供可能有用的步骤。可以由干细胞衍生的组织治疗的快速增长的疾病之一是糖尿病。1型糖尿病由胰岛中β细胞的自身免疫破坏而导致。2型糖尿病由外周组织胰岛素抗性和β细胞功能障碍而导致。糖尿病患者，尤其是罹患1型糖尿病的患者，能够有可能通过移植新的β细胞而治愈。通过这一策略，可以使移植了尸体的人胰岛的患者在5年或更长时间内不依赖于胰岛素，但是由于供体胰岛的缺乏和质量问题，这种方法是有限的。从干细胞产生无限的人β细胞供应可以将这种疗法扩展到数百万新患者，并且可以成为将干细胞生物学转化到临床中的重要测试案例。
5.通过引用并入
6.本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请均通过引用并入本文，其程度如同每个出版物、专利或专利申请被具体地和单独地指出通过引用来并入。除非另有说明，否则本说明书中提及的出版物、专利和专利申请通过引用以其整体并入本文。
7.概述
8.在一些方面，本文公开了包含在包含水溶性合成聚合物的培养基中的多于一个胰腺β细胞或其前体细胞的体外组合物。
9.在一些情况下，组合物包含胰腺β细胞前体细胞，并且其中胰腺β细胞前体细胞包括sox17阳性细胞、foxa2阳性细胞、pdx1阳性细胞、nkx6.1阳性细胞、isl1阳性细胞和/或胰岛素阳性内分泌细胞。在一些情况下，水溶性合成聚合物包括聚乙烯醇、泊洛沙姆、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇(peg)、peg共聚物、聚(n-异丙基丙烯酰胺)或聚丙烯酰胺。在一些情况下，水溶性合成聚合物包括聚乙烯醇。在一些情况下，水溶性合成聚合物以以下的浓度存在于培养基中：约0.005％至约0.5％(w/v)、约0.01％至约0.2％(w/v)、约0.02％至约0.1％(w/v)或约0.03％至约0.08％(w/v)。在一些情况下，水溶性合成聚合物以约0.04％至约0.06％(w/v)的浓度存在于培养基中。在一些情况下，水溶性合成聚合物以约0.05％(w/v)的浓度存在于培养基中。
10.在一些情况下，组合物包含多于一个nkx6.1阳性、胰岛素阳性细胞和/或非天然胰腺β细胞。在一些情况下，水溶性合成聚合物包括超过85％水解的聚乙烯醇。在一些情况下，水溶性合成聚合物包括约87％至89％水解的聚乙烯醇。在一些情况下，组合物还包含nkx6.1阳性、isl1阳性胰腺内分泌细胞。在一些情况下，组合物还包含胰腺α细胞、胰腺δ细胞、胰腺f细胞、胰腺ε细胞、肠嗜铬细胞或其任何组合。在一些情况下，培养基还包含选自由以下组成的组的一种或更多种剂：转化生长因子β(tgf-β)信号传导途径抑制剂、甲状腺激素信号传导途径激活剂、表观遗传修饰化合物、来自表皮生长因子(egf)家族的生长因子、视黄酸(ra)信号传导途径激活剂、音猬(shh)途径抑制剂、γ-分泌酶抑制剂、蛋白激酶抑制剂、rho相关的含卷曲螺旋蛋白激酶(rock)抑制剂和骨形态发生蛋白(bmp)信号传导途径抑
制剂。
11.在一些情况下，组合物包含胰腺β细胞前体细胞，并且其中胰腺β细胞前体细胞包括多于一个pdx1阳性、nkx6.1阳性细胞。在一些情况下，培养基还包含选自由以下组成的组的一种或更多种剂：蛋白激酶c激活剂、tgf-β信号传导途径抑制剂、甲状腺激素信号传导途径激活剂、表观遗传修饰化合物、来自表皮生长因子(egf)家族的生长因子、视黄酸(ra)信号传导途径激活剂、音猬(shh)途径抑制剂、γ-分泌酶抑制剂、蛋白激酶抑制剂、rho相关的含卷曲螺旋蛋白激酶(rock)抑制剂和骨形态发生蛋白(bmp)信号传导途径抑制剂。在一些情况下，培养基还包含：(a)选自由以下组成的组的tgf-β信号传导途径抑制剂：alk5i ii、a83-01、sb431542、d4476、gw788388、ly364947、ly580276、sb505124,gw6604、sb-525334、sd-208和sb-505124；(b)甲状腺激素信号传导途径激活剂，包括t3或gc-l；(c)选自由以下组成的组的表观遗传修饰化合物：3-去氮瓶菌素a(3-deazaneplanocin a，dznep)、gsk126、epz6438、kd5170、mc1568和tmp195；(d)来自表皮生长因子家族的生长因子，包括β细胞素或egf；(e)选自由以下组成的组的视黄酸信号传导途径激活剂：视黄酸、cd1530、am580、tthrb、cd437、ch55、bms961、ac261066、ac55649、am80、bms753、他扎罗汀、阿达帕林和cd2314；(f)选自由以下组成的组的音猬途径抑制剂：sant1、sant2、sant4、cur6l4l4、毛喉素、番茄碱、ay9944、曲帕拉醇和环巴胺；(g)γ-分泌酶抑制剂，包括xxi或dapt；(h)蛋白激酶抑制剂，包括星形孢菌素、ro-31-8220、双吲哚基马来酰亚胺(bis)化合物、10
′‑
{5
″‑
[(甲氧羰基)氨基]-2
″‑
甲基}-苯基氨基羰基星形孢菌素或staralog；(i)选自由以下组成的组的rock抑制剂：thiazovivin、y-27632、法舒地尔/ha1077和14-1152；(j)选自由以下组成的组的蛋白激酶c激活剂：佛波醇12,13-二丁酯(pdbu)、tpb、佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯和苔藓虫素1；和/或(k)骨形态发生蛋白信号传导途径抑制剂，包括ldn193189或dmh-1。在一些情况下，水溶性合成聚合物包括超过85％水解的聚乙烯醇。在一些情况下，水溶性合成聚合物包括约87％至89％水解的聚乙烯醇。在一些情况下，胰腺β细胞前体细胞还包括nkx6.1阳性、isl1阳性细胞。
[0012]
在一些情况下，组合物包含胰腺β细胞前体细胞，并且其中胰腺β细胞前体细胞包括多于一个pdx1阳性、nkx6.1阴性细胞。在一些情况下，培养基还包含选自由以下组成的组的一种或更多种剂：蛋白激酶c激活剂、来自转化生长因子β(tgf-β)超家族的生长因子、来自成纤维细胞生长因子(fgf)家族的生长因子、视黄酸(ra)信号传导途径激活剂、rho相关的含卷曲螺旋蛋白激酶(rock)抑制剂和音猬(shh)途径抑制剂。在一些情况下，培养基还包含：(a)选自由以下组成的组的来自转化生长因子β(tgf-β)超家族的生长因子：抑制素、激活素、米勒管抑制物质(mis)、骨形态发生蛋白(bmp)、decapentaplegic(dpp)、vg-1、单克隆非特异性抑制因子(mnsf)、生长分化因子8(gdf8)和生长分化因子11(gdf11)；(b)选自由以下组成的组的来自成纤维细胞生长因子(fgf)家族的生长因子：角质形成细胞生长因子(kgf)、fgf2、fgf10、fgf21和fgf8b；(c)选自由以下组成的组的视黄酸(ra)信号传导途径激活剂：视黄酸、cd1530、am580、tthrb、cd437、ch55、bms961、ac261066、ac55649、am80、bms753、他扎罗汀、阿达帕林和cd2314；(d)选自由以下组成的组的rock抑制剂：thiazovivin、y-27632、法舒地尔/ha1077和14-1152；(e)选自由以下组成的组的蛋白激酶c激活剂：佛波醇12,13-二丁酯(pdbu)、tpb、佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯和苔藓虫素1；和/或(f)选自由以下组成的组的音猬(shh)途径抑制剂：sant1、sant2、sant4、cur6l4l4、毛
喉素、番茄碱、ay9944、曲帕拉醇和环巴胺。在一些情况下，水溶性合成聚合物包括低于85％水解的聚乙烯醇。在一些情况下，水溶性合成聚合物包括约80％水解的聚乙烯醇。在一些情况下，胰腺β细胞前体细胞还包括pdx1阳性、nkx6.1阳性细胞。
[0013]
在一些情况下，组合物包含胰腺β细胞前体细胞，并且其中胰腺β细胞前体细胞包括多于一个foxa2阳性原始肠细胞。在一些情况下，培养基还包含选自由以下组成的组的一种或更多种剂：蛋白激酶c激活剂、来自转化生长因子β(tgf-β)超家族的生长因子、骨形态发生蛋白信号传导途径抑制剂、来自成纤维细胞生长因子(fgf)家族的生长因子、视黄酸(ra)信号传导途径激活剂、rho相关的含卷曲螺旋蛋白激酶(rock)抑制剂和音猬(shh)途径抑制剂。在一些情况下，培养基还包含：(a)选自由以下组成的组的蛋白激酶c激活剂：佛波醇12,13-二丁酯(pdbu)、tpb、佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯和苔藓虫素1；(b)选自由以下组成的组的来自转化生长因子β(tgf-β)超家族的生长因子：抑制素、激活素、米勒管抑制物质(mis)、骨形态发生蛋白(bmp)、decapentaplegic(dpp)、vg-1、单克隆非特异性抑制因子(mnsf)、生长分化因子8(gdf8)和生长分化因子11(gdf11)；(c)骨形态发生蛋白信号传导途径抑制剂，包括ldn193189或dmh-1；(d)选自由以下组成的组的来自成纤维细胞生长因子(fgf)家族的生长因子：角质形成细胞生长因子(kgf)、fgf2、fgf10、fgf21和fgf8b；(e)选自由以下组成的组的音猬途径抑制剂：sant1、sant2、sant4、cur6l4l4、毛喉素、番茄碱、ay9944、曲帕拉醇和环巴胺；(f)选自由以下组成的组的视黄酸信号传导途径激活剂：视黄酸、cd1530、am580、tthrb、cd437、ch55、bms961、ac261066、ac55649、am80、bms753、他扎罗汀、阿达帕林和cd2314；和/或(g)选自由以下组成的组的rock抑制剂：thiazovivin、y-27632、法舒地尔/ha1077和14-1152。在一些情况下，水溶性合成聚合物包括低于85％水解的聚乙烯醇。在一些情况下，水溶性合成聚合物包括约80％水解的聚乙烯醇。在一些情况下，胰腺β细胞前体细胞还包括pdx1阳性、nkx6.1阴性细胞。
[0014]
在一些情况下，组合物包含胰腺β细胞前体细胞，并且其中胰腺β细胞前体细胞包括多于一个sox17阳性定形内胚层细胞(definitive endoderm cells)。在一些情况下，培养基还包含来自成纤维细胞生长因子(fgf)家族的生长因子。在一些情况下，来自成纤维细胞生长因子(fgf)家族的生长因子选自由以下组成的组：角质形成细胞生长因子(kgf)、fgf2、fgf10、fgf21和fgf8b。在一些情况下，水溶性合成聚合物包括低于85％水解的聚乙烯醇。在一些情况下，水溶性合成聚合物包括约80％水解的聚乙烯醇。在一些情况下，胰腺β细胞前体细胞还包括foxa2阳性细胞。
[0015]
在一些情况下，组合物包含胰腺β细胞前体细胞，并且其中胰腺β细胞前体细胞包括多于一个多能干细胞(pluripotent stem cells)。在一些情况下，培养基还包含来自转化生长因子β(tgf-β)超家族的生长因子、wnt信号传导途径激活剂或两者。在一些情况下，培养基还包含：(a)选自由以下组成的组的来自转化生长因子β(tgf-β)超家族的生长因子：抑制素、激活素、米勒管抑制物质(mis)、骨形态发生蛋白(bmp)、decapentaplegic(dpp)、vg-1、单克隆非特异性抑制因子(mnsf)、生长分化因子8(gdf8)和生长分化因子11(gdf11)；和/或(b)选自由以下组成的组的wnt信号传导途径激活剂：chir99021、3f8、a 1070722、ar-a 014418、bio、bio-丙酮肟、fratide、10z-hymenialdisine、靛玉红-3’肟、kenpaullone、l803、l803-mts、碳酸锂、nsc 693868、sb 216763、sb 415286、tc-g 24、tcs2002、tcs21311和tws119。在一些情况下，水溶性合成聚合物包括低于85％水解的聚乙烯醇。在一些情况
下，水溶性合成聚合物包括约80％水解的聚乙烯醇。在一些情况下，组合物还包含sox17阳性细胞。在一些情况下，多能干细胞包括人类干细胞。在一些情况下，多能干细胞包括胚胎干细胞或诱导多能干细胞。
[0016]
在一些情况下，培养基不包含白蛋白。在一些情况下，培养基不包含人类血清白蛋白(hsa)。在一些情况下，培养基不包含血清。
[0017]
在一些方面，本文公开了一种方法，包括使多于一个胰腺β细胞前体细胞在不包含血清或血清白蛋白的培养基中分化。在一些情况下，培养基包含水溶性合成聚合物。在一些方面，本文公开了一种方法，包括使多于一个胰腺β细胞前体细胞在包含水溶性合成聚合物的培养基中分化。在一些情况下，水溶性合成聚合物包括泊洛沙姆、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇(peg)、peg共聚物、聚(n-异丙基丙烯酰胺)或聚丙烯酰胺。在一些情况下，水溶性合成聚合物包括聚乙烯醇。在一些情况下，水溶性合成聚合物以以下的浓度存在于培养基中：约0.005％至约0.5％(w/v)、约0.01％至约0.2％(w/v)、约0.02％至约0.1％(w/v)或约0.03％至约0.08％(w/v)。在一些情况下，水溶性合成聚合物以约0.04％至约0.06％(w/v)的浓度存在于培养基中。在一些情况下，水溶性合成聚合物以约0.05％(w/v)的浓度存在于培养基中。
[0018]
在一些情况下，胰腺β细胞前体细胞包括nkx6.1阳性、isl1阳性细胞。在一些情况下，该方法导致使nkx6.1阳性、isl1阳性细胞分化为胰腺β细胞。在一些情况下，水溶性合成聚合物包括超过85％水解的聚乙烯醇。在一些情况下，水溶性合成聚合物包括约87％至89％水解的聚乙烯醇。在一些情况下，培养基还包含选自由以下组成的组的一种或更多种剂：转化生长因子β(tgf-β)信号传导途径抑制剂、甲状腺激素信号传导途径激活剂、表观遗传修饰化合物、来自表皮生长因子(egf)家族的生长因子、视黄酸(ra)信号传导途径激活剂、音猬(shh)途径抑制剂、γ-分泌酶抑制剂、蛋白激酶抑制剂、rho相关的含卷曲螺旋蛋白激酶(rock)抑制剂和骨形态发生蛋白(bmp)信号传导途径抑制剂。在一些情况下，该方法包括使nkx6.1阳性、isl1阳性细胞与水溶性合成聚合物接触约7天至约14天。
[0019]
在一些情况下，胰腺β细胞前体细胞包括pdx1阳性、nkx6.1阳性细胞。在一些情况下，该方法导致使pdx1阳性、nkx6.1阳性细胞分化为nkx6.1阳性、isl1阳性细胞。在一些情况下，培养基还包含选自由以下组成的组的一种或更多种剂：蛋白激酶c激活剂、tgf-β信号传导途径抑制剂、甲状腺激素信号传导途径激活剂、表观遗传修饰化合物、来自表皮生长因子(egf)家族的生长因子、视黄酸(ra)信号传导途径激活剂、音猬(shh)途径抑制剂、γ-分泌酶抑制剂、蛋白激酶抑制剂、rho相关的含卷曲螺旋蛋白激酶(rock)抑制剂和骨形态发生蛋白(bmp)信号传导途径抑制剂。在一些情况下，培养基还包含：(a)选自由以下组成的组的tgf-β信号传导途径抑制剂：alk5i ii、a83-01、sb431542、d4476、gw788388、ly364947、ly580276、sb505124,gw6604、sb-525334、sd-208和sb-505124；(b)甲状腺激素信号传导途径激活剂，包括t3或gc-l；(c)选自由以下组成的组的表观遗传修饰化合物：3-去氮瓶菌素a(dznep)、gsk126、epz6438、kd5170、mc1568和tmp195；(d)来自表皮生长因子家族的生长因子，包括β细胞素或egf；(e)选自由以下组成的组的视黄酸信号传导途径激活剂：视黄酸、cd1530、am580、tthrb、cd437、ch55、bms961、ac261066、ac55649、am80、bms753、他扎罗汀、阿达帕林和cd2314；(f)选自由以下组成的组的音猬途径抑制剂：sant1、sant2、sant4、cur6l4l4、毛喉素、番茄碱、ay9944、曲帕拉醇和环巴胺；(g)γ-分泌酶抑制剂，包括xxi或
dapt；(h)蛋白激酶抑制剂，包括星形孢菌素、ro-31-8220、双吲哚基马来酰亚胺(bis)化合物、10
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[(甲氧羰基)氨基]-2
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甲基}-苯基氨基羰基星形孢菌素或staralog；(i)选自由以下组成的组的rock抑制剂：thiazovivin、y-27632、法舒地尔/ha1077和14-1152；(j)选自由以下组成的组的蛋白激酶c激活剂：佛波醇12,13-二丁酯(pdbu)、tpb、佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯和苔藓虫素1；和/或(k)骨形态发生蛋白信号传导途径抑制剂，包括ldn193189或dmh-1。在一些情况下，水溶性合成聚合物包括超过85％水解的聚乙烯醇。在一些情况下，水溶性合成聚合物包括约87％至89％水解的聚乙烯醇。在一些情况下，该方法包括使pdx1阳性、nkx6.1阳性细胞与水溶性合成聚合物接触约5天至约10天，或约6天至约9天。在一些情况下，该方法包括使pdx1阳性、nkx6.1阳性细胞与水溶性合成聚合物接触约5天、6天、7天、8天、9天或10天。
[0020]
在一些情况下，胰腺β细胞前体细胞包括pdx1阳性、nkx6.1阴性细胞。在一些情况下，该方法导致使pdx1阳性、nkx6.1阴性细胞分化为pdx1阳性、nkx6.1阳性细胞。在一些情况下，培养基还包含选自由以下组成的组的一种或更多种剂：蛋白激酶c激活剂、来自转化生长因子β(tgf-β)超家族的生长因子、来自成纤维细胞生长因子(fgf)家族的生长因子、视黄酸(ra)信号传导途径激活剂、rho相关的含卷曲螺旋蛋白激酶(rock)抑制剂和音猬(shh)途径抑制剂。在一些情况下，培养基还包含：(a)选自由以下组成的组的来自转化生长因子β(tgf-β)超家族的生长因子：抑制素、激活素、米勒管抑制物质(mis)、骨形态发生蛋白(bmp)、decapentaplegic(dpp)、vg-1、单克隆非特异性抑制因子(mnsf)、生长分化因子8(gdf8)和生长分化因子11(gdf11)；(b)选自由以下组成的组的来自成纤维细胞生长因子(fgf)家族的生长因子：角质形成细胞生长因子(kgf)、fgf2、fgf10、fgf21和fgf8b；(c)选自由以下组成的组的视黄酸(ra)信号传导途径激活剂：视黄酸、cd1530、am580、tthrb、cd437、ch55、bms961、ac261066、ac55649、am80、bms753、他扎罗汀、阿达帕林和cd2314；(d)选自由以下组成的组的rock抑制剂：thiazovivin、y-27632、法舒地尔/ha1077和14-1152；(e)选自由以下组成的组的蛋白激酶c激活剂：佛波醇12,13-二丁酯(pdbu)、tpb、佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯和苔藓虫素1；和/或(f)选自由以下组成的组的音猬(shh)途径抑制剂：sant1、sant2、sant4、cur6l4l4、毛喉素、番茄碱、ay9944、曲帕拉醇和环巴胺。在一些情况下，水溶性合成聚合物包括低于85％水解的聚乙烯醇。在一些情况下，水溶性合成聚合物包括约80％水解的聚乙烯醇。在一些情况下，该方法包括使pdx1阳性、nkx6.1阴性细胞与水溶性合成聚合物接触4天至8天或5天至7天。在一些情况下，该方法包括使pdx1阳性、nkx6.1阴性细胞与水溶性合成聚合物接触约4天、5天、6天、7天或8天。
[0021]
在一些情况下，胰腺β细胞前体细胞包括多于一个foxa2阳性细胞。在一些情况下，该方法导致使foxa2阳性细胞分化为pdx1阳性、nkx6.1阴性细胞。在一些情况下，培养基还包含选自由以下组成的组的一种或更多种剂：蛋白激酶c激活剂、来自转化生长因子β(tgf-β)超家族的生长因子、骨形态发生蛋白信号传导途径抑制剂、来自成纤维细胞生长因子(fgf)家族的生长因子、视黄酸(ra)信号传导途径激活剂、rho相关的含卷曲螺旋蛋白激酶(rock)抑制剂和音猬(shh)途径抑制剂。在一些情况下，培养基还包含：(a)选自由以下组成的组的蛋白激酶c激活剂：佛波醇12,13-二丁酯(pdbu)、tpb、佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯和苔藓虫素1；(b)选自由以下组成的组的来自转化生长因子β(tgf-β)超家族的生长因子：抑制素、激活素、米勒管抑制物质(mis)、骨形态发生蛋白(bmp)、decapentaplegic
(dpp)、vg-1、单克隆非特异性抑制因子(mnsf)、生长分化因子8(gdf8)和生长分化因子11(gdf11)；(c)骨形态发生蛋白信号传导途径抑制剂，包括ldn193189或dmh-1；(d)选自由以下组成的组的来自成纤维细胞生长因子(fgf)家族的生长因子：角质形成细胞生长因子(kgf)、fgf2、fgf10、fgf21和fgf8b；(e)选自由以下组成的组的音猬途径抑制剂：sant1、sant2、sant4、cur6l4l4、毛喉素、番茄碱、ay9944、曲帕拉醇和环巴胺；(f)选自由以下组成的组的视黄酸信号传导途径激活剂：视黄酸、cd1530、am580、tthrb、cd437、ch55、bms961、ac261066、ac55649、am80、bms753、他扎罗汀、阿达帕林和cd2314；和/或(g)选自由以下组成的组的rock抑制剂：thiazovivin、y-27632、法舒地尔/ha1077和14-1152。在一些情况下，水溶性合成聚合物包括低于85％水解的聚乙烯醇。在一些情况下，水溶性合成聚合物包括约80％水解的聚乙烯醇。在一些情况下，该方法包括使foxa2阳性细胞与水溶性合成聚合物接触1天至3天。在一些情况下，该方法包括使foxa2阳性细胞与水溶性合成聚合物接触约1天、2天或3天。
[0022]
在一些情况下，胰腺β细胞前体细胞包括sox17阳性细胞。在一些情况下，该方法导致使sox17阳性细胞分化为foxa2阳性细胞。在一些情况下，培养基还包含来自成纤维细胞生长因子(fgf)家族的生长因子。在一些情况下，来自成纤维细胞生长因子(fgf)家族的生长因子选自由以下组成的组：角质形成细胞生长因子(kgf)、fgf2、fgf10、fgf21和fgf8b。在一些情况下，水溶性合成聚合物包括低于85％水解的聚乙烯醇。在一些情况下，水溶性合成聚合物包括约80％水解的聚乙烯醇。在一些情况下，该方法包括使sox17阳性细胞与水溶性合成聚合物接触1天至5天或2天至4天。在一些情况下，该方法包括使sox17阳性细胞与水溶性合成聚合物接触约1天、2天、3天、4天或5天。
[0023]
在一些情况下，胰腺β细胞前体细胞包括干细胞。在一些情况下，该方法导致使干细胞分化为sox17阳性细胞。在一些情况下，干细胞包括人类干细胞。在一些情况下，干细胞包括胚胎干细胞或诱导多能干细胞。在一些情况下，培养基还包含来自转化生长因子β(tgf-β)超家族的生长因子、wnt信号传导途径激活剂或两者。在一些情况下，培养基还包含：(a)选自由以下组成的组的来自转化生长因子β(tgf-β)超家族的生长因子：抑制素、激活素、米勒管抑制物质(mis)、骨形态发生蛋白(bmp)、decapentaplegic(dpp)、vg-1、单克隆非特异性抑制因子(mnsf)、生长分化因子8(gdf8)和生长分化因子11(gdf11)；和/或(b)选自由以下组成的组的wnt信号传导途径激活剂：chir99021、3f8、a 1070722、ar-a 014418、bio、bio-丙酮肟、fratide、10z-hymenialdisine、靛玉红-3’肟、kenpaullone、l803、l803-mts、碳酸锂、nsc 693868、sb 216763、sb 415286、tc-g 24、tcs2002、tcs21311和tws119。在一些情况下，水溶性合成聚合物包括低于85％水解的聚乙烯醇。在一些情况下，水溶性合成聚合物包括约80％水解的聚乙烯醇。在一些情况下，该方法包括使干细胞与水溶性合成聚合物接触1天至5天或2天至4天。在一些情况下，该方法包括使干细胞与水溶性合成聚合物接触约1天、2天、3天、4天或5天。
[0024]
在一些情况下，培养基不包含白蛋白。在一些情况下，培养基不包含人类血清白蛋白(hsa)。在一些情况下，培养基不包含血清。
[0025]
在一些方面，本文公开了一种方法，该方法包括：(i)使多于一个pdx1阳性、nkx6.1阴性胰腺祖细胞或其前体细胞在包含低于85％水解的聚乙烯醇的培养基中分化，从而产生多于一个pdx1阳性、nkx6.1阳性胰腺祖细胞；以及(ii)将多于一个pdx1阳性、nkx6.1阳性胰
腺祖细胞在包含超过85％水解的聚乙烯醇的组合物中培养。
[0026]
在一些情况下，低于85％水解的聚乙烯醇是约80％水解的。在一些情况下，超过85％水解的聚乙烯醇是约87％至约89％水解的。在一些情况下，培养导致使多于一个pdx1阳性、nkx6.1阳性胰腺祖细胞分化为nkx6.1阳性、isl1阳性内分泌细胞。在一些情况下，培养导致使多于一个pdx1阳性、nkx6.1阳性胰腺祖细胞分化为胰腺β细胞。在一些情况下，培养导致使多于一个pdx1阳性、nkx6.1阳性胰腺祖细胞分化为nkx6.1阳性、isl1阳性内分泌细胞，并且其中该方法还包括将nkx6.1阳性、isl1阳性内分泌细胞在包含血清或血清白蛋白的培养基中培养。在一些情况下，培养导致使多于一个pdx1阳性、nkx6.1阳性胰腺祖细胞分化为nkx6.1阳性、isl1阳性内分泌细胞，并且其中该方法还包括将nkx6.1阳性、isl1阳性内分泌细胞在不包含聚乙烯醇的培养基中培养。在一些情况下，该方法包括将nkx6.1阳性、isl1阳性内分泌细胞在包含人类血清白蛋白的培养基中培养，任选地，其中培养基中人类血清白蛋白的浓度是约0.01％至约0.5％、约0.05％至约0.2％、约0.08％至约0.12％，任选地，其中培养基中人类血清白蛋白的浓度是约0.1％。在一些情况下，包含超过85％水解的聚乙烯醇的组合物还包含选自由以下组成的组的一种或更多种剂：蛋白激酶c激活剂、来自转化生长因子β(tgf-β)超家族的生长因子、骨形态发生蛋白信号传导途径抑制剂、来自成纤维细胞生长因子(fgf)家族的生长因子、视黄酸(ra)信号传导途径激活剂、rho相关的含卷曲螺旋蛋白激酶(rock)抑制剂和音猬(shh)途径抑制剂。
[0027]
在一些情况下，包含超过85％水解的聚乙烯醇的组合物还包含：(a)选自由以下组成的组的蛋白激酶c激活剂：佛波醇12,13-二丁酯(pdbu)、tpb、佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯和苔藓虫素1；(b)选自由以下组成的组的来自转化生长因子β(tgf-β)超家族的生长因子：抑制素、激活素、米勒管抑制物质(mis)、骨形态发生蛋白(bmp)、decapentaplegic(dpp)、vg-1、单克隆非特异性抑制因子(mnsf)、生长分化因子8(gdf8)和生长分化因子11(gdf11)；(c)骨形态发生蛋白信号传导途径抑制剂，包括ldn193189或dmh-1；(d)选自由以下组成的组的来自成纤维细胞生长因子(fgf)家族的生长因子：角质形成细胞生长因子(kgf)、fgf2、fgf10、fgf21和fgf8b；(e)选自由以下组成的组的音猬途径抑制剂：sant1、sant2、sant4、cur6l4l4、毛喉素、番茄碱、ay9944、曲帕拉醇和环巴胺；(f)选自由以下组成的组的视黄酸信号传导途径激活剂：视黄酸、cd1530、am580、tthrb、cd437、ch55、bms961、ac261066、ac55649、am80、bms753、他扎罗汀、阿达帕林和cd2314；和/或(g)选自由以下组成的组的rock抑制剂：thiazovivin、y-27632、法舒地尔/ha1077和14-1152。
[0028]
在一些方面，本文公开了一种体外组合物，该体外组合物包含多于一个pdx1阳性、nkx6.1阳性细胞、烟酰胺和来自表皮生长因子(egf)家族的生长因子。
[0029]
在一些情况下，来自egf家族的生长因子包括egf。在一些情况下，组合物包含约1ng/ml至约100ng/ml、约2ng/ml至约50ng/ml、约5ng/ml至约20ng/ml或约7.5ng/ml至约15ng/ml egf。在一些情况下，组合物包含约10ng/ml egf。在一些情况下，组合物不包含β细胞素。在一些情况下，组合物包含约1mm至约100mm、约2mm至约50mm、约5mm至约20mm或约7.5mm至约15mm烟酰胺。在一些情况下，组合物包含约10mm烟酰胺。在一些情况下，组合物还包含选自由以下组成的组的一种或更多种剂：蛋白激酶c激活剂、tgf-β信号传导途径抑制剂、甲状腺激素信号传导途径激活剂、表观遗传修饰化合物、视黄酸(ra)信号传导途径激活剂、音猬(shh)途径抑制剂、γ-分泌酶抑制剂、蛋白激酶抑制剂、rho相关的含卷曲螺旋蛋白
激酶(rock)抑制剂和骨形态发生蛋白(bmp)信号传导途径抑制剂。在一些情况下，组合物还包含：(a)选自由以下组成的组的tgf-β信号传导途径抑制剂：alk5i ii、a83-01、sb431542、d4476、gw788388、ly364947、ly580276、sb505124,gw6604、sb-525334、sd-208和sb-505124；(b)甲状腺激素信号传导途径激活剂，包括t3或gc-l；(c)选自由以下组成的组的表观遗传修饰化合物：3-去氮瓶菌素a(dznep)、gsk126、epz6438、kd5170、mc1568和tmp195；(d)选自由以下组成的组的视黄酸信号传导途径激活剂：视黄酸、cd1530、am580、tthrb、cd437、ch55、bms961、ac261066、ac55649、am80、bms753、他扎罗汀、阿达帕林和cd2314；(e)选自由以下组成的组的音猬途径抑制剂：sant1、sant2、sant4、cur6l4l4、毛喉素、番茄碱、ay9944、曲帕拉醇和环巴胺；(f)γ-分泌酶抑制剂，包括xxi或dapt；(g)蛋白激酶抑制剂，包括星形孢菌素、ro-31-8220、双吲哚基马来酰亚胺(bis)化合物、10
′‑
{5
″‑
[(甲氧羰基)氨基]-2
″‑
甲基}-苯基氨基羰基星形孢菌素或staralog；(h)选自由以下组成的组的rock抑制剂：thiazovivin、y-27632、法舒地尔/ha1077和14-1152；(i)选自由以下组成的组的蛋白激酶c激活剂：佛波醇12,13-二丁酯(pdbu)、tpb、佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯和苔藓虫素1；和/或(j)骨形态发生蛋白信号传导途径抑制剂，包括ldn193189或dmh-1。
[0030]
在一些方面，本文公开了一种方法，包括使多于一个pdx1阳性、nkx6.1阳性细胞与包含烟酰胺和来自表皮生长因子(egf)家族的生长因子的组合物接触。在一些情况下，来自egf家族的生长因子包括egf。在一些情况下，组合物包含约1ng/ml至约100ng/ml、约2ng/ml至约50ng/ml、约5ng/ml至约20ng/ml或约7.5ng/ml至约15ng/ml egf。在一些情况下，组合物包含约10ng/ml egf。在一些情况下，组合物不包含β细胞素。在一些情况下，组合物包含约1mm至约100mm、约2mm至约50mm、约5mm至约20mm或约7.5mm至约15mm烟酰胺。在一些情况下，组合物包含约10mm烟酰胺。在一些情况下，组合物还包含选自由以下组成的组的一种或更多种剂：蛋白激酶c激活剂、tgf-β信号传导途径抑制剂、甲状腺激素信号传导途径激活剂、表观遗传修饰化合物、视黄酸(ra)信号传导途径激活剂、音猬(shh)途径抑制剂、γ-分泌酶抑制剂、蛋白激酶抑制剂、rho相关的含卷曲螺旋蛋白激酶(rock)抑制剂和骨形态发生蛋白(bmp)信号传导途径抑制剂。在一些情况下，组合物还包含：(a)选自由以下组成的组的tgf-β信号传导途径抑制剂：alk5i ii、a83-01、sb431542、d4476、gw788388、ly364947、ly580276、sb505124,gw6604、sb-525334、sd-208和sb-505124；(b)甲状腺激素信号传导途径激活剂，包括t3或gc-l；(c)选自由以下组成的组的表观遗传修饰化合物：3-去氮瓶菌素a(dznep)、gsk126、epz6438、kd5170、mc1568和tmp195；(d)选自由以下组成的组的视黄酸信号传导途径激活剂：视黄酸、cd1530、am580、tthrb、cd437、ch55、bms961、ac261066、ac55649、am80、bms753、他扎罗汀、阿达帕林和cd2314；(e)选自由以下组成的组的音猬途径抑制剂：sant1、sant2、sant4、cur6l4l4、毛喉素、番茄碱、ay9944、曲帕拉醇和环巴胺；(f)γ-分泌酶抑制剂，包括xxi或dapt；(g)蛋白激酶抑制剂，包括星形孢菌素、ro-31-8220、双吲哚基马来酰亚胺(bis)化合物、10
′‑
{5
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[(甲氧羰基)氨基]-2
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甲基}-苯基氨基羰基星形孢菌素或staralog；(h)选自由以下组成的组的rock抑制剂：thiazovivin、y-27632、法舒地尔/ha1077和14-1152；(i)选自由以下组成的组的蛋白激酶c激活剂：佛波醇12,13-二丁酯(pdbu)、tpb、佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯和苔藓虫素1；和/或(j)骨形态发生蛋白信号传导途径抑制剂，包括ldn193189或dmh-1。在一些情况下，接触发生约1天至约3天。在一些情况下，接触发生约1天、2天或3天。在一些情况下，该方法包括：在接触约1天至约3天后，
从多于一个pdx1阳性、nkx6.1阳性细胞中去除烟酰胺和来自egf家族的生长因子；并且在去除后，使多于一个pdx1阳性、nkx6.1阳性细胞与不包含烟酰胺或来自egf家族的生长因子的组合物接触。在一些情况下，该方法导致使多于一个pdx1阳性、nkx6.1阳性细胞分化为nkx6.1阳性、isl1阳性细胞。
[0031]
在一些方面，本文公开了一种装置，该装置包含本文公开的组合物或细胞。
[0032]
在一些情况下，该装置被配置为在植入受试者中时产生和释放胰岛素。在一些情况下，细胞被包封。在一些情况下，该装置还包含半透膜，其中该半透膜被配置为将细胞保留在该装置中并且允许胰岛素通过。
[0033]
在一些方面，本文公开了一种治疗患有以在长时间段内的高血糖水平为特征的疾病的受试者的方法，该方法包括向受试者施用本文公开的组合物或细胞，或植入本文公开的装置。在一些情况下，疾病是糖尿病。
[0034]
附图简述
[0035]
本公开内容的特征在所附权利要求中具体阐述。通过参考以下对利用本公开内容原理的说明性实施方案加以阐述的详细描述以及附图，将会获得对本发明的特征和优点的更好理解，并且在这些附图中：
[0036]
图1a-图1c示出了显示在一个实验中观察到的在胰腺内分泌细胞从干细胞分化的期间聚乙烯醇(pva)对细胞产量(图1a)、细胞簇的形成(图1b)和细胞成分(在第4阶段的pdx1阳性、nkx6.1阳性细胞的百分比)的影响的点图和图。利用6个阶段的分步方案作为用于分化的基础方案，并且贯穿阶段1至阶段4，使用不同的pva材料，87％-89％ pva、87％-90％ pva和99％ pva，代替人类血清白蛋白作为培养基的补充剂。发现87％-89％ pva增强细胞产量(图1a)并且增加在阶段4的pdx1阳性、nkx6.1阳性细胞的百分比(图1c)。
[0037]
图2a-图2c示出了显示在另一个实验中观察到的在胰腺内分泌细胞从干细胞分化的期间聚乙烯醇(pva)对细胞产量(图2a)和细胞成分(在第4阶段的pdx1阳性、nkx6.1阳性细胞的百分比，图2b，和在第5阶段的nkx6.1阳性、isl1阳性细胞的百分比，图2c)的影响的点图和图。利用6个阶段的分步方案作为用于分化的基础方案，并且不同的pva材料，80％pva和87％
–
89％ pva，用于贯穿第1阶段至第5阶段代替人类血清白蛋白作为培养基的补充剂，或用于补充hsa(“89pva+hsa”)。发现与hsa对照相比，直到第4阶段，80％ pva增强细胞产量并且增加pdx1阳性、nkx6.1阳性细胞的百分比(图2b)，但在第5阶段减少细胞产量和nkx6.1阳性、isl1阳性细胞的百分比(图2c)。
[0038]
图3是用于体外胰腺细胞分化的5种不同pva补充范例的示意图。
[0039]
图4a-图4b示出了显示5种不同pva补充范例对细胞产量(图4a)和细胞成分(在第5阶段的nkx6.1阳性、isl1阳性细胞的百分比，图4b)的影响的点图。发现与对照hsa范例相比，所有pva补充范例显示出更一致的细胞产量(图4a)。还发现，在第5阶段从80％ pva转换至87％-89％ pva逆转了在所有80％ pva范例中观察到的在第5阶段的nkx6.1阳性、isl1阳性细胞的百分比的减少(图4b)。
[0040]
图5a是显示与包含β细胞素(对照)的基础分化方案相比，在第5阶段用烟酰胺和egf代替β细胞素导致相似的总细胞产量和β细胞产量的点图。图5b示出了流式细胞术结果，其显示与β细胞素处理相比，烟酰胺和egf处理得到的nkx6.1阳性、isl1阳性细胞的百分比更高。
[0041]
图6示出了总结在第5阶段用烟酰胺和egf代替β细胞素对第6阶段的回收率和总sc-β细胞产量的影响的点图。发现两种分化条件产生相似的回收率和总sc-β细胞产量。
[0042]
详述
[0043]
以下描述和实例详细阐述了本公开内容的实施方案。应当理解，本公开内容不限于本文描述的特定实施方案，并且因此可以变化。本领域技术人员将意识到，本公开内容存在许多变化和修改，这些变化和修改均涵盖在本发明的范围内。
[0044]
所有术语旨在被理解为本领域技术人员将理解的。除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语均具有与本公开内容所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同的含义。
[0045]
本文使用的章节标题仅用于组织的目的，不应当解释为限制所描述的主题。
[0046]
尽管可以在单一实施方案的上下文中描述本公开内容的各种特征，但是这些特征也可以单独提供或以任何合适的组合提供。相反，尽管为了清楚起见，本文可以在分开的实施方案的上下文中描述本公开内容，但是本公开内容也可以在单一实施方案中实现。
[0047]
以下定义是对本领域定义的补充，并且针对于本技术，且不应归于任何相关或不相关的情况，例如，不应归于任何共同拥有的专利或申请。本文描述了优选的材料和方法，但是任何与本文描述的那些相似或等同的方法和材料也可用于实践以测试本公开内容。因此，本文使用的术语仅仅是为了描述特定实施方案的目的，而并非旨在限制。
[0048]
在本技术中，除非另有特别说明，否则单数的使用包括复数。应当注意，如在说明书中所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式“一(a)”、“一(an)”和“该(the)”包括复数指示物。
[0049]
在本技术中，除非另有说明，否则“或”的使用意指“和/或”。本文所使用的术语“和/或”和“其任何组合”及其语法等同形式可互换使用。这些术语可表示任何组合都是特别考虑的。仅出于说明性目的，以下措辞“a、b和/或c”或“a、b、c或其任何组合”可意指“单独的a；单独的b；单独的c；a和b；b和c；a和c；以及a、b和c”。术语“或”可结合使用或分别使用，除非上下文明确地指示分别使用。
[0050]
此外，术语“包括(including)”及其他形式(诸如“包括(include)”、“包括(includes)”和“包括(included)”)的使用是非限制性的。
[0051]
说明书中提及的“一些实施方案”、“实施方案”、“一种实施方案”或“其他实施方案”意指结合实施方案描述的特定特征、结构或特性包括在本公开内容的至少一些实施方案中，但不一定包含在所有实施方案中。
[0052]
如在本说明书和权利要求中所使用的，词语“包含(comprising)”(和其任何形式，诸如“包含(comprise)”和“包含(comprises)”)、“具有(having)”(和其任何形式，诸如“具有(have)”和“具有(has)”)、“包括(including)”(和其任何形式，诸如“包括(includes)”和“包括(include)”)或“含有(containing)”(和其任何形式，诸如“含有(contains)”和“含有(contain)”)都是包含性或开放性的，并且不排除另外的、未提及的要素或方法步骤。设想的是本说明书中讨论的任何实施方案可以对于本公开内容的任何方法或组合物实施，反之亦然。此外，本公开内容的组合物可用于实现本公开内容的方法。
[0053]
如本文使用的，涉及参考数值的术语“约”及其语法等同物可包括该数值自身和该数值加或减10％的值的范围。
[0054]
术语“约(about)”或“大约(approximately)”意指在本领域普通技术人员确定的特定值的可接受误差范围内，这将部分地取决于如何测量或确定该值，例如，测量系统的局限性。例如，根据本领域的实践，“约”可以意指在1个标准差内或者大于1个标准差。可选地，“约”可以意指给定值的至多20％、至多10％、至多5％或至多1％的范围。在另一实例中，量“约10”包括10和从9到11的任何量。在又一实例中，关于参考数值的术语“约”还可包括该数值加或减10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的值的范围。可选地，特别是对于生物系统或过程而言，术语“约”可以意指在值的一个数量级以内，优选在值的5倍以内，并且更优选在值的2倍以内。在本技术和权利要求书中描述了特定值的情况下，除非另有说明，否则应当假定术语“约”意指在该特定值的可接受误差范围内。
[0055]
如本文使用的，术语“糖尿病”及其语法等同物可以指以在长时间段内的高血糖水平为特征的疾病。例如，如本文使用的，术语“糖尿病”及其语法等同物可以指糖尿病的所有或任何类型，包括但不限于，1型糖尿病、2型糖尿病、囊性纤维化相关糖尿病、外科手术性糖尿病、妊娠糖尿病和线粒体糖尿病。在一些情况下，糖尿病可以是遗传性糖尿病的形式。
[0056]
如果没有特别说明，术语“内分泌细胞”可以指存在于生物体胰腺中的激素产生细胞，诸如“胰岛(islet)”、“胰岛细胞”、“胰岛等同物”、“胰岛样细胞”、“胰岛(pancreatic islet)”及其语法等同物。在实施方案中，可以将内分泌细胞与胰腺祖细胞或前体区分。胰岛细胞可以包括不同类型的细胞，包括但不限于，胰腺α细胞、胰腺β细胞、胰腺δ细胞、胰腺f细胞和/或胰腺ε细胞。胰岛细胞还可以指一组细胞、细胞簇等。
[0057]
术语“祖细胞”和“前体”细胞在本文中可互换使用，并且指相对于可以通过分化产生的细胞具有更原始的细胞表型的细胞(例如，与完全分化的细胞相比，其处于发育途径或进展的较早步骤)。通常，祖细胞也可以具有显著的或非常高的增殖潜力。祖细胞可以产生多于一个不同的分化细胞类型或单一分化的细胞类型，这取决于发育途径和细胞在其中发育和分化的环境。
[0058]
与胰岛素阳性内分泌细胞相关的术语“其前体”可以指当在适合于使前体细胞分化为胰岛素阳性内分泌细胞的条件下培养时能够分化为胰岛素阳性内分泌细胞的任何细胞，包括例如多能(pluripotent)干细胞、定形内胚层细胞、原始肠管细胞、胰腺祖细胞或内分泌祖细胞。
[0059]
术语“干细胞衍生的β细胞”、“sc-β细胞”、“功能性β细胞”、“功能性胰腺β细胞”、“成熟sc-β细胞”及其语法等同物可以指显示至少一种指示胰腺β细胞的标志物(例如，pdx-1或nkx6.1)、表达胰岛素并显示内源性成熟β细胞的葡萄糖刺激的胰岛素分泌(gsis)反应特性的细胞(例如，非天然胰腺β细胞)。在一些实施方案中，本文使用的术语“sc-β细胞”和“非天然β细胞”是可互换的。在一些实施方案中，“sc-β细胞”包括成熟的胰腺细胞。应当理解，sc-β细胞不需要衍生自干细胞(例如，直接地)，因为本公开内容的方法能够使用任何细胞作为起点(例如，可以使用胚胎干细胞、诱导多能干细胞、祖细胞、部分重编程的体细胞(例如，已被部分重编程为诱导多能干细胞与其衍生自的体细胞之间的中间状态的体细胞)、多潜能细胞(multipotent cells)、全能细胞、任何前述细胞的转分化形式，等等，因此本发明并非旨在以这种方式进行限制)从任何胰岛素阳性内分泌细胞或其前体衍生出sc-β细胞。在一些实施方案中，sc-β细胞表现出对多于一次葡萄糖刺激(例如，至少一次、至少两次或至少三次或更多次顺序的葡萄糖刺激)的反应，例如在体外。在一些实施方案中，该反
应类似于内源性胰岛(例如，人类胰岛)对多于一次葡萄糖刺激的反应。在一些实施方案中，sc-β细胞的形态类似于内源性β细胞的形态。在一些实施方案中，sc-β细胞表现出类似于内源性β细胞的gsis反应的体外gsis反应。在一些实施方案中，sc-β细胞表现出类似于内源性β细胞的gsis反应的体内gsis反应。在一些实施方案中，sc-β细胞表现出类似于内源性β细胞的gsis反应的体外gsis反应和体内gsis反应。可以在将sc-β细胞移植到宿主(例如，人类或动物)的两周内观察到sc-β细胞的gsis反应。在一些实施方案中，sc-β细胞将胰岛素包封在分泌颗粒内。在一些实施方案中，sc-β细胞表现出包封的结晶胰岛素颗粒。在一些实施方案中，sc-β细胞表现出大于1的刺激指数。在一些实施方案中，sc-β细胞表现出大于1.1的刺激指数。在一些实施方案中，sc-β细胞表现出大于2的刺激指数。在一些实施方案中，sc-β细胞响应于细胞因子表现出细胞因子诱导的凋亡。在一些实施方案中，sc-β细胞的胰岛素分泌响应于已知的抗糖尿病药物(例如，促分泌素)而增强。在一些实施方案中，sc-β细胞是单激素的。在一些实施方案中，sc-β细胞不异常地共表达其他激素，诸如胰高血糖素、促生长素抑制素或胰腺多肽。在一些实施方案中，sc-β细胞表现出低复制速率。在一些实施方案中，sc-β细胞响应于葡萄糖而增加细胞内ca2+。
[0060]
术语“干细胞衍生的α细胞”、“sc-α细胞”、“功能性α细胞”、“功能性胰腺α细胞”、“成熟sc-α细胞”及其语法等同物可以指显示至少一种指示胰腺α细胞的标志物(例如，胰高血糖素，表达isl1但不表达nkx6.1)、表达胰高血糖素，并分泌功能性胰高血糖素的细胞(例如，非天然胰腺α细胞)。在一些实施方案中，“sc-α细胞”不表达促生长素抑制素。在一些实施方案中，“sc-α细胞”不表达胰岛素。在一些实施方案中，本文使用的术语“sc-α细胞”和“非天然α细胞”是可互换的。在一些实施方案中，“sc-α细胞”包括成熟的胰腺细胞。
[0061]
术语“干细胞衍生的δ细胞”、“sc-δ细胞”、“功能性δ细胞”、“功能性胰腺δ细胞”、“成熟sc-δ细胞”及其语法等同物可以指显示至少一种指示胰腺δ细胞的标志物(例如，促生长素抑制素)、表达和分泌促生长素抑制素的细胞(例如，非天然胰腺δ细胞)。在一些实施方案中，“sc-δ细胞”不表达胰高血糖素。在一些实施方案中，“sc-δ细胞”不表达胰岛素。在一些实施方案中，本文使用的术语“sc-δ细胞”和“非天然δ细胞”是可互换的。在一些实施方案中，“sc-δ细胞”包括成熟的胰腺细胞。
[0062]
术语“干细胞衍生的肠嗜铬(ec)细胞”、“sc-ec细胞”及其语法等同物可以指显示至少一种指示胰腺ec细胞的标志物(例如，vmat1(囊泡单胺转运蛋白体1(vesicular monoamine transporter 1))、表达nkx6.1但不表达isl1)的细胞(例如，非天然胰腺ec细胞)。在一些实施方案中，本文使用的术语“sc-ec细胞”和“非天然ec细胞”是可互换的。
[0063]
与sc-β细胞类似，应当理解sc-α、sc-δ细胞和sc-ec细胞不需要衍生自干细胞(例如，直接地)，因为本公开内容的方法能够从以sc-β细胞为起点的体外分化期间产生的其他前体细胞衍生sc-α细胞(例如，可以使用胚胎干细胞、诱导多能干细胞、祖细胞、部分重编程的体细胞(例如，已被部分重编程为诱导多能干细胞与其衍生自的体细胞之间的中间状态的体细胞)、多潜能细胞、全能细胞、任何前述细胞的转分化形式，等等，因此本发明并非旨在以这种方式进行限制)。
[0064]
如本文使用的，术语“胰岛素产生细胞”及其语法等同物指从分泌胰岛素的胰腺祖细胞或其前体分化的细胞。胰岛素产生细胞可以包括如本文描述的术语胰腺β细胞，以及以组成型或诱导型方式合成(例如，转录胰岛素基因、翻译胰岛素原mrna和将胰岛素原mrna修
饰为胰岛素蛋白)、表达(例如，表现出胰岛素基因携带的表型性状)或分泌(将胰岛素释放到细胞外间隙中)胰岛素的胰腺β样细胞。胰岛素产生细胞群体，例如根据本公开内容的方法通过使胰岛素阳性内分泌细胞或其前体分化为sc-β细胞而产生的胰岛素产生细胞群体可以是胰腺β细胞或β样细胞(例如，具有内源性β细胞的至少一种或至少两种特征并且表现出类似于内源性成体β细胞的葡萄糖刺激的胰岛素分泌(glucose stimulated insulin secretion，gsis)反应的细胞)。通过例如本文公开的方法产生的胰岛素产生细胞群体可以包含成熟胰腺β细胞或sc-β细胞，并且还可以包含非胰岛素产生细胞(例如，具有细胞样表型的细胞，但它们不产生或分泌胰岛素)。
[0065]
术语“胰岛素阳性β样细胞”、“胰岛素阳性内分泌细胞”及其语法等同物可以指显示至少一种指示胰腺β细胞的标志物并且也表达胰岛素，但缺乏内源性β细胞的葡萄糖刺激的胰岛素分泌(gsis)反应特性的细胞(例如，胰腺内分泌细胞)。“胰岛素阳性内分泌细胞”的示例性标志物包括但不限于nkx6.1、isl1和胰岛素。在一些情况下，术语“胰岛素阳性内分泌细胞”和“nkx6.1阳性、isl1阳性细胞”可以互换使用。
[0066]
术语“β细胞标志物”是指但不限于在胰腺β细胞中特异性地表达或存在的蛋白质、肽、核酸、蛋白质和核酸的多态性、剪接变体、蛋白质或核酸的片段、元件和其他分析物。示例性的β细胞标志物包括但不限于胰腺和十二指肠同源框1(pdx1)多肽、胰岛素、c肽、胰淀素(amylin)、e-钙黏着蛋白、hnf3β、pci/3、b2、nkx2.2、glut2、pc2、znt-8、isl1、pax6、pax4、neurod、1inf1b、hnf-6、hnf-3β和mafa，以及在zhang等人，diabetes.50(10):2231-6(2001)中描述的那些。在一些实施方案中，β细胞标志物是细胞核β细胞标志物。在一些实施方案中，β细胞标志物是pdx1或ph3。
[0067]
术语“胰腺内分泌标志物”可以指但不限于在胰腺内分泌细胞中特异性表达或存在的蛋白质、肽、核酸、蛋白质和核酸的多态性、剪接变体、蛋白质或核酸的片段、元件和其他分析物。示例性的胰腺内分泌细胞标志物包括但不限于ngn-3、neurod和islet-1。
[0068]
术语“胰腺祖细胞”、“胰腺内分泌祖细胞”、“胰腺前体”、“胰腺内分泌前体”及其语法等同物在本文中可互换使用，并且可以指能够成为能够形成胰腺内分泌细胞、胰腺外分泌细胞或胰管细胞的胰腺激素表达细胞的干细胞。这些细胞定型于分化为至少一种类型的胰腺细胞，例如产生胰岛素的β细胞；产生胰高血糖素的α细胞；产生促生长素抑制素的δ细胞(或d细胞)；和/或产生胰腺多肽的f细胞。这样的细胞可以表达以下标志物中的至少一种：ngn3、nkx2.2、neurod、isl1、pax4、pax6或arx。
[0069]
如本文使用的，术语“pdx1阳性胰腺祖细胞”可以指这样的细胞，其为具有分化为sc-β细胞(诸如胰腺β细胞)的能力的胰腺内胚层(pe)细胞。pdx1阳性胰腺祖细胞表达标志物pdx1。其他标志物包括但不限于cdcp1或ptf1a或hnf6或nrx2.2。可以通过技术人员已知的任何方法，诸如使用抗pdx1抗体的免疫化学或定量rt-pcr来评估pdx1的表达。在一些情况下，pdx1阳性胰腺祖细胞缺乏nkx6.1的表达。在一些情况下，由于pdx1阳性胰腺祖细胞缺乏nkx6.1的表达，因此也可以称为pdx1阳性、nkx6.1阴性胰腺祖细胞。在一些情况下，pdx1阳性胰腺祖细胞也可以称为“胰腺前肠内胚层细胞”。
[0070]
术语“pdx1阳性、nkx6.1阳性胰腺祖细胞”和“nkx6.1阳性胰腺祖细胞”在本文中可以互换使用，并且可以指这样的细胞，其为具有分化为胰岛素产生细胞(诸如胰腺β细胞)的能力的胰腺内胚层(pe)细胞。pdx1阳性、nkx6.1阳性胰腺祖细胞表达标志物pdx1和nkx6-1。
其他标志物包括但不限于cdcp1或ptf1a或hnf6或nrx2.2。可以通过技术人员已知的任何方法，诸如使用抗nkx6-1抗体的免疫化学或定量rt-pcr来评估nkx6-1的表达。如本文使用的，术语“nkx6.1”和“nkx6-1”是等同的并且可互换。在一些情况下，pdx1阳性、nkx6.1阳性胰腺祖细胞也可以称为“胰腺前肠前体细胞”。
[0071]
术语“neurod”和“neurod1”可互换使用并标识在胰腺内分泌祖细胞中表达的蛋白质以及编码该蛋白质的基因。
[0072]
术语“表观遗传学”是指不涉及dna序列改变的基因功能的可遗传改变。表观遗传学最常表示影响基因活性和表达的染色体变化，但也可用于描述并非源自基因组修饰的任何可遗传表型变化。这样的对细胞和生理表型性状的影响可能是由外部或环境因素引起的，或者是正常发育程序的一部分。表观遗传学也可以指基因组在功能上的相关改变，而不涉及核苷酸序列的改变。产生这样的变化的机制的实例是dna甲基化和组蛋白修饰，每一种都改变基因的表达方式而不会改变基础的dna序列。基因表达可通过附着于dna沉默区的阻遏蛋白的作用来控制。这些表观遗传变化可通过细胞分裂持续到细胞生命的整个过程，并且也可持续多于一代，即使它们不涉及生物体基础dna序列的变化。真核生物学中表观遗传学变化的一个实例是细胞分化过程。在形态发生过程中，全能干细胞变成各种多能细胞，继而又可以变成完全分化的细胞。
[0073]
术语“表观遗传修饰化合物”是指可以使基因表观遗传改变(即改变基因表达而不改变dna序列)的化合物。表观遗传学变化可以帮助确定基因是开启还是关闭，并可以影响某些细胞(例如β细胞)中蛋白质的产生。表观遗传修饰(诸如dna甲基化和组蛋白修饰)改变dna的可及性和染色质结构，从而调节基因表达的模式。这些过程对于成年生物体中不同细胞谱系的正常发育和分化至关重要。它们可以通过外源性影响被修饰，并且因此，可以促进或导致表型或病理表型的环境改变。重要的是，表观遗传修饰在多能性基因的调节中起着至关重要的作用，多能性基因在分化期间失活。非限制性示例性表观遗传修饰化合物包括dna甲基化抑制剂、组蛋白乙酰转移酶抑制剂、组蛋白脱乙酰基酶抑制剂、组蛋白甲基转移酶抑制剂、布罗莫结构域(bromodomain)抑制剂或其任何组合。
[0074]
术语“分化的细胞”或其语法等同物意指在其天然形式下并非多能(如该术语在本文所定义的)的任何原代细胞。换句话说，术语“分化的细胞”可以指在细胞分化过程中衍生自特化程度较低的细胞类型的细胞(例如，干细胞，诸如诱导多能干细胞)的特化程度较高的细胞类型的细胞。不希望受限于理论，多能干细胞在正常个体发育过程中可以首先分化为能够形成胰腺细胞的内胚层细胞和其他内胚层细胞类型。内胚层细胞的进一步分化导致胰腺途径，其中，在一些实施方案中，～98％的细胞变为外分泌细胞、导管或基质细胞，并且～2％变为内分泌细胞。早期内分泌细胞是胰岛祖细胞，其可随后进一步分化为分泌胰岛素、胰高血糖素、促生长素抑制素或胰腺多肽的胰岛素产生细胞(例如，功能性内分泌细胞)。内胚层细胞也可以分化为其他内胚层起源的细胞，例如，肺、肝、肠、胸腺等等起源的细胞。
[0075]
如本文使用的，术语“体细胞”可以指形成生物体的身体的任何细胞，与种系细胞相反。在哺乳动物中，种系细胞(也称为“配子”)是精子和卵子，它们在受精期间融合以产生称为合子的细胞，整个哺乳动物的胚胎都由其发育而来。哺乳动物身体中的每一种其他细胞类型(除了精子和卵子、形成它们的细胞(配子体)和未分化的干细胞)都是体细胞：内部
器官、皮肤、骨骼、血液和结缔组织均由体细胞组成。在一些实施方案中，体细胞是“非胚胎体细胞”，意指不存在于胚胎中或不是从胚胎中获得并且不是由这样的细胞在体外增殖产生的体细胞。在一些实施方案中，体细胞是“成体体细胞”，意指存在于除胚胎或胎儿以外的生物体中或从中获得的细胞，或者从这样的细胞在体外增殖获得的细胞。除非另有指示，否则用于将至少一种胰岛素阳性内分泌细胞或其前体转化为胰岛素产生、葡萄糖响应性细胞的方法可以在体内和体外两者中进行(其中当至少一种胰岛素阳性内分泌细胞或其前体存在于受试者体内时在体内实践，并且使用维持在培养物中的分离的至少一种胰岛素阳性内分泌细胞或其前体在体外实践)。
[0076]
如本文使用的，术语“成体细胞”可以指在胚胎发育后在整个身体中发现的细胞。
[0077]
如本文使用的，术语“内胚层细胞”可以指在非常早期的胚胎中来自三个主要胚细胞层(germ cell layer)之一的细胞(其他两个胚细胞层是中胚层和外胚层)。内胚层是这三层的最内层。内胚层细胞能够首先分化产生胚胎肠，并且然后再分化产生呼吸道和消化道(例如肠)的内衬、肝和胰腺。
[0078]
如本文使用的，术语“内胚层起源的细胞”可以指从内胚层细胞发育或分化的任何细胞。例如，内胚层起源的细胞包括肝、肺、胰腺、胸腺、肠、胃和甲状腺的细胞。不希望受理论的束缚，肝和胰腺祖细胞(也称为胰祖细胞)能够由胚胎前肠中的内胚层细胞发育。特化后不久，肝和胰腺祖细胞迅速获得明显不同的细胞功能和再生能力。这些变化由在脊椎动物中高度保守的诱导信号和遗传调节因子所引起。在肝衰竭和i型糖尿病的治疗中对肝细胞和胰腺β细胞的强烈需求激起了人们对器官发育和再生的兴趣。在多种模式生物和人类中的研究揭示，进化上保守的诱导信号和转录因子网络引发肝和胰腺细胞的分化，并为如何促进由多种干细胞和祖细胞类型分化肝细胞和β细胞提供指导。
[0079]
如本文使用的，术语“定形内胚层(definitive endoderm)”可以指从内胚层细胞分化并且可以分化为sc-β细胞(例如，胰腺β细胞)的细胞。定形内胚层细胞表达标志物sox17。定形内胚层细胞特征性的其他标志物包括但不限于：mixl2、gata4、hnf3b、gsc、fgf17、vwf、calcr、foxq1、cxcr4、cerberus、otx2、goosecoid、c-kit、cd99、cmkor1和crip1。特别地，本文的定形内胚层细胞表达sox17，并且在一些实施方案中表达sox17和hnf3b，并且不表达显著水平的gata4、sparc、apf或dab。定形内胚层细胞对标志物pdx1不呈阳性(例如，它们为pdx1阴性)。定形内胚层细胞具有分化为包括肝、肺、胰腺、胸腺、肠、胃和甲状腺的细胞在内的细胞的能力。可以通过技术人员已知的任何方法，诸如，免疫化学(例如使用抗sox17抗体的免疫化学)或定量rt-pcr来评估sox17和定形内胚层的其他标志物的表达。
[0080]
术语“胰腺内胚层”可以指内胚层起源的能够分化为多于一个胰腺谱系(包括胰腺β细胞)但不再具有分化为非胰腺谱系的能力的细胞。
[0081]
如本文使用的，术语“原始肠管细胞”、“原始肠”或“肠管细胞”可以指从内胚层细胞分化并且可以分化为sc-β细胞(例如，胰腺β细胞)的细胞。原始肠管细胞表达以下标志物中的至少一种：hnp1-β、hnf3-β或hnf4-α。在一些情况下，原始肠管细胞是foxa2阳性和sox2阳性的，即，表达foxa2(也称为hnf3-β)和sox2两者。在一些情况下，原始肠管细胞是foxa2阳性和pdx1阴性的，即，表达foxa2但不表达pdx1。原始肠管细胞具有分化为包括肺、肝、胰腺、胃和肠细胞在内的细胞的能力。可以通过技术人员已知的任何方法，诸如免疫化学(例如使用抗hnf1-β抗体的免疫化学)来评估hnf1-β和原始肠管的其他标志物的表达。
[0082]
如本文使用的，术语“干细胞”可以指能够增殖并产生更多祖细胞的未分化的细胞，祖细胞具有产生大量母细胞的能力，这些母细胞继而可以产生分化的(differentiated)或可分化的(differentiable)子细胞。子细胞本身可以被诱导增殖并产生子代，该子代随后分化为一种或更多种成熟细胞类型，同时还保留一种或更多种具有亲本发育潜力的细胞。术语“干细胞”可以指祖细胞的子集，其在特定情况下具有分化为特化或分化程度更高的表型的能力或潜力，并且在某些情况下保留增殖但基本不分化的能力。在一种实施方案中，术语干细胞通常是指天然存在的母细胞，其后代(子代)通常在不同的方向上通过分化(例如，通过获得完全独立的特征)而进行特化，这发生在胚胎细胞和组织的逐步多样化中。细胞分化是通常通过许多次细胞分裂而发生的复杂过程。分化的细胞可以衍生自多潜能细胞，该多潜能细胞本身也衍生自多潜能细胞，等等。虽然这些多潜能细胞中的每一种都可以被认为是干细胞，但是每种细胞所能产生的细胞类型的范围可能相差很大。一些分化的细胞也具有产生具有更大发育潜力的细胞的能力。这样的能力可以是天然的，也可以在用各种因子处理时由人工诱导。在许多生物学情况下，干细胞也是“多潜能的”，因为它们可以产生不止一种不同细胞类型的子代，但这不是“干性(stem-ness)”所必需的。自我更新是干细胞定义的另一个经典部分，并且其是必不可少的，如在本文件中使用的。从理论上讲，自我更新可以通过两种主要机制之一发生。干细胞可以不对称分裂，一个子代保持干细胞状态，并且另一个子代表现出一些不同的其他特定功能和表型。可选地，群体中的一些干细胞可以对称地分为两个干细胞，从而整体上维持群体中的一些干细胞，而群体中的其他细胞仅产生分化的子代。从形式上讲，开始于干细胞的细胞可能会走向分化的表型，但是然后“逆转”并重新表现干细胞表型，这在术语上通常被本领域普通技术人员称为“去分化”或“重编程”或“反分化”。如本文使用的，术语“多能干细胞”包括胚胎干细胞、诱导多能干细胞、胎盘干细胞，等等。
[0083]
如本文使用的，术语“多能”可以指在不同条件下具有分化为多于一种分化的细胞类型，并且优选地分化为所有三个胚细胞层特征性的细胞类型的能力的细胞。多能细胞的特征主要在于其分化为多于一种细胞类型，优选分化为所有三个胚层的能力，例如使用裸小鼠畸胎瘤形成测定。多能性还可以通过胚胎干(es)细胞标志物的表达来证明，尽管多能性的优选测试是展示分化为三个胚层中的每一个的细胞的能力。应当注意，简单地培养这样的细胞本身并不能赋予其多能性。相对于原代细胞亲代，重编程的多能细胞(例如，ips细胞，如该术语在本文所定义的)也具有延长传代而不丧失生长潜力的能力的特征，而原代细胞亲代在培养中通常仅具有有限的分裂次数。
[0084]
如本文使用的，术语“ips细胞”和“诱导多能干细胞”可互换使用，并且可以指从非多能细胞，通常是成体体细胞人工衍生(例如，诱导或通过完全逆转)的多能干细胞，例如，通过诱导一个或更多个基因的强制表达而人工衍生。
[0085]
术语“表型”可以指在特定的一组环境条件和因素下定义细胞或生物体的一个或一定数量的总生物学特性，而与实际基因型无关。
[0086]
术语“受试者”、“患者”或“个体”在本文可互换使用，并且可以指动物，例如，可以从其获得细胞的人类和/或向其提供使用本文描述的细胞的治疗(包括预防性治疗)的人类。对于特定动物诸如人类受试者特定的那些感染、状况或疾病状态的治疗，术语受试者可以指该特定动物。在本文可互换使用的“非人类动物”和“非人类哺乳动物”包括哺乳动物，
诸如大鼠、小鼠、兔、绵羊、猫、狗、牛、猪和非人类灵长类动物。术语“受试者”还涵盖任何脊椎动物，包括但不限于哺乳动物、爬行动物、两栖动物和鱼类。然而，有利地，受试者是哺乳动物，诸如人类，或其他哺乳动物，诸如家养的哺乳动物例如狗、猫、马等，或生产哺乳动物例如牛、绵羊、猪等。“有相应需要的患者”或“有相应需要的受试者”在本文中是指被诊断患有或怀疑患有疾病或紊乱的患者，该疾病或紊乱例如但不限于糖尿病。
[0087]
本文所用的“施用”可以指向患者或受试者提供本文描述的一种或更多种组合物。举例而言而非限制，组合物施用(例如，注射)可通过静脉内(i.v.)注射、皮下(s.c.)注射、皮内(i.d.)注射、腹膜内(i.p.)注射或肌肉内(i.m.)注射进行。可以采用一种或更多种这样的途径。肠胃外施用可以是例如通过团注或通过随时间逐渐灌注。可选地或同时地，可以通过口服途径施用。另外，还可以通过手术沉积细胞的丸剂或团剂或者通过放置医疗装置而施用。在实施方案中，本公开内容的组合物可包含表达本文描述的核酸序列的工程化细胞或宿主细胞，或包含至少一种本文描述的核酸序列的载体，其量有效治疗或预防增殖性紊乱。药物组合物可包含如本文描述的细胞群体，与一种或更多种药学上或生理上可接受的载体、稀释剂或赋形剂组合。这样的组合物可以包含缓冲剂，诸如中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水等；碳水化合物，诸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或右旋糖酐、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸，诸如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂，诸如edta或谷胱甘肽；辅料(adjuvants)(例如，氢氧化铝)；以及防腐剂。
[0088]
全文公开的一些数值被述及为例如“x为至少或至少约100；或200[或任何数目]。”该数值包括该数字自身和下列所有：
[0089]
i)x为至少100；
[0090]
ii)x为至少200；
[0091]
iii)x为至少约100；以及
[0092]
iv)x为至少约200。
[0093]
贯穿全文公开的数值设想了所有这些不同组合。除非另有明确相反指示，否则所有公开的数值均应以此方式进行解释，无论该数值是指施用治疗剂还是指天、月、年、重量、剂量量(dosage amounts)等。
[0094]
全文公开的范围有时被述及为例如“x在或在约第1天至第2天；或第2天至第3天[或任何数值范围]施用”。该范围包括该数字自身(例如，该范围的端点)和下列所有：
[0095]
i)x在第1天与第2天之间施用；
[0096]
ii)x在第2天与第3天之间施用；
[0097]
iii)x在约第1天与第2天之间施用；
[0098]
iv)x在约第2天与第3天之间施用；
[0099]
v)x在第1天与约第2天之间施用；
[0100]
vi)x在第2天与约第3天之间施用；
[0101]
vii)x在约第1天与约第2天之间施用；以及
[0102]
viii)x在约第2天与约第3天之间施用。
[0103]
贯穿全文公开的范围设想了所有这些不同组合。除非另有明确相反指示，否则所有公开的范围均应以此方式进行解释，无论该数值是指施用治疗剂还是指天、月、年、重量、剂量量等。
[0104]
在一些方面，本公开内容涉及水溶性合成聚合物用于胰腺内分泌细胞，例如，胰腺β细胞、胰腺α细胞、胰腺δ细胞或肠嗜铬细胞或胰腺f细胞或胰腺ε细胞或其前体细胞的体外产生和培养的用途。在一些情况下，本文提供了涉及胰腺内分泌细胞，例如，胰腺β细胞、胰腺α细胞、胰腺δ细胞或肠嗜铬细胞或胰腺f细胞或胰腺ε细胞或其前体细胞的体外产生的组合物和方法。本文提供的方法可以经由体外分化导致胰腺内分泌细胞或其祖细胞的有效产生。
[0105]
在一些情况下，本文提供了一种涉及胰腺β细胞或其前体细胞的产生的方法。历史上，血清一直是细胞培养方法的至关重要的组分，作为复杂生物分子诸如激素、生长因子、附着因子以及许多低分子量营养物的提供者。在某些情况下，例如，在体外细胞分化期间，用血清白蛋白代替血清已经是受欢迎的，并且可以为多种细胞类型的成功生长、永久细胞系的发育以及在一些情况下使细胞分化为某些期望的细胞类型提供足够的支持。白蛋白是血清中的主要蛋白，并且通常以约50mg/ml存在，其中白蛋白占总蛋白的约60％。大约60％的全身白蛋白(total body albumin)处于血管外空间，包括组织的间质空间内，这推断出了其在细胞的生理健康中的重要作用。不希望受某种理论的束缚，但主要是从其在循环中的作用的角度，白蛋白的主要功能已被总结为包括(1)维持血液渗透压和ph，(2)结合和转运生理上重要的配体，包括脂质、金属离子、氨基酸和其他因子，以及(3)抗氧化功能。白蛋白分子的这些基本功能也适用于动物组织中白蛋白与细胞之间的相互作用，或者对本综述重要的是，白蛋白与在培养物中生长的细胞之间的相互作用，无论是在研究实验室还是在大规模商业中。牛血清白蛋白(bsa)和人类血清白蛋白(hsa)都广泛用于组织工程，例如，胰腺细胞的体外分化。然而，血清白蛋白(例如，bsa和hsa)的成本和批次间可变性仍然是细胞产品工业规模生产的基本挑战。本文提供的方法和组合物可以通过在体外产生胰腺β细胞或其前体细胞期间用水溶性聚合物代替血清或血清白蛋白来解决该问题。
[0106]
在一些情况下，该方法包括使多于一个胰腺β细胞前体细胞在不包含血清或血清白蛋白的培养基中分化。在一些情况下，该方法包括使多于一个胰腺β细胞前体细胞在包含水溶性聚合物例如水溶性合成聚合物的培养基中分化。该方法可以适用于干细胞向胰腺β细胞分化的任何阶段。分化过程可以导致胰腺β细胞前体细胞(诸如sox17阳性细胞、foxa2阳性细胞、pdx1阳性细胞、nkx6.1阳性细胞、isl1阳性细胞或胰岛素阳性内分泌细胞)或最终成熟的功能性胰腺β细胞的产生。
[0107]
在一些情况下，本文提供了一种体外组合物，其包含在包含水溶性聚合物例如水溶性合成聚合物的培养基中的多于一个胰腺β细胞或其前体细胞。组合物可以包含多于一个胰腺β细胞或胰腺β细胞前体细胞，例如，但不限于sox17阳性细胞、foxa2阳性细胞、pdx1阳性细胞、nkx6.1阳性细胞、isl1阳性细胞或胰岛素阳性内分泌细胞。在一些情况下，本文提供的组合物是胰腺β细胞或其前体细胞分化期间的中间阶段组合物。在一些情况下，组合物是分化过程的终末阶段组合物。在一些情况下，组合物是从分化期间的组合物调整而来的，例如，细胞可以从用于分化的培养基中分离，并且用包含水溶性聚合物(例如，水溶性合成聚合物)的培养基重构。
[0108]
水溶性合成聚合物
[0109]
本文描述的水溶性聚合物可以指具有亲水性特性且在室温可溶于水溶液的任何聚合物。水溶性聚合物可以是天然存在的或合成的。在一些实施方案中，水溶性聚合物是白
蛋白(例如，人类血清白蛋白或牛血清白蛋白)。在一些实施方案中，水溶性聚合物是水溶性合成聚合物。本文描述的水溶性合成聚合物可以指具有亲水性特性且在室温可溶于水溶液的任何合成聚合物。适用于本主题方法和组合物的水溶性合成聚合物包括但不限于泊洛沙姆、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇(peg)、peg共聚物、聚(n-异丙基丙烯酰胺)和聚丙烯酰胺。水溶性合成聚合物可以指聚合物化合物或聚合物化合物的混合物，其可以具有理想化的化学式，但取决于适用的制造方法，也可以是理想化式的多种衍生物和/或前体。在一些情况下，水溶性合成聚合物用于至少部分代替通常用于细胞分化，例如，胰腺β细胞或其前体细胞的分化的血清或血清白蛋白，例如，bsa或hsa。在一些情况下，水溶性合成聚合物代替100％的通常用于细胞分化，例如，胰腺β细胞或其前体细胞的分化的血清白蛋白，例如，bsa或hsa。在一些情况下，水溶性合成聚合物将通常用于细胞分化，例如，胰腺β细胞或其前体细胞的分化的血清白蛋白，例如，bsa或hsa的量减少至少20％、30％、40％、50％、60％、80％、90％、95％或99％。在一些实施方案中，本公开内容提供了包含本文公开的任何细胞(例如，多能干细胞；内胚层细胞；原始肠细胞；pdx1阳性、nkx6.1阴性胰腺祖细胞；pdx1阳性、nkx6.1阳性胰腺祖细胞；胰岛素阳性细胞；和/或胰腺β细胞)的群体和水溶性聚合物的组合物，其中组合物中至少20％、30％、40％、50％、60％、80％、90％、95％或99％的水溶性聚合物是水溶性合成聚合物(例如，本文公开的任何pva分子)，并且其中剩余的水溶性聚合物是人类血清白蛋白多肽。在一些实施方案中，本公开内容提供了包含本文公开的任何细胞(例如，多能干细胞；内胚层细胞；原始肠细胞；pdx1阳性、nkx6.1阴性胰腺祖细胞；pdx1阳性、nkx6.1阳性胰腺祖细胞；胰岛素阳性细胞；和/或胰腺β细胞)的群体和水溶性聚合物的组合物，其中不多于1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、80％、90％、95％或99％的水溶性聚合物是天然存在的水溶性聚合物(例如，hsa或bsa)。在一些实施方案中，组合物中多于90％、95％、99％和多至100％的水溶性聚合物是水溶性合成聚合物(例如，pva)。
[0110]
在一些情况下，适用于本主题组合物和方法的水溶性合成聚合物包括聚乙烯醇(pva)。本文描述的聚乙烯醇可以指具有理想化式[ch2ch(oh)]n的水溶性合成聚合物，其可以部分或完全水解。在一些情况下，聚乙烯醇是通过聚乙酸乙烯酯的部分或完全水解以去除乙酸酯基团来制造的。在一些情况下，聚乙烯醇是最多85％水解的，例如，80％水解的。水解百分比测量聚乙酸乙烯酯前体聚合物中水解的乙酸酯残基的大约百分比(例如，平均百分比)。在一些情况下，聚乙烯醇是至少85％水解的，例如，87％-89％水解的，87％-90％水解的或99％水解的。在一些实施方案中，聚乙烯醇是78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％水解的。不希望受某种理论的束缚，聚乙烯醇可以承担培养基中载体分子的功能，这通常由血清或血清白蛋白，例如hsa来进行。聚乙烯醇的水解百分比可以通过用于产生聚乙烯醇的制造方法(例如，聚乙酸乙烯酯前体聚合物如何转化为聚乙烯醇，例如，通过碱催化的与乙醇的转酯反应的转化)来确定。在一些情况下，用于本主题方法或存在于本主题组合物中的水溶性合成聚合物制剂例如聚乙烯醇具有至少90％，诸如至少92％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.9％或近100％的纯度。聚乙烯醇的纯度测量制剂中具有理想化式[ch2ch(oh)]n的合成聚合物(包括任何水解百分比的聚乙烯醇)的百分比。聚乙烯醇制剂的杂质可以包括不具有理想化式[ch2ch(oh)]n的其他聚合物材料，
或者其他有机、无机材料。
[0111]
产生胰腺细胞的方法
[0112]
在各方面，本公开内容涉及从胰腺祖细胞或前体细胞产生胰腺细胞(例如，胰腺内分泌细胞)的组合物和方法。产生内分泌细胞以提供至少一种sc-β细胞和/或其他胰腺内分泌细胞(诸如sc-α细胞和sc-δ细胞)的某些示例性详细方案描述于国际专利公布第wo2019/169351号和美国专利公布第us20210198632号中，所述专利公布的每一个通过引用以其整体并入本文。
[0113]
在一些情况下，本文公开的方法包括使多于一个胰腺β细胞前体细胞在不包含血清或血清白蛋白的培养基中分化。可选地，在一些情况下，培养基不包含白蛋白。在一些情况下，培养基不包含人类血清白蛋白(hsa)。在一些情况下，培养基不包含血清。
[0114]
在这些情况中的一些情况下，培养基包含水溶性聚合物，例如，水溶性合成聚合物。在一些情况下，水溶性聚合物，例如，水溶性合成聚合物，作为培养基中血清或血清白蛋白的替代品起作用，例如，水溶性聚合物，例如，水溶性合成聚合物，代替血清或血清白蛋白以代替其功能中的至少一种，例如，支持和/或增强培养物中细胞的存活、生长、分化、功能成熟或稳定性。在一些情况下，本文公开的方法包括使多于一个胰腺β细胞前体细胞在包含水溶性聚合物例如水溶性合成聚合物的培养基中分化。在这些情况中的一些情况下，水溶性合成聚合物包括泊洛沙姆、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇(peg)、peg共聚物、聚(n-异丙基丙烯酰胺)或聚丙烯酰胺。在一些情况下，水溶性合成聚合物包括聚乙烯醇。
[0115]
在一些情况下，该方法包括使多于一个胰腺β细胞前体细胞在培养基中分化，所述培养基包含按培养基计约0.005％至约0.5％(w/v)、约0.01％至约0.2％(w/v)、约0.02％至约0.1％(w/v)或约0.03％至约0.08％(w/v)的浓度的水溶性聚合物，例如，水溶性合成聚合物。在一些情况下，该方法包括使多于一个胰腺β细胞前体细胞在培养基中分化，所述培养基包含按培养基计约0.04％至约0.06％(w/v)，诸如按培养基计约0.05％(w/v)的浓度的水溶性聚合物，例如，水溶性合成聚合物。
[0116]
在一些实施方案中，本文描述的体外组合物还包含水溶性合成聚合物。在一些实施方案中，水溶性合成聚合物是聚乙烯醇(pva)、泊洛沙姆、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇(peg)、peg共聚物、聚(n-异丙基丙烯酰胺)或聚丙烯酰胺，任选地，其中水溶性合成聚合物是聚乙烯醇。在一些实施方案中，水溶性合成聚合物是聚乙烯醇(pva)。在一些实施方案中，水溶性合成聚合物以以下的浓度存在于培养基中：约0.005％至约0.5％(w/v)、约0.01％至约0.2％(w/v)、约0.02％至约0.1％(w/v)或约0.03％至约0.08％(w/v)。在一些实施方案中，水溶性合成聚合物以以下的浓度存在于培养基中：约0.005％(w/v)、0.01％(w/v)、0.05％(w/v)、0.1％(w/v)、0.15％(w/v)、0.2％(w/v)、0.25％(w/v)、0.3％(w/v)、0.35％(w/v)、0.4％(w/v)、0.45％(w/v)或0.5％(w/v)。在一些实施方案中，水溶性合成聚合物是聚乙烯醇(pva)，并且pva是最多85％(例如，75％-80％)水解的。
[0117]
在一些实施方案中，水溶性合成聚合物以以下的浓度存在于培养基中：约0.005％至约0.5％(w/v)、约0.01％至约0.2％(w/v)、约0.02％至约0.1％(w/v)或约0.03％至约0.08％(w/v)。在一些实施方案中，水溶性合成聚合物以以下的浓度存在于培养基中：约0.005％至约0.5％(w/v)、约0.01％至约0.2％(w/v)、约0.02％至约0.1％(w/v)或约0.03％至约0.08％(w/v)。在一些实施方案中，水溶性合成聚合物以以下的浓度存在于培养基中：
约0.005％(w/v)、0.01％(w/v)、0.05％(w/v)、0.1％(w/v)、0.15％(w/v)、0.2％(w/v)、0.25％(w/v)、0.3％(w/v)、0.35％(w/v)、0.4％(w/v)、0.45％(w/v)或0.5％(w/v)。在一些实施方案中，水溶性合成聚合物是聚乙烯醇(pva)，并且pva是最多90％水解的。在一些实施方案中，pva是约87％-89％水解的。
[0118]
在本文公开的方法的一些情况下，胰腺β细胞前体细胞包括nkx6.1阳性、isl1阳性细胞(例如胰岛素阳性内分泌细胞)。在一些情况下，该方法包括使多于一个nkx6.1阳性、isl1阳性细胞在不包含血清或血清白蛋白的培养基中分化。在一些情况下，该方法包括使多于一个nkx6.1阳性、isl1阳性细胞在包含水溶性聚合物，例如，水溶性合成聚合物的培养基中分化。在一些情况下，该方法导致使nkx6.1阳性、isl1阳性细胞分化为胰腺β细胞。在用于使多于一个nkx6.1阳性、isl1阳性细胞分化的方法的一些情况下，水溶性合成聚合物包括约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％水解的聚乙烯醇。在用于使多于一个nkx6.1阳性、isl1阳性细胞分化的方法的一些情况下，水溶性合成聚合物包括超过85％水解的聚乙烯醇。在一些情况下，水溶性合成聚合物包括约87％至约89％水解的聚乙烯醇。在该方法的一些情况下，培养基包含水溶性聚合物，例如，水溶性合成聚合物，以及选自由以下组成的组的一种或更多种剂：转化生长因子β(tgf-β)信号传导途径抑制剂、甲状腺激素信号传导途径激活剂、表观遗传修饰化合物、来自表皮生长因子(egf)家族的生长因子、视黄酸(ra)信号传导途径激活剂、音猬(shh)途径抑制剂、γ-分泌酶抑制剂、蛋白激酶抑制剂、rho相关的含卷曲螺旋蛋白激酶(rock)抑制剂、代谢物、脂质、氨基酸、mgll抑制剂、维生素、锌(例如znso4)和骨形态发生蛋白(bmp)信号传导途径抑制剂。在一些情况下，该方法包括使多于一个nkx6.1阳性、isl1阳性细胞在包含以下的培养基中分化：水溶性聚合物，例如，水溶性合成聚合物，以及选自由以下组成的组的一种或更多种剂：转化生长因子β(tgf-β)信号传导途径抑制剂、甲状腺激素信号传导途径激活剂、表观遗传修饰化合物、来自表皮生长因子(egf)家族的生长因子、视黄酸(ra)信号传导途径激活剂、音猬(shh)途径抑制剂、γ-分泌酶抑制剂、蛋白激酶抑制剂、rho相关的含卷曲螺旋蛋白激酶(rock)抑制剂、代谢物、脂质、氨基酸、mgll抑制剂、维生素、锌(例如znso4)和骨形态发生蛋白(bmp)信号传导途径抑制剂。在一些情况下，该方法包括使多于一个nkx6.1阳性、isl1阳性细胞在包含以下的培养基中分化：水溶性聚合物，例如，水溶性合成聚合物，转化生长因子β(tgf-β)信号传导途径抑制剂、甲状腺激素信号传导途径激活剂、表观遗传修饰化合物、来自表皮生长因子(egf)家族的生长因子、视黄酸(ra)信号传导途径激活剂、音猬(shh)途径抑制剂、γ-分泌酶抑制剂、蛋白激酶抑制剂、rho相关的含卷曲螺旋蛋白激酶(rock)抑制剂、代谢物、脂质、氨基酸、mgll抑制剂、维生素、锌(例如znso4)和骨形态发生蛋白(bmp)信号传导途径抑制剂。在该方法的一些情况下，使nkx6.1阳性、isl1阳性细胞与水溶性聚合物，例如，水溶性合成聚合物接触约7至约14天。
[0119]
在本文公开的方法的一些其他情况下，nkx6.1阳性、isl1阳性细胞分化为胰腺β细胞是在存在血清或血清白蛋白，例如，人类血清白蛋白(hsa)，例如，约0.1％ hsa的情况下进行的。在一些情况下，nkx6.1阳性、isl1阳性细胞分化为胰腺β细胞是在不存在聚乙烯醇的情况下进行的。在一些情况下，例如，使多于一个nkx6.1阳性、isl1阳性细胞分化的方法包括将nkx6.1阳性、isl1阳性细胞在包含以下的培养基中培养：血清或血清白蛋白，例如，
hsa，例如，约0.1％ hsa，以及选自由以下组成的组的一种或更多种剂：转化生长因子β(tgf-β)信号传导途径抑制剂、甲状腺激素信号传导途径激活剂、表观遗传修饰化合物、来自表皮生长因子(egf)家族的生长因子、视黄酸(ra)信号传导途径激活剂、音猬(shh)途径抑制剂、γ-分泌酶抑制剂、蛋白激酶抑制剂、rho相关的含卷曲螺旋蛋白激酶(rock)抑制剂、代谢物、脂质、氨基酸、mgll抑制剂、维生素、锌(例如znso4)和骨形态发生蛋白(bmp)信号传导途径抑制剂。在一些情况下，该方法包括使多于一个nkx6.1阳性、isl1阳性细胞在包含以下的培养基中分化：hsa，例如，约0.1％ hsa，以及选自由以下组成的组的一种或更多种剂：转化生长因子β(tgf-β)信号传导途径抑制剂、甲状腺激素信号传导途径激活剂、表观遗传修饰化合物、来自表皮生长因子(egf)家族的生长因子、视黄酸(ra)信号传导途径激活剂、音猬(shh)途径抑制剂、γ-分泌酶抑制剂、蛋白激酶抑制剂、rho相关的含卷曲螺旋蛋白激酶(rock)抑制剂、代谢物、脂质、氨基酸、mgll抑制剂、维生素、锌(例如znso4)和骨形态发生蛋白(bmp)信号传导途径抑制剂。在一些情况下，该方法包括使多于一个nkx6.1阳性、isl1阳性细胞在包含以下的培养基中分化：hsa，例如，约0.1％ hsa，转化生长因子β(tgf-β)信号传导途径抑制剂、甲状腺激素信号传导途径激活剂、表观遗传修饰化合物、来自表皮生长因子(egf)家族的生长因子、视黄酸(ra)信号传导途径激活剂、音猬(shh)途径抑制剂、γ-分泌酶抑制剂、蛋白激酶抑制剂、rho相关的含卷曲螺旋蛋白激酶(rock)抑制剂、代谢物、脂质、氨基酸、mgll抑制剂、维生素、锌(例如znso4)和骨形态发生蛋白(bmp)信号传导途径抑制剂。
[0120]
在本文公开的方法的一些情况下，胰腺β细胞前体细胞包括pdx1阳性、nkx6.1阳性细胞(例如，nkx6.1阳性胰腺祖细胞，例如，pp2细胞)。在一些情况下，该方法包括使多于一个pdx1阳性、nkx6.1阳性细胞在不包含血清或血清白蛋白的培养基中分化。在一些情况下，该方法包括使多于一个pdx1阳性、nkx6.1阳性细胞在包含水溶性聚合物，例如，水溶性合成聚合物的培养基中分化。在一些情况下，该方法导致使pdx1阳性、nkx6.1阳性细胞分化为nkx6.1阳性、isl1阳性细胞。在该方法的一些情况下，培养基还包含选自由以下组成的组的一种或更多种剂：tgf-β信号传导途径抑制剂、甲状腺激素信号传导途径激活剂、表观遗传修饰化合物、来自表皮生长因子(egf)家族的生长因子、视黄酸(ra)信号传导途径激活剂、音猬(shh)途径抑制剂、γ-分泌酶抑制剂、蛋白激酶抑制剂、rho相关的含卷曲螺旋蛋白激酶(rock)抑制剂、蛋白激酶激活剂、烟酰胺和骨形态发生蛋白(bmp)信号传导途径抑制剂。在一些情况下，该方法包括使多于一个pdx1阳性、nkx6.1阳性细胞在包含以下的培养基中分化：水溶性聚合物，例如，水溶性合成聚合物，以及选自由以下组成的组的一种或更多种剂：tgf-β信号传导途径抑制剂、甲状腺激素信号传导途径激活剂、表观遗传修饰化合物、来自表皮生长因子(egf)家族的生长因子、视黄酸(ra)信号传导途径激活剂、音猬(shh)途径抑制剂、γ-分泌酶抑制剂、蛋白激酶抑制剂、rho相关的含卷曲螺旋蛋白激酶(rock)抑制剂、蛋白激酶激活剂、烟酰胺和骨形态发生蛋白(bmp)信号传导途径抑制剂。在一些情况下，该方法包括使多于一个pdx1阳性、nkx6.1阳性细胞在包含以下的培养基中分化：水溶性聚合物，例如，水溶性合成聚合物，tgf-β信号传导途径抑制剂、甲状腺激素信号传导途径激活剂、表观遗传修饰化合物、来自表皮生长因子(egf)家族的生长因子、视黄酸(ra)信号传导途径激活剂、音猬(shh)途径抑制剂、γ-分泌酶抑制剂、蛋白激酶抑制剂、rho相关的含卷曲螺旋蛋白激酶(rock)抑制剂、蛋白激酶激活剂、烟酰胺和骨形态发生蛋白(bmp)信号传导途
径抑制剂。在该方法的一些情况下，除了水溶性聚合物以外，培养基包含(a)选自由以下组成的组的tgf-β信号传导途径抑制剂：alk5i ii、a83-01、sb431542、d4476、gw788388、ly364947、ly580276、sb505124,gw6604、sb-525334、sd-208和sb-505124；(b)甲状腺激素信号传导途径激活剂，包括t3或gc-l；(c)选自由以下组成的组的表观遗传修饰化合物：3-去氮瓶菌素a(dznep)、gsk126、epz6438、kd5170、mc1568和tmp195；(d)来自表皮生长因子家族的生长因子，包括β细胞素或egf；(e)选自由以下组成的组的视黄酸信号传导途径激活剂：视黄酸、cd1530、am580、tthrb、cd437、ch55、bms961、ac261066、ac55649、am80、bms753、他扎罗汀、阿达帕林和cd2314；(f)选自由以下组成的组的音猬途径抑制剂：sant1、sant2、sant4、cur6l4l4、毛喉素、番茄碱、ay9944、曲帕拉醇和环巴胺；(g)γ-分泌酶抑制剂，包括xxi或dapt；(h)蛋白激酶抑制剂，包括星形孢菌素、ro-31-8220、双吲哚基马来酰亚胺(bis)化合物、10
′‑
{5
″‑
[(甲氧羰基)氨基]-2
″‑
甲基}-苯基氨基羰基星形孢菌素或staralog；(i)选自由以下组成的组的rock抑制剂：thiazovivin、y-27632、法舒地尔/ha1077和14-1152；(j)选自由以下组成的组的蛋白激酶c激活剂：佛波醇12,13-二丁酯(pdbu)、tpb、佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯和苔藓虫素1；和/或(k)骨形态发生蛋白信号传导途径抑制剂，包括ldn193189或dmh-1。在用于使多于一个pdx1阳性、nkx6.1阳性细胞分化的方法的一些情况下，水溶性合成聚合物包括80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％水解的聚乙烯醇。在用于使多于一个pdx1阳性、nkx6.1阳性细胞分化的方法的一些情况下，水溶性合成聚合物包括超过85％水解的聚乙烯醇。在该方法的一些情况下，水溶性合成聚合物包括约87％至89％水解的聚乙烯醇。在该方法的一些情况下，使pdx1阳性、nkx6.1阳性细胞与水溶性合成聚合物接触约5天至约10天或约6天至约9天。在一些情况下，使pdx1阳性、nkx6.1阳性细胞与水溶性聚合物，例如，水溶性合成聚合物接触约5天、6天、7天、8天、9天或10天。
[0121]
在本文公开的方法的一些情况下，胰腺β细胞前体细胞包括pdx1阳性、nkx6.1阴性细胞(例如，胰腺祖细胞，例如，pp1细胞)。在一些情况下，该方法包括使多于一个pdx1阳性、nkx6.1阴性细胞在不包含血清或血清白蛋白的培养基中分化。在一些情况下，该方法包括使多于一个pdx1阳性、nkx6.1阴性细胞在包含水溶性聚合物，例如，水溶性合成聚合物的培养基中分化。在一些情况下，该方法导致使pdx1阳性、nkx6.1阴性细胞分化为pdx1阳性、nkx6.1阳性细胞。在该方法的一些情况下，培养基还包含选自由以下组成的组的一种或更多种剂：蛋白激酶c激活剂、来自转化生长因子β(tgf-β)超家族的生长因子、来自成纤维细胞生长因子(fgf)家族的生长因子、视黄酸(ra)信号传导途径激活剂、rho相关的含卷曲螺旋蛋白激酶(rock)抑制剂和音猬(shh)途径抑制剂。在一些情况下，该方法包括使多于一个pdx1阳性、nkx6.1阴性细胞在包含以下的培养基中分化：水溶性聚合物，例如，水溶性合成聚合物，以及选自由以下组成的组的一种或更多种剂：蛋白激酶c激活剂、来自转化生长因子β(tgf-β)超家族的生长因子、来自成纤维细胞生长因子(fgf)家族的生长因子、视黄酸(ra)信号传导途径激活剂、rho相关的含卷曲螺旋蛋白激酶(rock)抑制剂和音猬(shh)途径抑制剂。在一些情况下，该方法包括使多于一个pdx1阳性、nkx6.1阴性细胞在包含以下的培养基中分化：水溶性聚合物，例如，水溶性合成聚合物，蛋白激酶c激活剂、来自转化生长因子β(tgf-β)超家族的生长因子、来自成纤维细胞生长因子(fgf)家族的生长因子、视黄酸(ra)信号传导途径激活剂、rho相关的含卷曲螺旋蛋白激酶(rock)抑制剂和音猬(shh)途径
抑制剂。在该方法的一些情况下，培养基还包含：(a)选自由以下组成的组的来自转化生长因子β(tgf-β)超家族的生长因子：抑制素、激活素、米勒管抑制物质(mis)、骨形态发生蛋白(bmp)、decapentaplegic(dpp)、vg-1、单克隆非特异性抑制因子(mnsf)、生长分化因子8(gdf8)和生长分化因子11(gdf11)；(b)选自由以下组成的组的来自成纤维细胞生长因子(fgf)家族的生长因子：角质形成细胞生长因子(kgf)、fgf2、fgf10、fgf21和fgf8b；(c)选自由以下组成的组的视黄酸(ra)信号传导途径激活剂：视黄酸、cd1530、am580、tthrb、cd437、ch55、bms961、ac261066、ac55649、am80、bms753、他扎罗汀、阿达帕林和cd2314；(d)选自由以下组成的组的rock抑制剂：thiazovivin、y-27632、法舒地尔/ha1077和14-1152；(e)选自由以下组成的组的蛋白激酶c激活剂：佛波醇12,13-二丁酯(pdbu)、tpb、佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯和苔藓虫素1；和/或(f)选自由以下组成的组的音猬(shh)途径抑制剂：sant1、sant2、sant4、cur6l4l4、毛喉素、番茄碱、ay9944、曲帕拉醇和环巴胺。在用于使多于一个pdx1阳性、nkx6.1阴性细胞分化的方法的一些情况下，水溶性合成聚合物包括80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％水解的聚乙烯醇。在用于使多于一个pdx1阳性、nkx6.1阴性细胞分化的方法的一些情况下，水溶性合成聚合物包括低于85％水解的聚乙烯醇。在一些情况下，水溶性合成聚合物包括约80％水解的聚乙烯醇。在该方法的一些情况下，使pdx1阳性、nkx6.1阴性细胞与水溶性聚合物，例如，水溶性合成聚合物接触4天至8天或5天至7天。在一些情况下，使pdx1阳性、nkx6.1阴性细胞与水溶性聚合物，例如，水溶性合成聚合物接触约4天、5天、6天、7天或8天。
[0122]
在本文公开的方法的一些情况下，胰腺β细胞前体细胞包括foxa2阳性细胞(例如，原始肠管细胞)。在一些情况下，该方法包括使多于一个foxa2阳性细胞在不包含血清或血清白蛋白的培养基中分化。在一些情况下，该方法包括使多于一个foxa2阳性细胞在包含水溶性聚合物，例如，水溶性合成聚合物的培养基中分化。在一些情况下，该方法导致使foxa2阳性细胞分化为pdx1阳性、nkx6.1阴性细胞。在该方法的一些情况下，培养基还包含选自由以下组成的组的一种或更多种剂：蛋白激酶c激活剂、来自转化生长因子β(tgf-β)超家族的生长因子、骨形态发生蛋白信号传导途径抑制剂、来自成纤维细胞生长因子(fgf)家族的生长因子、视黄酸(ra)信号传导途径激活剂、rho相关的含卷曲螺旋蛋白激酶(rock)抑制剂和音猬(shh)途径抑制剂。在一些情况下，该方法包括使多于一个foxa2阳性细胞在包含以下的培养基中分化：水溶性聚合物，例如，水溶性合成聚合物，以及选自由以下组成的组的一种或更多种剂：蛋白激酶c激活剂、来自转化生长因子β(tgf-β)超家族的生长因子、骨形态发生蛋白信号传导途径抑制剂、来自成纤维细胞生长因子(fgf)家族的生长因子、视黄酸(ra)信号传导途径激活剂、rho相关的含卷曲螺旋蛋白激酶(rock)抑制剂和音猬(shh)途径抑制剂。在一些情况下，该方法包括使多于一个foxa2阳性细胞在包含以下的培养基中分化：水溶性聚合物，例如，水溶性合成聚合物，蛋白激酶c激活剂、来自转化生长因子β(tgf-β)超家族的生长因子、骨形态发生蛋白信号传导途径抑制剂、来自成纤维细胞生长因子(fgf)家族的生长因子、视黄酸(ra)信号传导途径激活剂、rho相关的含卷曲螺旋蛋白激酶(rock)抑制剂和音猬(shh)途径抑制剂。在该方法的一些情况下，培养基还包含：(a)选自由以下组成的组的蛋白激酶c激活剂：佛波醇12,13-二丁酯(pdbu)、tpb、佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯和苔藓虫素1；(b)选自由以下组成的组的来自转化生长因子β(tgf-β)超家族
的生长因子：抑制素、激活素、米勒管抑制物质(mis)、骨形态发生蛋白(bmp)、decapentaplegic(dpp)、vg-1、单克隆非特异性抑制因子(mnsf)、生长分化因子8(gdf8)和生长分化因子11(gdf11)；(c)骨形态发生蛋白信号传导途径抑制剂，包括ldn193189或dmh-1；(d)选自由以下组成的组的来自成纤维细胞生长因子(fgf)家族的生长因子：角质形成细胞生长因子(kgf)、fgf2、fgf10、fgf21和fgf8b；(e)选自由以下组成的组的音猬途径抑制剂：sant1、sant2、sant4、cur6l4l4、毛喉素、番茄碱、ay9944、曲帕拉醇和环巴胺；(f)选自由以下组成的组的视黄酸信号传导途径激活剂：视黄酸、cd1530、am580、tthrb、cd437、ch55、bms961、ac261066、ac55649、am80、bms753、他扎罗汀、阿达帕林和cd2314；和/或(g)选自由以下组成的组的rock抑制剂：thiazovivin、y-27632、法舒地尔/ha1077和14-1152。在使多于一个foxa2阳性细胞分化的方法的一些情况下，水溶性合成聚合物包括80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％水解的聚乙烯醇。在使多于一个foxa2阳性细胞分化的方法的一些情况下，水溶性合成聚合物包括低于85％水解的聚乙烯醇。在一些情况下，水溶性合成聚合物包括约80％水解的聚乙烯醇。在一些情况下，使foxa2阳性细胞与水溶性聚合物，例如，水溶性合成聚合物接触1天至3天。在一些情况下，使foxa2阳性细胞与水溶性聚合物，例如，水溶性合成聚合物接触约1天、2天或3天。
[0123]
在本文公开的方法的一些情况下，胰腺β细胞前体细胞包括sox17阳性细胞(例如，定形内胚层细胞)。在一些情况下，该方法包括使多于一个sox17阳性细胞在不包含血清或血清白蛋白的培养基中分化。在一些情况下，该方法包括使多于一个sox17阳性细胞在包含水溶性聚合物，例如，水溶性合成聚合物的培养基中分化。在一些情况下，该方法导致使sox17阳性细胞分化为foxa2阳性细胞。在该方法的一些情况下，培养基还包含来自成纤维细胞生长因子(fgf)家族的生长因子。在一些情况下，该方法包括使多于一个sox17阳性细胞在包含水溶性聚合物(例如，水溶性合成聚合物)以及来自fgf家族的生长因子的培养基中分化。在该方法的一些情况下，来自成纤维细胞生长因子(fgf)家族的生长因子选自由以下组成的组：角质形成细胞生长因子(kgf)、fgf2、fgf10、fgf21和fgf8b。在使多于一个sox17阳性细胞分化的方法的一些情况下，水溶性合成聚合物包括80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％水解的聚乙烯醇。在使多于一个sox17阳性细胞分化的方法的一些情况下，水溶性合成聚合物包括低于85％水解的聚乙烯醇。在一些情况下，水溶性合成聚合物包括约80％水解的聚乙烯醇。在该方法的一些情况下，使sox17阳性细胞与水溶性聚合物，例如，水溶性合成聚合物接触1天至5天或2天至4天。在一些情况下，使sox17阳性细胞与水溶性聚合物，例如，水溶性合成聚合物接触约1天、2天、3天、4天或5天。
[0124]
在本文公开的方法的一些情况下，胰腺β细胞前体细胞包括干细胞(例如，人类干细胞)。在一些情况下，该方法包括使多于一个干细胞在不包含血清或血清白蛋白的培养基中分化。在一些情况下，该方法包括使多于一个干细胞在包含水溶性聚合物，例如，水溶性合成聚合物的培养基中分化。在一些情况下，该方法导致使干细胞分化为sox17阳性细胞。在一些情况下，干细胞包括胚胎干细胞或诱导多能干细胞。在该方法的一些情况下，培养基还包含来自转化生长因子β(tgf-β)超家族的生长因子、wnt信号传导途径激活剂或两者。在一些情况下，该方法包括使多于一个干细胞在包含以下的培养基中分化：水溶性聚合物，例
如，水溶性合成聚合物，以及来自转化生长因子β(tgf-β)超家族的生长因子和wnt信号传导途径激活剂。在该方法的一些情况下，培养基还包含：(a)选自由以下组成的组的来自转化生长因子β(tgf-β)超家族的生长因子：抑制素、激活素、米勒管抑制物质(mis)、骨形态发生蛋白(bmp)、decapentaplegic(dpp)、vg-1、单克隆非特异性抑制因子(mnsf)、生长分化因子8(gdf8)和生长分化因子11(gdf11)；和/或(b)选自由以下组成的组的wnt信号传导途径激活剂：chir99021、3f8、a 1070722、ar-a 014418、bio、bio-丙酮肟、fratide、10z-hymenialdisine、靛玉红-3’肟、kenpaullone、l803、l803-mts、碳酸锂、nsc 693868、sb 216763、sb 415286、tc-g 24、tcs2002、tcs21311和tws119。在使多于一个干细胞分化的方法的一些情况下，水溶性合成聚合物包括80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％水解的聚乙烯醇。在使多于一个干细胞分化的方法的一些情况下，水溶性合成聚合物包括低于85％水解的聚乙烯醇。在一些情况下，水溶性合成聚合物包括约80％水解的聚乙烯醇。在该方法的一些情况下，使干细胞与水溶性聚合物，例如，水溶性合成聚合物接触1天至5天或2天至4天。在一些情况下，使干细胞与水溶性聚合物，例如，水溶性合成聚合物接触约1天、2天、3天、4天或5天。
[0125]
在一些情况下，本文公开的方法包括：(i)使多于一个pdx1阳性、nkx6.1阴性胰腺祖细胞或其前体细胞在包含低于85％水解的聚乙烯醇的培养基中分化，从而产生多于一个pdx1阳性、nkx6.1阳性胰腺祖细胞；以及(ii)将多于一个pdx1阳性、nkx6.1阳性胰腺祖细胞在包含超过85％水解的聚乙烯醇的组合物中培养。在一些情况下，该方法包括使干细胞分化为sox17阳性细胞(例如，定形肠管细胞)，使sox17阳性细胞分化为foxa2阳性细胞(例如，原始肠管细胞)，使foxa2阳性细胞分化为pdx1阳性、nkx6.1阴性细胞(例如，pp1细胞)，以及使pdx1阳性、nkx6.1阴性细胞分化为pdx1阳性、nkx6.1阳性细胞(例如，pp2细胞)，所有这些都在包含低于85％水解的聚乙烯醇(例如，约80％水解的聚乙烯醇)的培养基中进行。在一些情况下，该方法还包括使pdx1阳性、nkx6.1阳性细胞在包含超过85％水解的聚乙烯醇的培养基中分化为nkx6.1阳性、isl1阳性细胞(例如，胰岛素阳性内分泌细胞)。在该方法的一些情况下，低于85％水解的聚乙烯醇是约80％水解的。在一些情况下，超过85％水解的聚乙烯醇是约87％至约89％水解的。在一些情况下，培养导致使多于一个pdx1阳性、nkx6.1阳性胰腺祖细胞分化为nkx1阳性、isl1阳性内分泌细胞。在一些情况下，培养导致使多于一个pdx1阳性、nkx6.1阳性胰腺祖细胞分化为胰腺β细胞。在一些情况下，使nkx6.1阳性、isl1阳性细胞分化为胰腺β细胞是在血清或血清白蛋白，例如，人类血清白蛋白(hsa)，例如，0.1％ hsa存在的情况下进行的。在一些情况下，nkx6.1阳性、isl1阳性细胞分化为胰腺β细胞是在不存在聚乙烯醇的情况下进行的。
[0126]
在一些情况下，包含超过85％水解的聚乙烯醇的组合物还包含选自由以下组成的组的一种或更多种剂：蛋白激酶c激活剂、来自转化生长因子β(tgf-β)超家族的生长因子、骨形态发生蛋白信号传导途径抑制剂、来自成纤维细胞生长因子(fgf)家族的生长因子、视黄酸(ra)信号传导途径激活剂、rho相关的含卷曲螺旋蛋白激酶(rock)抑制剂和音猬(shh)途径抑制剂。在一些实施方案中，水溶性合成聚合物包括86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％水解的聚乙烯醇。在一些情况下，包含超过85％水解的聚乙烯醇的组合物还包含：(a)选自由以下组成的组的蛋白激酶c
激活剂：佛波醇12,13-二丁酯(pdbu)、tpb、佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯和苔藓虫素1；(b)选自由以下组成的组的来自转化生长因子β(tgf-β)超家族的生长因子：抑制素、激活素、米勒管抑制物质(mis)、骨形态发生蛋白(bmp)、decapentaplegic(dpp)、vg-1、单克隆非特异性抑制因子(mnsf)、生长分化因子8(gdf8)和生长分化因子11(gdf11)；(c)骨形态发生蛋白信号传导途径抑制剂，包括ldn193189或dmh-1；(d)选自由以下组成的组的来自成纤维细胞生长因子(fgf)家族的生长因子：角质形成细胞生长因子(kgf)、fgf2、fgf10、fgf21和fgf8b；(e)选自由以下组成的组的音猬途径抑制剂：sant1、sant2、sant4、cur6l4l4、毛喉素、番茄碱、ay9944、曲帕拉醇和环巴胺；(f)选自由以下组成的组的视黄酸信号传导途径激活剂：视黄酸、cd1530、am580、tthrb、cd437、ch55、bms961、ac261066、ac55649、am80、bms753、他扎罗汀、阿达帕林和cd2314；和/或(g)选自由以下组成的组的rock抑制剂：thiazovivin、y-27632、法舒地尔/ha1077和14-1152。
[0127]
在一些方面，本文公开的方法涉及在使pdx1阳性、nkx6.1阳性细胞的体外分化期间使用烟酰胺和来自egf家族的生长因子代替β细胞素。在一些情况下，该方法包括使多于一个pdx1阳性、nkx6.1阳性细胞与包含烟酰胺和来自egf家族的生长因子的组合物接触。在一些情况下，组合物不包含β细胞素。
[0128]
在使pdx1阳性、nkx6.1阳性细胞分化的方法的一些情况下，来自egf家族的生长因子包括egf。在一些情况下，该方法涉及在组合物(例如，培养基)中使用约1ng/ml至约100ng/ml、约2ng/ml至约50ng/ml、约5ng/ml至约20ng/ml或约7.5ng/ml至约15ng/ml egf。在该方法的一些情况下，组合物包含约10ng/ml egf。在一些情况下，组合物包含约1mm至约100mm、约2mm至约50mm、约5mm至约20mm或约7.5mm至约15mm烟酰胺。在一些情况下，组合物包含约10mm烟酰胺。
[0129]
在使pdx1阳性、nkx6.1阳性细胞分化的方法的一些情况下，与pdx1阳性、nkx6.1阳性细胞接触的组合物包含烟酰胺、来自egf家族的生长因子以及选自由以下组成的组的一种或更多种剂：tgf-β信号传导途径抑制剂、甲状腺激素信号传导途径激活剂、表观遗传修饰化合物、视黄酸(ra)信号传导途径激活剂、音猬(shh)途径抑制剂、γ-分泌酶抑制剂、蛋白激酶抑制剂、rho相关的含卷曲螺旋蛋白激酶(rock)抑制剂和骨形态发生蛋白(bmp)信号传导途径抑制剂。在一些情况下，组合物包含烟酰胺、来自egf家族的生长因子、tgf-β信号传导途径抑制剂、甲状腺激素信号传导途径激活剂、表观遗传修饰化合物、视黄酸(ra)信号传导途径激活剂、音猬(shh)途径抑制剂、γ-分泌酶抑制剂、蛋白激酶抑制剂、rho相关的含卷曲螺旋蛋白激酶(rock)抑制剂和骨形态发生蛋白(bmp)信号传导途径抑制剂。在一些情况下，用于使pdx1阳性、nkx6.1阳性细胞分化的组合物还包含：(a)选自由以下组成的组的tgf-β信号传导途径抑制剂：alk5i ii、a83-01、sb431542、d4476、gw788388、ly364947、ly580276、sb505124,gw6604、sb-525334、sd-208和sb-505124；(b)甲状腺激素信号传导途径激活剂，包括t3或gc-l；(c)选自由以下组成的组的表观遗传修饰化合物：3-去氮瓶菌素a(dznep)、gsk126、epz6438、kd5170、mc1568和tmp195；(d)选自由以下组成的组的视黄酸信号传导途径激活剂：视黄酸、cd1530、am580、tthrb、cd437、ch55、bms961、ac261066、ac55649、am80、bms753、他扎罗汀、阿达帕林和cd2314；(e)选自由以下组成的组的音猬途径抑制剂：sant1、sant2、sant4、cur6l4l4、毛喉素、番茄碱、ay9944、曲帕拉醇和环巴胺；(f)γ-分泌酶抑制剂，包括xxi或dapt；(g)蛋白激酶抑制剂，包括星形孢菌素、ro-31-8220、双
吲哚基马来酰亚胺(bis)化合物、10
′‑
{5
″‑
[(甲氧羰基)氨基]-2
″‑
甲基}-苯基氨基羰基星形孢菌素或staralog；(h)选自由以下组成的组的rock抑制剂：thiazovivin、y-27632、法舒地尔/ha1077和14-1152；或(i)骨形态发生蛋白信号传导途径抑制剂，包括ldn193189或dmh-1。在该方法的一些情况下，接触发生1天至3天。在该方法的一些情况下，接触发生约1天、2天或3天。在一些情况下，该方法包括：在接触1天至3天后，从多于一个pdx1阳性、nkx6.1阳性细胞中去除烟酰胺和来自egf家族的生长因子；并且在去除后，使多于一个pdx1阳性、nkx6.1阳性细胞与不包含烟酰胺或来自egf家族的生长因子的组合物接触。在一些情况下，该方法导致使多于一个pdx1阳性、nkx6.1阳性细胞分化为nkx6.1阳性、isl1阳性细胞。
[0130]
细胞组合物
[0131]
在一些方面，本文公开了涉及胰腺内分泌细胞，诸如，胰腺β细胞、胰腺α细胞或胰腺δ细胞的体外产生的细胞组合物。在一些方面，本文公开了组合物，所述组合物包含与培养基和/或可以有助于细胞分化、生长、存活和/或稳定性的剂组合的细胞组合物。
[0132]
在一些情况下，组合物(例如，体外组合物)包含在包含水溶性聚合物例如水溶性合成聚合物的培养基中的多于一个胰腺β细胞或其前体细胞。在一些情况下，本文提供的组合物中的培养基不包含白蛋白。在一些情况下，培养基不包含人类血清白蛋白(hsa)。在一些情况下，培养基不包含血清。胰腺β细胞前体细胞可以包括例如，sox17阳性细胞；foxa2阳性细胞、pdx1阳性细胞、nkx6.1阳性细胞、isl1阳性细胞或胰岛素阳性内分泌细胞。在一些情况下，sox17阳性细胞包括定形内胚层细胞。在一些情况下，foxa2阳性细胞包括原始肠管细胞。在一些情况下，pdx1阳性细胞包括pdx1阳性、nkx6.1阴性细胞(例如，pp1细胞)和/或pdx1阳性、nkx6.1阳性细胞(例如，pp2细胞)。在一些情况下，isl1阳性细胞包括nkx6.1阳性、isl1阳性细胞(例如，胰岛素阳性内分泌细胞)。在一些情况下，胰岛素阳性内分泌细胞包括胰腺β细胞。
[0133]
在一些情况下，水溶性合成聚合物包括聚乙烯醇、泊洛沙姆、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇(peg)、peg共聚物、聚(n-异丙基丙烯酰胺)或聚丙烯酰胺。在一些情况下，水溶性合成聚合物包括聚乙烯醇。在本文公开的组合物的一些情况下，水溶性合成聚合物以以下的浓度存在于培养基中：约0.005％至约0.5％(w/v)、约0.01％至约0.2％(w/v)、约0.02％至约0.1％(w/v)或约0.03％至约0.08％(w/v)。在这些情况中的一些情况下，水溶性合成聚合物以约0.04％至约0.06％(w/v)的浓度存在于培养基中。在一些情况下，水溶性合成聚合物以约0.05％(w/v)的浓度存在于培养基中。
[0134]
在一些情况下，本文公开的组合物包含多于一个胰岛素阳性细胞。在一些情况下，本文公开的组合物包含多于一个非天然胰腺β细胞。在一些实施方案中，本文公开的任何组合物包含水溶性合成聚合物。在一些实施方案中，水溶性合成聚合物包括80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％水解的聚乙烯醇。在这些情况中的一些情况下，水溶性合成聚合物包括超过85％水解的聚乙烯醇，例如，约87％至89％水解的聚乙烯醇。在这些情况中的一些情况下，组合物还包含nkx6.1阳性、isl1阳性细胞，例如，胰岛素阳性内分泌细胞。在一些情况下，组合物还包含胰腺α细胞、胰腺δ细胞、胰腺f细胞、胰腺ε细胞、肠嗜铬细胞或其任何组合。在一些情况下，组合物包含胰腺β细胞、胰腺α细胞和胰腺δ细胞的组合。在这些情况中的
一些情况下，培养基还包含选自由以下组成的组的一种或更多种剂：转化生长因子β(tgf-β)信号传导途径抑制剂、甲状腺激素信号传导途径激活剂、表观遗传修饰化合物、蛋白激酶抑制剂、rho相关的含卷曲螺旋蛋白激酶(rock)抑制剂和骨形态发生蛋白(bmp)信号传导途径抑制剂。在这些情况中的一些情况下，培养基还包含选自由以下组成的组的一种或更多种剂：转化生长因子β(tgf-β)信号传导途径抑制剂、甲状腺激素信号传导途径激活剂、表观遗传修饰化合物、来自表皮生长因子(egf)家族的生长因子、视黄酸(ra)信号传导途径激活剂、音猬(shh)途径抑制剂、γ-分泌酶抑制剂、蛋白激酶抑制剂、rho相关的含卷曲螺旋蛋白激酶(rock)抑制剂和骨形态发生蛋白(bmp)信号传导途径抑制剂。
[0135]
在一些情况下，组合物包含在包含水溶性聚合物的培养基中的多于一个pdx1阳性、nkx6.1阳性细胞(例如，pp2细胞)。在这些情况中的一些情况下，培养基还包含选自由以下组成的组的一种或更多种剂：蛋白激酶c激活剂、tgf-β信号传导途径抑制剂、甲状腺激素信号传导途径激活剂、表观遗传修饰化合物、来自表皮生长因子(egf)家族的生长因子、视黄酸(ra)信号传导途径激活剂、音猬(shh)途径抑制剂、γ-分泌酶抑制剂、蛋白激酶抑制剂、rho相关的含卷曲螺旋蛋白激酶(rock)抑制剂和骨形态发生蛋白(bmp)信号传导途径抑制剂。在一些情况下，培养基包含水溶性聚合物，和(a)选自由以下组成的组的tgf-β信号传导途径抑制剂：alk5i ii、a83-01、sb431542、d4476、gw788388、ly364947、ly580276、sb505124,gw6604、sb-525334、sd-208和sb-505124；(b)甲状腺激素信号传导途径激活剂，包括t3或gc-l；(c)选自由以下组成的组的表观遗传修饰化合物：3-去氮瓶菌素a(dznep)、gsk126、epz6438、kd5170、mc1568和tmp195；(d)来自表皮生长因子家族的生长因子，包括β细胞素或egf；(e)选自由以下组成的组的视黄酸信号传导途径激活剂：视黄酸、cd1530、am580、tthrb、cd437、ch55、bms961、ac261066、ac55649、am80、bms753、他扎罗汀、阿达帕林和cd2314；(f)选自由以下组成的组的音猬途径抑制剂：sant1、sant2、sant4、cur6l4l4、毛喉素、番茄碱、ay9944、曲帕拉醇和环巴胺；(g)γ-分泌酶抑制剂，包括xxi或dapt；(h)蛋白激酶抑制剂，包括星形孢菌素、ro-31-8220、双吲哚基马来酰亚胺(bis)化合物、10
′‑
{5
″‑
[(甲氧羰基)氨基]-2
″‑
甲基}-苯基氨基羰基星形孢菌素或staralog；(i)选自由以下组成的组的rock抑制剂：thiazovivin、y-27632、法舒地尔/ha1077和14-1152；(j)选自由以下组成的组的蛋白激酶c激活剂：佛波醇12,13-二丁酯(pdbu)、tpb、佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯和苔藓虫素1；和/或(k)骨形态发生蛋白信号传导途径抑制剂，包括ldn193189或dmh-1。在一些实施方案中，水溶性合成聚合物包括80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％水解的聚乙烯醇。在这些情况中的一些情况下，水溶性合成聚合物包括超过85％水解的聚乙烯醇，例如，约87％至89％水解的聚乙烯醇。在一些情况下，组合物还包含nkx6.1阳性、isl1阳性细胞，例如，胰岛素阳性内分泌细胞。
[0136]
在一些情况下，组合物包含在包含水溶性聚合物的培养基中的多于一个pdx1阳性、nkx6.1阴性细胞(例如，pp1细胞)。在这些情况中的一些情况下，培养基还包含选自由以下组成的组的一种或更多种剂：蛋白激酶c激活剂、来自转化生长因子β(tgf-β)超家族的生长因子、来自成纤维细胞生长因子(fgf)家族的生长因子、视黄酸(ra)信号传导途径激活剂、rho相关的含卷曲螺旋蛋白激酶(rock)抑制剂和音猬(shh)途径抑制剂。在一些情况下，培养基包含水溶性聚合物，和(a)选自由以下组成的组的来自转化生长因子β(tgf-β)超家
族的生长因子：抑制素、激活素、米勒管抑制物质(mis)、骨形态发生蛋白(bmp)、decapentaplegic(dpp)、vg-1、单克隆非特异性抑制因子(mnsf)、生长分化因子8(gdf8)和生长分化因子11(gdf11)；(b)选自由以下组成的组的来自成纤维细胞生长因子(fgf)家族的生长因子：角质形成细胞生长因子(kgf)、fgf2、fgf10、fgf21和fgf8b；(c)选自由以下组成的组的视黄酸(ra)信号传导途径激活剂：视黄酸、cd1530、am580、tthrb、cd437、ch55、bms961、ac261066、ac55649、am80、bms753、他扎罗汀、阿达帕林和cd2314；(d)选自由以下组成的组的rock抑制剂：thiazovivin、y-27632、法舒地尔/ha1077和14-1152；(e)选自由以下组成的组的蛋白激酶c激活剂：佛波醇12,13-二丁酯(pdbu)、tpb、佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯和苔藓虫素1；和/或(f)选自由以下组成的组的音猬(shh)途径抑制剂：sant1、sant2、sant4、cur6l4l4、毛喉素、番茄碱、ay9944、曲帕拉醇和环巴胺。在这些情况中的一些情况下，水溶性合成聚合物包括低于85％水解的聚乙烯醇，例如，约80％水解的聚乙烯醇。在一些情况下，组合物还包含pdx1阳性、nkx6.1阳性细胞(例如，pp2细胞)。
[0137]
在一些情况下，组合物包含在包含水溶性聚合物的培养基中的多于一个foxa2阳性细胞，例如，原始肠细胞。在这些情况中的一些情况下，培养基还包含选自由以下组成的组的一种或更多种剂：蛋白激酶c激活剂、来自转化生长因子β(tgf-β)超家族的生长因子、骨形态发生蛋白信号传导途径抑制剂、来自成纤维细胞生长因子(fgf)家族的生长因子、视黄酸(ra)信号传导途径激活剂、rho相关的含卷曲螺旋蛋白激酶(rock)抑制剂和音猬(shh)途径抑制剂。在一些情况下，培养基包含水溶性聚合物，和(a)选自由以下组成的组的蛋白激酶c激活剂：佛波醇12,13-二丁酯(pdbu)、tpb、佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯和苔藓虫素1；(b)选自由以下组成的组的来自转化生长因子β(tgf-β)超家族的生长因子：抑制素、激活素、米勒管抑制物质(mis)、骨形态发生蛋白(bmp)、decapentaplegic(dpp)、vg-1、单克隆非特异性抑制因子(mnsf)、生长分化因子8(gdf8)和生长分化因子11(gdf11)；(c)骨形态发生蛋白信号传导途径抑制剂，包括ldn193189或dmh-1；(d)选自由以下组成的组的来自成纤维细胞生长因子(fgf)家族的生长因子：角质形成细胞生长因子(kgf)、fgf2、fgf10、fgf21和fgf8b；(e)选自由以下组成的组的音猬途径抑制剂：sant1、sant2、sant4、cur6l4l4、毛喉素、番茄碱、ay9944、曲帕拉醇和环巴胺；(f)选自由以下组成的组的视黄酸信号传导途径激活剂：视黄酸、cd1530、am580、tthrb、cd437、ch55、bms961、ac261066、ac55649、am80、bms753、他扎罗汀、阿达帕林和cd2314；和/或(g)选自由以下组成的组的rock抑制剂：thiazovivin、y-27632、法舒地尔/ha1077和14-1152。在一些实施方案中，水溶性合成聚合物包括80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％水解的聚乙烯醇。在这些情况中的一些情况下，水溶性合成聚合物包括低于85％水解的聚乙烯醇，例如，约80％水解的聚乙烯醇。在这些情况中的一些情况下，组合物还包含pdx1阳性、nkx6.1阴性细胞(例如，pp1细胞)。
[0138]
在一些情况下，组合物包含在包含水溶性聚合物的培养基中的多于一个sox17阳性细胞(例如，定形内胚层细胞)。在这些情况中的一些情况下，培养基还包含来自成纤维细胞生长因子(fgf)家族的生长因子。在一些情况下，来自成纤维细胞生长因子(fgf)家族的生长因子选自由以下组成的组：角质形成细胞生长因子(kgf)、fgf2、fgf10、fgf21和fgf8b。在一些实施方案中，水溶性合成聚合物包括80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％水解的聚乙
烯醇。在这些情况中的一些情况下，水溶性合成聚合物包括低于85％水解的聚乙烯醇，例如，约80％水解的聚乙烯醇。在一些情况下，该组合物还包含foxa2阳性细胞，例如，原始肠细胞。
[0139]
在一些情况下，组合物包含在包含水溶性聚合物的培养基中的多能干细胞(例如，人类胚胎干细胞或诱导多能干细胞)。在这些情况中的一些情况下，培养基还包含来自转化生长因子β(tgf-β)超家族的生长因子、wnt信号传导途径激活剂或两者。在一些情况下，培养基包含水溶性聚合物，(a)选自由以下组成的组的来自转化生长因子β(tgf-β)超家族的生长因子：抑制素、激活素、米勒管抑制物质(mis)、骨形态发生蛋白(bmp)、decapentaplegic(dpp)、vg-1、单克隆非特异性抑制因子(mnsf)、生长分化因子8(gdf8)和生长分化因子11(gdf11)；和/或(b)选自由以下组成的组的wnt信号传导途径激活剂：chir99021、3f8、a1070722、ar-a014418、bio、bio-丙酮肟、fratide、10z-hymenialdisine、靛玉红-3’肟、kenpaullone、l803、l803-mts、碳酸锂、nsc 693868、sb 216763、sb 415286、tc-g 24、tcs2002、tcs21311和tws119。在一些实施方案中，水溶性合成聚合物包括80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％水解的聚乙烯醇。在这些情况中的一些情况下，水溶性合成聚合物包括低于85％水解的聚乙烯醇，例如，约80％水解的聚乙烯醇。在一些情况下，组合物还包含sox17阳性细胞(例如，定形内胚层细胞)。
[0140]
在一些情况下，组合物(例如，体外组合物)包含多于一个pdx1阳性、nkx6.1阳性细胞(例如，pp2细胞)、烟酰胺和来自表皮生长因子(egf)家族的生长因子。在一些情况下，组合物不包含β细胞素。来自egf家族的生长因子可以包括egf。在一些情况下，组合物包含约1ng/ml至约100ng/ml、约2ng/ml至约50ng/ml、约5ng/ml至约20ng/ml或约7.5ng/ml至约15ng/ml egf，例如，约2ng/ml、约5ng/ml、约10ng/ml、约15ng/ml、约20ng/ml、约25ng/ml、约30ng/ml、约40ng/ml、约50ng/mlegf。在一些情况下，组合物包含约10ng/ml egf。在一些情况下，组合物包含约1mm至约100mm、约2mm至约50mm、约5mm至约20mm或约7.5mm至约15mm烟酰胺，例如，约2mm、约5mm、约10mm、约15mm、约20mm、约25mm、约30mm、约40mm、约50mm烟酰胺。在一些情况下，组合物包含约10mm烟酰胺。在这些情况中的一些情况下，组合物还包含选自由以下组成的组的一种或更多种剂：tgf-β信号传导途径抑制剂、甲状腺激素信号传导途径激活剂、表观遗传修饰化合物、视黄酸(ra)信号传导途径激活剂、音猬(shh)途径抑制剂、γ-分泌酶抑制剂、蛋白激酶c激活剂、蛋白激酶抑制剂、rho相关的含卷曲螺旋蛋白激酶(rock)抑制剂和骨形态发生蛋白(bmp)信号传导途径抑制剂。在一些情况下，组合物包含多于一个pdx1阳性、nkx6.1阳性细胞(例如，pp2细胞)、烟酰胺和来自表皮生长因子(egf)家族的生长因子，以及(a)选自由以下组成的组的tgf-β信号传导途径抑制剂：alk5i ii、a83-01、sb431542、d4476、gw788388、ly364947、ly580276、sb505124,gw6604、sb-525334、sd-208和sb-505124；(b)甲状腺激素信号传导途径激活剂，包括t3或gc-l；(c)选自由以下组成的组的表观遗传修饰化合物：3-去氮瓶菌素a (dznep)、gsk126、epz6438、kd5170、mc1568和tmp195；(d)选自由以下组成的组的视黄酸信号传导途径激活剂：视黄酸、cd1530、am580、tthrb、cd437、ch55、bms961、ac261066、ac55649、am80、bms753、他扎罗汀、阿达帕林和cd2314；(e)选自由以下组成的组的音猬途径抑制剂：sant1、sant2、sant4、cur6l4l4、毛喉素、番茄碱、ay9944、曲帕拉醇和环巴胺；(f)γ-分泌酶抑制剂，包括xxi或dapt；(g)蛋白激
酶抑制剂，包括星形孢菌素、ro-31-8220、双吲哚基马来酰亚胺(bis)化合物、10
′‑
{5
″‑
[(甲氧羰基)氨基]-2
″‑
甲基}-苯基氨基羰基星形孢菌素或staralog；(h)选自由以下组成的组的rock抑制剂：thiazovivin、y-27632、法舒地尔/ha1077和14-1152；(i)蛋白激酶c激活剂，包括佛波醇12,13-二丁酯(pdbu)、tpb、佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯和苔藓虫素1；和/或(j)骨形态发生蛋白信号传导途径抑制剂，包括ldn193189或dmh-1。
[0141]
在一些实施方案中，本公开内容提供了包含本文公开的任何水溶性聚合物和多能干细胞的组合物。在一些实施方案中，组合物中至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％或30％-40％、40％-50％、50％-95％、50％-75％、70％-95％、70％-80％、80％-95％、85％-95％或90％-95％之间的细胞是多能干细胞。
[0142]
在一些实施方案中，本公开内容提供了包含本文公开的任何水溶性聚合物和定形细胞的组合物。在一些实施方案中，组合物中至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％或30％-40％、40％-50％、50％-95％、50％-75％、70％-95％、70％-80％、80％-95％、85％-95％或90％-95％之间的细胞是定形内胚层细胞。
[0143]
在一些实施方案中，本公开内容提供了包含本文公开的任何水溶性聚合物和原始肠细胞的组合物。在一些实施方案中，组合物中至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％或30％-40％、40％-50％、50％-95％、50％-75％、70％-95％、70％-80％、80％-95％、85％-95％或90％-95％之间的细胞是原始肠细胞。
[0144]
在一些实施方案中，本公开内容提供了包含本文公开的任何水溶性聚合物和pdx1阳性、nkx6.1阴性细胞的组合物。在一些实施方案中，组合物中至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％或30％-40％、40％-50％、50％-95％、50％-75％、70％-95％、70％-80％、80％-95％、85％-95％或90％-95％之间的细胞是pdx1阳性、nkx6.1阴性细胞。
[0145]
在一些实施方案中，本公开内容提供了包含本文公开的任何水溶性聚合物和pdx1阳性、nkx6.1阳性细胞的组合物。在一些实施方案中，组合物中至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％或30％-40％、40％-50％、50％-95％、50％-75％、70％-95％、70％-80％、80％-95％、85％-95％或90％-95％之间的细胞是pdx1阳性、nkx6.1阳性细胞。在一些实施方案中，组合物中70％-80％、70％-85％或75％-85％的细胞是pdx1阳性、nkx6.1阳性细胞。
[0146]
在一些实施方案中，本公开内容提供了包含本文公开的任何水溶性聚合物和nkx6.1阳性、isl1阳性细胞的组合物。在一些实施方案中，组合物中至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％或5％-10％、10％-20％、20％-30％、30％-40％、40％-50％、50％-95％、50％-75％、70％-95％、70％-80％、80％-95％、85％-95％或90％-95％之间的细胞是nkx6.1阳性、isl1阳性细胞。在一些实施方案中，本公开内容提供了包含本文公开的任何水溶性聚合物和nkx6.1阳性、isl1阴性细胞的组合物。在一些实施方案中，组合物中至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％或5％-10％、10％-20％、20％-30％、30％-40％、40％-50％、50％-95％、50％-75％、70％-95％、70％-80％、80％-95％、85％-95％或90％-95％之间的细胞是nkx6.1阳性、isl1阴性细胞。在一些实施方案中，本公开内容提供了包含本文公开的任何水溶性聚合物和nkx6.1阴性、isl1阳性细胞的组合物。在一些实施方案中，组合物中至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％或5％-10％、10％-20％、20％-30％、30％-40％、
40％-50％、50％-95％、50％-75％、70％-95％、70％-80％、80％-95％、85％-95％或90％-95％之间的细胞是nkx6.1阴性、isl1阴性细胞。在一些实施方案中，组合物中至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％或5％-10％、10％-20％、20％-30％、30％-40％、40％-50％、50％-95％、50％-75％、70％-95％、70％-80％、80％-95％、85％-95％或90％-95％之间的细胞是nkx6.1阴性、isl1阴性细胞。在一些实施方案中，组合物中30％-35％的细胞是nkx6.1阳性、isl1阳性细胞。
[0147]
干细胞和重编程
[0148]
本文提供了干细胞用于产生sc-β细胞(例如，成熟胰腺β细胞或β样细胞)或其前体的用途。在实施方案中，可以使用与美国专利申请公布第us20150240212号和第us20150218522号或美国专利申请14/684,129；14/684,101；和17/390,839(wo 2022/026932的us对应物)中描述的类似方案，使用胚细胞代替干细胞或与干细胞一起使用以提供至少一种sc-β细胞，该专利申请的每一个通过引用以其整体并入本文。合适的生殖细胞可以由例如末次月经期后约8-11周获取的人类胎儿材料中存在的原始生殖细胞制备。例如，示例性胚细胞制备方法描述于例如shamblott等人，proc.natl.acad.sci.usa 95:13726,1998和美国专利第6,090,622号中。
[0149]
本文提供了产生sc-β细胞(例如，胰腺β细胞)以及胰腺α细胞和/或胰腺δ细胞的组合物和方法。在一些实施方案中，本公开内容提供了产生富集胰腺α细胞的细胞群体的方法。在一些实施方案中，本公开内容提供了产生富集胰腺δ细胞的细胞群体的方法。
[0150]
通常，至少一种sc-β细胞或其前体，例如根据本文公开的方法产生的胰腺祖细胞可以包含不同细胞的混合物或组合，例如，细胞如原始肠管细胞、pdx1阳性胰腺祖细胞、pdx1阳性、nkx6-1阳性胰腺祖细胞、ngn3阳性内分泌祖细胞、胰岛素阳性内分泌细胞(例如，nkx6-1阳性、isl1阳性细胞或β样细胞)和/或其他多能细胞或干细胞等的混合物。
[0151]
可以根据任何合适的培养方案使干细胞或多能细胞分化为期望的分化阶段来产生至少一种胰腺α、β和/或δ细胞或其前体。在一些实施方案中，通过在适于使至少一种多能细胞分化为至少一种胰腺α、β和/或δ细胞或其前体的条件下将至少一种多能细胞培养一段时间来产生至少一种胰腺α、β和/或δ细胞或其前体。
[0152]
在一些实施方案中，至少一种胰腺α、β和/或δ细胞或其前体是基本纯的胰腺α、β和/或δ细胞或其前体的群体。在一些实施方案中，胰腺α、β和/或δ细胞或其前体的群体基本不含或缺乏胚胎干细胞或多能细胞或ips细胞。
[0153]
在一些实施方案中，体细胞(例如成纤维细胞)可以例如以组织活检(诸如，例如皮肤活检)从受试者分离，并重编程为诱导多能干细胞，以进一步分化从而产生用于本文描述的组合物和方法中的至少一种胰腺α、β和/或δ细胞或其前体。在一些实施方案中，通过本领域普通技术人员已知的方法将体细胞(例如成纤维细胞)维持在培养物中，并且在一些实施方案中，在通过本文公开的方法将其转化为胰腺α、β和/或δ细胞之前进行增殖。
[0154]
在一些实施方案中，通过本领域普通技术人员已知的方法将至少一种胰腺α、β和/或δ细胞或其前体维持在培养物中，并且在一些实施方案中，在通过本文公开的方法将其转化为胰腺α、β和/或δ细胞之前进行增殖。
[0155]
此外，至少一种胰腺α、β和/或δ细胞或其前体例如胰腺祖细胞可以来自任何哺乳动物物种，非限制性实例包括鼠、牛、猿、猪、马、绵羊或人类细胞。在一些实施方案中，至少
一种胰腺α、β和/或δ细胞或其前体源自人类个体。
[0156]
干细胞
[0157]
本公开内容的实施方案涉及干细胞用于产生胰腺α、β和/或δ细胞或其前体的用途。如本文使用的，术语“干细胞”可以指具有自我更新和产生分化细胞类型两种能力的细胞(例如，植物干细胞、脊椎动物干细胞)(morrison等人，(1997)cell 88:287-298)。在细胞个体发育的上下文中，形容词“分化的(differentiated)”或“分化的(differentiating)”是相对术语。“分化的细胞”可以是相对于与之相比的细胞，沿着发育途径进一步向下发展的细胞。因此，多能干细胞可以分化为谱系限制性祖细胞(例如，定形内胚层细胞)，继而可以分化为进一步限制性的细胞(例如，胰腺祖细胞)，这些细胞可以分化为终末阶段细胞(例如，终末分化的细胞，例如β细胞，等)，它们在某些组织类型中具有特征性作用，并且可以保留或不保留进一步增殖的能力。干细胞可以通过特异性标志物(例如，蛋白质、rna，等等)的存在和特异性标志物的不存在两者来表征。干细胞也可以通过体外功能测定和体内功能测定两者来鉴别，特别是与干细胞产生多于一个分化的后代的能力相关的测定。在实施方案中，宿主细胞是成体干细胞、体细胞干细胞、非胚胎干细胞、胚胎干细胞、造血干细胞、包括多能干细胞和滋养层干细胞。
[0158]
感兴趣的干细胞，例如可以在本文提供的方法中使用的干细胞可以包括多能干细胞(psc)。如本文使用的，术语“多能干细胞”或“psc”可以指能够产生生物体的所有细胞类型的干细胞。因此，psc可以产生生物体所有胚层的细胞(例如，脊椎动物的内胚层、中胚层和外胚层)。多能细胞可以能够形成畸胎瘤并有助于活生物体中的外胚层、中胚层或内胚层组织。植物的多能干细胞可以能够产生植物的所有细胞类型(例如，根、茎、叶等的细胞)。
[0159]
本公开内容的实施方案涉及psc用于产生胰腺α、β和/或δ细胞或其前体的用途。动物的psc可以通过多种不同方式获得。例如，胚胎干细胞(esc)可以衍生自胚胎的内细胞团(thomson等人，science.1998年11月6日；282(5391):1145-7)，而诱导多能干细胞(ipsc)可以衍生自体细胞(takahashi等人，cell.2007年11月30日；131(5):861-72；takahashi等人，nat protoc.2007；2(12):3081-9；yu等人，science.2007年12月21日；318(5858):1917-20.epub 2007年11月20日)。因为术语psc可以指多能干细胞而不考虑它们的起源，所以术语psc可以涵盖术语esc和ipsc，以及术语胚胎生殖干细胞(egsc)，其是psc的另一个实例。psc可以是已建立的细胞系的形式，它们可以直接从原代胚胎组织获得，或者可以衍生自体细胞。
[0160]
本公开内容的实施方案涉及esc用于产生胰腺α、β和/或δ细胞或其前体的用途。“胚胎干细胞”(esc)可以意指从胚胎，通常从胚泡的内细胞团分离的psc。esc细胞系在nih人胚胎干细胞注册表(nih human embryonic stem cell registry)中列出，例如hesbgn-01、hesbgn-02、hesbgn-03、hesbgn-04(bresagen,inc.)；hes-1、hes-2、hes-3、hes-4、hes-5、hes-6(es cell international)；miz-hes1(mizmedi hospital-seoul national university)；hsf-1、hsf-6(university of california at san francisco)；以及h1、h7、h9、h13、h14(wisconsin alumni research foundation(wicell research institute))。感兴趣的干细胞还包括来自其他灵长类动物的胚胎干细胞，诸如恒河猴干细胞和狨猴干细胞。所述干细胞可以从任何哺乳动物物种获得，例如人类、马、牛、猪、犬、猫、啮齿动物(例如小鼠、大鼠、仓鼠)、灵长类动物，等等(thomson等人，(1998)science 282:1145；thomson等
人，(1995)proc.natl.acad.sci usa 92:7844；thomson等人，(1996)biol.reprod.55:254；shamblott等人，proc.natl.acad.sci.usa 95:13726,1998))。在培养中，esc可以生长为具有大的核质比、明确边界和突出核仁的扁平集落。此外，esc可以表达ssea-3、ssea-4、tra-1-60、tra-1-81和碱性磷酸酶，但不表达ssea-1。生成和表征esc的方法的实例可见于，例如，美国专利第7,029,913号、美国专利第5,843,780号和美国专利第6,200,806号，其各自以其整体并入本文。用于使未分化形式的hesc增殖的方法描述于wo 99/20741、wo 01/51616和wo 03/020920中，其各自以其整体并入本文。
[0161]“胚胎生殖干细胞”(egsc)或“胚胎生殖细胞”或“eg细胞”可以意指衍生自生殖细胞和/或生殖细胞祖细胞的psc，例如原始生殖细胞，例如可以变成精子和卵子的那些细胞。胚胎生殖细胞(eg细胞)被认为具有与上述胚胎干细胞相似的性质。生成和表征eg细胞的方法的实例可见于例如，美国专利第7,153,684号；matsui,y.等人，(1992)cell 70:841；shamblott,m.等人，(2001)proc.natl.acad.sci.usa 98:113；shamblott,m.等人，(1998)proc.natl.acad.sci.usa,95:13726；和koshimizu,u.等人，(1996)development,122:1235，其各自以其整体并入本文。
[0162]
本公开内容的实施方案涉及ipsc用于生成胰腺α、β和/或δ细胞或其前体的用途。“诱导多能干细胞”或“ipsc”可以意指衍生自非psc的细胞的psc(例如，衍生自相对于psc分化了的细胞)。ipsc可以衍生自多于一个不同的细胞类型，包括终末分化的细胞。ipsc可以具有es细胞样的形态，生长为具有大的核质比、明确边界和突出核仁的扁平集落。此外，ipsc可以表达一种或更多种本领域普通技术人员已知的关键多能性标志物，包括但不限于碱性磷酸酶、ssea3、ssea4、sox2、oct3/4、nanog、tra160、tra181、tdgf 1、dnmt3b、foxd3、gdf3、cyp26a1、tert和zfp42。生成和表征ipsc的方法的实例可见于例如美国专利公布第us20090047263号、第us20090068742号、第us20090191159号、第us20090227032号、第us20090246875号和第us20090304646号，其各自以其整体并入本文。通常，为了生成ipsc，向体细胞提供本领域已知的重编程因子(例如，oct4、sox2、klf4、myc、nanog、lin28，等等)，以将体细胞重编程为多能干细胞。
[0163]
本公开内容的实施方案涉及体细胞用于生成胰腺α、β和/或δ细胞或其前体的用途。“体细胞”可以意指生物体中在不存在实验操纵的情况下通常不产生生物体中所有类型的细胞的任何细胞。换句话说，体细胞可以是已经充分分化的细胞，它们不能天然地生成身体的所有三个胚层(例如外胚层、中胚层和内胚层)的细胞。例如，体细胞可以包括神经元细胞和神经祖细胞两者，后者能够天然产生中枢神经系统的所有或一些细胞类型，但无法产生中胚层或内胚层谱系的细胞。
[0164]
在某些实例中，根据本文公开的方法，在暴露于至少一种分化因子或组合物之前，干细胞可以是未分化的(例如，细胞未定型至特定谱系)，而在其他实例中，可能期望在暴露于本文描述的至少一种分化因子或组合物之前，使干细胞分化为一种或更多种中间细胞类型。例如，干细胞可显示未分化细胞的形态、生物学或物理特性，这些特性可用于将干细胞与胚胎或成体来源的分化细胞区分开。在一些实例中，未分化的细胞可以出现在具有高核/质比和突出核仁的细胞集落的二维显微视图中。干细胞可以是干细胞本身(例如，基本上不存在任何分化的细胞)，也可以在分化的细胞存在下使用。在某些实例中，可以在合适的营养物和任选地其他细胞的存在下培养干细胞，使得该干细胞可以生长并任选地分化。例如，
在培养物中可以存在胚胎成纤维细胞或成纤维细胞样细胞，以帮助干细胞的生长。成纤维细胞可以在干细胞生长的一个阶段期间存在，但不必在所有阶段存在。例如，可以在第一培养阶段将成纤维细胞添加到干细胞培养物，而在一个或更多个随后的培养阶段不添加到干细胞培养物。
[0165]
在本发明的所有方面中使用的干细胞可以是衍生自任何种类的组织(例如胚胎组织，诸如胎儿或胎儿前组织或成体组织)的任何细胞，该干细胞可以具有在适当条件下能够产生不同细胞类型(例如所有3个胚层(内胚层、中胚层和外胚层)或其中至少一种)的后代的特性。这些细胞类型可以以已建立的细胞系的形式提供，或者可以直接从原代胚胎组织获得并直接用于分化。包括在nih人胚胎干细胞注册表中列出的细胞，例如hesbgn-01、hesbgn-02、hesbgn-03、hesbgn-04(bresagen,inc.)；hes-1、hes-2、hes-3、hes-4、hes-5、hes-6(es cell international)；miz-hes1(mizmedi hospital-seoul national university)；hsf-1、fisf-6(university of california at san francisco)；以及h1、h7、h9、h13、h14(wisconsin alumni research foundation(wicell research institute))。在一些实施方案中，用于化学诱导分化为成熟胰岛素阳性细胞的人类干细胞或多能干细胞的来源没有涉及破坏人类胚胎。在一些实施方案中，用于化学诱导分化为成熟胰岛素阳性细胞的人类干细胞或多能干细胞的来源不涉及破坏人类胚胎。
[0166]
在另一个实例中，可以从包括实体组织在内的组织分离干细胞。在一些实施方案中，该组织是皮肤、脂肪组织(fat tissue)(例如，adipose tissue)、肌肉组织、心脏组织。在其他实施方案中，该组织是例如但不限于脐带血、胎盘、骨髓或软骨。
[0167]
可以在本文提供的方法中使用的干细胞还可以包括各种类型的胚胎细胞，例如人类胚胎干(hes)细胞，如thomson等人,(1998)science 282:1145所述；来自其他灵长类动物的胚胎干细胞，诸如恒河猴干细胞(thomson等人，(1995)proc.natl.acad.sci.usa 92:7844)；狨猴干细胞(thomson等人(1996)biol.reprod.55:254)；和人胚胎生殖(heg)细胞(shambloft等人，proc.natl.acad.sci.usa 95:13726,1998))。谱系定型干细胞也可适用于本文提供的方法，该细胞诸如中胚层干细胞和其他早期生心细胞(参见reyes等人，(2001)blood 98:2615-2625；eisenberg和bader(1996)circ res.78(2):205-16；等等)。所述干细胞可以从任何哺乳动物物种获得，例如人类、马、牛、猪、犬、猫、啮齿动物(例如小鼠、大鼠、仓鼠)、灵长类动物，等等。在一些实施方案中，对于用于本文公开的方法和组合物的多能细胞来源，人类胚胎没有被破坏。在一些实施方案中，对于用于本文公开的方法和组合物的多能细胞来源，人类胚胎不被破坏。
[0168]
为了本公开内容的目的，可以从哺乳动物供体收获来自内皮、肌肉和/或神经干细胞的合适来源的细胞的混合物。合适的来源是造血微环境。例如，可以从受试者中移取循环外周血，优选动员的(例如，募集的)循环外周血。在实施方案中，干细胞可以是重编程干细胞，诸如衍生自体细胞或分化细胞的干细胞。在这样的实施方案中，去分化的干细胞可以是例如但不限于赘生性细胞、肿瘤细胞和癌细胞，或者可选地为诱导重编程细胞，诸如诱导多能干细胞或ips细胞。
[0169]
在一些实施方案中，本文描述的胰腺α、β和/或δ细胞可以衍生自以下一种或更多种：毛状细胞(trichocyte)、角质形成细胞、促性腺激素细胞、促肾上腺皮质激素细胞、促甲状腺激素细胞、促生长激素细胞(somatotrope)、催乳素细胞、嗜铬细胞、滤泡旁细胞、球细
胞、黑素细胞、痣细胞、梅克尔细胞、成牙本质细胞、成牙骨质细胞、角膜角质细胞、视网膜muller细胞、视网膜色素上皮细胞、神经元、神经胶质(例如，少突胶质细胞、星形胶质细胞)、室管膜细胞、松果体细胞、肺细胞(例如，i型肺细胞和ii型肺细胞)、克拉拉细胞、杯形细胞、g细胞、d细胞、ecl细胞、胃主细胞、壁细胞、小凹细胞(foveolar cell)、k细胞、d细胞、i细胞、杯形细胞、帕内特细胞、肠细胞、微褶细胞、肝细胞、肝星状细胞(例如，来自中胚层的kupffer细胞)、胆囊细胞、泡心细胞、胰腺星状细胞、胰腺α细胞、胰腺β细胞、胰腺δ细胞、胰腺f细胞(例如，pp细胞)、胰腺ε细胞、甲状腺(例如，滤泡细胞)、甲状旁腺(例如，甲状旁腺主细胞)、嗜酸性细胞、尿道上皮细胞、成骨细胞、骨细胞、成软骨细胞、软骨细胞、成纤维细胞、纤维细胞、成肌细胞、肌细胞、肌卫星细胞、腱细胞、心肌细胞、成脂肪细胞、脂肪细胞、cajal间质细胞、成血管细胞、内皮细胞、系膜细胞(例如，肾小球内系膜细胞和肾小球外系膜细胞)、肾小球旁细胞、致密斑细胞、基质细胞、间质细胞、特络细胞(telocyte)、简单上皮细胞、足细胞、肾近端小管刷状缘细胞、塞托利细胞、莱迪希细胞、颗粒细胞、栓细胞、生殖细胞、精子、卵子、淋巴细胞、髓样细胞、内皮祖细胞、内皮干细胞、成血管细胞、中胚层成血管细胞(mesoangioblast)、周细胞、壁细胞、脾细胞(例如，t淋巴细胞、b淋巴细胞、树突细胞、小噬细胞、白细胞)、滋养层干细胞或其任何组合。
[0170]
如本文使用的，术语“重编程”可以指改变或逆转体细胞的分化状态的过程。在重编程之前，该细胞可以是部分分化的或是终末分化的。重编程可以涵盖将体细胞的分化状态完全逆转为多能细胞。分化的这种完全逆转可以产生诱导多能(ips)细胞。如本文使用的，重编程还可以包括细胞分化状态的部分逆转，例如逆转至多潜能状态，或者逆转至体细胞，体细胞既不多能也不多潜能，而是失去了其来源的分化细胞特征性的一个或更多个特定特性的细胞，例如分化细胞直接重编程为不同的体细胞类型。重编程可以涉及在随着合子发育为成体的细胞分化过程中发生的核酸修饰(例如，甲基化)、染色质凝聚、表观遗传变化、基因组印记等可遗传模式中至少一些的改变(例如，逆转)。
[0171]
如本文使用的，术语“重编程因子”可以指与细胞“重编程”(即分化和/或去分化和/或转分化)相关的分子，使得细胞转化为不同的细胞类型或表型。重编程因子通常影响与细胞分化、去分化和/或转分化相关的基因的表达。转录因子是重编程因子的实例。
[0172]
如本文使用的，术语“分化”及其语法等同物可以指特化程度较低的细胞(例如，具有较高细胞潜能的较初始(naive)的细胞)藉以变为特化程度较高的细胞类型(例如，具有较低细胞潜能的较不初始的细胞)的过程；并且术语“去分化”可以指特化程度较高的细胞变为特化程度较低的细胞类型(例如，具有较高细胞潜能的较初始的细胞)的过程；并且术语“转分化”是指特定细胞类型的细胞在不显著改变其“细胞潜能(cell potency)”或“初始”水平的情况下转化为另一种细胞类型的过程。不希望受理论的束缚，认为细胞在从一种谱系定型的细胞类型或终末分化的细胞类型转化为另一种谱系定型的细胞类型或终末分化的细胞类型时“转分化”，而没有显著改变其“细胞潜能”或“初始”水平。
[0173]
如本文使用的，术语“细胞潜能”应理解为是指细胞分化为不同谱系的细胞的能力。例如，多能细胞(例如干细胞)具有分化为三种胚层(即内胚层(胃内壁、胃肠道、肺)、中胚层(肌肉、骨骼、血液、泌尿生殖道)或外胚层(表皮组织和神经系统))中任何一种的潜能，并因此具有高细胞潜能；多潜能细胞(例如某种类型的干细胞或诱导型干细胞)具有产生多于一个但数量有限的谱系的细胞的能力(诸如造血干细胞、心脏干细胞或神经细胞)，相比
多能细胞具有较低的细胞潜能。定型于特定谱系或终末分化的细胞可能具有较低的细胞潜能。本领域已知的转分化的特定实例包括例如，从胰腺外分泌细胞至β细胞的转化等。
[0174]
因此，可以使细胞分化为更初始的细胞(例如，可以使终末分化的细胞分化为多潜能或多能的)；或者可以使该细胞去分化为较不初始的细胞(例如，可以使多潜能或多能细胞分化为谱系定型细胞或终末分化细胞)。然而，在实施方案中，可以使细胞从一种细胞类型(或表型)转化或转分化为例如具有相似的细胞潜能水平的另一种细胞类型(或表型)。因此，在本公开内容的实施方案中，本公开内容的诱导步骤可以将本公开内容的细胞重编程以分化、去分化和/或转分化。在本公开内容的实施方案中，本公开内容的诱导步骤可以将细胞重编程以进行转分化。
[0175]
将特定类型的细胞重编程或诱导成为另一种类型细胞的方法，例如，使用一种或更多种外源性多核苷酸或多肽重编程因子通过分化、去分化和/或转分化将特定类型的细胞重编程或诱导成为另一种类型细胞的方法，是本领域技术人员所熟知的。这样的方法可依赖于编码与细胞重编程相关的一种或更多种转录因子或其他多肽的遗传物质的引入。例如，已知pdx1、ngn3和mafa或其功能片段编码可以诱导本公开内容细胞的细胞分化、去分化和/或转分化的肽。在本领域技术人员已知的一些方法中，使由重编程基因(诸如上述基因)编码的外源多肽(例如重组多肽)与细胞接触，以诱导例如本公开内容的细胞。本领域技术人员将理解，其他基因也可能与细胞的重编程有关，并且编码这些基因(或其功能片段)的外源分子和所编码的多肽也被认为是多核苷酸或多肽重编程因子(例如多核苷酸或多肽继而影响与细胞重编程相关的另一个基因的表达水平)。例如，已经显示，减少p53失活的外源性多核苷酸或多肽表观遗传基因沉默子的引入提高了诱导诱导多能干细胞(ipsc)的效率。因此，编码表观遗传沉默子和可以直接或间接参与细胞重编程或提高细胞编程效率的其他基因或蛋白质的外源性多核苷酸或多肽将被认为构成外源性多核苷酸或多肽重编程因子。本领域技术人员将理解，存在其他影响细胞重编程的方法，诸如引入rnai分子(或编码rnai分子的遗传物质)，可以敲低参与抑制细胞重编程的基因的表达。因此，任何与细胞重编程有关或增强细胞重编程的外源性多核苷酸分子或多肽分子应被理解为本文描述的外源性多核苷酸或多肽重编程因子。
[0176]
应当理解，所述方法可以利用“常规”组织培养组分，诸如培养基、血清、血清替代品、补充剂、抗生素等，诸如rpmi、肾上皮基础培养基(rebm)、dulbecco改良eagle培养基(dmem)、mcdb131培养基、cmrl 1066培养基、f12、胎牛血清(fetal calf serum(fcs)，foetal bovine serum(fbs))、牛血清白蛋白(bsa)、d-葡萄糖、l-谷氨酰胺、glutamax.tm.1(二肽，l-丙氨酸-l-谷氨酰胺)、b27、肝素、黄体酮、腐胺、层黏连蛋白、烟酰胺、胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸钠、硒、乙醇胺、人类表皮生长因子(hegf)、碱性成纤维细胞生长因子(bfgf)、氢化可的松、肾上腺素、normacin、青霉素、链霉素、庆大霉素和两性霉素，等等。应当理解，这些典型的组织培养组分(以及组织培养中常规使用的其他类似组织培养组分)并不是用于本公开内容的目的的小分子重编程分子。这些组分不是本文定义的小分子和/或不是本文定义的重编程因子。
[0177]
相应地，在实施方案中，本公开内容不涉及使用一种或更多种外源性多核苷酸或多肽重编程因子的细胞培养步骤。相应地，在实施方案中，本公开内容的方法不涉及例如通过引入转座子、病毒转基因载体(诸如逆转录病毒载体)、质粒、mrna、mirna、肽或任何这些
分子的片段(其涉及产生诱导α、β和/或δ细胞，或以其他方式诱导本公开内容的细胞分化、去分化和/或转分化)而引入一种或更多种外源性多核苷酸或多肽重编程因子。
[0178]
即，在实施方案中，所述方法在不存在一种或更多种外源性多核苷酸或多肽重编程因子的情况下发生。因此，应当理解，在实施方案中，本公开内容的方法利用小分子(例如，hdac抑制剂)来对细胞重编程，而不添加多肽转录因子；与诱导分化、去分化和/或转分化具体相关的其他多肽因子；编码多肽转录因子的多核苷酸序列，编码与诱导分化、去分化和/或转分化具体相关的其他多肽因子的多核苷酸序列；mrna；干扰rna；微小rna及其片段。
[0179]
产生干细胞衍生的β细胞的方法
[0180]
本文提供了产生sc-β细胞(例如，非天然胰腺β细胞)的方法。产生内分泌细胞干细胞以提供至少一种sc-β细胞的详细方案的实例描述于美国专利申请公布第us20150240212号、第us20150218522号、第us20210198632号和wo2019/169351，所述专利公布的每一个通过引用以其整体并入本文。
[0181]
内胚层可以形成消化道和呼吸道、甲状腺、肝和胰腺。内胚层谱系的代表性疾病是由产生胰岛素的β细胞的破坏引起的1型糖尿病。由人类多能干细胞(hpsc)体外产生功能性β细胞可能是用于1型糖尿病的置换细胞治疗的实用的、可再生细胞来源。由胚泡期胚胎的内细胞团产生的胚胎干(es)细胞代表了用于任何受损细胞的移植或基于细胞的治疗的有希望的细胞来源。它们可以在培养物中维持、自我更新、并作为未分化的es细胞无限增殖。es细胞能够分化为体内的所有细胞类型，如外胚层、中胚层和内胚层谱系细胞或组织。es细胞的主要益处是在培养物中稳定的自我更新和分化潜力。
[0182]
可以通过胚胎发生的原肠胚形成过程从内细胞团中体内产生定形内胚层，其中上胚层细胞被指示形成三个胚层。定形内胚层可以产生不同的细胞和组织，这些细胞和组织对重要器官如胰腺β细胞、肝细胞、肺泡细胞、甲状腺、胸腺以及消化道和呼吸道的上皮内膜有贡献。它不同于胚外组织的原始内胚层，后者可以形成脏壁内胚层和腔壁内胚层。源自es细胞的定形内胚层理论上能够成为任何内胚层衍生物，并且指导es细胞成为内胚层谱系是产生治疗性内胚层衍生物的先决条件。
[0183]
定形内胚层的前后轴的精确模式最终可以形成原始肠管。定形内胚层来源的原始肠管沿前后轴诱导咽、食道、胃、十二指肠、小肠和大肠以及相关器官，包括胰腺、肺、甲状腺、胸腺、甲状旁腺和肝。原始肠管前肠的前部变为肺、甲状腺、食道和胃。胰腺、肝和十二指肠起源于前肠的后部。原始肠管的中肠和后肠产生小肠和大肠。前肠前部表达发育标志物、nk2同源框1(nkx2-1)和sry(性别决定区y)框2(sox2)；前肠后部表达造血表达的同源框(hhex)、胰腺和十二指肠同源框1(pdx1)、一个切割的同源框1(onecut1，称为hnf6)和肝细胞核因子4α(hnf4a)；以及中肠/后肠表达尾型同源框1(cdx1)、尾型同源框2(cdx2)以及运动神经元和胰腺同源框1(mnx1)(3,19,20)。
[0184]
成功分化为胰腺α、β和/或δ细胞应需要分化的细胞合成并分泌生理上适当量的胰岛素。已开发出指导hpsc细胞分化的示例性分步方案，其需要重演正常胰腺内分泌发育主要阶段的分化过程。hpsc细胞向表达激素的胰腺内分泌细胞的分化是通过使hpsc细胞转变通过胚胎发育的主要阶段进行的；分化为中胚层和定形内胚层，建立原始肠内胚层、前肠后部模式建成，以及胰腺内胚层和内分泌前体的特化和成熟。通过这些阶段，hpsc细胞可以获得胰腺内分泌表型和体外葡萄糖反应性胰岛素分泌能力。
[0185]
在一些实施方案中，本文描述的体外组合物(例如，体外第1阶段、第2阶段、第3阶段、第4阶段或第5阶段组合物)还包含水溶性合成聚合物。在一些实施方案中，水溶性合成聚合物是聚乙烯醇(pva)、泊洛沙姆、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇(peg)、peg共聚物、聚(n-异丙基丙烯酰胺)或聚丙烯酰胺，任选地，其中水溶性合成聚合物是聚乙烯醇。在一些实施方案中，水溶性合成聚合物是聚乙烯醇(pva)。在一些实施方案中，水溶性合成聚合物以以下的浓度存在于培养基中：约0.005％至约0.5％(w/v)、约0.01％至约0.2％(w/v)、约0.02％至约0.1％(w/v)或约0.03％至约0.08％(w/v)。在一些实施方案中，水溶性合成聚合物以以下的浓度存在于培养基中：约0.005％(w/v)、0.01％(w/v)、0.05％(w/v)、0.1％(w/v)、0.15％(w/v)、0.2％(w/v)、0.25％(w/v)、0.3％(w/v)、0.35％(w/v)、0.4％(w/v)、0.45％(w/v)或0.5％(w/v)。本文描述的聚乙烯醇可以指具有理想化式[ch2ch(oh)]n的水溶性合成聚合物，其可以部分或完全水解。在一些情况下，聚乙烯醇是通过聚乙酸乙烯酯的部分或完全水解以去除乙酸酯基团来制备的。在一些情况下，聚乙烯醇是最多85％水解的，例如，80％水解的。水解百分比测量聚乙酸乙烯酯前体聚合物中水解的乙酸酯残基的大约百分比(例如，平均百分比)。在一些情况下，聚乙烯醇是至少85％水解的，例如，87％-89％水解的，87％-90％水解的或99％水解的。在一些实施方案中，聚乙烯醇是78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％水解的。在一些实施方案中，水溶性合成聚合物是聚乙烯醇(pva)，并且pva是最多90％(例如，87％-89％)水解的。在一些实施方案中，pva是80％水解的(例如，在第1阶段-第4阶段)。在一些实施方案中，pva是89％水解的(例如，在第5阶段)。在一些实施方案中，第6阶段组合物特别不包含水溶性合成聚合物(例如，pva)。在一些实施方案中，第6阶段组合物包含血清白蛋白(例如，hsa)而不是水溶性合成聚合物。
[0186]
通常，至少一种胰腺α、β和/或δ细胞或其前体，例如，根据本文公开的方法产生的胰腺祖细胞，可以包括不同细胞的混合物或组合，例如，例如，细胞诸如pdx1阳性、nkx6.1阴性胰腺祖细胞、共表达pdx1和nkx6-1的胰腺祖细胞、ngn3阳性内分泌祖细胞、胰岛素阳性内分泌细胞(例如，nkx6.1阳性、isl1阳性细胞或β样细胞)和/或其他多能细胞或干细胞的混合物。
[0187]
可以根据任何合适的培养方案方案来产生至少一种胰腺α、β和/或δ细胞或其前体，以使干细胞或多能细胞分化为期望的分化阶段。在一些实施方案中，通过在适合于使至少一种多能细胞分化为至少一种胰腺α、β和/或δ细胞或其前体的条件下将至少一种多能细胞培养一段时间来产生至少一种胰腺α、β和/或δ细胞或其前体。
[0188]
在一些实施方案中，至少一种胰腺α、β和/或δ细胞或其前体是基本上纯的胰腺α、β和/或δ细胞或其前体的群体。在一些实施方案中，胰腺α、β和/或δ细胞或其前体的群体包含多能细胞或分化的细胞的混合物。在一些实施方案中，胰腺α、β和/或δ细胞或其前体的群体基本上不含或缺少胚胎干细胞或多能细胞或ips细胞。
[0189]
在一些实施方案中，可以例如以组织活检(例如皮肤活检)从受试者分离体细胞，例如成纤维细胞，并重编程为诱导多能干细胞，以进一步分化从而产生用于本文描述的组合物和方法中的至少一种sc-β细胞或其前体。在一些实施方案中，通过本领域普通技术人员已知的方法将体细胞(例如成纤维细胞)维持在培养物中，并且在一些实施方案中，在通过本文公开的方法将其转化为胰腺α、β和/或δ细胞之前进行增殖。
[0190]
在一些实施方案中，通过本领域普通技术人员已知的方法将至少一种胰腺α、β和/或δ细胞或其前体维持在培养物中，并且在一些实施方案中，在通过本文公开的方法将其转化为胰腺α、β和/或δ细胞之前进行增殖。
[0191]
此外，至少一种胰腺α、β和/或δ细胞或其前体(例如胰腺祖细胞)可以来自任何哺乳动物物种，非限制性实例包括鼠、牛、猿、猪、马、绵羊或人类细胞。为了清楚和简单起见，本文方法的描述是指哺乳动物的至少一种胰腺α、β和/或δ细胞或其前体，但是应当理解，本文描述的所有方法可以容易地应用于至少一种胰腺α、β和/或δ细胞或其前体的其他细胞类型。在一些实施方案中，至少一种胰腺α、β和/或δ细胞或其前体源自人类个体。
[0192]
定形内胚层细胞
[0193]
本公开内容的方面涉及定形内胚层细胞。本文中使用的定形内胚层细胞可以衍生自任何来源或根据任何合适的方案产生。在一些方面，多能干细胞(例如，ipsc或hesc)分化为内胚层细胞。在一些方面，内胚层细胞(第1阶段)进一步分化为例如，原始肠管细胞(第2阶段)、pdx1阳性、nkx6.1阴性胰腺祖细胞(第3阶段)、pdx1阳性、nkx6.1阳性胰腺祖细胞(第4阶段)或者ngn3阳性内分泌祖细胞或胰岛素阳性内分泌细胞(第5阶段)，随后被诱导或成熟为sc-β细胞(第6阶段)。在一些实施方案中，使第4阶段细胞(例如，第4阶段第5天细胞)与pkc激活剂(例如，pdbu)接触1天、2天、3天、4天、5天中的任何一种。在一些实施方案中，使第4阶段细胞(例如，第4阶段第5天细胞)与pkc激活剂(例如，pdbu)接触，进入第5阶段(例如，第5阶段，第2天细胞)。参见例如wo2020/033879，其通过引用以其整体并入本文。
[0194]
在一些情况下，可以通过使群体中的至少一些多能细胞分化为定形内胚层细胞来获得定形内胚层细胞，例如，通过使多能细胞的群体与i)至少一种来自tgf-β超家族的生长因子和ii)wnt信号传导途径激活剂接触，以诱导多能细胞中的至少一些分化为定形内胚层细胞，其中定形内胚层细胞表达至少一种定形内胚层特征性的标志物。
[0195]
可以在本文提供的方法中使用任何能够诱导多能干细胞分化为定形内胚层细胞的来自tgf-β超家族的生长因子(例如，单独地或与wnt信号传导途径激活剂组合)。在一些情况下，来自tgf-β超家族的生长因子包括激活素a。在一些情况下，来自tgf-β超家族的生长因子包括生长分化因子8(gdf8)。可以在本文提供的方法中使用任何能够诱导多能干细胞分化为定形内胚层细胞的wnt信号传导途径激活剂(例如，单独地或与来自tgf-β超家族的生长因子组合)。在一些情况下，wnt信号传导途径激活剂包括chir99021、3f8、a 1070722、ar-a014418、bio、bio-丙酮肟、fratide、10z-hymenialdisine、靛玉红-3
’‑
肟、kenpaullone、l803、l803-mts、碳酸锂、nsc 693868、sb 216763、sb 415286、tc-g 24、tcs2002、tcs21311或tws119。在一些实施方案中，wnt信号传导途径激活剂包括chir99021。在一些情况下，wnt信号传导途径激活剂包括wnt3a重组蛋白。
[0196]
在一些情况下，通过使多能细胞的群体与i)激活素a和ii)chir99021接触合适的时间段，例如约2天、约3天、约4天或约5天以诱导群体中的至少一些多能细胞分化为定形内胚层细胞的过程，从而使群体中的多能细胞中的至少一些分化为定形内胚层细胞，其中定形内胚层细胞表达至少一种定形内胚层特征性的标志物。在一些情况下，通过使多能细胞的群体与i)激活素a和ii)chir99021接触1天，随后使群体与激活素a(在chir99021不存在的情况下)接触2天的过程，从而使群体中的至少一些多能细胞分化为定形内胚层细胞。
[0197]
在一些实例中，该方法包括通过使多能细胞群体与合适浓度，诸如约10ng/ml、约
20ng/ml、约50ng/ml、约75ng/ml、约80ng/ml、约90ng/ml、约95ng/ml、约100ng/ml、约110ng/ml、约120ng/ml、约130ng/ml、约140ng/ml、约150ng/ml、约175ng/ml、约180ng/ml、约200ng/ml、约250ng/ml或约300ng/ml的来自tgf-β超家族的生长因子(例如，激活素a)接触，使多能细胞分化为定形内胚层细胞。在一些情况下，该方法包括使用约100ng/ml的激活素a使多能细胞分化为定形内胚层细胞。在一些情况下，该方法包括使用约200ng/ml的激活素a使多能细胞分化为定形内胚层细胞。
[0198]
在一些实例中，该方法包括通过使多能细胞群体与合适浓度，诸如约0.01μm、约0.05μm、约0.1μm、约0.2μm、约0.5μm、约0.8μm、约1μm、约1.5μm、约2μm、约2.5μm、约3μm、约3.5μm、约4μm、约5μm、约8μm、约10μm、约12μm、约15μm、约20μm、约30μm、约50μm、约100μm或约200μm的wnt信号传导途径激活剂(例如，chir99021)接触，使多能细胞分化为定形内胚层细胞。在一些情况下，该方法包括使用约2μm的chir99021使多能细胞分化为定形内胚层细胞。在一些情况下，该方法包括使用约5μm的chir99021使多能细胞分化为定形内胚层细胞。
[0199]
在一些情况下，通过如本文公开的方法产生的定形内胚层细胞表达选自由以下组成的组的至少一种标志物：nodal、tmprss2、tmem30b、st14、spink3、sh3gl2、ripk4、rab1s、npnt、clic6、cldn5、cacna1b、bnip1、anxa4、emb、foxa1、sox17和rbm35a，其中相对于定形内胚层细胞衍生自的多能干细胞，定形内胚层细胞中至少一种标志物的表达上调了统计上显著的量。在一些情况下，相对于定形内胚层细胞衍生自的多能干细胞，通过如本文公开的方法产生的定形内胚层细胞不表达统计上显著量的选自由以下组成的组的至少一种标志物：gata4、sparc、afp和dab2。在一些情况下，相对于定形内胚层细胞衍生自的多能干细胞，通过如本文公开的方法产生的定形内胚层细胞不表达统计上显著量的选自由以下组成的组的至少一种标志物：zic1、pax6、flk1和cd31。在一些情况下，相对于定形内胚层细胞衍生自的多能干细胞，通过本文公开的方法产生的定形内胚层细胞具有统计上显著量的较高水平的smad2磷酸化。在一些情况下，通过本文公开的方法产生的定形内胚层细胞具有在体内形成肠管的能力。在一些情况下，通过如本文公开的方法产生的定形内胚层细胞可以分化为具有肠细胞特征性的形态的细胞，并且其中具有肠细胞特征性的形态的细胞表达foxa2和/或claudin6。在一些情况下，通过如本文公开的方法产生的定形内胚层细胞可以进一步分化为内胚层起源的细胞。
[0200]
在一些情况下，在任何分化之前或在分化的第一阶段期间，在至少一种β细胞分化因子的存在下培养多能干细胞群体。可以使用任何多能干细胞，诸如人类多能干细胞，或人类ips细胞或本文讨论的任何多能干细胞或其他合适的多能干细胞。在一些情况下，如本文描述的β细胞分化因子可以存在于多能干细胞群体的培养基中，或者可以在多能干细胞群体的生长(例如，复制或增殖)期间以单次大剂量(bolus)或定期添加。在某些实例中，多能干细胞群体可以在任何分化之前暴露于至少一种β细胞分化因子。在其他实例中，多能干细胞群体可以在分化的第一阶段期间暴露于至少一种β细胞分化因子。
[0201]
原始肠管细胞
[0202]
本公开内容的方面涉及原始肠管细胞。本文使用的原始肠管细胞可以衍生自任何来源或者根据任何合适的方案产生。在一些方面，定形内胚层细胞分化为原始肠管细胞。在一些方面，原始肠管细胞进一步分化为例如，pdx1阳性、nkx6.1阴性胰腺祖细胞、pdx1阳性、nkx6.1阳性胰腺祖细胞、ngn3阳性内分泌祖细胞、胰岛素阳性内分泌细胞，随后被诱导或成
熟为sc-β细胞。
[0203]
在一些情况下，可以通过使群体中的至少一些定形内胚层细胞分化为原始肠管细胞来获得原始肠管细胞，例如，通过使定形内胚层细胞与至少一种来自成纤维细胞生长因子(fgf)家族的生长因子接触，以诱导至少一些定形内胚层细胞分化为原始肠管细胞，其中原始肠管细胞表达至少一种原始肠管细胞特征性的标志物。
[0204]
可以在本文提供的方法中使用任何能够诱导定形内胚层细胞分化为原始肠管细胞的来自fgf家族的生长因子(例如，单独地或与其他因子组合)。在一些情况下，至少一种来自fgf家族的生长因子包括角质形成细胞生长因子(kgf)。在一些情况下，至少一种来自fgf家族的生长因子包括fgf2。在一些情况下，至少一种来自fgf家族的生长因子包括fgf8b。在一些情况下，至少一种来自fgf家族的生长因子包括fgf10。在一些情况下，至少一种来自fgf家族的生长因子包括fgf21。
[0205]
在一些情况下，原始肠管细胞可以通过使群体中的至少一些定形内胚层细胞分化为原始肠管细胞来获得，例如，通过使定形内胚层细胞与kgf接触一段时间，例如约1天、约2天、约3天或约4天，以诱导至少一些定形内胚层细胞分化为原始肠管细胞。
[0206]
在一些情况下，该方法包括通过使定形内胚层细胞与合适浓度，诸如约10ng/ml、约20ng/ml、约50ng/ml、约75ng/ml、约80ng/ml、约90ng/ml、约95ng/ml、约100ng/ml、约110ng/ml、约120ng/ml、约130ng/ml、约140ng/ml、约150ng/ml、约175ng/ml、约180ng/ml、约200ng/ml、约250ng/ml或约300ng/ml的来自fgf家族的生长因子(例如，kgf)接触，使定形内胚层细胞分化为原始肠管细胞。在一些情况下，该方法包括使用约50ng/ml的kgf使定形内胚层细胞分化为原始肠管细胞。在一些情况下，该方法包括使用约100ng/ml的kgf使定形内胚层细胞分化为原始肠管细胞。
[0207]
pdx1阳性胰腺祖细胞
[0208]
本公开内容的方面涉及pdx1阳性、nkx6.1阴性胰腺祖细胞。本文使用的pdx1阳性、nkx6.1阴性胰腺祖细胞可以衍生自任何来源或者根据任何合适的方案产生。在一些方面，原始肠管细胞分化为pdx1阳性、nkx6.1阴性胰腺祖细胞。在一些方面，pdx1阳性、nkx6.1阴性胰腺祖细胞进一步分化为例如，pdx1阳性、nkx6.1阳性胰腺祖细胞、ngn3阳性内分泌祖细胞、胰岛素阳性内分泌细胞，随后被诱导或成熟为胰腺α、β和/或δ细胞，
[0209]
在一些方面，pdx1阳性、nkx6.1阴性胰腺祖细胞可以通过使群体中的至少一些原始肠管细胞分化为pdx1阳性、nkx6.1阴性胰腺祖细胞来获得，例如，通过使原始肠管细胞与i)至少一种bmp信号传导途径抑制剂、ii)来自tgf-β超家族的生长因子、iii)至少一种来自fgf家族的生长因子、iv)至少一种shh途径抑制剂、v)至少一种视黄酸(ra)信号传导途径激活剂、vi)至少一种蛋白激酶c激活剂以及vii)rock抑制剂接触，以诱导原始肠管细胞中的至少一些分化为pdx1阳性、nkx6.1阴性胰腺祖细胞。
[0210]
在一些方面，pdx1阳性、nkx6.1阴性胰腺祖细胞可以通过使群体中的至少一些原始肠管细胞分化为pdx1阳性、nkx6.1阴性胰腺祖细胞来获得，例如，通过使原始肠管细胞与i)至少一种bmp信号传导途径抑制剂、ii)来自tgf-β超家族的生长因子、iii)至少一种来自fgf家族的生长因子、iv)至少一种shh途径抑制剂、v)至少一种视黄酸(ra)信号传导途径激活剂以及vi)至少一种蛋白激酶c激活剂接触，以诱导原始肠管细胞中的至少一些分化为pdx1阳性、nkx6.1阴性胰腺祖细胞。
[0211]
在一些情况下，pdx1阳性、nkx6.1阴性胰腺祖细胞可以通过使群体中的至少一些原始肠管细胞分化为pdx1阳性、nkx6.1阴性胰腺祖细胞来获得，例如，通过使原始肠管细胞与i)至少一种bmp信号传导途径抑制剂、ii)至少一种来自fgf家族的生长因子、iii)至少一种shh途径抑制剂、iv)至少一种视黄酸(ra)信号传导途径激活剂以及v)至少一种蛋白激酶c激活剂接触，以诱导原始肠管细胞中的至少一些分化为pdx1阳性、nkx6.1阴性胰腺祖细胞。
[0212]
在一些情况下，pdx1阳性、nkx6.1阴性胰腺祖细胞可以通过使群体中的至少一些原始肠管细胞分化为pdx1阳性、nkx6.1阴性胰腺祖细胞来获得，例如，通过使原始肠管细胞与i)至少一种shh途径抑制剂、ii)至少一种视黄酸(ra)信号传导途径激活剂以及iii)至少一种蛋白激酶c激活剂接触。
[0213]
在一些情况下，pdx1阳性、nkx6.1阴性胰腺祖细胞可以通过使群体中的至少一些原始肠管细胞分化为pdx1阳性、nkx6.1阴性胰腺祖细胞来获得，例如，通过使原始肠管细胞与i)至少一种来自fgf家族的生长因子和ii)至少一种视黄酸(ra)信号传导途径激活剂接触，以诱导原始肠管细胞中的至少一些分化为pdx1阳性、nkx6.1阴性胰腺祖细胞。在一些情况下，pdx1阳性、nkx6.1阴性胰腺祖细胞可以通过使群体中的至少一些原始肠管细胞分化为pdx1阳性胰腺祖细胞来获得，例如，通过使原始肠管细胞与dmh-1、激活素a、视黄酸、kgf、sant1、ldn193189、pdbu接触第一天，并且与激活素a、视黄酸、kgf、sant1、ldn193189、pdbu接触第二天。在一些实施方案中，细胞在第二天不与dmh-1接触。
[0214]
可以在本文提供的方法中使用任何能够诱导原始肠管细胞分化为pdx1阳性、nkx6.1阴性胰腺祖细胞的bmp信号传导途径抑制剂(例如，单独地，或与来自tgf-β超家族的生长因子、至少一种来自fgf家族的生长因子、至少一种shh途径抑制剂、至少一种视黄酸信号传导途径激活剂、至少一种蛋白激酶c激活剂和rock抑制剂进行任何组合)。在一些情况下，bmp信号传导途径抑制剂包括ldn193189或dmh-1。在一些实例中，该方法包括使原始肠管细胞与一定浓度，诸如，约30nm、约40nm、约50nm、约60nm、约70nm、约80nm、约90nm、约100nm、约110nm、约120nm、约130nm、约140nm、约150nm、约160nm、约170nm、约180nm、约190nm、约200nm、约210nm、约220nm、约230nm、约240nm、约250nm、约280nm、约300nm、约400nm、约500nm或约1μm的bmp信号传导途径抑制剂(例如，ldn193189)接触。在一些实例中，该方法包括使原始肠管细胞与一定浓度，诸如，约0.01μm、约0.02μm、约0.05μm、约0.1μm、约0.2μm、约0.5μm、约0.8μm、约1μm、约1.2μm、约1.5μm、约1.75μm、约2μm、约2.2μm、约2.5μm、约2.75μm、约3μm、约3.25μm、约3.5μm、约3.75μm、约4μm、约4.5μm、约5μm、约8μm、约10μm、约15μm、约20μm、约30μm、约40μm、约50μm或约100μm的bmp信号传导途径抑制剂(例如，dmh-1)接触。
[0215]
可以使用任何能够诱导原始肠管细胞分化为pdx1阳性、nkx6.1阴性胰腺祖细胞的来自tgf-β超家族的生长因子(例如，单独地，或与至少一种bmp信号传导途径抑制剂、来自fgf家族的生长因子、至少一种shh途径抑制剂、至少一种视黄酸信号传导途径激活剂、至少一种蛋白激酶c激活剂和rock抑制剂进行任何组合)。在一些情况下，来自tgf-β家族的生长因子包括激活素a。在一些情况下，来自tgf-β家族的生长因子包括激活素a或gdf8。在一些实例中，该方法包括使原始肠管细胞与一定浓度，诸如，约5ng/ml、约7.5ng/ml、约8ng/ml、约9ng/ml、约10ng/ml、约11ng/ml、约12ng/ml、约13ng/ml、约14ng/ml、约15ng/ml、约16ng/
ml、约17ng/ml、约18ng/ml、约19ng/ml、约20ng/ml、约21ng/ml、约22ng/ml、约23ng/ml、约24ng/ml、约25ng/ml、约26ng/ml、约27ng/ml、约28ng/ml、约29ng/ml、约30ng/ml、约35ng/ml、约40ng/ml、约50ng/ml或约100ng/ml的来自tgf-β超家族的生长因子(例如，激活素a)接触。
[0216]
可以使用任何能够诱导原始肠管细胞分化为pdx1阳性、nkx6.1阴性胰腺祖细胞的来自fgf家族的生长因子(例如，单独地，或与至少一种bmp信号传导途径抑制剂、来自tgf-β超家族的生长因子、至少一种shh途径抑制剂、至少一种视黄酸信号传导途径激活剂、至少一种蛋白激酶c激活剂和rock抑制剂进行任何组合)。在一些情况下，至少一种来自fgf家族的生长因子包括角质形成细胞生长因子(kgf)。在一些情况下，至少一种来自fgf家族的生长因子选自由以下组成的组：fgf2、fgf8b、fgf 10和fgf21。在一些实例中，该方法包括使原始肠管细胞与一定浓度，诸如，约10ng/ml、约20ng/ml、约50ng/ml、约75ng/ml、约80ng/ml、约90ng/ml、约95ng/ml、约100ng/ml、约110ng/ml、约120ng/ml、约130ng/ml、约140ng/ml、约150ng/ml、约175ng/ml、约180ng/ml、约200ng/ml、约250ng/ml或约300ng/ml的来自fgf家族的生长因子(例如，kgf)接触。
[0217]
可以使用任何能够诱导原始肠管细胞分化为pdx1阳性、nkx6.1阴性胰腺祖细胞的shh途径抑制剂(例如，单独地，或与至少一种bmp信号传导途径抑制剂、至少一种来自fgf家族的至少一种生长因子、来自tgf-β超家族的生长因子、至少一种视黄酸信号传导途径激活剂、至少一种蛋白激酶c激活剂和rock抑制剂进行任何组合)。在一些情况下，shh途径抑制剂包括sant1。在一些实例中，该方法包括使原始肠管细胞与一定浓度，诸如，约0.001μm、约0.002μm、约0.005μm、约0.01μm、约0.02μm、约0.03μm、约0.05μm、约0.08μm、约0.1μm、约0.12μm、约0.13μm、约0.14μm、约0.15μm、约0.16μm、约0.17μm、约0.18μm、约0.19μm、约0.2μm、约0.21μm、约0.22μm、约0.23μm、约0.24μm、约0.25μm、约0.26μm、约0.27μm、约0.28μm、约0.29μm、约0.3μm、约0.31μm、约0.32μm、约0.33μm、约0.34μm、约0.35μm、约0.4μm、约0.45μm、约0.5μm、约0.6μm、约0.8μm、约1μm、约2μm或约5μm的shh途径抑制剂(例如，sant1)接触。
[0218]
可以使用任何能够诱导原始肠管细胞分化为pdx1阳性、nkx6.1阴性胰腺祖细胞的ra信号传导途径激活剂(例如，单独地，或与至少一种bmp信号传导途径抑制剂、至少一种来自fgf家族的生长因子、至少一种shh途径抑制剂、至少一种蛋白激酶c激活剂和rock抑制剂进行任何组合)。在一些情况下，ra信号传导途径激活剂包括视黄酸。在一些实例中，该方法包括使原始肠管细胞与一定浓度，诸如，约0.02μm、约0.1μm、约0.2μm、约0.25μm、约0.3μm、约0.4μm、约0.45μm、约0.5μm、约0.55μm、约0.6μm、约0.65μm、约0.7μm、约0.75μm、约0.8μm、约0.85μm、约0.9μm、约1μm、约1.1μm、约1.2μm、约1.3μm、约1.4μm、约1.5μm、约1.6μm、约1.7μm、约1.8μm、约1.9μm、约2μm、约2.1μm、约2.2μm、约2.3μm、约2.4μm、约2.5μm、约2.6μm、约2.7μm、约2.8μm、约3μm、约3.2μm、约3.4μm、约3.6μm、约3.8μm、约4μm、约4.2μm、约4.4μm、约4.6μm、约4.8μm、约5μm、约5.5μm、约6μm、约6.5μm、约7μm、约7.5μm、约8μm、约8.5μm、约9μm、约9.5μm、约10μm、约12μm、约14μm、约15μm、约16μm、约18μm、约20μm、约50μm或约100μm的ra信号传导途径激活剂(例如，视黄酸)接触。
[0219]
可以使用任何能够诱导原始肠管细胞分化为pdx1阳性、nkx6.1阴性胰腺祖细胞的pkc激活剂(例如，单独地，或与至少一种bmp信号传导途径抑制剂、至少一种来自fgf家族的生长因子、至少一种shh途径抑制剂、至少一种ra信号传导途径激活剂和rock抑制剂进行任
何组合)。在一些情况下，pkc激活剂包括pdbu。在一些情况下，pkc激活剂包括tpb。在一些实例中，该方法包括使原始肠管细胞与一定浓度，诸如，约10nm、50nm、100nm、150nm、200nm、250nm、300nm、350nm、400nm、450nm、500nm、550nm、600nm、650nm、700nm、750nm、800nm、850nm、900nm、950nm、1μm、10μm、约20μm、约50μm、约75μm、约80μm、约100μm、约120μm、约140μm、约150μm、约175μm、约180μm、约200μm、约210μm、约220μm、约240μm、约250μm、约260μm、约280μm、约300μm、约320μm、约340μm、约360μm、约380μm、约400μm、约420μm、约440μm、约460μm、约480μm、约500μm、约520μm、约540μm、约560μm、约580μm、约600μm、约620μm、约640μm、约660μm、约680μm、约700μm、约750μm、约800μm、约850μm、约900μm、约1mm、约2mm、约3mm、约4mm或约5mm的pkc激活剂(例如，pdbu)接触。在一些实施方案中，该方法包括使原始肠管细胞与10nm-1mm、10nm-500μm、10nm-1μm、10nm-800nm、100nm-900nm、300nm-800nm、300nm-600nm、400nm-600nm、450nm-550nm或约500nm的浓度的pkc激活剂(例如，pdbu)接触。在一些实施方案中，未用pkc激活剂(例如，pdbu)处理原始肠管细胞。
[0220]
可以使用任何能够诱导原始肠管细胞分化为pdx1阳性、nkx6.1阴性胰腺祖细胞的rock抑制剂(例如，单独地，或与至少一种bmp信号传导途径抑制剂、至少一种来自fgf家族的生长因子、至少一种shh途径抑制剂、pkc激活剂和至少一种ra信号传导途径激活剂进行任何组合)。在一些情况下，rock抑制剂包括thiazovivin、y-27632、法舒地尔/ha1077或h-1152。在一些情况下，rock抑制剂包括y-27632。在一些情况下，rock抑制剂包括thiazovivin。在一些实例中，该方法包括使原始肠管细胞与一定浓度，诸如，约0.2μm、约0.5μm、约0.75μm、约1μm、约2μm、约3μm、约4μm、约5μm、约6μm、约7μm、约7.5μm、约8μm、约9μm、约10μm、约11μm、约12μm、约13μm、约14μm、约15μm、约16μm、约17μm、约18μm、约19μm、约20μm、约21μm、约22μm、约23μm、约24μm、约25μm、约26μm、约27μm、约28μm、约29μm、约30μm、约35μm、约40μm、约50μm或约100μm的rock抑制剂(例如，y-27632或thiazovivin)接触。
[0221]
在一些情况下，pdx1阳性、nkx6.1阴性胰腺祖细胞可以通过使群体中的至少一些原始肠管细胞分化为pdx1阳性、nkx6.1阴性胰腺祖细胞来获得，例如，通过使原始肠管细胞与视黄酸、kgf、sant1、dmh-1、pdbu、thiazovivin和激活素a接触合适的时间段，例如约1天、约2天、约3天或约4天。在一些情况下，pdx1阳性、nkx6.1阴性胰腺祖细胞可以通过使群体中的至少一些原始肠管细胞分化为pdx1阳性、nkx6.1阴性胰腺祖细胞来获得，例如，通过使原始肠管细胞与视黄酸、kgf、sant1、dmh-1、pdbu、thiazovivin和激活素a接触约2天。在一些情况下，pdx1阳性、nkx6.1阴性胰腺祖细胞可以通过使至少一些原始肠管细胞在s3培养基中分化来获得。
[0222]
nkx6.1阳性胰腺祖细胞
[0223]
本公开内容的方面涉及pdx1阳性、nkx6.1阳性胰腺祖细胞。本文使用的pdx1阳性、nkx6.1阳性胰腺祖细胞可以衍生自任何来源或者根据任何合适的方案产生。在一些方面，pdx1阳性、nkx6.1阴性胰腺祖细胞分化为pdx1阳性、nkx6.1阳性胰腺祖细胞。在一些方面，pdx1阳性、nkx6.1阳性胰腺祖细胞进一步分化为例如，ngn3阳性内分泌祖细胞或胰岛素阳性内分泌细胞，随后被诱导或成熟为胰腺α、β和/或δ细胞。
[0224]
在一些方面，由pdx1阳性、nkx6.1阴性胰腺祖细胞产生pdx1阳性、nkx6.1阳性胰腺祖细胞的方法包括使包含pdx1阳性、nkx6.1阴性胰腺祖细胞的细胞的群体(例如，在促进细胞簇集和/或促进细胞存活的条件下)与包含以下的至少两种β细胞分化因子接触：a)至少
一种来自成纤维细胞生长因子(fgf)家族的生长因子，b)音猬途径抑制剂，和任选地c)低浓度的视黄酸(ra)信号传导途径激活剂，以诱导群体中的至少一个pdx1阳性、nkx6.1阴性胰腺祖细胞分化为nkx6.1阳性、nkx6.1阳性胰腺祖细胞。
[0225]
在一些情况下，pdx1阳性、nkx6.1阳性胰腺祖细胞通过使pdx1阳性、nkx6.1阴性胰腺祖细胞与i)至少一种来自fgf家族的生长因子、ii)至少一种shh途径抑制剂以及任选地iii)低浓度的ra信号传导途径激活剂接触，以诱导pdx1阳性、nkx6.1阴性胰腺祖细胞中的至少一些分化为pdx1阳性、nkx6.1阳性胰腺祖细胞来获得。
[0226]
在一些情况下，pdx1阳性、nkx6.1阳性胰腺祖细胞通过使pdx1阳性、nkx6.1阴性胰腺祖细胞与i)至少一种来自fgf家族的生长因子、ii)至少一种shh途径抑制剂、以及任选地iii)ra信号传导途径激活剂、iv)rock抑制剂和v)至少一种来自tgf-β超家族的生长因子接触，以诱导pdx1阳性、nkx6.1阴性胰腺祖细胞中的至少一些分化为pdx1阳性、nkx6.1阳性胰腺祖细胞来获得。在一些情况下，pdx1阳性、nkx6.1阳性胰腺祖细胞通过使pdx1阳性、nkx6.1阴性胰腺祖细胞在促进细胞簇集的条件下与至少一种来自fgf家族的生长因子接触来获得。在一些实施方案中，向pdx1阳性、nkx6.1阴性胰腺祖细胞施用pkc激活剂(例如，pdbu)。参见例如wo2020/033879，其通过引用以其整体并入本文。
[0227]
可以在本文提供的方法中使用任何能够诱导pdx1阳性、nkx6.1阴性胰腺祖细胞分化为pdx1阳性、nkx6.1阳性胰腺祖细胞的来自fgf家族的生长因子(例如，单独地，或与至少一种shh途径抑制剂、rock抑制剂、来自tgf-β超家族的生长因子和至少一种视黄酸信号传导途径激活剂进行任何组合)。在一些情况下，至少一种来自fgf家族的生长因子包括角质形成细胞生长因子(kgf)。在一些情况下，至少一种来自fgf家族的生长因子选自由以下组成的组：fgf2、fgf8b、fgf10和fgf21。在一些实例中，该方法包括使pdx1阳性、nkx6.1阴性胰腺祖细胞与一定浓度，诸如，约10ng/ml、约20ng/ml、约50ng/ml、约75ng/ml、约80ng/ml、约90ng/ml、约95ng/ml、约100ng/ml、约110ng/ml、约120ng/ml、约130ng/ml、约140ng/ml、约150ng/ml、约175ng/ml、约180ng/ml、约200ng/ml、约250ng/ml或约300ng/ml的来自fgf家族的生长因子(例如，kgf、fgf2或两者)接触。
[0228]
可以在本文提供的方法中使用任何能够诱导pdx1阳性、nkx6.1阴性胰腺祖细胞分化为pdx1阳性、nkx6.1阳性胰腺祖细胞的shh途径抑制剂(例如，单独地，或与至少一种来自fgf家族的生长因子、至少一种视黄酸信号传导途径激活剂、rock抑制剂和至少一种来自tgf-β超家族的生长因子进行任何组合)。在一些情况下，shh途径抑制剂包括sant1。在一些实例中，该方法包括使pdx1阳性、nkx6.1阴性胰腺祖细胞与一定浓度，诸如，约0.001μm、约0.002μm、约0.005μm、约0.01μm、约0.02μm、约0.03μm、约0.05μm、约0.08μm、约0.1μm、约0.12μm、约0.13μm、约0.14μm、约0.15μm、约0.16μm、约0.17μm、约0.18μm、约0.19μm、约0.2μm、约0.21μm、约0.22μm、约0.23μm、约0.24μm、约0.25μm、约0.26μm、约0.27μm、约0.28μm、约0.29μm、约0.3μm、约0.31μm、约0.32μm、约0.33μm、约0.34μm、约0.35μm、约0.4μm、约0.45μm、约0.5μm、约0.6μm、约0.8μm、约1μm、约2μm或约5μm的shh途径抑制剂(例如，sant1)接触。
[0229]
可以使用任何能够诱导pdx1阳性、nkx6.1阴性胰腺祖细胞分化为pdx1阳性、nkx6.1阳性胰腺祖细胞的ra信号传导途径激活剂(例如，单独地，或与至少一种来自fgf家族的生长因子、至少一种shh途径抑制剂、rock抑制剂和至少一种来自tgf-β超家族的生长因子进行任何组合)。在一些情况下，ra信号传导途径激活剂包括视黄酸。在一些实例中，该
方法包括使pdx1阳性、nkx6.1阴性胰腺祖细胞与一定浓度，诸如，约0.02μm、约0.1μm、约0.2μm、约0.25μm、约0.3μm、约0.4μm、约0.45μm、约0.5μm、约0.55μm、约0.6μm、约0.65μm、约0.7μm、约0.75μm、约0.8μm、约0.85μm、约0.9μm、约1μm、约1.1μm、约1.2μm、约1.3μm、约1.4μm、约1.5μm、约1.6μm、约1.7μm、约1.8μm、约1.9μm、约2μm、约2.1μm、约2.2μm、约2.3μm、约2.4μm、约2.5μm、约2.6μm、约2.7μm、约2.8μm、约3μm、约3.2μm、约3.4μm、约3.6μm、约3.8μm、约4μm、约4.2μm、约4.4μm、约4.6μm、约4.8μm、约5μm、约5.5μm、约6μm、约6.5μm、约7μm、约7.5μm、约8μm、约8.5μm、约9μm、约9.5μm、约10μm、约12μm、约14μm、约15μm、约16μm、约18μm、约20μm、约50μm或约100μm的ra信号传导途径激活剂(例如，视黄酸)接触。
[0230]
可以使用任何能够诱导pdx1阳性、nkx6.1阴性胰腺祖细胞分化为pdx1阳性、nkx6.1阳性胰腺祖细胞的rock抑制剂(例如，单独地，或与至少一种来自fgf家族的生长因子、至少一种shh途径抑制剂、ra信号传导途径激活剂和至少一种来自tgf-β超家族的生长因子进行任何组合)。在一些情况下，rock抑制剂包括thiazovivin、y-27632、法舒地尔/ha1077和14-1152。在一些实例中，该方法包括使pdx1阳性、nkx6.1阴性胰腺祖细胞与一定浓度，诸如，约0.2μm、约0.5μm、约0.75μm、约1μm、约2μm、约3μm、约4μm、约5μm、约6μm、约7μm、约7.5μm、约8μm、约9μm、约10μm、约11μm、约12μm、约13μm、约14μm、约15μm、约16μm、约17μm、约18μm、约19μm、约20μm、约21μm、约22μm、约23μm、约24μm、约25μm、约26μm、约27μm、约28μm、约29μm、约30μm、约35μm、约40μm、约50μm或约100μm的rock抑制剂(例如，y-27632或thiazovivin)接触。
[0231]
可以使用任何能够诱导pdx1阳性、nkx6.1阴性胰腺祖细胞分化为pdx1阳性、nkx6.1阳性胰腺祖细胞的来自tgf-β超家族的激活剂(例如，单独地，或与至少一种来自fgf家族的生长因子、至少一种shh途径抑制剂、ra信号传导途径激活剂和rock抑制剂进行任何组合)。在一些情况下，来自tgf-β超家族的激活剂包括激活素a或gdf8。在一些实例中，该方法包括使pdx1阳性、nkx6.1阴性胰腺祖细胞与一定浓度，诸如，约0.1ng/ml、约0.2ng/ml、约0.3ng/ml、约0.4ng/ml、约0.5ng/ml、约0.6ng/ml、约0.7ng/ml、约0.8ng/ml、约1ng/ml、约1.2ng/ml、约1.4ng/ml、约1.6ng/ml、约1.8ng/ml、约2ng/ml、约2.2ng/ml、约2.4ng/ml、约2.6ng/ml、约2.8ng/ml、约3ng/ml、约3.2ng/ml、约3.4ng/ml、约3.6ng/ml、约3.8ng/ml、约4ng/ml、约4.2ng/ml、约4.4ng/ml、约4.6ng/ml、约4.8ng/ml、约5ng/ml、约5.2ng/ml、约5.4ng/ml、约5.6ng/ml、约5.8ng/ml、约6ng/ml、约6.2ng/ml、约6.4ng/ml、约6.6ng/ml、约6.8ng/ml、约7ng/ml、约8ng/ml、约9ng/ml、约10ng/ml、约20ng/ml、约30ng/ml或约50ng/ml的来自tgf-β超家族的生长因子(例如，激活素a)接触。在一些实例中，该方法包括使pdx1阳性、nkx6.1阴性胰腺祖细胞与一定浓度，诸如，约5ng/ml的来自tgf-β超家族的生长因子(例如，激活素a)接触。
[0232]
在一些情况下，pdx1阳性、nkx6.1阳性胰腺祖细胞通过使pdx1阳性、nkx6.1阴性胰腺祖细胞在促进细胞簇集的条件下与kgf、sant1和ra接触5天或6天的时间段来获得。在一些情况下，pdx1阳性、nkx6.1阳性胰腺祖细胞通过使pdx1阳性、nkx6.1阴性胰腺祖细胞在促进细胞簇集的条件下与kgf、sant1、ra、thiazovivin和激活素a接触5天或6天的时间段来获得。在一些情况下，pdx1阳性、nkx6.1阳性胰腺祖细胞通过使pdx1阳性、nkx6.1阴性胰腺祖细胞在促进细胞簇集的条件下与kgf接触5天或6天的时间段来获得。在一些情况下，pdx1阳性、nkx6.1阳性胰腺祖细胞通过使pdx1阳性、nkx6.1阴性胰腺祖细胞在s3培养基中分化来
获得。
[0233]
在一些情况下，pdx1阳性、nkx6.1阳性胰腺祖细胞通过使pdx1阳性、nkx6.1阴性胰腺祖细胞在促进细胞簇集的条件下与kgf、sant1、ra、thiazovivin和/或激活素a接触5天或6天的时间段来获得。在一些实施方案中，pdx1阳性、nkx6.1阳性胰腺祖细胞通过以下获得：a)使pdx1阳性、nkx6.1阴性胰腺祖细胞与kgf、sant1、ra、thiazovivin和激活素a接触3天、4天或5天的时间段，随后b)使a)的细胞与pdbu、xxi、kgf、sant1、ra、thiazovivin和激活素a接触1天、2天或3天的时间段。
[0234]
胰岛素阳性内分泌细胞
[0235]
本公开内容的方面涉及胰岛素阳性内分泌细胞(例如，nkx6.1阳性、isl1阳性细胞或β样细胞)。本文使用的胰岛素阳性内分泌细胞可以衍生自任何来源或者根据任何合适的方案产生。在一些方面，pdx1阳性、nkx6.1阳性胰腺祖细胞分化为胰岛素阳性内分泌细胞(例如，nkx6.1阳性、isl1阳性细胞或β样细胞)。在一些方面，胰岛素阳性内分泌细胞进一步分化，例如，通过诱导或成熟为sc-β细胞。
[0236]
在一些方面，从pdx1阳性、nkx6.1阳性胰腺祖细胞产生胰岛素阳性内分泌细胞的方法包括使包含pdx1阳性、nkx6-1阳性胰腺祖细胞的细胞的群体(例如，在促进细胞簇集的条件下)与a)tgf-β信号传导途径抑制剂、b)甲状腺激素信号传导途径激活剂和c)蛋白激酶抑制剂和/或音猬抑制剂接触，以诱导群体中的至少一个pdx1阳性、nkx6.1阳性胰腺祖细胞分化为胰岛素阳性内分泌细胞，其中该胰岛素阳性内分泌细胞表达胰岛素。在一些情况下，胰岛素阳性内分泌细胞表达pdx1、nkx6.1、isl1、nkx2.2、mafb、glis3、sur1、kir6.2、znt8、slc2a1、slc2a3和/或胰岛素。
[0237]
可以使用任何能够诱导pdx1阳性、nkx6.1阳性胰腺祖细胞分化为胰岛素阳性内分泌细胞的tgf-β信号传导途径抑制剂(例如，单独地，或与其他β细胞分化因子，例如，甲状腺激素信号传导途径激活剂进行组合)。在一些情况下，tgf-β信号传导途径包括tgf-β受体i型激酶信号传导。在一些情况下，tgf-β信号传导途径抑制剂包括alk5抑制剂ii。
[0238]
可以使用任何能够诱导pdx1阳性、nkx6.1阳性胰腺祖细胞分化为胰岛素阳性内分泌细胞的甲状腺激素信号传导途径激活剂(例如，单独地，或与其他β细胞分化因子，例如，tgf-β信号传导途径抑制剂进行组合)。在一些情况下，甲状腺激素信号传导途径激活剂包括三碘甲腺原氨酸(t3)。在一些情况下，甲状腺激素信号传导途径激活剂包括gc-1。
[0239]
在一些情况下，该方法包括使细胞的群体(例如，pdx1阳性、nkx6.1阳性胰腺祖细胞)与至少一种另外的因子接触。在一些情况下，该方法包括使pdx1阳性、nkx6.1阳性胰腺祖细胞与以下中的至少一种接触：i)shh途径抑制剂、ii)ra信号传导途径激活剂、iii)γ-分泌酶抑制剂、iv)至少一种来自表皮生长因子(egf)家族的生长因子、v)蛋白激酶抑制剂、vi)tgf-β信号传导途径抑制剂或vii)甲状腺激素信号传导途径激活剂。在一些实施方案中，该方法包括使细胞的群体(例如，pdx1阳性、nkx6.1阳性胰腺祖细胞)与至少一种另外的因子接触。在一些情况下，该方法包括使pdx1阳性、nkx6.1阳性胰腺祖细胞与以下中的至少一种或更多种接触：i)shh途径抑制剂、ii)ra信号传导途径激活剂、iii)γ-分泌酶抑制剂、iv)至少一种来自表皮生长因子(egf)家族的生长因子、v)蛋白激酶抑制剂、vi)tgf-β信号传导途径抑制剂、vii)甲状腺激素信号传导途径激活剂或viii)pkc激活剂。在一些实施方案中，向pdx1阳性、nkx6.1阳性胰腺祖细胞施用pkc激活剂(例如，pdbu)1天、2天或3天。参见
例如wo2020/033879或us20210238553，其中的每一个通过引用以其整体并入本文。
[0240]
在一些情况下，该方法包括使pdx1阳性、nkx6.1阳性胰腺祖细胞与以下中的至少一种接触：i)shh途径抑制剂、ii)ra信号传导途径激活剂、iii)γ-分泌酶抑制剂、iv)至少一种来自表皮生长因子(egf)家族的生长因子、v)至少一种骨形态发生蛋白(bmp)信号传导途径抑制剂、vi)tgf-β信号传导途径抑制剂、vii)甲状腺激素信号传导途径激活剂、viii)蛋白激酶抑制剂(例如，星形孢菌素)或ix)rock抑制剂。
[0241]
在一些情况下，该方法包括使pdx1阳性、nkx6.1阳性胰腺祖细胞与以下中的至少一种接触：i)shh途径抑制剂、ii)ra信号传导途径激活剂、iii)γ-分泌酶抑制剂、iv)至少一种来自表皮生长因子(egf)家族的生长因子、v)至少一种骨形态发生蛋白(bmp)信号传导途径抑制剂、vi)tgf-β信号传导途径抑制剂、vii)甲状腺激素信号传导途径激活剂、viii)表观遗传修饰化合物、ix)蛋白激酶抑制剂或x)rock抑制剂。
[0242]
在一些情况下，该方法包括使pdx1阳性、nkx6.1阳性胰腺祖细胞与以下中的至少一种接触：i)shh途径抑制剂、ii)ra信号传导途径激活剂、iii)γ-分泌酶抑制剂、iv)至少一种来自表皮生长因子(egf)家族的生长因子、v)至少一种骨形态发生蛋白(bmp)信号传导途径抑制剂、vi)tgf-β信号传导途径抑制剂、vii)甲状腺激素信号传导途径激活剂、viii)表观遗传修饰化合物、ix)蛋白激酶抑制剂(例如，星形孢菌素)、x)rock抑制剂和/或xi)烟酰胺。
[0243]
在一些实施方案中，在从pdx1阳性、nkx6.1阳性胰腺祖细胞产生胰岛素阳性内分泌细胞的方法中，一些分化因子仅在分化步骤的前1天、2天、3天、4天或5天期间存在。在一些情况下，在孵育的前1天、2天或3天后，将一些分化因子，诸如shh途径抑制剂、pkc激活剂、ra信号传导途径激活剂和至少一种来自egf家族的生长因子从培养基中去除和/或其不存在于培养基中。
[0244]
在一些情况下，该方法包括使pdx1阳性、nkx6.1阳性胰腺祖细胞与以下中的至少一种接触1天、2天、3天或4天(例如，3天)的时间段：i)shh途径抑制剂、ii)ra信号传导途径激活剂、iii)γ-分泌酶抑制剂、iv)来自表皮生长因子(egf)家族的生长因子、v)至少一种骨形态发生蛋白(bmp)信号传导途径抑制剂、vi)tgf-β信号传导途径抑制剂、vii)甲状腺激素信号传导途径激活剂、viii)表观遗传修饰化合物、ix)蛋白激酶抑制剂(例如，星形孢菌素)和/或x)rock抑制剂，并且然后使细胞在i)shh途径抑制剂、ii)ra信号传导途径激活剂和/或来自表皮生长因子(egf)家族的生长因子不存在的情况下与以下中的至少一种接触2天、3天、4天、5天或6天(例如，4天)的时间段：i)γ-分泌酶抑制剂、ii)骨形态发生蛋白(bmp)信号传导途径抑制剂、iii)tgf-β信号传导途径抑制剂、iv)甲状腺激素信号传导途径激活剂、v)表观遗传修饰化合物、vi)蛋白激酶抑制剂和/或vii)rock抑制剂。
[0245]
可以使用任何能够诱导群体中的pdx1阳性、nkx6.1阳性胰腺祖细胞分化为胰岛素阳性内分泌细胞的γ-分泌酶抑制剂(例如，单独地，或与tgf-β信号传导途径抑制剂和/或甲状腺激素信号传导途径激活剂中的任何剂进行组合)。在一些情况下，γ-分泌酶抑制剂包括xxi。在一些情况下，γ-分泌酶抑制剂包括dapt。在一些实例中，该方法包括使pdx1阳性、nkx6.1阳性胰腺祖细胞与一定浓度，诸如，约0.01μm、约0.02μm、约0.05μm、约0.075μm、约0.1μm、约0.2μm、约0.3μm、约0.4μm、约0.5μm、约0.6μm、约0.7μm、约0.8μm、约0.9μm、约1μm、约1.1μm、约1.2μm、约1.3μm、约1.4μm、约1.5μm、约1.6μm、约1.7μm、约1.8μm、约1.9μm、约2
μm、约2.1μm、约2.2μm、约2.3μm、约2.4μm、约2.5μm、约2.6μm、约2.7μm、约2.8μm、约2.9μm、约3μm、约3.2μm、约3.4μm、约3.6μm、约3.8μm、约4μm、约4.2μm、约4.4μm、约4.6μm、约4.8μm、约5μm、约5.2μm、约5.4μm、约5.6μm、约5.8μm、约6μm、约6.2μm、约6.4μm、约6.6μm、约6.8μm、约7μm、约8μm、约9μm、约10μm、约20μm、约30μm或约50μm的γ-分泌酶抑制剂(例如，xxi)接触。
[0246]
可以使用任何能够诱导群体中的pdx1阳性、nkx6.1阳性胰腺祖细胞分化为胰岛素阳性内分泌细胞的来自egf家族的生长因子(例如，单独地，或与tgf-β信号传导途径抑制剂和/或甲状腺激素信号传导途径激活剂中的任何剂进行组合)。在一些情况下，至少一种来自egf家族的生长因子包括β细胞素。在一些情况下，至少一种来自egf家族的生长因子包括egf。在一些实例中，该方法包括使pdx1阳性、nkx6.1阳性胰腺祖细胞与一定浓度，诸如，约1ng/ml、约2ng/ml、约4ng/ml、约6ng/ml、约8ng/ml、约10ng/ml、约12ng/ml、约14ng/ml、约16ng/ml、约18ng/ml、约20ng/ml、约22ng/ml、约24ng/ml、约26ng/ml、约28ng/ml、约30ng/ml、约40ng/ml、约50ng/ml、约75ng/ml、约80ng/ml、约90ng/ml、约95ng/ml、约100ng/ml、约150ng/ml、约200ng/ml、约250ng/ml或约300ng/ml的来自egf家族的生长因子(例如，β细胞素)接触。
[0247]
在一些实施方案中，该方法包括使pdx1阳性、nkx6.1阳性胰腺祖细胞与约1mm至约100mm、约2mm至约50mm、约5mm至约20mm或约7.5mm至约15mm烟酰胺浓度的烟酰胺接触。在一些情况下，组合物包含约10mm烟酰胺。
[0248]
可以使用任何能够诱导pdx1阳性、nkx6.1阳性胰腺祖细胞分化为胰岛素阳性内分泌细胞的ra信号传导途径激活剂(例如，单独地，或与tgf-β信号传导途径抑制剂和/或甲状腺激素信号传导途径激活剂中的任何剂进行组合)。在一些情况下，ra信号传导途径激活剂包括ra。在一些实例中，该方法包括使pdx1阳性、nkx6.1阳性胰腺祖细胞与一定浓度，诸如，约0.02μm、约0.1μm、约0.2μm、约0.25μm、约0.3μm、约0.4μm、约0.45μm、约0.5μm、约0.55μm、约0.6μm、约0.65μm、约0.7μm、约0.75μm、约0.8μm、约0.85μm、约0.9μm、约1μm、约1.1μm、约1.2μm、约1.3μm、约1.4μm、约1.5μm、约1.6μm、约1.7μm、约1.8μm、约1.9μm、约2μm、约2.1μm、约2.2μm、约2.3μm、约2.4μm、约2.5μm、约2.6μm、约2.7μm、约2.8μm、约3μm、约3.2μm、约3.4μm、约3.6μm、约3.8μm、约4μm、约4.2μm、约4.4μm、约4.6μm、约4.8μm、约5μm、约5.5μm、约6μm、约6.5μm、约7μm、约7.5μm、约8μm、约8.5μm、约9μm、约9.5μm、约10μm、约12μm、约14μm、约15μm、约16μm、约18μm、约20μm、约50μm或约100μm的ra信号传导途径激活剂(例如，视黄酸)接触。
[0249]
可以在本文提供的方法中使用任何能够诱导pdx1阳性、nkx6.1阳性胰腺祖细胞分化为胰岛素阳性内分泌细胞的shh途径抑制剂(例如，单独地，或与tgf-β信号传导途径抑制剂和/或甲状腺激素信号传导途径激活剂中的任何剂进行组合)。在一些情况下，shh途径抑制剂包括sant1。在一些实例中，该方法包括使pdx1阳性、nkx6.1阳性胰腺祖细胞与一定浓度，诸如，约0.001μm、约0.002μm、约0.005μm、约0.01μm、约0.02μm、约0.03μm、约0.05μm、约0.08μm、约0.1μm、约0.12μm、约0.13μm、约0.14μm、约0.15μm、约0.16μm、约0.17μm、约0.18μm、约0.19μm、约0.2μm、约0.21μm、约0.22μm、约0.23μm、约0.24μm、约0.25μm、约0.26μm、约0.27μm、约0.28μm、约0.29μm、约0.3μm、约0.31μm、约0.32μm、约0.33μm、约0.34μm、约0.35μm、约0.4μm、约0.45μm、约0.5μm、约0.6μm、约0.8μm、约1μm、约2μm或约5μm的shh途径抑制剂(例如，sant1)接触。
[0250]
可以使用任何能够诱导pdx1阳性、nkx6.1阳性胰腺祖细胞分化为胰岛素阳性内分泌细胞的bmp信号传导途径抑制剂(例如，单独地，或与tgf-β信号传导途径抑制剂和/或甲状腺激素信号传导途径激活剂中的任何剂进行组合)。在一些情况下，bmp信号传导途径抑制剂包括ldn193189或dmh-1。在一些实例中，该方法包括使pdx1阳性、nkx6.1阳性胰腺祖细胞与一定浓度，诸如，约30nm、约40nm、约50nm、约60nm、约70nm、约80nm、约90nm、约100nm、约110nm、约120nm、约130nm、约140nm、约150nm、约160nm、约170nm、约180nm、约190nm、约200nm、约210nm、约220nm、约230nm、约240nm、约250nm、约280nm、约300nm、约400nm、约500nm或约1μm的bmp信号传导途径抑制剂(例如，ldn193189)接触。
[0251]
可以使用任何能够诱导群体中的pdx1阳性、nkx6.1阳性胰腺祖细胞分化为胰岛素阳性内分泌细胞的rock抑制剂(例如，单独地，或与tgf-β信号传导途径抑制剂和/或甲状腺激素信号传导途径激活剂中的任何剂进行组合)。在一些情况下，rock抑制剂包括thiazovivin、y-27632、法舒地尔/ha1077或h-1152。在一些情况下，rock抑制剂包括y-27632。在一些情况下，rock抑制剂包括thiazovivin。在一些实例中，该方法包括使pdx1阳性、nkx6.1阳性胰腺祖细胞与一定浓度，诸如，约0.2μm、约0.5μm、约0.75μm、约1μm、约2μm、约3μm、约4μm、约5μm、约6μm、约7μm、约7.5μm、约8μm、约9μm、约10μm、约11μm、约12μm、约13μm、约14μm、约15μm、约16μm、约17μm、约18μm、约19μm、约20μm、约21μm、约22μm、约23μm、约24μm、约25μm、约26μm、约27μm、约28μm、约29μm、约30μm、约35μm、约40μm、约50μm或约100μm的rock抑制剂(例如，y-27632或thiazovivin)接触。
[0252]
可以使用任何能够诱导群体中的pdx1阳性、nkx6.1阳性胰腺祖细胞分化为胰岛素阳性内分泌细胞的表观遗传修饰化合物(例如，单独地，或与tgf-β信号传导途径抑制剂和/或甲状腺激素信号传导途径激活剂中的任何剂进行组合)。在一些情况下，表观遗传修饰化合物包括组蛋白甲基转移酶抑制剂或hdac抑制剂。在一些情况下，表观遗传修饰化合物包括组蛋白甲基转移酶抑制剂，例如，dznep。在一些情况下，表观遗传修饰化合物包括hdac抑制剂，例如，kd5170。在一些实例中，该方法包括使pdx1阳性、nkx6.1阳性胰腺祖细胞与一定浓度，诸如，约0.01μm、约0.025μm、约0.05μm、约0.075μm、约0.1μm、约0.15μm、约0.2μm、约0.5μm、约0.75μm、约1μm、约2μm、约3μm、约4μm、约5μm、约6μm、约7μm、约7.5μm、约8μm、约9μm、约10μm、约15μm、约20μm、约25μm、约30μm、约35μm、约40μm、约50μm或约100μm的表观遗传修饰化合物(例如，dznep或kd5170)接触。
[0253]
在一些情况下，细胞的群体任选地与蛋白激酶抑制剂接触。在一些情况下，细胞的群体不与蛋白激酶抑制剂接触。在一些情况下，细胞的群体与蛋白激酶抑制剂接触。可以使用任何能够诱导群体中的pdx1阳性、nkx6.1阳性胰腺祖细胞分化为胰岛素阳性内分泌细胞的蛋白激酶抑制剂(例如，单独地，或与tgf-β信号传导途径抑制剂和/或甲状腺激素信号传导途径激活剂中的任何剂进行组合)。在一些情况下，蛋白激酶抑制剂包括星形孢菌素。
[0254]
在一些情况下，该方法包括使细胞的群体(例如，pdx1阳性、nkx6.1阳性胰腺祖细胞)与xxi、alk5i、t3或gc-1、ra、sant1和β细胞素接触7天的时间段，以诱导群体中的至少一个pdx1阳性、nkx6.1阳性胰腺祖细胞分化为胰岛素阳性内分泌细胞，其中该胰岛素阳性内分泌细胞表达胰岛素。在一些情况下，该方法包括使细胞的群体(例如，pdx1阳性、nkx6.1阳性胰腺祖细胞)与xxi、alk5i、t3或gc-1、ra、sant1、β细胞素和ldn193189接触7天的时间段，以诱导群体中的至少一个pdx1阳性、nkx6.1阳性胰腺祖细胞分化为胰岛素阳性内分泌细
胞，其中该胰岛素阳性内分泌细胞表达胰岛素。在一些实施方案中，在第5阶段的一部分中，例如，仅在第5阶段的时间段的前1天、2天、3天、4天、5天或6天或在第5阶段的时间段的最后1天、2天、3天、4天、5天或6天添加一种或更多种分化因子。在一个实例中，仅在第5阶段期间的前2天、3天、4天或5天使细胞与shh信号传导途径抑制剂接触，随后将shh信号传导途径抑制剂从培养基去除。在另一个实例中，仅在第5阶段期间的前1天、2天或3天使细胞与bmp信号传导途径抑制剂接触，随后将bmp信号传导途径抑制剂从培养基去除。
[0255]
在一些情况下，该方法包括在be5培养基中培养细胞的群体(例如，pdx1阳性、nkx6.1阳性胰腺祖细胞)，以诱导群体中的至少一个nkx6.1阳性胰腺祖细胞分化为胰岛素阳性内分泌细胞，其中该胰岛素阳性内分泌细胞表达胰岛素。
[0256]
胰腺β细胞
[0257]
本公开内容的方面涉及产生胰腺β细胞(例如，非天然胰腺β细胞)。在一些情况下，非天然胰腺β细胞在形式和功能上类似于内源性成熟β细胞，但仍与天然β细胞不同。
[0258]
在一些情况下，使用本文提供的方法产生的胰岛素阳性胰腺内分泌细胞可以单独地形成细胞簇或与其他类型的细胞(例如，其前体，例如干细胞、定形内胚层细胞、原始肠管细胞、pdx1阳性、nkx6.1阴性胰腺祖细胞或pdx1阳性、nkx6.1阳性胰腺祖细胞)一起形成细胞簇。
[0259]
在一些情况下，包含胰岛素阳性内分泌细胞的细胞群体可以被直接诱导成熟为sc-β细胞，而不添加任何外源性分化因子(诸如tgf-β信号传导途径的抑制剂、甲状腺激素信号传导途径激活剂、pkc激活剂、来自tgf-β超家族、fgf家族或egf家族的生长因子、shh信号传导途径抑制剂、γ-分泌酶抑制剂、rock抑制剂或bmp信号传导途径抑制剂)。在一些实施方案中，本文提供的方法包括使包含nkx6.1阳性、isl1阳性内分泌细胞的细胞群体与水溶性聚合物(例如，血清白蛋白或pva)、tgf-β信号传导途径抑制剂、shh途径抑制剂、甲状腺激素信号传导途径激活剂、蛋白激酶抑制剂、rock抑制剂、bmp信号传导途径抑制剂和/或表观遗传修饰化合物接触。在一些实施方案中，本文提供的方法包括使包含nkx6.1阳性、isl1阳性内分泌细胞的细胞群体与人类血清白蛋白接触。在一些实施方案中，本文提供的方法包括使包含nkx6.1阳性、isl1阳性内分泌细胞的细胞群体与本文描述的任何聚乙烯醇分子接触。在一些实施方案中，本文提供的方法包括使包含nkx6.1阳性、isl1阳性内分泌细胞的细胞群体与pkc激活剂接触。
[0260]
在一些情况下，通过使胰岛素阳性内分泌细胞与分化因子接触，可以使包含胰岛素阳性内分泌细胞的细胞群体被诱导成熟为sc-β细胞。分化因子可以包括如本文描述的至少一种tgf-β信号传导途径抑制剂和甲状腺激素信号传导途径激活剂。在一些情况下，sc-β细胞可以通过使包含胰岛素阳性内分泌细胞的细胞群体与alk5i和t3或gc-1接触来获得。
[0261]
在一些实例中，可以在ns-gfs培养基、mcdb131培养基、dmem培养基或cmrl培养基中使胰岛素阳性内分泌细胞成熟。在一些情况下，可以在补充有10％ fbs的cmrl培养基中使胰岛素阳性内分泌细胞成熟。在一些情况下，可以在补充有1％ hsa的dmem/f12培养基中使胰岛素阳性内分泌细胞成熟。在其他情况下，可以通过在可补充2％ bsa的mcdb131培养基中培养含有胰岛素阳性内分泌细胞的细胞群体来获得sc-β细胞。在一些情况下，用于使胰岛素阳性内分泌细胞成熟为sc-β细胞的含有2％ bsa的mcdb131培养基可以不包含如本文描述的小分子因子。在一些情况下，用于使胰岛素阳性内分泌细胞成熟为sc-β细胞的含
有2％ bsa的mcdb131培养基可以不包含血清(例如，无fbs)。在其他情况下，sc-β细胞可以通过在可以补充0.05％ hsa和维生素c的mcdb131培养基中培养包含胰岛素阳性内分泌细胞的细胞的群体来获得。在一些情况下，sc-β细胞可以通过在可以补充0.05％ hsa、its-x、维生素c和谷氨酰胺(gln，例如，4mm)的mcdb131培养基中培养包含胰岛素阳性内分泌细胞的细胞的群体来获得。在一些情况下，在s6期间，培养基的类型可以改变。例如，s6细胞在最初2天至4天在可以补充0.05％ hsa和维生素c的mcdb131培养基中培养，并且然后随后在补充有1％ hsa的dmem/f12培养基中培养。在一些情况下，另外的因子被引入培养基中。例如，s6细胞可以在可以补充0.05％ hsa、its-x、维生素c和谷氨酰胺(gln，例如，4mm)的mcdb131培养基中培养整个10-12天，在此期间znso4从s6的第4天引入。
[0262]
在一些方面，本公开内容提供了一种从多能细胞产生sc-β细胞的方法，该方法包括：a)通过使多能干细胞与至少一种来自tgfβ超家族的因子和wnt信号传导途径激活剂接触3天的时间段，使群体中的多能干细胞分化为定形内胚层细胞；b)通过使定形内胚层细胞与至少一种来自fgf家族的因子接触3天的时间段的过程，使定形内胚层细胞中的至少一些分化为原始肠管细胞；c)通过使原始肠管细胞与i)视黄酸信号传导途径激活剂、ii)至少一种来自fgf家族的因子、iii)shh途径抑制剂、iv)bmp信号传导途径抑制剂(例如，dmh-1或ldn193189)、v)pkc激活剂、和vi)rock抑制剂接触的过程，使原始肠管细胞中的至少一些分化为pdx1阳性胰腺祖细胞；d)通过使pdx1阳性胰腺祖细胞在促进细胞簇集的条件下与i)至少一种来自fgf家族的生长因子、ii)至少一种shh途径抑制剂、和任选地iii)ra信号传导途径激活剂、和任选地iv)rock抑制剂和v)至少一种来自tgfβ超家族的因子接触5天的时间段的过程，使pdx1阳性胰腺祖细胞中的至少一些分化为pdx1阳性、nkx6.1阳性胰腺祖细胞；e)通过使pdx1阳性、nkx6.1阳性胰腺祖细胞与i)tgf-β信号传导途径抑制剂、ii)th信号传导途径激活剂、iii)至少一种shh途径抑制剂、iv)ra信号传导途径激活剂、v)γ-分泌酶抑制剂、任选地vi)至少一种来自表皮生长因子(egf)家族的生长因子、和任选地vii)bmp信号传导途径抑制剂接触5天与7天之间的时间段的过程，使pdx1阳性、nkx6.1阳性胰腺祖细胞中的至少一些分化为pdx1阳性、nkx6.1阳性、胰岛素阳性内分泌细胞；以及f)通过在无外源性分化因子的培养基(例如，ns-gfs培养基、补充有bsa的mcdb培养基、mcdb131培养基或dmem/f12培养基)中培养pdx1阳性、nkx6.1阳性、胰岛素阳性内分泌细胞7天与14天之间的时间段，以诱导pdx1阳性、nkx6.1阳性、胰岛素阳性内分泌细胞中的至少一些在体外成熟为sc-β细胞的过程，使pdx1阳性、nkx6.1阳性、胰岛素阳性内分泌细胞中的至少一些分化为sc-β细胞，其中该sc-β细胞在体外和/或体内表现出gsis反应。在一些情况下，gsis反应类似于内源性成熟β细胞的gsis反应。
[0263]
在一些方面，本公开内容提供了一种从多能细胞产生sc-β细胞的方法，该方法包括：a)通过使多能干细胞与至少一种来自tgfβ超家族的因子和wnt信号传导途径激活剂接触3天的时间段，使群体中的多能干细胞分化为定形内胚层细胞；b)通过使定形内胚层细胞与至少一种来自fgf家族的因子接触3天的时间段的过程，使定形内胚层细胞中的至少一些分化为原始肠管细胞；c)通过使原始肠管细胞与i)视黄酸信号传导途径激活剂、ii)至少一种来自fgf家族的因子、iii)shh途径抑制剂、iv)bmp信号传导途径抑制剂、v)pkc激活剂、vi)rock抑制剂、和vii)来自tgfβ超家族的生长因子接触2天的时间段的过程，使原始肠管细胞中的至少一些分化为pdx1阳性、nkx6.1阴性胰腺祖细胞；d)通过使pdx1阳性、nkx6.1阴
性胰腺祖细胞在促进细胞簇集的条件下与i)至少一种来自fgf家族的生长因子、ii)至少一种shh途径抑制剂、和任选地iii)ra信号传导途径激活剂、和任选地iv)rock抑制剂和v)至少一种来自tgfβ超家族的因子接触5天的时间段的过程，使pdx1阳性、nkx6.1阴性胰腺祖细胞中的至少一些分化为pdx1阳性、nkx6.1阳性胰腺祖细胞；e)通过使pdx1阳性、nkx6.1阳性胰腺祖细胞与i)tgf-β信号传导途径抑制剂、ii)th信号传导途径激活剂、iii)至少一种shh途径抑制剂、iv)ra信号传导途径激活剂、v)γ-分泌酶抑制剂、任选地vi)至少一种来自表皮生长因子(egf)家族的生长因子、和任选地vii)bmp信号传导途径抑制剂接触5天与7天之间的时间段的过程，使pdx1阳性、nkx6.1阳性胰腺祖细胞中的至少一些分化为pdx1阳性、nkx6.1阳性、胰岛素阳性内分泌细胞；以及f)通过在无外源性分化因子的培养基(例如，ns-gfs培养基、补充有bsa的mcdb培养基、mcdb131培养基或dmem/f12培养基)中培养pdx1阳性、nkx6.1阳性、胰岛素阳性内分泌细胞7天与14天之间的时间段，以诱导pdx1阳性、nkx6.1阳性、胰岛素阳性内分泌细胞中的至少一些在体外成熟为sc-β细胞的过程，使pdx1阳性、nkx6.1阳性、胰岛素阳性内分泌细胞中的至少一些分化为sc-β细胞，其中该sc-β细胞在体外和/或体内表现出gsis反应。在一些情况下，gsis反应类似于内源性成熟β细胞的gsis反应。
[0264]
在一些方面，本公开内容提供了一种从多能细胞产生sc-β细胞的方法，该方法包括：a)通过使多能干细胞与至少一种来自tgfβ超家族的因子和wnt信号传导途径激活剂接触3天的时间段，使群体中的多能干细胞分化为定形内胚层细胞；b)通过使定形内胚层细胞与至少一种来自fgf家族的因子接触3天的时间段的过程，使定形内胚层细胞中的至少一些分化为原始肠管细胞；c)通过使原始肠管细胞与i)视黄酸信号传导途径激活剂、ii)至少一种来自fgf家族的因子、iii)shh途径抑制剂、iv)pkc激活剂、和v)rock抑制剂接触的过程，使原始肠管细胞中的至少一些分化为pdx1阳性、nkx6.1阴性胰腺祖细胞；d)通过使pdx1阳性、nkx6.1阴性胰腺祖细胞在促进细胞簇集的条件下与i)至少一种来自fgf家族的生长因子、ii)至少一种shh途径抑制剂、和任选地iii)ra信号传导途径激活剂、和任选地iv)rock抑制剂和v)至少一种来自tgfβ超家族的因子接触5天的时间段的过程，使pdx1阳性、nkx6.1阴性胰腺祖细胞中的至少一些分化为pdx1阳性、nkx6.1阳性胰腺祖细胞；e)通过使pdx1阳性、nkx6.1阳性胰腺祖细胞与i)tgf-β信号传导途径抑制剂、ii)th信号传导途径激活剂、iii)至少一种shh途径抑制剂、iv)ra信号传导途径激活剂、v)γ-分泌酶抑制剂、和任选地vi)至少一种来自表皮生长因子(egf)家族的生长因子接触5天与7天之间的时间段的过程，使pdx1阳性、nkx6.1阳性胰腺祖细胞中的至少一些分化为pdx1阳性、nkx6.1阳性、胰岛素阳性内分泌细胞；以及f)通过在无外源性分化因子的培养基(例如，ns-gfs培养基、补充有bsa的mcdb培养基、mcdb131培养基或dmem/f12培养基)中培养pdx1阳性、nkx6.1阳性、胰岛素阳性内分泌细胞7天与14天之间的时间段，以诱导pdx1阳性、nkx6.1阳性、胰岛素阳性内分泌细胞中的至少一些在体外成熟为sc-β细胞的过程，使pdx1阳性、nkx6.1阳性、胰岛素阳性内分泌细胞中的至少一些分化为sc-β细胞，其中该sc-β细胞在体外和/或体内表现出gsis反应。在一些情况下，gsis反应类似于内源性成熟β细胞的gsis反应。
[0265]
在一些方面，本公开内容提供了一种从多能细胞产生sc-β细胞的方法，该方法包括：a)通过使多能干细胞与至少一种来自tgfβ超家族的因子和wnt信号传导途径激活剂接触3天的时间段，使群体中的多能干细胞分化为定形内胚层细胞；b)通过使定形内胚层细胞
与至少一种来自fgf家族的因子接触3天的时间段的过程，使定形内胚层细胞中的至少一些分化为原始肠管细胞；c)通过使原始肠管细胞与i)视黄酸信号传导途径激活剂、ii)至少一种来自fgf家族的因子、iii)shh途径抑制剂、iv)bmp信号传导途径抑制剂(例如，dmh-1或ldn193189)、v)pkc激活剂、和vi)rock抑制剂接触的过程，使原始肠管细胞中的至少一些分化为pdx1阳性、nkx6.1阴性胰腺祖细胞；d)通过使pdx1阳性、nkx6.1阴性胰腺祖细胞在促进细胞簇集的条件下与i)至少一种来自fgf家族的生长因子、ii)至少一种shh途径抑制剂、和任选地iii)ra信号传导途径激活剂、和任选地iv)rock抑制剂和v)至少一种来自tgfβ超家族的因子接触5天或6天的时间段的过程，使pdx1阳性、nkx6.1阴性胰腺祖细胞中的至少一些分化为pdx1阳性、nkx6.1阳性胰腺祖细胞；e)通过使pdx1阳性、nkx6.1阳性胰腺祖细胞与i)shh信号传导途径抑制剂、ii)ra信号传导途径激活剂、iii)γ-分泌酶抑制剂、iv)至少一种来自表皮生长因子(egf)家族的生长因子、v)至少一种骨形态发生蛋白(bmp)信号传导途径抑制剂、vi)tgf-β信号传导途径抑制剂、vii)甲状腺激素信号传导途径激活剂、viii)表观遗传修饰化合物(例如，dznep或kd5170)、ix)蛋白激酶抑制剂、和x)rock抑制剂接触5天与7天之间的时间段的过程，使pdx1阳性、nkx6.1阳性胰腺祖细胞中的至少一些分化为pdx1阳性、nkx6.1阳性、胰岛素阳性内分泌细胞；以及f)通过在无外源性分化因子的培养基(例如，ns-gfs培养基、补充有bsa的mcdb培养基、mcdb131培养基或dmem/f12培养基)中培养pdx1阳性、nkx6.1阳性、胰岛素阳性内分泌细胞7天与14天之间的时间段，以诱导pdx1阳性、nkx6.1阳性、胰岛素阳性内分泌细胞中的至少一些在体外成熟为sc-β细胞的过程，使pdx1阳性、nkx6.1阳性、胰岛素阳性内分泌细胞中的至少一些分化为sc-β细胞，其中该sc-β细胞在体外和/或体内表现出gsis反应。在一些情况下，gsis反应类似于内源性成熟β细胞的gsis反应。
[0266]
在一些方面，本公开内容提供了一种从多能细胞产生sc-β细胞的方法，该方法包括：a)通过使多能干细胞与至少一种来自tgfβ超家族的因子和wnt信号传导途径激活剂接触3天的时间段，使群体中的多能干细胞分化为定形内胚层细胞；b)通过使定形内胚层细胞与至少一种来自fgf家族的因子接触3天的时间段的过程，使定形内胚层细胞中的至少一些分化为原始肠管细胞；c)通过使原始肠管细胞与i)视黄酸信号传导途径激活剂、ii)至少一种来自fgf家族的因子、iii)shh途径抑制剂、iv)bmp信号传导途径抑制剂(例如，dmh-1或ldn193189)、v)pkc激活剂、和vi)rock抑制剂接触的过程，使原始肠管细胞中的至少一些分化为pdx1阳性、nkx6.1阴性胰腺祖细胞；d)通过使pdx1阳性、nkx6.1阴性胰腺祖细胞在促进细胞簇集的条件下与i)至少一种来自fgf家族的生长因子、ii)至少一种shh途径抑制剂、和任选地iii)ra信号传导途径激活剂、和任选地iv)rock抑制剂、和v)至少一种来自tgfβ超家族的因子接触5天或6天的时间段的过程，使pdx1阳性、nkx6.1阴性胰腺祖细胞中的至少一些分化为pdx1阳性、nkx6.1阳性胰腺祖细胞；e)通过以下过程使pdx1阳性、nkx6.1阳性胰腺祖细胞中的至少一些分化为pdx1阳性、nkx6.1阳性、胰岛素阳性内分泌细胞：使pdx1阳性、nkx6.1阳性胰腺祖细胞与i)γ-分泌酶抑制剂、ii)至少一种骨形态发生蛋白(bmp)信号传导途径抑制剂、iii)tgf-β信号传导途径抑制剂、iv)甲状腺激素信号传导途径激活剂、v)表观遗传修饰化合物(例如，dznep或kd5170)、vi)蛋白激酶抑制剂、和vii)rock抑制剂接触5天与7天之间的时间段，并且在该5天与7天之间的时间段的前3天内使pdx1阳性、nkx6.1阳性胰腺祖细胞与shh途径抑制剂、ra信号传导途径激活剂和至少一种来自egf家族的生长因
1152)、蛋白激酶c(pkc)的激活剂(例如，佛波醇12,13-二丁酯(pdbu)、tpb、佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯、苔藓虫素1或其衍生物)、tgfβ超家族的拮抗剂(例如，alk5抑制剂ii(cas 446859-33-2)、a83-01、sb431542、d4476、gw788388、ly364947、ly580276、sb505124、gw6604、sb-525334、sd-208、sb-505124或其衍生物)、骨形态发生蛋白(bmp)1型受体的抑制剂(例如，ldn193189或其衍生物)、甲状腺激素信号传导途径激活剂(例如，t3、gc-1或其衍生物)、γ-分泌酶抑制剂(例如，xxi、dapt或其衍生物)、tgf-β信号传导途径的激活剂(例如，wnt3a或激活素a)、来自表皮生长因子(egf)家族的生长因子(例如，β细胞素或egf)、广泛激酶(例如，星形孢菌素或其衍生物)、非必需氨基酸、维生素或抗氧化剂(例如，环巴胺、维生素d、维生素c、维生素a或其衍生物)、或者其他添加物，如n-乙酰半胱氨酸、硫酸锌或肝素。在一些情况下，重新聚集培养基可以不包含外源细胞外基质分子。在一些情况下，重新聚集培养基不包含matrigel
tm
。在一些情况下，重新聚集培养基不包含其他细胞外基质分子或物质，诸如胶原蛋白、明胶、聚-l-赖氨酸、聚-d-赖氨酸、玻连蛋白、层黏连蛋白、纤连蛋白、plo层黏连蛋白、纤维蛋白、凝血酶和retronectin及其混合物，例如，裂解的细胞膜制剂。
[0269]
本领域普通技术人员将理解，补充到培养基的血清白蛋白浓度可以变化。例如，培养基(例如，mcdb131)可以包含约0.01％、0.05％、0.1％、1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约10％或约15％的bsa。在其他情况下，培养基可以包含约0.01％、0.05％、0.1％、1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约10％或约15％的hsa。所使用的培养基(例如，mcdb131培养基)可以包含传统基础培养基中未发现的组分，诸如微量元素、腐胺、腺嘌呤、胸苷以及更高水平的一些氨基酸和维生素。这些添加物可以允许培养基补充非常低水平的血清或确定的组分。培养基可以不含蛋白和/或生长因子，并且可以补充egf、氢化可的松和/或谷氨酰胺。培养基可以包含一种或更多种细胞外基质分子(例如，细胞外蛋白)。培养基中使用的非限制性示例性细胞外基质分子可以包括胶原蛋白、胎盘基质、纤连蛋白、层黏连蛋白、分区蛋白、生腱蛋白、肝素、硫酸肝素、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、聚集蛋白聚糖、双糖链蛋白聚糖、血小板反应蛋白、玻连蛋白和饰胶蛋白聚糖。在一些情况下，培养基包含层黏连蛋白，诸如ln-332。在一些情况下，培养基包含肝素。
[0270]
培养基可以在培养中定期更换，例如，以向培养基中的细胞提供最佳环境。当培养从第一细胞簇解离的细胞以进行重新聚集时，培养基可以至少或约每4小时、12小时、24小时、48小时、3天或4天更换。例如，培养基可以约每48小时更换。
[0271]
在一些情况下，细胞可以在动态条件下(例如，在其中细胞在悬浮培养的同时经历持续的移动或搅拌的条件下)培养。对于细胞的动态培养，细胞可以在容器(例如，非黏附性容器，诸如转瓶(例如，200ml至3000ml的转瓶，例如250ml的转瓶；100ml的转瓶；或125ml锥形瓶(erlenmeyer))中培养，该容器可以连接至控制单元，并从而呈现受控的培养系统。在一些情况下，可以在非动态条件(例如，静态培养)下培养细胞，同时保持其增殖能力。对于细胞的非动态培养，细胞可以在黏附培养器皿中培养。黏附培养器皿可以涂覆有任何用于细胞黏附的基底诸如细胞外基质(ecm)以改善器皿表面与细胞的黏附性。用于细胞黏附的基底可以是任何旨在黏附干细胞或饲养细胞(若使用)的物质。用于细胞黏附的基底包括胶原蛋白、明胶、聚-l-赖氨酸、聚-d-赖氨酸、玻连蛋白、层黏连蛋白、纤连蛋白、plo层黏连蛋白、纤维蛋白、凝血酶和retronectin及其混合物，例如，matrigel
tm
和裂解的细胞膜制剂。
[0272]
可以搅拌动态细胞培养器皿(例如，转瓶)中的培养基(例如，通过搅拌器)。旋转速度可以与重新聚集的第二细胞簇的大小相关。可以控制旋转速度以使得第二细胞簇的大小可以类似于内源性胰岛。在一些情况下，控制旋转速度以使得第二细胞簇的大小可以为约75μm至约250μm。动态细胞培养器皿(例如，转瓶)的旋转速度可以是约20转/分钟(rpm)至约100rpm，例如，约30rpm至约90rpm、约40rpm至约60rpm、约45rpm至约50rpm。在一些情况下，旋转速度可以为约50rpm。
[0273]
如本文提供的第6阶段细胞可以经历或可以不经历如本文描述的解离和重新聚集过程。在一些情况下，可以使包含胰岛素阳性内分泌细胞的细胞簇重新聚集。细胞簇重新聚集可以富集胰岛素阳性内分泌细胞。在一些情况下，细胞簇中的胰岛素阳性内分泌细胞可以进一步成熟为胰腺β细胞。例如，在重新聚集后，第二细胞簇可以表现出类似于天然胰岛的体外gsis。例如，在重新聚集后，第二细胞簇可以包含表现出体外gsis的非天然胰腺β细胞。在一些实施方案中，可以根据pct申请wo2019/018818或us20200332262的公开内容进行重新聚集过程，所述申请的每一个通过引用以其整体并入本文。
[0274]
根据本文提供的方法获得的第6阶段细胞在冷冻保存和重新聚集程序后可以具有高的回收率。在一些情况下，在涉及在第3阶段的bmp信号传导途径抑制剂(例如，dmh-1或ldn)和来自tgf-β超家族的生长因子(例如，激活素a)的处理，以及在第5阶段表的观遗传修饰化合物(例如，组蛋白甲基转移酶抑制剂，例如，ezh2抑制剂，例如，dznep)的处理的分化过程中获得的第6阶段细胞与未进行这种处理的相应细胞群体相比，在第5阶段后的冷冻保存后，可以具有更高的回收率。在一些情况下，在涉及在第3阶段的bmp信号传导途径抑制剂(例如，dmh-1或ldn)和来自tgf-β超家族的生长因子(例如，激活素a)的处理，以及在第5阶段的表观遗传修饰化合物(例如，组蛋白甲基转移酶抑制剂，例如，ezh2抑制剂，例如，dznep)的处理的分化过程中获得的第6阶段细胞与在第3阶段未经bmp信号传导途径抑制剂(例如，dmh-1或ldn)和来自tgf-β超家族的生长因子(例如，激活素a)处理的相应细胞群体相比，在第5阶段后的冷冻保存后，可以具有更高的回收率。在一些情况下，在涉及在第3阶段的bmp信号传导途径抑制剂(例如，dmh-1或ldn)和来自tgf-β超家族的生长因子(例如，激活素a)的处理，以及在第5阶段的表观遗传修饰化合物(例如，组蛋白甲基转移酶抑制剂，例如，ezh2抑制剂，例如，dznep)的处理的分化过程中获得的第6阶段细胞在第5阶段后的冷冻保存后，可以具有至少为约35％、37.5％、40％、42.5％、45％、47.5％、48％、49％或50％的回收率。与冷冻保存前的细胞相比，回收率可以计算为在冷冻保存、解冻和恢复以及重新聚集程序后存活并形成重新聚集的细胞簇的细胞百分比。
[0275]
在一些实施方案中，本公开内容涉及使用本文提供的方法获得的非天然胰腺β细胞或其前体的冷冻保存。在一些实施方案中，包含非天然胰腺β细胞的细胞群体可以经由冷冻保存来储存。例如，包含非天然胰腺β细胞(例如，在一些情况下为第6阶段细胞)的细胞群体可以解离到细胞悬浮液，例如单细胞悬浮液中，并可以将细胞悬浮液冷冻保存，例如，冷冻在冷冻保存溶液中。细胞的解离可以通过本文所提供的任何技术进行，例如，通过酶处理。细胞可以在最高-20℃、最高-30℃、最高-40℃、最高-50℃、最高-60℃、最高-70℃、最高-80℃、最高-90℃、最高-100℃、最高-110℃、最高-120℃、最高-130℃、最高-140℃、最高-150℃、最高-160℃、最高-170℃、最高-180℃、最高-190℃或最高-200℃的温度冷冻。在一些情况下，细胞在约-80℃的温度冷冻。在一些情况下，细胞在约-195℃的温度冷冻。可以
131接触的方法。在一些实施方案中，本公开内容提供了一种包含胰岛素阳性细胞的群体和dmem/f12的组合物。在一些实施方案中，本公开内容提供了一种使胰岛素阳性细胞的群体与dmem/f12接触的方法。在一些实施方案中，本公开内容提供了一种包含胰岛素阳性细胞的群体和锌的组合物。在一些实施方案中，本公开内容提供了一种使胰岛素阳性细胞的群体与锌接触的方法。在一些实施方案中，本公开内容提供了一种包含胰岛素阳性细胞的群体和znso4的组合物。在一些实施方案中，本公开内容提供了一种使胰岛素阳性细胞的群体与znso4接触的方法。
[0280]
在一些实施方案中，本公开内容提供了一种包含胰岛素阳性细胞的群体和至少一种代谢物的组合物。在一些实施方案中，本公开提供了一种使胰岛素阳性细胞的群体与至少一种代谢物接触的方法。在一些实施方案中，至少一种代谢物是谷氨酸、乙酸、b-羟基丁酸、l-肉碱、牛磺酸、甲酸或生物素。在一些实施方案中，本公开内容提供了一种包含胰岛素阳性细胞的群体和谷氨酸、乙酸、b-羟基丁酸、l-肉碱、牛磺酸、甲酸或生物素中的一种、两种、三种、四种、五种、六种或七种的组合物。在一些实施方案中，本公开内容提供了一种使胰岛素阳性细胞的群体与谷氨酸、乙酸、b-羟基丁酸、l-肉碱、牛磺酸、甲酸或生物素中的一种、两种、三种、四种、五种、六种或七种接触的方法。在一些实施方案中，组合物包含dmem/f12。在一些实施方案中，组合物包含锌(例如，znso4)。在一些实施方案中，组合物包含人类血清白蛋白。
[0281]
在一些实施方案中，本公开内容提供了一种包含胰岛素阳性细胞的群体和至少一种氨基酸的组合物。在一些实施方案中，本公开提供了一种使胰岛素阳性细胞的群体与至少一种氨基酸接触的方法。在一些实施方案中，至少一种氨基酸是丙氨酸、谷氨酸、甘氨酸、脯氨酸、苏氨酸或色氨酸。在一些实施方案中，至少一种氨基酸是精氨酸、组氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸(glutamic acid)、丝氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、硒代半胱氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、谷氨酸(glutamate)、甘氨酸、脯氨酸、苏氨酸或色氨酸。在一些实施方案中，本公开内容提供了一种包含胰岛素阳性细胞的群体和至少一种维生素的组合物。在一些实施方案中，本公开提供了一种使胰岛素阳性细胞的群体与至少一种维生素接触的方法。在一些实施方案中，至少一种维生素是生物素或核黄素。
[0282]
在一些实施方案中，本公开内容提供了包含胰岛素阳性细胞的群体和单甘油酯脂肪酶(mgll)抑制剂的组合物。在一些实施方案中，本公开提供了一种使胰岛素阳性细胞的群体与至少一种维生素接触的方法。在一些实施方案中，mgll抑制剂是jjkk048、kml29、nf1819、jw642、jzl184、jzl195、jzp361、扁塑藤素(pristimerin)或urb602中或其衍生物的任何一种。
[0283]
在一些实施方案中，本文公开的任何细胞(例如，本文公开的任何sc衍生的β细胞或任何簇中的细胞)包含至少一种(例如，1种、2种或3种)基因序列中的基因组破坏，其中所述破坏减少或消除由所述基因序列编码的蛋白的表达。在一些实施方案中，所述至少一种基因序列编码mhc-i类基因。在一些实施方案中，所述mhc-i类基因编码β-2微球蛋白(b2m)、hla-a、hla-b或hla-c。在一些实施方案中，所述至少一种基因序列编码ciita。在一些实施方案中，细胞包含编码hla-a和hla-b的基因中的基因组破坏，但不包含编码hla-c的基因中的基因组破坏。在一些实施方案中，所述细胞包含自然杀伤细胞激活配体基因中的基因组
破坏。在一些实施方案中，所述自然杀伤细胞激活配体基因编码细胞间黏附分子1(icam1)、cd58、cd155、癌胚抗原相关细胞黏附分子1(ceacam1)、细胞黏附分子1(cadm1)、mhc-i类多肽相关序列a(mica)或mhc-i类多肽相关序列b(micb)。在一些实施方案中，相对于未被遗传修饰的细胞，细胞具有β-2微球蛋白、ciita、hla-a、hla-b、hla-c、hla-dp、hla-dq和hladr中的一种或更多种的减少的表达。在一些实施方案中，相对于未被遗传修饰的细胞，细胞具有cd47、pdl1、hla-g、cd46、cd55、cd59和ctla的增加的表达。在特定实施方案中，与来自健康对照受试者的内源性胰岛细胞相比，本文公开的胰岛细胞(例如，sc-β细胞)具有pdl1的增加的表达。在特定实施方案中，与来自健康对照受试者的内源性胰岛细胞相比，本文公开的胰岛细胞(例如，sc-β细胞)具有cd47的增加的表达。在一些实施方案中，基因组破坏通过使用基因编辑系统，例如，crispr cas技术来诱导。
[0284]
分化因子
[0285]
本公开内容的方面涉及使祖细胞(例如，干细胞、例如，ips细胞、定形内胚层细胞、原始肠管细胞、pdx1阳性、nkx6.1阴性胰腺祖细胞、pdx1阳性、nkx6.1阳性胰腺祖细胞、胰岛素阳性内分泌细胞)与β细胞分化因子接触，例如，以诱导胰岛素阳性内分泌细胞成熟或诱导其他祖细胞分化为sc-β细胞(例如，成熟胰腺β细胞)。在一些实施方案中，分化因子可以例如根据本文描述的方法诱导多能细胞(例如，ipsc或hesc)分化为定形内胚层细胞。在一些实施方案中，分化因子可以例如根据本文描述的方法诱导定形内胚层细胞分化为原始肠管细胞。在一些实施方案中，分化因子可以例如根据本文描述的方法诱导原始肠管细胞分化为pdx1阳性、nkx6.1阴性胰腺祖细胞。在一些实施方案中，分化因子可以例如根据本文描述的方法诱导pdx1阳性、nkx6.1阴性胰腺祖细胞分化为nkx6-1阳性胰腺祖细胞。在一些实施方案中，分化因子可以例如根据本文描述的方法诱导nkx6-1阳性胰腺祖细胞分化为胰岛素阳性内分泌细胞。在一些实施方案中，分化因子可以例如根据本文描述的方法诱导胰岛素阳性内分泌细胞成熟为sc-β细胞。
[0286]
根据本文公开的方法，本文描述的至少一种分化因子可以单独使用或与其他分化因子组合使用，以产生sc-β细胞。在一些实施方案中，在产生sc-β细胞的方法中使用至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种、至少九种或至少十种本文描述的分化因子。
[0287]
转化生长因子-β(tgf)超家族
[0288]
本公开内容的方面涉及来自转化生长因子β(tgf-β)超家族的生长因子作为分化因子的用途。“tgf-β超家族”是指具有已知tgfβ家族成员的结构和功能特性的蛋白。tgfβ蛋白家族可以包括tgfβ系列蛋白、抑制素(包括抑制素a和抑制素b)、激活素(包括激活素a、激活素b和激活素ab)、mis(米勒管抑制物质)、bmp(骨形态发生蛋白)、dpp(decapentaplegic)、vg-1、mnsf(单克隆非特异性抑制因子)及其他。该蛋白家族的活性可以基于与各种细胞类型上的某些受体的特异性结合。该家族的成员可以共享与其功能相关的序列同一性区域，尤其是在c末端。tgfβ家族可以包括多于一百种不同的蛋白，全部共享至少一个氨基酸序列同一性的区域。可以在本文公开的方法中使用的该家族成员可以包括但不限于如由其genbank登录号标识的以下蛋白：p07995、p18331、p08476、q04998、p03970、p43032、p55102、p27092、p42917、p09529、p27093、p04088、q04999、p17491、p55104、q9wuk5、p55103、o88959、o08717、p58166、o61643、p35621、p09534、p48970、q9nr23、p25703、p30884、
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aad27804.1、aan76665.1、bac11909.1、xp-1-421648.1、cab63704.1、np-037306.1、a55706、aaf02780.1、cag09623.1、np-067589.1、np-035707.1、aav30547.1、aap49817.1、bac77407.1、aal87199.1、cag07172.1、b36193、caa33024.1、np-1-001009400.1、aap36538.1、xp-512687.1、xp-510080.1、aah05513.1、1ktz、aah14690.1、aaa31526.1。
[0289]
本文提供的方法和组合物中的来自tgf-β超家族的生长因子可以是天然获得的或重组的。在一些实施方案中，来自tgf-β超家族的生长因子包括激活素a。术语“激活素a”可以包括激活素a的片段和衍生物。示例性激活素a的序列如美国公布第2009/0155218号(’218出版物)中的seq id no:1所公开的。在’218出版物的seq id no:2-16中提供了激活素a的其他非限制性实例，并且在’218出版物的seq id no:33-34中提供了编码激活素a的核酸的非限制性实例。在一些实施方案中，来自tgf-β超家族的生长因子可以包括具有与’218出版物的seq id no:1至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少99％或更多相同的氨基酸序列的多肽。
[0290]
在一些实施方案中，来自tgf-β超家族的生长因子包括生长分化因子8(gdf8)。术语“gdf8”可以包括gdf8的片段和衍生物。gdf8多肽的序列是本领域技术人员可得的。在一些实施方案中，来自tgf-β超家族的生长因子包括具有与人gdf8多肽序列(genbank登录号eax10880)至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少99％或更多相同的氨基酸序列的多肽。
[0291]
在一些实施方案中，来自tgf-β超家族的生长因子包括与gdf8密切相关的生长因子，例如生长分化因子11(gdf11)。在一些实施方案中，来自tgf-β超家族的生长因子包括具有与人gdf11多肽序列(genbank登录号aaf21630)至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少99％或更多相同的氨基酸序列的多肽。
[0292]
在一些实施方案中，可以用模拟至少一种来自tgf-β超家族的生长因子的剂代替来自tgf-β超家族的生长因子。示例性的模拟至少一种来自tgf-β超家族的生长因子的剂包括但不限于ide1和ide2。
[0293]
在一些实施方案中，tgf-β配体(例如，激活素a)以1ng/ml-10ng/ml的浓度存在于培养基中。在一些实施方案中，tgf-β配体(例如，激活素a)以以下的浓度存在于培养基中：1ng/ml-10ng/ml、1ng/ml-9ng/ml、1ng/ml-8ng/ml、1ng/ml-7ng/ml、1ng/ml-6ng/ml、1ng/ml-5ng/ml、1ng/ml-4ng/ml、1ng/ml-3ng/ml、1ng/ml-2ng/ml、2ng/ml-10ng/ml、2ng/ml-9ng/ml、2ng/ml-8ng/ml、2ng/ml-7ng/ml、2ng/ml-6ng/ml、2ng/ml-5ng/ml、2ng/ml-4ng/ml、2ng/ml-3ng/ml、3ng/ml-10ng/ml、3ng/ml-9ng/ml、3ng/ml-8ng/ml、3ng/ml-7ng/ml、3ng/ml-6ng/ml、3ng/ml-5ng/ml、3ng/ml-4ng/ml、4ng/ml-10ng/ml、4ng/ml-9ng/ml、4ng/ml-8ng/ml、4ng/ml-7ng/ml、4ng/ml-6ng/ml、4ng/ml-5ng/ml、5ng/ml-10ng/ml、5ng/ml-9ng/ml、5ng/ml-8ng/ml、5ng/ml-7ng/ml、5ng/ml-6ng/ml、6ng/ml-10ng/ml、6ng/ml-9ng/ml、6ng/ml-8ng/ml、6ng/ml-7ng/ml、7ng/ml-10ng/ml、7ng/ml-9ng/ml、7ng/ml-8ng/ml、8ng/ml-10ng/ml、8ng/ml-9ng/ml或9ng/ml-10ng/ml。在一些实施方案中，tgf-β配体(例如，激活素a)以以下的浓度存在于培养基中：2ng/ml-8ng/ml(例如，2ng/ml、3ng/ml、4ng/ml、5ng/ml、6ng/ml、7ng/ml、8ng/ml)。在一些实施方案中，tgf-β配体(例如激活素a)以5ng/ml的浓度存在于培养基中。
[0294]
骨形态发生蛋白(bmp)信号传导途径抑制剂
[0295]
本公开内容的方面涉及bmp信号传导途径抑制剂作为β细胞分化因子的用途。bmp信号传导家族是tgf-β超家族的不同亚型(sebald等人，biol.chem.385:697-710,2004)。超过二十种已知的bmp配体被三种不同的ii型受体(bmprii、actriia和actriib)和至少三种i型受体(alk2、alk3和alk6)识别。二聚体配体促进受体异聚体的组装，从而允许组成型活性的ii型受体丝氨酸/苏氨酸激酶使i型受体丝氨酸/苏氨酸激酶磷酸化。活化的i型受体使bmp响应性(br-)smad效应子(smad 1、smad 5和smad 8)磷酸化，以促进在与smad4的复合物中的核易位，smad4是同样促进tgf信号传导的co-smad。此外，bmp信号可以以独立于smad的方式激活细胞内效应子，诸如mapk p38(nohe等人，cell signal16:291-299,2004)。可溶性bmp拮抗剂(诸如头蛋白、腱蛋白、gremlin和促卵泡激素抑释素)通过配体螯合来限制bmp信号传导。
[0296]
在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的bmp信号传导途径抑制剂包括dmh-1或其衍生物、类似物或变体。在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的bmp信号传导途径抑制剂包括以下化合物或以下化合物的衍生物、类似物或变体：
[0297][0298]
在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的bmp信号传导途径抑制剂包括ldn193189(也称为ldn193189、1062368-24-4、ldn-193189、dm 3189、dm-3189，iupac名：4-[6-(4-哌嗪-1-基苯基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基]喹诺酮)。在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的bmp信号传导途径抑制剂包括以下化合物或以下化合物的衍生物、类似物或变体：
[0299]
[0300]
在一些情况下，与ldn193189相比，dmh-1可以更具选择性。在本公开内容的一些实施方案中，dmh-1对于本文提供的方法可能特别有用。在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物不包括ldn193189的使用。在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物不包括ldn193189或其衍生物、类似物或变体用于从原始肠管细胞产生pdx1阳性、nkx6.1阴性胰腺祖细胞的使用。在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物涉及dmh-1或其衍生物、类似物或变体用于从原始肠管细胞产生pdx1阳性、nkx6.1阴性胰腺祖细胞的使用。
[0301]
在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的bmp信号传导途径抑制剂包括ldn193189的类似物或衍生物，例如ldn193189的盐、水合物、溶剂化物、酯或前药。在一些实施方案中，ldn193189的衍生物(例如，盐)包括ldn193189盐酸盐。
[0302]
在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的bmp信号传导途径抑制剂包括来自美国专利公布第2011/0053930号的式i化合物。
[0303]
在一些实施方案中，骨形态发生(bmp)信号传导途径抑制剂(例如，ldn-193189)以0.05μm-0.5μm的浓度存在于培养基中。在一些实施方案中，骨形态发生(bmp)信号传导途径抑制剂(例如，ldn-193189)以以下的浓度存在于培养基中：0.05μm-0.5μm、0.1μm-0.5μm、0.15μm-0.5μm、0.2μm-0.5μm、0.25μm-0.5μm、0.3μm-0.5μm、0.35μm-0.5μm、0.4μm-0.5μm、0.45μm-0.5μm、0.05μm-0.4μm、0.1μm-0.4μm、0.15μm-0.4μm、0.2μm-0.4μm、0.25μm-0.4μm、0.3μm-0.4μm、0.35μm-0.4μm、0.05μm-0.3μm、0.1μm-0.3μm、0.15μm-0.3μm、0.2μm-0.3μm、0.25μm-0.3μm、0.05μm-0.2μm、0.1μm-0.2μm、0.15μm-0.2μm或0.05μm-0.1μm。在一些实施方案中，骨形态发生(bmp)信号传导途径抑制剂(例如，ldn-193189)以以下的浓度存在于培养基中：0.05μm-0.2μm(例如，0.05μm、0.1μm、0.15μm或0.2μm)。在一些实施方案中，骨形态发生(bmp)信号传导途径抑制剂(例如，ldn-193189)以0.1μm的浓度存在于培养基中。
[0304]
tgf-β信号传导途径抑制剂
[0305]
本公开内容的方面涉及tgf-β信号传导途径抑制剂作为β细胞分化因子的用途。
[0306]
在一些实施方案中，tgf-β信号传导途径包括tgf-β受体i型激酶(tgf-βri)信号传导。在一些实施方案中，tgf-β信号传导途径抑制剂包括alk5抑制剂ii(cas 446859-33-2，一种tgf-b ri激酶的atp竞争性抑制剂，也称为repsox，iupac名：2-[5-(6-甲基吡啶-2-基)-1h-吡唑-4-基]-1,5-萘啶。在一些实施方案中，tgf-β信号传导途径抑制剂是alk5抑制剂ii的类似物或衍生物。在一些实施方案中，tgfβ-r1激酶抑制剂(例如，alk5i)以1μm-50μm的浓度存在于培养基中。在一些实施方案中，tgfβ-r1激酶抑制剂(例如，alk5i)以以下的浓度存在于培养基中：1μm-50μm、1μm-40μm、1μm-30μm、1μm-20μm、1μm-10μm、10μm-50μm、10μm-40μm、10μm-30μm、10μm-20μm、20μm-50μm、20μm-40μm、20μm-30μm、30μm-50μm、30μm-40μm或40μm-50μm。在一些实施方案中，tgfβ-r1激酶抑制剂(例如，alk5i)以以下的浓度存在于培养基中：5μm-20μm(例如，5μm、10μm、15μm或20μm)。在一些实施方案中，tgfβ-r1激酶抑制剂(例如a，lk5i)以10μm的浓度存在于培养基中。
[0307]
在一些实施方案中，alk5抑制剂ii的类似物或衍生物(也称为“alk5i”)是如美国专利公布第2012/0021519号中描述的式i化合物，其通过引用以其整体并入本文。
[0308]
在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的tgf-β信号传导途径抑制剂是在美国专利公布第2010/0267731号中描述的tgf-β受体抑制剂。在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的tgf-β信号传导途径抑制剂包括在美国专利公布第2009/0186076号
和第2007/0142376号中描述的alk5抑制剂。在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的tgf-β信号传导途径抑制剂是a83-01。在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的tgf-β信号传导途径抑制剂不是a83-01。在一些实施方案中，本文描述的组合物和方法不包括a 83-01。在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的tgf-β信号传导途径抑制剂是sb 431542。在一些实施方案中，所述tgf-β信号传导途径抑制剂不是sb 431542。在一些实施方案中，本文描述的组合物和方法不包括sb 431542。在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的tgf-β信号传导途径抑制剂是d 4476。在一些实施方案中，所述tgf-β信号传导途径抑制剂不是d 4476。在一些实施方案中，本文描述的组合物和方法不包括d4476。在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的tgf-β信号传导途径抑制剂是gw788388。在一些实施方案中，所述tgf-β信号传导途径抑制剂不是gw 788388。在一些实施方案中，本文描述的组合物和方法不包括gw 788388。在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的tgf-β信号传导途径抑制剂是ly 364947。在一些实施方案中，所述tgf-β信号传导途径抑制剂不是ly 364947。在一些实施方案中，本文描述的组合物和方法不包括ly 364947。在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的tgf-β信号传导途径抑制剂是ly 580276。在一些实施方案中，所述tgf-β信号传导途径抑制剂不是ly 580276。在一些实施方案中，本文描述的组合物和方法不包括ly 580276。在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的tgf-β信号传导途径抑制剂是sb 525334。在一些实施方案中，所述tgf-β信号传导途径抑制剂不是sb 525334。在一些实施方案中，本文描述的组合物和方法不包括sb 525334。在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的tgf-β信号传导途径抑制剂是sb 505124。在一些实施方案中，所述tgf-β信号传导途径抑制剂不是sb 505124。在一些实施方案中，本文描述的组合物和方法不包括sb 505124。在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的tgf-β信号传导途径抑制剂是sd 208。在一些实施方案中，所述tgf-β信号传导途径抑制剂不是sd 208。在一些实施方案中，本文描述的组合物和方法不包括sd 208。在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的tgf-β信号传导途径抑制剂是gw 6604。在一些实施方案中，所述tgf-β信号传导途径抑制剂不是gw 6604。在一些实施方案中，本文描述的组合物和方法不包括gw 6604。在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的tgf-β信号传导途径抑制剂是gw 788388。在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的tgf-β信号传导途径抑制剂不是gw 788388。在一些实施方案中，本文描述的组合物和方法不包括gw 788388。
[0309]
从以上描述化合物的集合中，以下可以从各种来源获得：ly-364947、sb-525334、sd-208和sb-505124可以从sigma,p.o.box 14508,st.louis,mo.,63178-9916获得；616452和616453可以从calbiochem(emd chemicals,inc.),480s.democrat road,gibbstown,n.j.,08027获得；gw788388和gw6604可以从glaxosmithkline,980great west road,brentford,middlesex,tw8 9gs,united kingdom获得；ly580276可以从lilly research,indianapolis,ind.46285获得；并且sm16可以从biogen idec,p.o.box 14627,5000davis drive,research triangle park,n.c.,27709-4627获得。
[0310]
wnt信号传导途径
[0311]
本公开内容的方面涉及wnt信号传导途径的激活剂作为β细胞分化因子的用途。
[0312]
在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的wnt信号传导途径激活剂包括
chir99021。在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的wnt信号传导途径激活剂包括chir99021的衍生物，例如chir99021的盐，例如chir99021的三盐酸盐、盐酸盐。在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的wnt信号传导途径激活剂包括wnt3a重组蛋白。在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的wnt信号传导途径激活剂包括糖原合成酶激酶3(gsk3)抑制剂。示例性的gsk3抑制剂包括但不限于3f8、a 1070722、ar-a014418、bio、bio-丙酮肟、fratide、10z-hymenialdisine、靛玉红-3
’‑
肟、kenpaullone、l803、l803-mts、碳酸锂、nsc 693868、sb 216763、sb 415286、tc-g 24、tcs2002、tcs21311、tws119和这些中任何一种的类似物或衍生物。在某些实施方案中，本文公开的方法、组合物和试剂盒不包括wnt信号传导途径激活剂。
[0313]
在一些实例中，该方法包括通过使多能细胞的群体与合适浓度，诸如，约0.01μm、约0.05μm、约0.1μm、约0.2μm、约0.5μm、约0.8μm、约1μm、约1.5μm、约2μm、约2.5μm、约3μm、约3.5μm、约4μm、约5μm、约8μm、约10μm、约12μm、约15μm、约20μm、约30μm、约50μm、约100μm或约200μm的wnt信号传导途径激活剂(例如，chir99021)接触，使多能细胞分化为定形内胚层细胞。在一些实施方案中，该方法包括使用约1μm-5μm或2μm-4μm的chir99021使多能细胞分化为定形内胚层细胞。在一些实施方案中，该方法包括使用约2μm的chir99021使多能细胞分化为定形内胚层细胞。在一些实施方案中，该方法包括使用约3μm的chir99021使多能细胞分化为定形内胚层细胞。在一些实施方案中，该方法包括使用约5μm的chir99021使多能细胞分化为定形内胚层细胞。
[0314]
成纤维细胞生长因子(fgf)家族
[0315]
本公开内容的方面涉及来自fgf家族的生长因子作为β细胞分化因子的用途。
[0316]
在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的来自fgf家族的生长因子包括角质形成细胞生长因子(kgf)。kgf的多肽序列是本领域技术人员可获得的。在一些实施方案中，来自fgf家族的生长因子包括具有与人类kgf多肽序列(genbank登录号aab21431)至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少99％或更多相同的氨基酸序列的多肽。
[0317]
在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的来自fgf家族的生长因子包括fgf2。fgf2的多肽序列是本领域技术人员可获得的。在一些实施方案中，来自fgf家族的生长因子包括具有与人类fgf2多肽序列(genbank登录号np—001997)至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少99％或更多相同的氨基酸序列的多肽。
[0318]
在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的至少一种来自fgf家族的生长因子包括fgf8b。fgf8b的多肽序列是本领域技术人员可获得的。在一些实施方案中，来自fgf家族的生长因子包括具有与人类fgf8b多肽序列(genbank登录号aab40954)至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少99％或更多相同的氨基酸序列的多肽。
[0319]
在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的至少一种来自fgf家族的生长因子包括fgf10。fgf10的多肽序列是本领域技术人员可获得的。在一些实施方案中，来自fgf家族的生长因子包括具有与人类fgf10多肽序列(genbank登录号cag46489)至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少99％或更
多相同的氨基酸序列的多肽。
[0320]
在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的至少一种来自fgf家族的生长因子包括fgf21。fgf21的多肽序列是本领域技术人员可获得的。在一些实施方案中，来自fgf家族的生长因子包括具有与人类fgf21多肽序列(genbank登录号aaq89444.1)至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少99％或更多相同的氨基酸序列的多肽。
[0321]
在一些实施方案中，成纤维细胞生长因子(例如，角质形成细胞生长因子(kgf))以10ng/ml-100ng/ml的浓度存在于培养基中。在一些实施方案中，成纤维细胞生长因子(例如，角质形成细胞生长因子(kgf))以以下的浓度存在于培养基中：10ng/ml-100ng/ml、10ng/ml-90ng/ml、10ng/ml-80ng/ml、10ng/ml-70ng/ml、10ng/ml-60ng/ml、10ng/ml-50ng/ml、10ng/ml-40ng/ml、10ng/ml-30ng/ml、10ng/ml-20ng/ml、20ng/ml-100ng/ml、20ng/ml-90ng/ml、20ng/ml-80ng/ml、20ng/ml-70ng/ml、20ng/ml-60ng/ml、20ng/ml-50ng/ml、20ng/ml-40ng/ml、20ng/ml-30ng/ml、30ng/ml-100ng/ml、30ng/ml-90ng/ml、30ng/ml-80ng/ml、30ng/ml-70ng/ml、30ng/ml-60ng/ml、30ng/ml-50ng/ml、30ng/ml-40ng/ml、40ng/ml-100ng/ml、40ng/ml-90ng/ml、40ng/ml-80ng/ml、40ng/ml-70ng/ml、40ng/ml-60ng/ml、40ng/ml-50ng/ml、50ng/ml-100ng/ml、50ng/ml-90ng/ml、50ng/ml-80ng/ml、50ng/ml-70ng/ml、50ng/ml-60ng/ml、60ng/ml-100ng/ml、60ng/ml-90ng/ml、60ng/ml-80ng/ml、60ng/ml-70ng/ml、70ng/ml-100ng/ml、70ng/ml-90ng/ml、70ng/ml-80ng/ml、80ng/ml-100ng/ml、80ng/ml-90ng/ml或90ng/ml-100ng/ml。在一些实施方案中，成纤维细胞生长因子(例如，角质形成细胞生长因子(kgf))以以下的浓度存在于培养基中：20ng/ml-80ng/ml(例如，20ng/ml、30ng/ml、40ng/ml、50ng/ml、60ng/ml、70ng/ml、80ng/ml)。在一些实施方案中，成纤维细胞生长因子(例如，角质形成细胞生长因子(kgf))以50ng/ml的浓度存在于培养基中。
[0322]
音猬(shh)信号传导途径
[0323]
本公开内容的方面涉及shh信号传导途径抑制剂作为β细胞分化因子的用途。
[0324]
在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的shh信号传导途径抑制剂包括sant1。在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的shh信号传导途径抑制剂包括sant2。在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的shh信号传导途径抑制剂包括sant3。在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的shh信号传导途径抑制剂包括sant4。在一些实施方案中，所述shh信号传导途径抑制剂包括cur61414。在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的shh信号传导途径抑制剂包括毛喉素。在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的shh信号传导途径抑制剂包括番茄碱。在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的shh信号传导途径抑制剂包括ay9944。在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的shh信号传导途径抑制剂包括曲帕拉醇。在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的shh信号传导途径抑制剂包括化合物a或化合物b(如美国公布第2004/0060568号中所公开的)。在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的shh信号传导途径抑制剂包括如美国公布第2006/0276391号中所公开的拮抗刺猬信号传导的甾体生物碱(例如，环巴胺或其衍生物)。在某些实施方案中，本文公开的方法、组合物和试剂盒不包括shh信号传导途径抑制剂。
[0325]
在一些实施方案中，音猬(shh)信号传导途径抑制剂(例如，sant-1)以以下的浓度存在于培养基中：0.1μm-10μm、0.1μm-9μm、0.1μm-8μm、0.1μm-7μm、0.1μm-6μm、0.1μm-5μm、0.1μm-4μm、0.1μm-3μm、0.1μm-2μm、0.1μm-1μm、0.1μm-0.5μm、0.5μm-10μm、0.5μm-9μm、0.5μm-8μm、0.5μm-7μm、0.5μm-6μm、0.5μm-5μm、0.5μm-4μm、0.5μm-3μm、0.5μm-2μm、0.5μm-1μm、1μm-10μm、1μm-9μm、1μm-8μm、1μm-7μm、1μm-6μm、1μm-5μm、1μm-4μm、1μm-3μm、1μm-2μm、2μm-10μm、2μm-9μm、2μm-8μm、2μm-7μm、2μm-6μm、2μm-5μm、2μm-4μm、2μm-3μm、3μm-10μm、3μm-9μm、3μm-8μm、3μm-7μm、3μm-6μm、3μm-5μm、3μm-4μm、4μm-10μm、4μm-9μm、4μm-8μm、4μm-7μm、4μm-6μm、4μm-5μm、5μm-10μm、5μm-9μm、5μm-8μm、5μm-7μm、5μm-6μm、6μm-10μm、6μm-9μm、6μm-8μm、6μm-7μm、7μm-10μm、7μm-9μm、7μm-8μm、8μm-10μm、8μm-9μm或9μm-10μm。在一些实施方案中，音猬(shh)信号传导途径抑制剂(例如，sant-1)以以下的浓度存在于培养基中：0.1μm-0.5μm(例如，0.1μm、0.15μm、0.2μm、0.25μm、0.3μm、0.35μm、0.4μm、0.45μm或0.5μm)。在一些实施方案中，音猬(shh)信号传导途径抑制剂(例如，sant-1)以0.25μm的浓度存在于培养基中。
[0326]
rho激酶(rock)信号传导途径
[0327]
本公开内容的方面涉及rock传导途径抑制剂(rock抑制剂)作为β细胞分化因子的用途。
[0328]
在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的rock抑制剂包括y-27632或thiazovivin。在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的rock抑制剂包括thiazovivin。在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的rock抑制剂包括y-27632。在一些情况下，本文提供的方法和组合物中的rock抑制剂包括以下化合物或其衍生物：
[0329][0330]
在一些情况下，本文提供的方法和组合物中的rock抑制剂包括以下化合物或其衍生物：
[0331][0332]
可以用于本文提供的方法和组合物中的rock抑制剂的非限制性实例包括thiazovivin、y-27632、法舒地尔/ha1077、h-1152、瑞舒地尔(ripasudil)、y39983、wf-536、slx-2119、氮杂苯并咪唑-氨基呋咱、de-104、烯烃、异喹啉、吲唑和吡啶烯烃衍生物、rokα抑制剂、xd-4000、hmn-1152、4-(1-氨基烷基)-n-(4-吡啶基)环己烷-羧酰胺、rhostatin、ba-210、ba-207、ba-215、ba-285、ba-1037、ki-23095、vas-012和喹唑啉。
[0333]
在一些实施方案中，任何组合物都包含rock抑制剂。在一些实施方案中，rho相关的含卷曲螺旋蛋白激酶(rock)抑制剂(例如，thiazovivin)以1μm-10μm的浓度存在于培养基中。在一些实施方案中，rho相关的含卷曲螺旋蛋白激酶(rock)抑制剂(例如，thiazovivin)以以下的浓度存在于培养基中：1μm-10μm、1μm-9μm、1μm-8μm、1μm-7μm、1μm-6μm、1μm-5μm、1μm-4μm、1μm-3μm、1μm-2μm、2μm-10μm、2μm-9μm、2μm-8μm、2μm-7μm、2μm-6μm、2μm-5μm、2μm-4μm、2μm-3μm、3μm-10μm、3μm-9μm、3μm-8μm、3μm-7μm、3μm-6μm、3μm-5μm、3μm-4μm、4μm-10μm、4μm-9μm、4μm-8μm、4μm-7μm、4μm-6μm、4μm-5μm、5μm-10μm、5μm-9μm、5μm-8μm、5μm-7μm、5μm-6μm、6μm-10μm、6μm-9μm、6μm-8μm、6μm-7μm、7μm-10μm、7μm-9μm、7μm-8μm、8μm-10μm、8μm-9μm或9μm-10μm。在一些实施方案中，rho相关的含卷曲螺旋蛋白激酶(rock)抑制剂(例如，thiazovivin)以以下的浓度存在于培养基中：1μm
–
5μm(例如1μm、1.5μm、2μm、2.5μm、3μm、3.5μm、4μm、4.5μm或5μm)。在一些实施方案中，rho相关的含卷曲螺旋蛋白激酶(rock)抑制剂(例如，thiazovivin)以2.5μm的浓度存在于培养基中。
[0334]
视黄酸信号传导途径
[0335]
本公开内容的方面涉及视黄酸信号传导的调节剂作为β细胞分化因子的用途。
[0336]
在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的视黄酸信号传导的调节剂包括视黄酸信号传导的激活剂。在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的ra信号传导途径激活剂包括视黄酸。在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的ra信号传导途径激活剂包括视黄酸受体激动剂。本文提供的方法和组合物中的示例性视黄酸受体激动剂包括但不限于cd 1530、am 580、ttnpb、cd 437、ch 55、bms 961、ac 261066、ac 55649、am 80、bms 753、他扎罗汀、阿达帕林和cd 2314。
[0337]
在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的视黄酸信号传导的调节剂包括视黄酸信号传导的抑制剂。在一些实施方案中，视黄酸信号传导途径抑制剂包括deab(iupac名：2-[2-(二乙基氨基)乙氧基]-3-丙-2-烯基苯甲醛)。在一些实施方案中，视黄酸信号传导途径抑制剂包括deab的类似物或衍生物。
[0338]
在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的视黄酸信号传导途径抑制剂包括视黄酸受体拮抗剂。在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的视黄酸受体拮抗剂包括(e)-4-[2-(5,6-二氢-5,5-二甲基-8-苯基-2-萘基)乙烯基]苯甲酸、(e)-4-[[(5,6-二氢-5,5-二甲基-8-苯基乙炔基)-2-萘基]乙烯基]苯甲酸、(e)-4-[2-[5,6-二氢-5,5-二甲基-8-(2-萘基)-2-萘基]乙烯基]-苯甲酸和(e)-4-[2-[5,6-二氢-5,5-二甲基-8-(4-甲氧基苯基)-2-萘基]乙烯基]苯甲酸。在一些实施方案中，视黄酸受体拮抗剂包括bms195614(cas#253310-42-8)、er 50891(cas#187400-85-7)、bms 493(cas#170355-78-9)、cd 2665(cas#170355-78-9)、le 135(cas#155877-83-1)、bms 453(cas#166977-43-1)或mm 11253(cas#345952-44-5)。
[0339]
在某些实施方案中，本文公开的方法、组合物和试剂盒不包括视黄酸信号传导的调节剂。在某些实施方案中，本文公开的方法、组合物和试剂盒不包括视黄酸信号传导途径激活剂。在某些实施方案中，本文公开的方法、组合物和试剂盒不包括视黄酸信号传导途径抑制剂。
[0340]
在一些实施方案中，视黄酸以0.02μm-0.5μm的浓度存在于培养基中。在一些实施方案中，视黄酸以以下的浓度存在于培养基中：0.02μm-0.5μm、0.05μm-0.5μm、0.1μm-0.5μ
m、0.15μm-0.5μm、0.2μm-0.5μm、0.25μm-0.5μm、0.3μm-0.5μm、0.35μm-0.5μm、0.4μm-0.5μm、0.45μm-0.5μm、0.02μm-0.4μm、0.05μm-0.4μm、0.1μm-0.4μm、0.15μm-0.4μm、0.2μm-0.4μm、0.25μm-0.4μm、0.3μm-0.4μm、0.35μm-0.4μm、0.02μm-0.3μm、0.05μm-0.3μm、0.1μm-0.3μm、0.15μm-0.3μm、0.2μm-0.3μm、0.25μm-0.3μm、0.02μm-0.2μm、0.05μm-0.2μm、0.1μm-0.2μm、0.15μm-0.2μm、0.02μm-0.1μm、0.05μm-0.1μm或0.02μm-0.05μm。在一些实施方案中，视黄酸以以下的浓度存在于培养基中：0.02μm-0.2μm(例如，0.02μm、0.05μm、0.1μm、0.15μm或0.2μm)。在一些实施方案中，视黄酸以0.05μm的浓度存在于培养基中。
[0341]
蛋白激酶c
[0342]
本公开内容的方面涉及蛋白激酶c激活剂作为β细胞分化因子的用途。蛋白激酶c是蛋白激酶最大的家族之一，并且包括多种异形体。传统的异形体包括α、βi、βii、γ；新的异形体包括δ、ε、η、θ；并且非典型的异形体包括ξ和ι/λ。pkc酶主要是胞质的，但在激活时会转运到膜上。在细胞质中，pkc被其他激酶磷酸化或自我磷酸化。为了被激活，一些pkc异形体(例如，pkc-ε)需要分子结合至二酰基甘油(“dag”)结合位点或磷脂酰丝氨酸(“ps”)结合位点。其他异形体能够在完全不需要任何第二结合信使的情况下被激活。与dag位点结合的pkc激活剂包括但不限于苔藓虫素、picologue、佛波酯、海兔毒素(aplysiatoxin)和格尼迪木灵(gnidimacrin)。与ps位点结合的pkc激活剂包括但不限于多不饱和脂肪酸及其衍生物。设想了可以在本文描述的方法、组合物和试剂盒中使用能够单独地或与一种或更多种其他β细胞分化因子组合地诱导至少一个产生胰岛素的内分泌细胞或其前体分化为sc-β细胞的任何蛋白激酶c激活剂。
[0343]
在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的pkc激活剂包括pdbu。在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的pkc激活剂包括tpb。在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的pkc激活剂包括如wipo公开号wo/2013/071282中所述的环丙烷化多不饱和脂肪酸、环丙烷化单不饱和脂肪酸、环丙烷化多不饱和脂肪醇、环丙烷化单不饱和脂肪醇、环丙烷化多不饱和脂肪酸酯、环丙烷化单不饱和脂肪酸酯、环丙烷化多不饱和脂肪酸硫酸酯、环丙烷化单不饱和脂肪酸硫酸酯、环丙烷化多不饱和脂肪酸磷酸酯、环丙烷化单不饱和脂肪酸磷酸酯、大环内酯、dag衍生物、类异戊二烯、辛基吲哚内酰胺v、格尼迪木灵、iripallidal、巨大戟二萜醇(ingenol)、萘磺酰胺(napthalenesulfonamide)、二酰甘油激酶抑制剂、成纤维细胞生长因子18(fgf-18)、胰岛素生长因子、激素和生长因子激活剂。在一些实施方案中，苔藓虫素包括苔藓虫素-1、苔藓虫素-2、苔藓虫素-3、苔藓虫素-4、苔藓虫素-5、苔藓虫素-6、苔藓虫素-7、苔藓虫素-8、苔藓虫素-9、苔藓虫素-10、苔藓虫素-11、苔藓虫素-12、苔藓虫素-13、苔藓虫素-14、苔藓虫素-15、苔藓虫素-16、苔藓虫素-17或苔藓虫素-18。在某些实施方案中，本文公开的方法、组合物和试剂盒不包括蛋白激酶c激活剂。
[0344]
在一些实施方案中，pkc激活剂(例如，pdbu)以0.1μm-10μm的浓度存在于培养基中。在一些实施方案中，pkc激活剂(例如，pdbu)以以下的浓度存在于培养基中：0.1μm-10μm、0.1μm-9μm、0.1μm-8μm、0.1μm-7μm、0.1μm-6μm、0.1μm-5μm、0.1μm-4μm、0.1μm-3μm、0.1μm-2μm、0.1μm-1μm、0.1μm-0.5μm、0.5μm-10μm、0.5μm-9μm、0.5μm-8μm、0.5μm-7μm、0.5μm-6μm、0.5μm-5μm、0.5μm-4μm、0.5μm-3μm、0.5μm-2μm、0.5μm-1μm、1μm-10μm、1μm-9μm、1μm-8μm、1μm-7μm、1μm-6μm、1μm-5μm、1μm-4μm、1μm-3μm、1μm-2μm、2μm-10μm、2μm-9μm、2μm-8μm、2μm-7μm、2μm-6μm、2μm-5μm、2μm-4μm、2μm-3μm、3μm-10μm、3μm-9μm、3μm-8μm、3μm-7μm、3μm-6μm、
3μm-5μm、3μm-4μm、4μm-10μm、4μm-9μm、4μm-8μm、4μm-7μm、4μm-6μm、4μm-5μm、5μm-10μm、5μm-9μm、5μm-8μm、5μm-7μm、5μm-6μm、6μm-10μm、6μm-9μm、6μm-8μm、6μm-7μm、7μm-10μm、7μm-9μm、7μm-8μm、8μm-10μm、8μm-9μm或9μm-10μm。在一些实施方案中，pkc激活剂(例如，pdbu)以以下的浓度存在于培养基中：0.2μm-1μm(例如，0.2μm、0.3μm、0.4μm、0.5μm、0.6μm、0.7μm、0.8μm、0.9μm或1μm)。在一些实施方案中，pkc激活剂(例如，pdbu)以0.3μm-0.7μm或0.4μm-0.6μm的浓度存在于培养基中。在一些实施方案中，pkc激活剂(例如，pdbu)以0.5μm的浓度存在于培养基中。
[0345]
γ-分泌酶抑制剂
[0346]
本公开内容的方面涉及γ-分泌酶抑制剂作为β细胞分化因子的用途。
[0347]
在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的γ-分泌酶抑制剂包括xxi。在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的γ-分泌酶抑制剂包括dapt。本文提供的方法和组合物中的另外的示例性γ-分泌酶抑制剂包括但不限于美国专利第7,049,296号、第8,481,499号、第8,501,813号和wipo公布第wo/2013/052700号中描述的γ-分泌酶抑制剂。在某些实施方案中，本文公开的方法、组合物和试剂盒不包括γ-分泌酶抑制剂。
[0348]
在一些实施方案中，notch信号传导途径抑制剂(例如，γ-分泌酶抑制剂，诸如xxi)以以下的浓度存在于培养基中：0.1μm-10μm、0.1μm-9μm、0.1μm-8μm、0.1μm-7μm、0.1μm-6μm、0.1μm-5μm、0.1μm-4μm、0.1μm-3μm、0.1μm-2μm、0.1μm-1μm、0.1μm-0.5μm、0.5μm-10μm、0.5μm-9μm、0.5μm-8μm、0.5μm-7μm、0.5μm-6μm、0.5μm-5μm、0.5μm-4μm、0.5μm-3μm、0.5μm-2μm、0.5μm-1μm、1μm-10μm、1μm-9μm、1μm-8μm、1μm-7μm、1μm-6μm、1μm-5μm、1μm-4μm、1μm-3μm、1μm-2μm、2μm-10μm、2μm-9μm、2μm-8μm、2μm-7μm、2μm-6μm、2μm-5μm、2μm-4μm、2μm-3μm、3μm-10μm、3μm-9μm、3μm-8μm、3μm-7μm、3μm-6μm、3μm-5μm、3μm-4μm、4μm-10μm、4μm-9μm、4μm-8μm、4μm-7μm、4μm-6μm、4μm-5μm、5μm-10μm、5μm-9μm、5μm-8μm、5μm-7μm、5μm-6μm、6μm-10μm、6μm-9μm、6μm-8μm、6μm-7μm、7μm-10μm、7μm-9μm、7μm-8μm、8μm-10μm、8μm-9μm或9μm-10μm。在一些实施方案中，notch信号传导途径抑制剂(例如，γ-分泌酶抑制剂，诸如xxi)以以下的浓度存在于培养基中：0.5μm
–
5μm(例如，0.5μm、1μm、1.5μm、2μm、2.5μm、3μm、3.5μm、4μm、4.5μm或5μm)。在一些实施方案中，notch信号传导途径抑制剂(例如，γ-分泌酶抑制剂，诸如xxi)以2μm的浓度存在于培养基中。
[0349]
甲状腺激素信号传导途径激活剂
[0350]
本公开内容的方面涉及甲状腺激素信号传导途径激活剂作为β细胞分化因子的用途。
[0351]
在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的甲状腺激素信号传导途径激活剂包括三碘甲腺原氨酸(t3)。在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的甲状腺激素信号传导途径激活剂包括gc-1。在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的甲状腺激素信号传导途径激活剂包括t3或gc-1的类似物或衍生物。本文提供的方法和组合物中的t3的示例性类似物包括但不限于选择性和非选择性的拟甲状腺素药(thyromimetic)、trβ选择性激动剂-gc-1、gc-24、4-羟基-pcb 106、mb07811、mb07344、3,5-二碘甲腺丙酸(ditpa)；选择性tr-β激动剂gc-1；3-碘类甲腺质(3-iodothyronamine)(t(1)am)和3,3’,5-三碘甲腺乙酸(triac)(激素甲状腺素的生物活性代谢物(t(4))；kb-2115和kb-141；类甲腺质；skf l-94901；dibit；3
’‑
ac-t2；四碘甲腺乙酸(tetrac)和三碘甲腺乙酸(triac)(通过
甲状腺素[t4]和三碘甲腺原氨酸[t3]丙氨酸链的氧化脱氨和脱羧)、3,3’,5
’‑
三碘甲腺原氨酸(rt3)(通过t4和t3脱碘)、3,3
’‑
二碘甲腺原氨酸(3,3
’‑
t2)和3,5-二碘甲腺原氨酸(t2)(通过t4、t3和rt3脱碘)以及3-碘类甲腺质(t1am)和类甲腺质(t0am)(通过t4和t3脱碘和氨基酸脱羧)，以及th结构类似物，诸如3,5,3
’‑
三碘甲腺丙酸(triprop)、3,5-二溴-3-哒嗪酮-1-甲腺原氨酸(l-940901)、n-[3,5-二甲基-4-(4
’‑
羟基-3
’‑
异丙基苯氧基)-苯基]-草氨酸(cgs23425)、3,5-二甲基-4-[(4
’‑
羟基-3
’‑
异丙基苄基)-苯氧基]乙酸(gc-1)、3,5-二氯-4-[(4-羟基-3-异丙基苯氧基)苯基]乙酸(kb-141)和3,5-二碘甲腺丙酸(ditpa)。
[0352]
在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的甲状腺激素信号传导途径激活剂包括t3的前药或激素原，诸如t4甲状腺激素(例如，甲状腺素或l-3,5,3’,5
’‑
四碘甲腺原氨酸)。
[0353]
在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的甲状腺激素信号传导途径激活剂是美国专利第7,163,918号中描述的碘甲腺原氨酸组合物。
[0354]
在一些实施方案中，甲状腺激素(例如，gc-1)以0.1μm-10μm的浓度存在于培养基中。在一些实施方案中，甲状腺激素(例如，gc-1)以以下的浓度存在于培养基中：0.1μm-10μm、0.1μm-9μm、0.1μm-8μm、0.1μm-7μm、0.1μm-6μm、0.1μm-5μm、0.1μm-4μm、0.1μm-3μm、0.1μm-2μm、0.1μm-1μm、0.1μm-0.5μm、0.5μm-10μm、0.5μm-9μm、0.5μm-8μm、0.5μm-7μm、0.5μm-6μm、0.5μm-5μm、0.5μm-4μm、0.5μm-3μm、0.5μm-2μm、0.5μm-1μm、1μm-10μm、1μm-9μm、1μm-8μm、1μm-7μm、1μm-6μm、1μm-5μm、1μm-4μm、1μm-3μm、1μm-2μm、2μm-10μm、2μm-9μm、2μm-8μm、2μm-7μm、2μm-6μm、2μm-5μm、2μm-4μm、2μm-3μm、3μm-10μm、3μm-9μm、3μm-8μm、3μm-7μm、3μm-6μm、3μm-5μm、3μm-4μm、4μm-10μm、4μm-9μm、4μm-8μm、4μm-7μm、4μm-6μm、4μm-5μm、5μm-10μm、5μm-9μm、5μm-8μm、5μm-7μm、5μm-6μm、6μm-10μm、6μm-9μm、6μm-8μm、6μm-7μm、7μm-10μm、7μm-9μm、7μm-8μm、8μm-10μm、8μm-9μm或9μm-10μm。在一些实施方案中，甲状腺激素(例如，gc-1)以以下的浓度存在于培养基中：0.5μm-5μm(例如，0.5μm、1μm、1.5μm、2μm、2.5μm、3μm、3.5μm、4μm、4.5μm或5μm)。在一些实施方案中，甲状腺激素(例如，gc-1)以1μm的浓度存在于培养基中。
[0355]
表皮生长因子(egf)家族
[0356]
本公开内容的方面涉及来自egf家族的生长因子作为β细胞分化因子的用途。
[0357]
在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的至少一种来自egf家族的生长因子包括β细胞素。在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的至少一种来自egf家族的生长因子包括egf。表皮生长因子(egf)是从大的整合膜蛋白前体蛋白水解裂解的53个氨基酸的细胞因子。在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的来自egf家族的生长因子包括变体egf多肽，例如在美国专利第7,084,246号中所公开的与人类野生型egf多肽序列具有至少90％氨基酸同一性的分离的表皮生长因子多肽。在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的来自egf家族的生长因子包括在美国专利第8,247,531号中所公开的结合并激动(agonize)egf受体的工程化egf突变体。在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的来自egf家族的至少一种生长因子被激活egf家族中的信号传导途径的剂代替。在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的来自egf家族的生长因子包括模拟egf的化合物。在某些实施方案中，本文公开的方法、组合物和试剂盒不包括来自egf家族的生长因子。
0.5μm、0.25μm-0.5μm、0.3μm-0.5μm、0.35μm-0.5μm、0.4μm-0.5μm、0.45μm-0.5μm、0.05μm-0.4μm、0.1μm-0.4μm、0.15μm-0.4μm、0.2μm-0.4μm、0.25μm-0.4μm、0.3μm-0.4μm、0.35μm-0.4μm、0.05μm-0.3μm、0.1μm-0.3μm、0.15μm-0.3μm、0.2μm-0.3μm、0.25μm-0.3μm、0.05μm-0.2μm、0.1μm-0.2μm、0.15μm-0.2μm或0.05μm-0.1μm。在一些实施方案中，组蛋白甲基转移酶ezh2抑制剂(例如，dznep)以以下的浓度存在于培养基中：0.05μm-0.2μm(例如0.05μm、0.1μm、0.15μm或0.2μm)。在一些实施方案中，组蛋白甲基转移酶ezh2抑制剂(例如，dznep)以0.1μm的浓度存在于培养基中。
[0365]
蛋白激酶抑制剂
[0366]
本公开内容的方面涉及蛋白激酶抑制剂作为β细胞分化因子的用途。
[0367]
在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的蛋白激酶抑制剂包括星形孢菌素。在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的蛋白激酶抑制剂包括星形孢菌素的类似物。本文提供的方法和组合物中的星形孢菌素的示例性类似物包括但不限于ro-31-8220、双吲哚基马来酰亚胺(bis)化合物、10
′‑
{5
″‑
[(甲氧羰基)氨基]-2
″‑
甲基}-苯基氨基羰基星形孢菌素、staralog(参见，例如lopez等人，“staurosporine-derived inhibitors broaden the scope of analog-sensitive kinase technology”,j.am.chem.soc.2013；135(48):18153-18159)和cgp41251。
[0368]
在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的蛋白激酶抑制剂是pkcβ的抑制剂。在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的蛋白激酶抑制剂是具有以下化结构的pkcβ抑制剂或如下化合物的衍生物、类似物或变体：
[0369][0370]
在一些实施方案中，pkcβ的抑制剂是具有以下结构的gsk-2化合物或如下化合物的衍生物、类似物或变体：
[0371][0372]
在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的pkc抑制剂是双吲哚基马来酰亚胺。示例性的双吲哚基马来酰亚胺包括但不限于：双吲哚基马来酰亚胺i、双吲哚基马来
酰亚胺ii、双吲哚基马来酰亚胺iii、其盐酸盐或衍生物、类似物或变体。
[0373]
在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的pkc抑制剂是伪金丝桃素或其衍生物、类似物或变体。在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的pkc抑制剂是indorublin-3-单肟、5-iodo或其衍生物、类似物或变体。在某些实施方案中，本文公开的方法、组合物和试剂盒不包括蛋白激酶抑制剂。
[0374]
在一些实施方案中，蛋白激酶抑制剂(例如，星形孢菌素)以0.5nm-10nm的浓度存在于培养基中。在一些实施方案中，蛋白激酶抑制剂(例如，星形孢菌素)以以下的浓度存在于培养基中：0.5nm-10nm、0.5nm-9nm、0.5nm-8nm、0.5nm-7nm、0.5nm-6nm、0.5nm-5nm、0.5nm-4nm、0.5nm-3nm、0.5nm-2nm、0.5nm-1nm、1nm-10nm、1nm-9nm、1nm-8nm、1nm-7nm、1nm-6nm、1nm-5nm、1nm-4nm、1nm-3nm、1nm-2nm、2nm-10nm、2nm-9nm、2nm-8nm、2nm-7nm、2nm-6nm、2nm-5nm、2nm-4nm、2nm-3nm、3nm-10nm、3nm-9nm、3nm-8nm、3nm-7nm、3nm-6nm、3nm-5nm、3nm-4nm、4nm-10nm、4nm-9nm、4nm-8nm、4nm-7nm、4nm-6nm、4nm-5nm、5nm-10nm、5nm-9nm、5nm-8nm、5nm-7nm、5nm-6nm、6nm-10nm、6nm-9nm、6nm-8nm、6nm-7nm、7nm-10nm、7nm-9nm、7nm-8nm、8nm-10nm、8nm-9nm或9nm-10nm。在一些实施方案中，蛋白激酶抑制剂(例如，星形孢菌素)以以下的浓度存在于培养基中：1nm-5nm(例如，1nm、2nm、3nm、4nm或5nm)。在一些实施方案中，蛋白激酶抑制剂(例如，星形孢菌素)以3nm的浓度存在于培养基中。
[0375]
药物组合物
[0376]
本公开内容涉及包括通过任何前述方法产生的细胞或包含任何前述细胞群体的治疗组合物。所述治疗组合物还可以包含生理相容溶液，其包括例如人工脑脊液或磷酸盐缓冲盐水。所述治疗组合物可用于治疗、预防或稳定糖尿病。例如，体细胞或干细胞可以从需要治疗的个体或健康个体获得，并通过本公开内容的方法重编程为干细胞衍生的β细胞。在本公开内容的一种实施方案中，将干细胞衍生的β细胞分选并富集并引入到个体中以治疗该状况。在另一实施方案中，干细胞在引入到个体中之前在适于分化为β细胞的条件下培养，并且可以用于替代或辅助病变或受损组织的正常功能。本公开内容的巨大优势在于，其提供了本质上无限量的患者特异性人类β细胞或来自具有适合移植的相同hla类型的健康个体的相容的干细胞衍生的β细胞。在细胞治疗中使用自体和/或相容细胞提供了优于使用非自体细胞的重大优势，非自体细胞可能会受到免疫排斥。相反，自体细胞不太可能引起显著的免疫应答。
[0377]
在一些情况下，本公开内容提供了可以在用于治疗疾病(例如，糖尿病)的各种方法中利用非天然胰腺β细胞(β细胞)群体以及细胞组分和产物的药物组合物。某些情况包括包含活细胞(例如，单独的或与其他细胞类型混合的非天然胰腺β细胞)的药物组合物。其他情况包括包含非天然胰腺β细胞组分(例如，细胞裂解物、可溶性细胞级分、条件培养基、ecm或上述任一种的组分)或产物(例如，由非天然胰腺β细胞或通过遗传修饰产生的营养因子和其他生物因子、来自非天然胰腺β细胞培养物的条件培养基)的药物组合物。在任一种情况下，药物组合物还可以包含本领域技术人员已知的其他活性剂，诸如抗炎剂、外源性小分子激动剂、外源性小分子拮抗剂、抗凋亡剂、抗氧化剂和/或生长因子。
[0378]
本公开内容的药物组合物可以包含与药学上可接受的载体(例如，介质或赋形剂)一起配制的非天然胰腺β细胞或其组分或产物。术语药学上可接受的载体(或介质)可以与术语生物相容性载体或介质可互换使用，可以指这样的试剂、细胞、化合物、材料、组合物
和/或剂型，其不仅与待治疗性施用的细胞和其他剂相容，而且还适合于与人类和动物的组织接触使用而无过度的毒性、刺激、变态反应或其他并发症。合适的药学上可接受的载体可以包括水、盐溶液(诸如林格氏液)、醇、油、明胶和碳水化合物，诸如乳糖、直链淀粉或淀粉、脂肪酸酯、羟甲基纤维素和聚乙烯吡咯烷。这样的制剂可以是灭菌的，并且在期望的情况下可以与诸如润滑剂、防腐剂、稳定剂、湿润剂、乳化剂、影响渗透压的盐、缓冲剂和着色剂等辅助剂混合。包含细胞组分或产物但不包含活细胞的药物组合物可以配制成液体。包含活的非天然胰腺β细胞的药物组合物可以配制成液体、半固体(例如，凝胶、凝胶胶囊或脂质体)或固体(例如，基质、支架等)。
[0379]
如本文使用的，术语“药学上可接受的”可以指在合理的医学判断范围内，适合于与人类和动物的组织接触使用而无过度的毒性、刺激、变态反应或者其他问题或并发症，与合理的获益/风险比相称的那些化合物、材料、组合物和/或剂型。
[0380]
如本文使用的，术语“药学上可接受的载体”可以指涉及将主题化合物从一个器官或身体部分携带或运输到另一器官或身体部分的药学上可接受的材料、组合物或媒介物，诸如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、制造助剂(例如，润滑剂、滑石、硬脂酸镁、硬脂酸钙或硬脂酸锌，或硬脂酸)或溶剂包封材料。在与制剂的其他成分相容并且对患者无害的意义上，每种载体必须是“可接受的”。可以用作药学上可接受的载体的材料的一些实例包括：(1)糖，诸如乳糖、葡萄糖和蔗糖；(2)淀粉，诸如玉米淀粉和马铃薯淀粉；(3)纤维素及其衍生物，诸如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、乙基纤维素、微晶纤维素和乙酸纤维素；(4)粉状黄蓍胶；(5)麦芽；(6)明胶；(7)润滑剂，诸如硬脂酸镁、十二烷基硫酸钠和滑石；(8)赋形剂，诸如可可脂和栓剂蜡；(9)油，诸如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；(10)二元醇，诸如丙二醇；(11)多元醇，诸如甘油、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇(peg)；(12)酯，诸如油酸乙酯和月桂酸乙酯；(13)琼脂；(14)缓冲剂，诸如氢氧化镁和氢氧化铝；(15)藻酸；(16)无热原水；(17)等渗盐水；(18)林格氏溶液；(19)乙醇；(20)ph缓冲溶液；(21)聚酯、聚碳酸酯和/或聚酐；(22)填充剂(bulking agent)，诸如多肽和氨基酸；(23)血清组分，诸如血清白蛋白、hdl和ldl；(22)c2-c12醇，诸如乙醇；以及(23)在药物制剂中使用的其他无毒的相容性物质。制剂中还可存在润湿剂、着色剂、脱模剂、包衣剂、甜味剂、调味剂、芳香剂、防腐剂和抗氧化剂。诸如“赋形剂”、“载体”、“药学上可接受的载体”等术语在本文中可互换使用。
[0381]
如本文使用的使用的，关于细胞群体的短语“治疗有效量”意味着以适用于任何医学治疗的合理的获益/风险比在动物中细胞的至少亚群体中有效地产生一些期望的治疗效果的细胞群体中的相关细胞(例如，本公开内容的sc-β细胞或成熟的胰腺β细胞，或包含sc-β细胞的组合物)的量。例如，向受试者施用的足以在1型、1.5型或2型糖尿病的至少一种症状中产生统计上显著的、可测量的变化(诸如糖基化血红蛋白水平、空腹血糖水平、低胰岛素血症，等等)的sc-β细胞群体的量。治疗有效量的确定完全在本领域技术人员的能力范围内。通常，治疗有效量可以随受试者的病史、年龄、状况、性别以及受试者的医学状况的严重程度和类型以及其他药物活性剂的施用而变化。
[0382]
在一些情况下，干细胞衍生的β细胞的药物组合物以常规的方式使用一种或更多种生理上可接受的载体进行配制，所述载体包括赋形剂和助剂，其有助于将活性化合物加工成可药用的制剂。合适的制剂取决于所选择的施用途径。本文描述的药物组合物的概述
可见于，例如，remington:the science and practice of pharmacy,第十九版(easton,pa.:mack publishing company,1995)；hoover,john e.,remington’s pharmaceutical sciences,mack publishing co.,easton,pennsylvania 1975；liberman,h.a.和lachman,l.,编著,pharmaceutical dosage forms,marcel decker,new york,n.y.,1980；以及pharmaceutical dosage forms and drug delivery systems,第七版(lippincott williams&wilkins1999)。
[0383]
药物组合物任选地以常规方式制备，诸如，仅通过实例的方式，通过常规混合、溶解、制粒、糖衣丸制备、粉碎、乳化、包封、包埋或压制工艺。
[0384]
在某些实施方案中，组合物还可以包含一种或更多种ph调节剂或缓冲剂，包括酸，诸如乙酸、硼酸、柠檬酸、乳酸、磷酸和盐酸；碱，诸如氢氧化钠、磷酸钠、硼酸钠、柠檬酸钠、乙酸钠、乳酸钠和三羟甲基氨基甲烷；以及缓冲剂，诸如柠檬酸盐/右旋糖、碳酸氢钠和氯化铵。这些酸、碱和缓冲剂以所需的量包含在内，以使组合物的ph维持在可接受的范围内。
[0385]
在其他实施方案中，组合物还可以包含所需量的一种或更多种盐，以使组合物的重量摩尔渗透压浓度在可接受的范围内。这些盐包括含有钠、钾或铵阳离子和氯离子、柠檬酸根、抗坏血酸根、硼酸根、磷酸根、碳酸氢根、硫酸根、硫代硫酸根或亚硫酸氢根阴离子的那些盐；合适的盐包括氯化钠、氯化钾、硫代硫酸钠、亚硫酸氢钠和硫酸铵。
[0386]
本文描述的药物组合物通过任何合适的施用途径施用，包括但不限于，口服、肠胃外(例如，静脉内、皮下、肌肉内、脑内、脑室内、关节内、腹膜内或颅内)、鼻内、含服、舌下或直肠施用途径。在一些情况下，将药物组合物配制成用于肠胃外(例如，静脉内、皮下、肌肉内、脑内、脑室内、关节内、腹膜内或颅内)施用。
[0387]
本文描述的药物组合物被配制为任何合适的剂型，包括但不限于，水性口服分散液、液体、凝胶、糖浆、酏剂、浆液、悬浮液等，以供待治疗的个体口服摄取；固体口服剂型、气雾剂、控释制剂、速熔制剂、泡腾剂制剂、冻干制剂、片剂、粉末、丸剂、糖衣丸、胶囊、缓释制剂、延迟释放剂、脉冲释放制剂、多颗粒制剂，以及混合即时释放和控释制剂。在一些实施方案中，药物组合物被配制为胶囊。在一些实施方案中，药物组合物被配制为溶液(例如，用于iv施用)。在一些情况下，药物组合物被配制为输注液。在一些情况下，药物组合物被配制为注射剂。
[0388]
本文描述的药物固体剂型任选地包含本文描述的化合物和一种或更多种药学上可接受的添加剂，诸如相容性载体、黏合剂、填充剂、悬浮剂、调味剂、甜味剂、崩解剂、分散剂、表面活性剂、润滑剂、着色剂、稀释剂、增溶剂、湿润剂、增塑剂、稳定剂、渗透促进剂、润湿剂、消泡剂、抗氧化剂、防腐剂或其一种或更多种组合。
[0389]
在又其他的方面，使用标准包衣程序，诸如在remington’s pharmaceutical sciences，第20版(2000)中描述的包衣程序，在组合物周围提供薄膜包衣。在一些实施方案中，组合物被配制为颗粒(例如以供通过胶囊施用)，并且部分或全部颗粒被包衣。在一些实施方案中，组合物被配制为颗粒(例如以供通过胶囊施用)，并且部分或全部颗粒被微囊化。在一些实施方案中，组合物被配制为颗粒(例如以供通过胶囊施用)，并且部分或全部颗粒未被微囊化且未被包衣。
[0390]
在某些实施方案中，本文提供的组合物还可包含一种或更多种防腐剂，以抑制微生物活性。合适的防腐剂包括含汞物质，诸如硼酸苯汞和硫柳汞；稳定的二氧化氯；以及季
共-乙醇酸)、甲基纤维素、透明质酸、胶原蛋白等。
[0398]
在其他情况下，将细胞递送到可生物降解的(优选可生物再吸收的或可生物吸收的)支架或基质之上或之内可能是期望的或适当的。这些典型的三维生物材料包含附着于支架、分散在支架内或并入包埋在支架中的细胞外基质中的活细胞。在植入身体的靶区域后，这些植入物与宿主组织整合，其中移植的细胞逐渐建立。
[0399]
可以在本公开内容中使用的支架或基质(有时统称为“框架”)材料的实例包括非织造垫、多孔泡沫或自组装肽。例如，非织造垫可以使用包含以下的纤维来形成：合成的可吸收的乙醇酸和乳酸的共聚物(pga/pla)、泡沫和/或者聚(ε-己内酯)/聚(乙醇酸)(pcl/pga)共聚物。
[0400]
在另一实施方案中，框架是毡状物(felt)，其可以包含由可生物吸收的材料(例如，pga、pla、pcl共聚物或共混物、或者透明质酸)制成的复丝纱线(multifilament yarn)。使用由卷曲(crimping)、切割、梳理(carding)和针织(needling)组成的标准纺织加工技术将纱线制成毡状物。在另一实施方案中，将细胞接种到泡沫支架上，该泡沫支架可以是复合结构。在上述许多情况下，框架可以模塑成有用的形状。此外，应当理解，非天然胰腺β细胞可以在预先成形的不可降解的手术或可植入装置上培养。
[0401]
基质、支架或装置可以在细胞接种前进行处理，以便增强细胞附着。例如，在接种前，可以用0.1m乙酸处理尼龙基质，并在聚赖氨酸、pbs和/或胶原蛋白中孵育以包覆尼龙。可以用硫酸对聚苯乙烯进行类似处理。框架的外表面也可以进行修饰，以改善细胞的附着或生长以及组织的分化，诸如通过血浆包覆框架或者添加一种或更多种蛋白质(例如，胶原蛋白、弹性纤维、网状纤维)、糖蛋白、糖胺聚糖(例如，硫酸肝素、4-硫酸软骨素、6-硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸角蛋白)、细胞基质和/或其他材料，诸如但不限于，明胶、藻酸盐、琼脂、琼脂糖和植物胶等。
[0402]
在一方面，本公开内容提供了包含细胞簇的装置，所述细胞簇包含至少一种胰腺β细胞。本文提供的装置可以被配置为当植入受试者中时产生和释放胰岛素。装置可以包含细胞簇，所述细胞簇包含至少一种胰腺β细胞，例如，非天然胰腺β细胞。装置中的细胞簇可以表现出体外gsis。装置还可以包含半透膜。半透膜可以被配置为将细胞簇保留在装置中，并允许细胞簇分泌的胰岛素通过。在装置的一些情况下，细胞簇可以被半透膜包封。包封可以通过本领域技术人员可用的任何技术进行。半透膜也可以由本领域技术人员将理解和验证的任何合适的材料制成。例如，半透膜可以由多糖或聚阳离子制成。在一些情况下，半透膜可以由聚(丙交酯)(pla)、聚(乙醇酸)(pga)、聚(丙交酯-共-乙交酯)(plga)和其他聚羟基酸、聚(己内酯)、聚碳酸酯、聚酰胺、聚酐、聚磷腈、聚氨基酸、聚原酸酯、聚缩醛、聚氰基丙烯酸酯、可生物降解的聚氨酯、白蛋白、胶原蛋白、纤维蛋白、聚氨基酸、谷醇溶蛋白、藻酸盐、琼脂糖、琼脂糖与明胶、右旋糖酐、聚丙烯酸酯、乙烯-乙酸乙烯酯聚合物及其他酰基取代的乙酸纤维素及其衍生物、聚氨酯、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚氟乙烯、聚(乙烯基咪唑)、氯磺化聚烯烃、聚氧化乙烯或其任何组合。在一些情况下，半透膜包含藻酸盐。在一些情况下，细胞簇被包封在微胶囊中，所述微胶囊包含被半透膜包围的藻酸盐核心。在一些情况下，对藻酸盐核心进行修饰，例如以产生包含藻酸盐核心的支架，所述藻酸盐核心具有与rgd序列(精氨酸、甘氨酸、天冬氨酸)共价缀合的寡肽。在一些情况下，对藻酸盐核心进行修饰，例如，以产生具有稳定性增强的化学酶促工程化的藻酸盐的共价加强的微胶囊。在一些情况
下，对藻酸盐核心进行修饰，例如以产生通过丙烯酸酯官能化磷脂的原位聚合而组装的模拟膜的薄层。在一些情况下，微胶囊包含使用差向异构酶酶促修饰的藻酸盐。在一些情况下，微胶囊包含微胶囊膜的相邻层之间的共价连接。在一些实施方案中，微胶囊包含亚筛粒度的胶囊，其包含与酚部分偶联的藻酸盐。在一些情况下，微胶囊包含支架，所述支架包含藻酸盐-琼脂糖。在一些情况下，sc-β细胞被peg修饰，然后包封在藻酸盐中。在一些情况下，分离的细胞群体，例如，sc-β细胞被包封在光反应性脂质体和藻酸盐中。应当理解，微胶囊中使用的藻酸盐可以用其他合适的生物材料代替，包括但不限于，聚乙二醇(peg)、壳聚糖、聚酯中空纤维、胶原蛋白、透明质酸、右旋糖酐与rod、bhd和聚乙二醇-二丙烯酸酯(pegda)、聚(mpc-共-甲基丙烯酸正丁酯-共-4-乙烯基苯基硼酸)(pmbv)和聚(乙烯醇)(pva)、琼脂糖、琼脂糖与明胶以及这些的多层情况。在一些情况下，本文提供的装置包括体外区段，例如，当将装置植入到受试者中时，装置的一部分可以在受试者体外。体外区段可以包括装置的任何具有或不具有本文提供的细胞或细胞簇的功能组件。
[0403]
治疗方法
[0404]
本文还提供了用于治疗或预防受试者中的疾病的方法。可以将包含本文提供的或根据本文提供的方法产生的细胞簇或细胞的组合物施用于受试者以在受试者中恢复一定程度的胰腺功能。例如，可以将类似于内源性胰岛的细胞簇或类似于内源性胰腺α、β和/或δ细胞的细胞(例如，非天然胰腺α、β和/或δ细胞)或其前体移植至受试者以治疗糖尿病。
[0405]
该方法可以包括将本技术中公开的细胞簇或细胞移植到受试者，例如，有相应需要的受试者。术语“移植”可以指通过导致引入的细胞或细胞簇至少部分地定位在期望部位的方法或途径，将细胞或细胞簇、细胞或其细胞簇的任何部分、或者包含细胞、细胞簇或其任何部分的任何组合物置于受试者体内。细胞或细胞簇可以直接植入胰腺，或可选地通过任何适当的途径施用，所述途径导致递送至受试者体内的期望位置，在该处至少一部分植入的细胞或细胞簇保持存活。在施用于受试者后，细胞或细胞簇的存活期可以短至几小时(例如，二十四小时)至几天，至长达数年。在一些情况下，细胞或细胞簇，或者其细胞或细胞簇的任何部分，还可以在非胰腺位置(诸如在肝中或皮下)反式施用(transadminister)，例如，在胶囊(例如，微胶囊)中施用以使植入的细胞或细胞簇维持在植入位置，并避免迁移。
[0406]
如本文所使用的，术语“治疗(treating)”和“治疗(treatment)”可以指向受试者施用有效量的组合物(例如，细胞簇或其部分)，从而使受试者获得疾病的至少一种症状的减少或疾病改善，例如，有益或期望的临床结果。为了本公开内容的目的，有益或期望的临床结果包括但不限于一种或更多种症状的缓和、疾病程度的减弱、疾病的稳定状态(例如，不恶化)、疾病进展的延迟或减慢、疾病状态的改善或减轻、以及缓解(例如，部分的或完全的)，无论是可检测的还是不可检测的。治疗可以指与不接受治疗的情况下预期的生存期相比延长生存期。因此，本领域技术人员将意识到治疗可以改善疾病状况，但是可能不完全治愈该疾病。如本文使用的，术语“治疗”包括预防。
[0407]
示例性的施用模式包括但不限于注射、输注、滴注、吸入或摄取。“注射”包括但不限于静脉内、肌肉内、动脉内、鞘内、心室内、囊内、眶内、心脏内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下(suhcuticular)、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、脑脊髓内和胸骨内注射和输注。在优选的实施方案中，组合物通过静脉内输注或注射施用。
[0408]
疾病或紊乱的“治疗”、“预防”或“改善”是指延迟或预防这样的疾病或紊乱的发
作，逆转、缓和、改善、抑制、减慢或停止与这样的疾病或紊乱相关的状况的进展或严重程度的进展、加重或恶化。在一种实施方案中，疾病或紊乱的症状缓和了至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％或至少50％。
[0409]
糖尿病的治疗通过标准医学方法来确定。糖尿病治疗的目标是使糖水平尽可能安全地降至接近正常水平。通常设定的目标是餐前80-120毫克每分升(mg/dl)，睡前100-140mg/dl。特定的医师可能会根据其他因素(诸如患者多久一次发生低血糖反应)为患者设定不同的目标。有用的医学测试包括对患者血液和尿液的测试以确定血糖水平、对糖基化血红蛋白水平(hba1c；过去2-3个月中的平均血糖水平的量度，正常范围为4％-6％)的测试、对胆固醇和脂肪水平的测试以及对尿蛋白水平的测试。这样的测试是本领域技术人员已知的标准测试(参见例如，美国糖尿病协会(american diabetes association)，1998)。也可以通过在方案中减少具有与糖尿病相关的并发症(诸如眼病、肾病或神经疾病)的患者来确定成功的治疗方案。
[0410]
延迟受试者的糖尿病的发作是指使糖尿病的至少一种症状(例如高血糖症、低胰岛素血症、糖尿病性视网膜病变、糖尿病性肾病、失明、记忆丧失、肾衰竭、心血管疾病(包括冠状动脉疾病、外周动脉疾病、脑血管疾病、动脉粥样硬化和高血压)、神经病、自主神经功能障碍、高血糖高渗性昏迷或其组合)的发作延迟至少1周、至少2周、至少1个月、至少2个月、至少6个月、至少1年、至少2年、至少5年、至少10年、至少20年、至少30年、至少40年或更久，并且可以包括受试者的整个生命期间。
[0411]
在一些方面，本公开内容涉及一种方法，该方法包括在受试者中植入包含本文提供的细胞或细胞簇(例如，胰岛素产生细胞)的装置，其中所述装置以足以降低受试者的血糖水平的量释放胰岛素。在一些实施方案中，胰岛素产生细胞是葡萄糖响应性胰岛素产生细胞。
[0412]
在一些实施方案中，由本文提供的细胞或细胞簇或装置的移植诱导的受试者血糖水平的降低导致葡萄糖的量低于糖尿病阈值。在一些实施方案中，受试者是哺乳动物受试者。在一些实施方案中，哺乳动物受试者是人类。在一些实施方案中，在植入后1、2、3、4、5、6、7、8、9或10天，葡萄糖的量减少至低于糖尿病阈值。
[0413]
如上详述的，本公开内容的药物组合物可以被特别地配制为用于以固体或液体形式施用，包括适用于以下的那些：(1)口服施用，例如灌服药(drenches，水性或非水性溶液或悬浮液)、锭剂、糖衣丸，胶囊、丸剂、片剂(例如，针对含服、舌下和全身吸收的片剂)、大药丸(boluses)、粉末、颗粒、用于应用于舌头的糊剂；(2)肠胃外施用，例如通过皮下、肌肉内、静脉内或硬膜外注射，作为例如无菌溶液或悬浮液或缓释制剂；(3)表面(topical)应用，例如作为应用于皮肤的乳膏、软膏或者控释贴剂或喷雾剂；(4)阴道内或直肠内，例如作为阴道栓、乳膏或泡沫；(5)舌下；(6)眼；(7)经皮；(8)经黏膜；或(9)鼻。另外，可以将化合物植入到患者体内或使用药物递送系统注射。参见，例如urquhart等人，ann.rev.pharmacol.toxicol.24:199-236(1984)；lewis编著“controlled release of pesticides and pharmaceuticals”(plenum press，new york，1981)；美国专利第3,773,919号；以及美国专利第35 3,270,960号。
[0414]
可以通过本文的方法治疗的受试者可以是人类或非人类动物。在一些情况下，受试者可以是哺乳动物。受试者的实例包括但不限于灵长类动物，例如，猴子、黑猩猩、狒狒或
人类。在一些情况下，受试者是人类。受试者可以是非灵长类动物，包括但不限于狗、猫、马、牛、猪、绵羊、山羊、兔等。在一些情况下，接受治疗的受试者是有相应需要的受试者，例如，有相应需要的人类。
[0415]
在某些实施方案中，受试者是哺乳动物，例如灵长类动物，例如人类。术语“患者”和“受试者”在本文可互换使用。优选地，受试者是哺乳动物。哺乳动物可以是人类、非人灵长类动物、小鼠、大鼠、狗、猫、马或牛，但不限于这些实例。非人哺乳动物可以有利地用作代表1型糖尿病、2型糖尿病或前驱糖尿病状况的动物模型的受试者。另外，本文描述的方法可以用于治疗家养动物和/或宠物。受试者可以是雄性或雌性。受试者可以是先前已被诊断或被鉴别为罹患或具有糖尿病(例如1型或2型)、糖尿病相关的一种或更多种并发症或前驱糖尿病状况的个体，并且任选地但不需要已经经历了针对糖尿病、糖尿病相关的一种或更多种并发症或前驱糖尿病状况的治疗。受试者还可以是未罹患糖尿病或前驱糖尿病状况的受试者。受试者还可以是已经被诊断或被鉴别为罹患糖尿病、糖尿病相关的一种或更多种并发症或前驱糖尿病状况，但是由于接受针对糖尿病、糖尿病相关的一种或更多种并发症或前驱糖尿病状况的一种或更多种治疗而显示出已知糖尿病风险因素的改善的个体。可选地，受试者还可以是先前未被诊断患有糖尿病、糖尿病相关的一种或更多种并发症或前驱糖尿病状况的受试者。例如，受试者可以是表现出一种或更多种糖尿病、糖尿病相关的并发症或前驱糖尿病状况的风险因素的受试者，或者未表现出糖尿病风险因素的受试者，或者是对糖尿病、糖尿病相关的一种或更多种并发症或前驱糖尿病状况无症状的受试者。受试者还可以是罹患糖尿病或前驱糖尿病状况或具有发展糖尿病或前驱糖尿病状况风险的受试者。受试者还可以是已被诊断或鉴别为患有与本文所定义的糖尿病或前驱糖尿病状况相关的一种或更多种并发症的受试者，或者可选地，受试者可以是先前未被诊断或鉴别为患有与糖尿病或前驱糖尿病状况相关的一种或更多种并发症的受试者。
[0416]
所述方法可以包括使用本领域中的任何手段将细胞簇移植至受试者。例如，所述方法可以包括经由腹膜内间隙、肾小囊下、肾小囊、网膜、皮下间隙或经由胰床输注来移植细胞簇。例如，移植可以是囊下移植、肌肉内移植或门静脉内移植，例如，门静脉内输注。在一些实施方案中，细胞簇经由肝门静脉施用。可以实施免疫保护性包封以对细胞簇提供免疫保护。在一些情况下，本文提供的治疗方法可以包括施用免疫应答调节剂，以调节或减少针对植入物(例如，细胞或装置)的移植排斥反应或其他免疫应答。可以在该方法中使用的免疫应答调节剂的实例可包括嘌呤合成抑制剂，如硫唑嘌呤和霉酚酸；嘧啶合成抑制剂，如来氟米特和特立氟胺；抗叶酸剂，如甲氨蝶呤、他克莫司、环孢素、吡美莫司、阿贝莫司、胍立莫司、来那度胺、泊马度胺、沙利度胺，pde4抑制剂，阿普斯特、阿那白滞素、西罗莫司、依维莫司、利罗莫司(ridaforolimus)、坦罗莫司、优美莫司(umirolimus)、佐他莫司，抗胸腺细胞球蛋白抗体，抗淋巴细胞球蛋白抗体ctla-4、其片段及其融合蛋白，如阿巴西普和贝拉西普，tnf抑制剂如依那西普和培那西普(pegsunercept)、阿柏西普、阿法西普、利纳西普；针对补体成分5的抗体如依库珠单抗；抗tnf抗体如阿达木单抗、阿非莫单抗、培塞妥珠单抗、戈利木单抗、英夫利昔单抗和奈瑞莫单抗；针对白介素5的抗体如美泊利单抗；抗ige抗体如奥马珠单抗；抗干扰素抗体如法拉莫单抗；抗il-6抗体如艾西莫单抗；针对il-12和il-23的抗体如来金珠单抗(lebrikizumab)和乌司奴单抗；抗il-17a抗体如苏金单抗；抗cd3抗体如莫罗单抗-cd3、奥昔珠单抗、替利珠单抗和维西珠单抗；抗cd4抗体如克立昔单抗
(clenoliximab)、凯利昔单抗(keliximab)和扎木单抗(zanolimumab)；抗cd11a抗体如依法珠单抗；抗cd18抗体如厄利珠单抗(erlizumab)；抗cd20抗体如奥妥珠单抗、利妥昔单抗、奥瑞珠单抗(ocrelizumab)和帕考珠单抗(pascolizumab)；抗cd23抗体如gomiliximab和鲁昔单抗；抗cd40抗体如替奈昔单抗和托利珠单抗(toralizumab)；针对cd62l/l-选择素的抗体如阿塞珠单抗；抗cd80抗体如加利昔单抗；抗cd147/基础免疫球蛋白(basigin)抗体如加维莫单抗(gavilimomab)；抗cd154抗体如芦利珠单抗(ruplizumab)；抗blys抗体如贝利木单抗和blisibimod；抗ctla-4抗体如伊匹木单抗和曲美木单抗；抗cat抗体如柏替木单抗、乐德木单抗(lerdelimumab)和美替木单抗(metelimumab)；抗整合素抗体如那他珠单抗；针对白介素-6受体的抗体如托珠单抗；抗lfa-1抗体如奥度莫单抗；针对il-2受体/cd25的抗体如巴利昔单抗、达克珠单抗和伊诺莫单抗；针对t-淋巴细胞的抗体(阿佐莫单抗(zolimomab aritox))如阿托木单抗(atorolimumab)、西地珠单抗(cedelizumab)、芳妥珠单抗(fontolizumab)、马司莫单抗、莫罗木单抗(morolimumab)、培克珠单抗、瑞利珠单抗、罗维珠单抗(rovelizumab)、西利珠单抗(siplizumab)、他利珠单抗、阿替莫单抗(telimomab aritox)、伐利昔单抗和维帕莫单抗。
[0417]“消泡剂”减少加工过程中的起泡，起泡可能导致水性分散体的凝结、成品薄膜中的气泡，或通常损害加工过程。示例性消泡剂包括硅乳液或失水山梨醇倍半油酸酯。
[0418]“抗氧化剂”包括例如丁基羟基甲苯(bht)、抗坏血酸钠、抗坏血酸、焦亚硫酸钠和生育酚。在某些实施方案中，抗氧化剂在需要时增强化学稳定性。
[0419]
本文所述的制剂可以受益于抗氧化剂、金属螯合剂、含硫醇化合物和其他一般稳定剂。这些稳定剂的实例包括但不限于：(a)约0.5％至约2％w/v甘油，(b)约0.1％至约1％w/v甲硫氨酸，(c)约0.1％至约2％w/v单硫代甘油，(d)约1mm至约10mm edta，(e)约0.01％至约2％w/v抗坏血酸，(f)0.003％至约0.02％w/v聚山梨酯80，(g)0.001％至约0.05％w/v聚山梨酯20，(h)精氨酸，(i)肝素，(j)硫酸右旋糖酐，(k)环糊精，(l)戊聚糖多硫酸酯和其他类肝素，(m)二价阳离子，诸如镁和锌；或(n)其组合。
[0420]“黏合剂”赋予黏性性质并且包括例如藻酸及其盐；纤维素衍生物，诸如羧甲基纤维素、甲基纤维素(例如，)、羟丙基甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素(例如，)、乙基纤维素(例如，)和微晶纤维素(例如，)；微晶右旋糖；直链淀粉；硅酸镁铝；多糖酸；膨润土；明胶；聚乙烯吡咯烷酮/乙酸乙烯酯共聚物；交聚维酮；聚维酮；淀粉；预胶化淀粉；黄蓍胶、糊精、糖诸如蔗糖(例如，)、葡萄糖、右旋糖、糖蜜、甘露醇、山梨醇、木糖醇(例如，)和乳糖；天然胶或合成的胶，诸如阿拉伯胶、黄蓍胶、茄替胶、车前子壳胶(mucilage of isapol husks)、聚乙烯吡咯烷酮(例如，cl、cl、xl-10)、落叶松阿拉伯半乳聚糖(larch arabogalactan)、聚乙二醇、蜡、藻酸钠等。
[0421]“载体”或“载体材料”包括药剂学中任何常用的赋形剂，并且应基于与本文公开的化合物(诸如依鲁替尼和抗癌剂的化合物)的相容性以及所需剂型的释放谱特性来选择。示例性的载体材料包括，例如，黏合剂、悬浮剂、崩解剂、填充剂、表面活性剂、增溶剂、稳定剂、润滑剂、润湿剂、稀释剂等。“药学上相容的载体材料”可以包括但不限于，阿拉伯胶、明胶、胶体二氧化硅、甘油磷酸钙、乳酸钙、麦芽糊精、甘油、硅酸镁、聚乙烯吡咯烷酮(pvp)、胆固
醇、胆固醇酯、酪蛋白酸钠、大豆卵磷脂、牛磺胆酸、磷脂酰胆碱、氯化钠、磷酸三钙、磷酸氢二钾、纤维素和纤维素缀合物、糖硬脂酰乳酸钠、卡拉胶、单酸甘油酯、甘油二酯、预胶化淀粉等。参见，例如，remington:the science and practice of pharmacy,第十九版(easton,pa.:mack publishing company,1995)；hoover,john e.,remington’s pharmaceutical sciences,mack publishing co.,easton,pennsylvania 1975；liberman,h.a.和lachman,l.,编著,pharmaceutical dosage forms,marcel decker,new york,n.y.,1980；以及pharmaceutical dosage forms and drug delivery systems,第七版(lippincott williams&wilkins1999)。
[0422]“分散剂”和/或“黏度调节剂”包括通过液体介质或造粒法或混合法控制药物扩散和均匀性的材料。在一些实施方案中，这些剂还促进包衣或可溶蚀性基质的有效性。示例性的扩散促进剂/分散剂包括例如亲水性聚合物、电解质、60或80、peg、聚乙烯吡咯烷酮(pvp；商业上称为)和基于碳水化合物的分散剂诸如例如羟丙基纤维素(例如，hpc、hpc-sl和hpc-l)、羟丙基甲基纤维素(例如，hpmc k100、hpmc k4m、hpmc k15m和hpmc k100m)、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯、硬脂酸乙酸羟丙基甲基纤维素(hpmcas)、非晶态纤维素、硅酸镁铝、三乙醇胺、聚乙烯醇(pva)、乙烯基吡咯烷酮/乙酸乙烯酯共聚物(s630)、带有环氧乙烷和甲醛的4-(1,1,3,3-四甲基丁基)-苯酚聚合物(也称为泰洛沙泊)、泊洛沙姆(例如，pluronics苯酚聚合物(也称为泰洛沙泊)、泊洛沙姆(例如，pluronics和其是环氧乙烷和环氧丙烷的嵌段共聚物)；以及泊洛沙明(poloxamine)(例如，tetronic也称为poloxamine它是由环氧丙烷和环氧乙烷依次加成到乙二胺得到的四官能嵌段共聚物(basf corporation,parsippany,n.j.))、聚乙烯吡咯烷酮k12、聚乙烯吡咯烷酮k17、聚乙烯吡咯烷酮k25或聚乙烯吡咯烷酮k30、聚乙烯吡咯烷酮/乙酸乙烯酯共聚物(s-630)、聚乙二醇(例如聚乙二醇可以具有约300至约6000，或约3350至约4000，或约7000至约5400的分子量)、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、聚山梨酯80、藻酸钠、树胶(诸如黄蓍胶和阿拉伯胶)、瓜尔胶、黄原胶类(包括黄原胶)、糖、纤维素(诸如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠)、聚山梨酯80、藻酸钠、聚乙氧基失水山梨醇单月桂酸酯、聚乙氧基失水山梨醇单月桂酸酯、聚维酮、卡波姆、聚乙烯醇(pva)、藻酸盐、壳聚糖及其组合。增塑剂诸如纤维素或三乙基纤维素也可以用作分散剂。在脂质体分散体和自乳化分散体中特别有用的分散剂是二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、来自鸡蛋的天然磷脂酰胆碱、鸡蛋中的天然磷脂酰甘油、胆固醇和肉豆蔻酸异丙酯。
[0423]
一种或更多种溶蚀促进剂与一种或更多种扩散促进剂的组合也可以用于本发明的组合物中。
[0424]
术语“稀释剂”是指在递送前用于稀释感兴趣的化合物的化合物。稀释剂还可以用于稳定化合物，因为它们可以提供更稳定的环境。溶解在缓冲溶液中的盐(其也可以提供ph控制或维持)在本领域中用作稀释剂，其包括但不限于磷酸盐缓冲盐水溶液。在某些实施方案中，稀释剂增加组合物的体积，以促进压缩或为胶囊填充的均匀混合产生足够的体积。这样的化合物包括例如乳糖、淀粉、甘露醇、山梨醇、右旋糖、微晶纤维素诸如磷酸氢钙、二水合磷酸氢钙；磷酸三钙、磷酸钙；无水乳糖、喷雾干燥乳糖；预胶化淀粉、可压缩糖诸如(amstar)；甘露醇、羟丙基甲基纤维素、硬脂酸乙酸羟丙基甲基纤维素、蔗糖基稀释剂、糖粉；一水合硫酸钙、二水合硫酸钙；三水合乳酸钙、右旋糖类(dextrates)；水解谷物
固体、直链淀粉；粉状纤维素、碳酸钙；甘氨酸、高岭土；甘露醇、氯化钠；肌醇，膨润土等。
[0425]“填充剂”包括诸如乳糖、碳酸钙、磷酸钙、磷酸氢钙、硫酸钙、微晶纤维素、纤维素粉末、右旋糖、右旋糖类、右旋糖酐、淀粉、预胶化淀粉、蔗糖、木糖醇、乳糖醇、甘露醇、山梨醇、氯化钠、聚乙二醇等化合物。
[0426]“润滑剂”和“助流剂”是防止、减少或抑制材料黏附或摩擦的化合物。示例性的润滑剂包括例如硬脂酸、氢氧化钙、滑石、硬脂富马酸钠、烃(诸如矿物油、或氢化植物油诸如氢化大豆油)、高级脂肪酸及其碱金属和碱土金属盐(诸如铝、钙、镁、锌)、硬脂酸、硬脂酸钠、甘油、滑石、蜡、硼酸、苯甲酸钠、乙酸钠、氯化钠、亮氨酸、聚乙二醇(例如，peg-4000)或甲氧基聚乙二醇(诸如carbowax
tm
)、油酸钠、苯甲酸钠、山萮酸甘油酯、聚乙二醇、十二烷基硫酸镁或十二烷基硫酸钠、胶体二氧化硅(诸如syloid
tm
、)、淀粉(诸如玉米淀粉)、硅油、表面活性剂等。
[0427]“增塑剂”是用于软化微囊化材料或薄膜包衣，以使其不那么脆的化合物。合适的增塑剂包括例如聚乙二醇(诸如peg 300、peg 400、peg 600、peg 1450、peg 3350和peg 800)、硬脂酸、丙二醇、油酸、三乙基纤维素和三乙酸甘油酯。在一些实施方案中，增塑剂还可以起分散剂或润湿剂的作用。
[0428]“增溶剂”包括诸如三乙酸甘油酯、柠檬酸三乙酯、油酸乙酯、辛酸乙酯、十二烷基硫酸钠、多库酯钠(sodium doccusate)、维生素e tpgs、二甲基乙酰胺、n-甲基吡咯烷酮、n-羟乙基吡咯烷酮、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素、羟丙基环糊精、乙醇、正丁醇、异丙醇、胆固醇、胆盐、聚乙二醇200-600、三缩四乙二醇、二乙二醇单乙基醚、丙二醇和异山梨醇二甲醚等化合物。
[0429]“稳定剂”包括诸如任何抗氧化剂、缓冲剂、酸、防腐剂等化合物。
[0430]“悬浮剂”包括诸如聚乙烯吡咯烷酮(例如，聚乙烯吡咯烷酮k12、聚乙烯吡咯烷酮k17、聚乙烯吡咯烷酮k25或聚乙烯吡咯烷酮k30、乙烯基吡咯烷酮/乙酸乙烯酯共聚物(s630))、聚乙二醇(例如，聚乙二醇可以具有约300至约6000，或约3350至约4000，或约7000至约5400的分子量)、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、硬脂酸乙酸羟甲基纤维素、聚山梨酯80、羟乙基纤维素、藻酸钠、树胶(诸如例如黄蓍胶和阿拉伯胶)、瓜尔胶、黄原胶类(包括黄原胶)、糖、纤维素(诸如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、羟丙基甲基纤维素、羟乙基纤维素)、聚山梨酯80、藻酸钠、聚乙氧基失水山梨醇单月桂酸酯、聚乙氧基失水山梨醇单月桂酸酯、聚维酮等化合物。
[0431]“表面活性剂”包括诸如十二烷基硫酸钠、多库酯钠、tween 60或80、三乙酸甘油酯、维生素e tpgs、失水山梨醇单油酸酯、聚氧乙烯失水山梨醇单油酸酯、聚山梨酸酯、泊洛沙姆、胆盐、单硬脂酸甘油酯、环氧乙烷和环氧丙烷的共聚物例如(basf)等化合物。其他一些表面活性剂包括聚氧乙烯脂肪酸甘油酯和植物油，例如，聚氧乙烯(60)氢化蓖麻油；以及聚氧乙烯烷基醚和烷基苯基醚，例如，辛苯昔醇(octoxynol)10、辛苯昔醇40。在一些实施方案中，可以包括表面活性剂以增强物理稳定性或用于其他目的。
[0432]“黏度增强剂”包括例如甲基纤维素、黄原胶、羧甲基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、硬脂酸乙酸羟丙基甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯、卡波姆、聚乙烯醇、藻酸盐、阿拉伯胶、壳聚糖及其组合。
[0433]“润湿剂”包括诸如油酸、单硬脂酸甘油酯、失水山梨醇单油酸酯、失水山梨醇单月
桂酸酯、三乙醇胺油酸酯、聚氧乙烯失水山梨醇单油酸酯、聚氧乙烯失水山梨醇单月桂酸酯、多库酯钠、油酸钠、十二烷基硫酸钠、多库酯钠、三乙酸甘油酯、tween 80、维生素e tpgs、铵盐等化合物。
实施例
[0434]
提供这些实施例仅仅是为了说明的目的而非限制本文提供的权利要求的范围。
[0435]
实施例1.聚乙烯醇用于胰腺β细胞分化的用途
[0436]
本实施例显示，在胰腺β细胞的体外分化期间，可以使用pva代替血清白蛋白(例如，hsa)。本实施例还说明了不同pva补充范例对细胞分化过程的影响。
[0437]
使用根据本公开内容的示例性基础分化方案，版本a，使人类干细胞分化为能够响应于体外葡萄糖刺激而释放胰岛素的成熟β细胞。在一些实验中，版本a修改为在如下文描述的不同阶段用pva代替hsa。
[0438]
版本a方案是6个阶段的分步方案。在版本a方案中，将干细胞在前五个阶段期间按以下连续顺序用试剂处理：第1阶段(s1)：激活素-a持续3天，并且还有chir99021持续前24小时；第2阶段(s2)：kgf持续3天；第3阶段(s3)：kgf、pdbu、sant-1、视黄酸(ra)、激活素a和thiazovivin持续2天，并且还有dmh-1持续第一天；第4阶段(s4)：kgf、sant-1、thiazovivin、激活素a和ra持续6天；第5阶段(s5)：xxi、alk5i、gc-1、ldn-193189、thiazovivin、星形孢菌素和dznep持续7天，并且还有ra、sant-1和β细胞素持续前2天；和第6阶段(s6)：hsa、znso4、l-谷氨酸、甲酸、l-肉碱、牛磺酸、乙酸、β-羟基丁酸和生物素持续7-11天，并且还有alk5i、gc-1、ldn-193189、thiazovivin、星形孢菌素和dznep持续前四天。在从s1至s6的整个分化阶段，hsa被补充至培养基中：s1至s5为约0.05％，并且在s6的前三天为0.05％，并且然后在s6的剩余时间增加至1％。
[0439]
在一个实验中，使用具有以下不同水解水平的pva材料：87％-89％、87％-90％和99％，代替版本a (对照)中使用的hsa。s1-s5使用约0.5％的pva，而s6中不包含pva。如图1a中示出的，从初始阶段直到s4完成(s4c)，对细胞数量进行定量。在s3c和s4c，在“99pva”(用99％水解的pva培养)和“87-90pva”(用87％-90％水解的pva培养)条件下的细胞数量与“对照”条件(版本a)相当，而在“87-89pva”条件下(用87％-89％水解的pva培养)的细胞数量比在其他条件下的细胞相对更高。图1b示出了在对照条件和87-89pva条件两者下在第3阶段的细胞簇的照片，它们在形态学上看起来相当。图1c示出了在对照条件和87-89pva条件下在第4阶段的细胞的流式细胞术表征。如图中示出的，在87-89pva条件下pdx1阳性、nkx6.1阳性细胞的百分比(80.0％)比对照条件(70.3％)略高。
[0440]
在另一个实验中，对具有较低水解水平的pva材料与其他pva材料和对照条件进行测试。如图2a中示出的，在s1c和s4c，在“80pva”条件下(用80％水解的pva培养)的细胞数量比在以下所有其他组的更高：整个用hsa培养的对照组，用87％-89％水解的pva培养的“87-89pva”组，以及用hsa和87％-89％水解的pva培养的“89pva+hsa”组(图中指示为“89pva”)。此外，如图2b中示出的，如通过流式细胞术测量的，“80pva”组中的细胞也显示出更高的pdx1阳性、nkx6.1阳性细胞的百分比。
[0441]
然而，还发现在第5阶段，“80pva”组中较高的细胞产量变得比“89pva+hsa”和对照组两者更低，如图2a中示出的。进一步发现，如通过流式细胞术测量的，“80pva”组中在第5
阶段完成时nkx6.1阳性、isl1阳性细胞的百分比比“89pva+hsa”和对照组更低(图2c)。
[0442]
在另一个实验中，测试了5种不同的pva补充范例，如图3中示出的。范例1(对照)贯穿s1至s5在培养基中包含hsa，范例2贯穿s1至s5具有80％ pva，范例3贯穿s1至s5具有87％-89％ pva，范例4贯穿s1至s4具有80％ pva，随后在s5具有87％-89％ pva(在图中指示为“89pva”)，范例5贯穿s1至s4具有80％ pva，随后在s5具有hsa，并且范例6贯穿s1至s4具有80％ pva，随后在s5具有87％-89％ pva(在图中指示为“89pva”)+hsa。
[0443]
图4a总结了5种不同范例下的总细胞产量(在对照范例下存在两个生物学重复)。图4b示出了流式细胞术数据，该数据显示与对照范例相比，范例4细胞具有相类的nkx6.1阳性、isl1阳性细胞的百分比，并且比范例2和范例3更高。如点图所示的，与对照范例相比，所有pva补充范例显示出更一致的产量。
[0444]
在另一个实验中，在第6阶段用87％-89％ pva代替hsa。pva浓度跟随hsa的浓度，即在第6阶段(s6d1-s6d4)的前三天为0.05％，并且然后在s6d4-s6d10(或s6d6/7)增加至1％。发现pva能够稳定s5c细胞冷冻保存后的回收率，并且稳定β细胞在所得细胞组合物中的百分比。
[0445]
实施例2.烟酰胺和egf对胰腺β细胞分化的影响
[0446]
本实施例显示可以在胰腺β细胞分化期间使用烟酰胺和egf代替β细胞素。
[0447]
使用与实施例1相同的示例性基础分化方案，版本a，经过修改用于下文描述的实验。
[0448]
在一个实验中，测试并比较了三种不同的分化条件：在第一组(对照)中，在第5阶段使用版本a与β细胞素；在第二组中，版本a的第5阶段的β细胞素被10mm烟酰胺和10ng/ml人类egf代替；在第三组中，去除在版本a的第5阶段的β细胞素而没有任何代替品。图5a是总结分化过程结束时三组的总细胞产量和β细胞产量的点图。如图中示出的，在不使用β细胞素(“无btc”)时，与对照条件相比，总细胞产量和β细胞产量两者均减少。相比之下，烟酰胺和egf代替品(“nic+hegf”)导致相对于对照条件的相当的总细胞产量和β细胞产量。图5b示出了三个不同组中在第5阶段结束时细胞的流式细胞术表征。三组中nkx6.1阳性、isl1阳性细胞的百分比相当，接受烟酰胺和egf代替品的组的百分比最高。图6示出了总结第6阶段期间的回收率和总sc-β细胞产量的点图。在s6的第7天和第10天，对照组与烟酰胺和egf代替品组之间的两个参数相当。
[0449]
虽然本文已经示出和描述了本公开内容的优选的实施方案，但是对于本领域技术人员明显的是，这样的实施方案仅以示例的方式提供。在不偏离本公开内容的情况下，本领域技术人员现将想到许多变化、改变和代替。应理解，在实践本公开内容时可以采用本公开内容的实施方案的各种替代方案。所附权利要求旨在限定本公开内容的范围，并且从而涵盖在这些权利要求范围内的方法和结构及其等同物。