用于使用超声雾化器施用用于预防或治疗包括COVID-19的呼吸道病毒感染、由病毒感染引起的肺纤维化或呼吸道疾病的双链寡核苷酸结构的组合物的制作方法

本发明涉及一种用于使用超声雾化器施用双链寡核苷酸结构的组合物，并且具体地涉及一种用于通过使用超声雾化器施用用于预防或治疗包括covid-19的呼吸道病毒感染、由病毒感染引起的肺纤维化或呼吸道疾病的双链寡核苷酸结构的组合物。

背景技术：

1、通过吸入进行药物递送是一种易于使用的药物递送方法，使得药物即使在低药物剂量下也能够展现出希望的效果，可以通过允许药物直接到达靶器官、尤其是支气管或肺来避免或最大程度地减小全身性副作用，并且使得药物能够展现出快速效果。吸入器根据药物形式分为计量吸入器(mdi)、干粉吸入器(dpi)和雾化器。计量吸入器是一种在使用时通过填充到药物容器中的气体的压力释放一定量药物的装置，而干粉吸入器未填充任何气体并且是一种通过其吸入能力吸入药物的形式。雾化器是一种这样的装置，其使用机械振动将药物雾化成小液体颗粒，然后通过空气压力将雾化的颗粒通过吸入管递送到患者体内。由于雾化器将细微雾化的药物颗粒(其效果递送良好)递送到支气管和肺泡，因此其具有能够用于呼吸道病毒感染、间质性肺纤维化、慢性阻塞性肺疾病、哮喘、支气管扩张、支气管炎、肺炎、肺气肿等的优点。雾化器可以根据雾化方法分为压缩机型雾化器和超声雾化器。在压缩机型雾化器中，压缩机通过使空气穿过雾化器药物室而产生雾化的颗粒，并且通过振动筛网的微孔产生气溶胶。在超声雾化器中，超声波在穿过药物室的同时振动药物，从而产生气溶胶。取决于设备，通过使空气或微波穿过筛网的微孔产生具有一定大小的气溶胶。

2、已经进行了各种尝试来开发基于sirna的药物作为吸入剂。然而，这些吸入剂主要是干粉配制品，包括透明质酸包衣的脂质体喷雾配制品(冻干配制品)、包含白蛋白和plga(聚乳酸-共-乙醇酸)的混合物的纳米颗粒配制品、壳聚糖聚合物配制品、阳离子脂质或脂质体配制品以及包含细胞穿透蛋白(mpg、tat、cady、lah4)的纳米颗粒配制品。开发基于脂质体的sirna药物的吸入剂的最大障碍是脂质体的稳定性在雾化后被破坏的现象，如脂质体在雾化后破碎。为了改进脂质体在雾化后的稳定性，已经尝试了各种配制方法，如将脂质体与胆固醇、高相变磷脂等混合，或使脂质体聚乙二醇化，但是仍然需要改进脂质体本身的稳定性和药物在脂质体中的稳定性(mindaugas rudokas,med.princ.pract.2016年3月；25:60)。另外，在阳离子脂质或脂质体配制品的情况下，颗粒本身具有毒性风险，并且在常规的基于rnai的药物的情况下，它们具有通过诱导先天性免疫应答以非特异性地激活促炎性细胞因子以及诱导干扰素应答而引起毒性的风险，并且显示出有限的递送效率和药物效应(hasan uludag,front.bioeng.biotechnol.2020年7月；8:916)。

3、1995年，guo和kemphues报道，不仅有义rna，而且反义rna也有效抑制秀丽隐杆线虫(c.elegans)中的基因表达，并且从那时起，进行了研究以鉴定其原因。1998年，fire等人首先描述了一种现象，其中注射双链rna(dsrna)通过特异性地降解与其对应的mrna而抑制基因表达。这种现象称为rna干扰(rnai)。rnai是一种用于抑制基因表达的过程，可以以简单的方式以低成本展现出独特的抑制基因表达的作用，并且因此这种技术的应用范围已经扩大。

4、由于这种抑制基因表达的技术可以调节特定基因的表达，因此它可以在mrna水平上去除与癌症、遗传疾病等相关的特定基因，并且可以用作开发用于疾病治疗的治疗剂和验证靶标的重要工具。作为用于抑制靶基因表达的常规技术，已经披露了针对靶基因引入转基因的技术。这些技术包括相对于启动子在反义方向上引入转基因的方法和相对于启动子在反义方向上引入转基因的方法。

5、这种靶向rna的rna疗法是针对靶rna使用寡核苷酸去除目的基因的功能的方法，并且可以被认为与其中治疗剂(如抗体和小分子)主要靶向蛋白质的常规方法不同。用于靶向rna的方法大致分为两种类型：双链rna介导的rnai和反义寡核苷酸(aso)。目前，正在通过靶向各种疾病中的rna尝试临床试验。

6、反义寡核苷酸(在下文中称为“aso”)是短合成dna，其被设计成根据watson-crick碱基配对与靶基因结合，并且可以特异性地抑制基因的特定核苷酸序列的表达。因此，反义寡核苷酸已被用于研究基因的作用以及开发能够在分子水平上治疗疾病(如癌症)的治疗剂。这些aso具有能够通过设定各种抑制基因表达的靶标而容易地产生的优点，并且为了抑制癌基因表达和癌细胞生长，已经对aso的使用进行了研究。通过将aso结合到互补的mrna序列以诱导rna酶h活性并且去除所述mrna，或者通过干扰用于蛋白质翻译的核糖体复合物的形成和进展来完成通过aso抑制特定基因表达的过程。另外，据报道，aso与基因组dna结合以形成三螺旋结构，从而抑制基因转录。aso具有如上所述的潜力，但为了在临床实践中使用aso，需要改进aso对核酸酶的稳定性，并且将aso有效地递送到靶组织或细胞中，以便特异性地结合靶基因的核苷酸序列。另外，遗传mrna的二级和三级结构是aso特异性结合的重要因素，并且其中mrna二级结构的形成减少的区域对于aso的进入非常有利。因此，在合成aso前，已经作出努力通过系统地分析其中mrna二级结构的形成减少的区域来不仅在体外而且在体内有效地实现基因特异性抑制。这些aso比sirna(一种rna)更稳定，并且具有易溶于水和生理盐水的优点。迄今为止，联邦药品管理局(fda)已批准了三种aso(jessica,c.,j postdoc res,4:35-50,2016)。

7、由于发现了rna干扰(在下文中称为“rnai”)的作用，因此已经发现rnai在各种类型的哺乳动物细胞中作用于序列特异性mrna(barik,s.,j mol.med.(2005)83:764-773)。当双链rna的长链被递送到细胞中时，所递送的双链rna被dicer核酸内切酶转化为加工成21至23个碱基对(bp)的小干扰rna(在下文中称为“sirna”)。sirna与rna诱导的沉默复合物(risc)结合，并且通过其中引导(反义)链识别并且降解靶mrna的过程以序列特异性方式抑制靶基因表达。使用sirna抑制基因表达的技术被用于抑制靶细胞中的靶基因表达并且观察由此产生的变化，并且有效地用于鉴定靶细胞中的靶基因的功能的研究。特别地，抑制传染性病毒或癌细胞中的靶基因的功能可以有效地用于开发针对目的疾病的治疗方法。作为使用实验动物进行体外研究和体内研究的结果，已经报道了通过sirna抑制靶基因表达是可能的。

8、bertrand等人报道，sirna在体外和体内对mrna表达的抑制作用好于针对相同靶基因的反义寡核苷酸(aso)，并且这种作用持续更久。另外，关于作用机理，sirna通过与靶mrna互补结合以序列特异性方式调节靶基因表达。因此，sirna优于常规的基于抗体的药物或化学药物(小分子药物)，因为sirna适用的受试者的范围可以显著扩大(ma behlke,molecular therapy.2006 13(4):664-670)。

9、sirna具有优异的作用，并且可以用于各种应用中，但为了将sirna开发为治疗剂，应改进sirna的体内稳定性及其细胞递送效率，使得sirna可以被有效地递送到靶细胞。为了改进体内稳定性并解决与sirna的非特异性先天免疫刺激相关的问题，已积极尝试通过修饰sirna的一些核苷酸或其骨架以具有核酸酶抗性，或使用病毒载体、脂质体或纳米颗粒来对其进行研究。

10、包含病毒载体(如腺病毒或逆转录病毒)的递送系统具有高转染功效，但具有高免疫原性和致癌性。另一方面，含有纳米颗粒的非病毒递送系统具有比病毒递送系统低的细胞递送效率，但具有优点，包括体内高安全性、靶标特异性递送、rnai寡核苷酸向细胞或组织中的有效摄取和内化、以及低细胞毒性和免疫刺激。因此，非病毒递送系统目前被认为是比病毒递送系统更有前景的递送方法(akhtar s,j clin invest.2007年12月3日；117(12):3623-3632)。

11、在非病毒递送系统之中，使用纳米载体的方法是其中使用各种聚合物(如脂质体和阳离子聚合物复合物)形成纳米颗粒并且其中将sirna装载到此类纳米颗粒(即，纳米载体)中并且递送到细胞的方法。在使用纳米载体的方法之中，常用的方法包括使用聚合物纳米颗粒、聚合物胶束、脂质体复合物(lipoplex)等的方法。其中，脂质体复合物由阳离子脂质构成，并且功能是与细胞内体的阴离子脂质相互作用以诱导内体的不稳定，从而允许细胞外递送外核体。

12、另外，已知可以通过将化学化合物等缀合至sirna的随从(有义)链的末端区域以赋予其改进的药代动力学特征来增加sirna在体内的效率(j.soutschek,nature 11；432(7014):173-8,2004)。在这种情况下，sirna的稳定性取决于与sirna的有义(随从)链或反义(指导)链的末端缀合的化学化合物的特性而变化。例如，与聚合物化合物(如聚乙二醇(peg))缀合的sirna在阳离子化合物的存在下与sirna的阴离子磷酸根基团相互作用以形成复合物，从而提供具有改进的sirna稳定性的载体(sh kim,j control release 129(2):107-16,2008)。特别地，与其他药物递送系统(如微球或纳米颗粒)相比，由聚合物复合物构成的胶束具有非常小的大小和非常均匀的大小分布，并且是自发形成的。因此，这些胶束的优点在于容易管理胶束配制品的质量并且容易确保其可再现性。

13、为了改进sirna的细胞内递送效率，已经开发了使用sirna缀合物来确保sirna的稳定性和增加sirna的细胞膜渗透性的技术，所述sirna缀合物是通过经由简单的共价键或接头介导的共价键将作为生物相容性聚合物的亲水性化合物(例如，聚乙二醇(peg))与sirna缀合而获得的(韩国专利号883471)。然而，即使当sirna被化学修饰并且缀合到聚乙二醇(peg)(聚乙二醇化)时，其仍具有低的体内稳定性以及不容易将其递送到靶器官中的缺点。为了克服这些缺点，已经开发了双链寡核苷酸rna结构，其包含与寡核苷酸、特别是双链寡rna(如sirna)结合的亲水性和疏水性化合物。此结构通过疏水性化合物的疏水性相互作用而形成称为samirna(自组装胶束抑制性rna)的自组装纳米颗粒(韩国专利号1224828)。samirna技术相对于常规递送技术具有的优点是可以获得大小非常小的均匀纳米颗粒。

14、具体地，在samirna技术中，将peg(聚乙二醇)或heg(六乙二醇)用作亲水性化合物。peg是合成聚合物，通常用于增加医用药物(特别是蛋白质)的溶解度并且调节药物的药代动力学。peg是多分散材料，并且单批聚合物由不同数量的单体构成，并且因此展现出具有高斯曲线的分子量分布。另外，材料的均匀性表示为多分散指数(mw/mn)。换句话说，当peg具有低分子量(3至5kda)时，其具有约1.01的多分散指数，而当peg具有高分子量(20kda)时，其具有约1.2的高多分散指数，表明peg的均匀性随其分子量的增加而降低。因此，当peg与药物缀合时，存在的缺点在于，peg的多分散特性反映在缀合物中，并且因此不容易验证单一材料。由于这种缺点，已经改进了用于合成和纯化peg的方法，以便产生具有低多分散指数的材料。然而，当peg与具有低分子量的化合物缀合时，存在与所述化合物的多分散特性相关的问题，包括不容易确认是否容易地实现缀合的问题(francesco m.v.,drug discovery today(2005)10(21):1451-1458)。

15、因此，近年来，已经通过以下方式改进了samirna技术(即，自组装纳米颗粒)：将双链rna结构的亲水性化合物(构成samirna)形成为基本单元嵌段，每个嵌段包含1至15个具有均匀分子量的单体；以及(如果需要)接头，使得根据需要使用合适数量的嵌段。因此，已经开发了与常规samirnatm相比具有小的大小和显著改进的多分散特性的新型递送系统技术(韩国专利号18162349)。已经知道，当注射sirna时，sirna被血液中存在的各种酶快速降解，并且因此将其递送到靶细胞或组织的效率很差。因此，改进的samirna中也出现稳定性和表达抑制率的变化，这取决于靶基因。因此，为了使用由改进的自组装纳米颗粒构成的samirna更稳定地且有效地抑制靶基因的表达，本发明的诸位发明人已经试图通过应用双链寡核苷酸来增强samirna对靶基因的表达抑制作用和samirna的稳定性，所述双链寡核苷酸包含作为指导(有义)链的aso的dna序列和作为随从(反义有义)序列的rna序列。

16、然而，在rnai药物递送中，常规rnai药物递送方法主要基于粉末配制品，如上所述，其具有由颗粒本身导致的毒性以及引起非特异性免疫应答的风险，并且显示出有限的药物递送效率和药物效应。因此，本发明的诸位发明人已经试图基于samirna的结构特征开发特别适合于samirna的能够克服这些限制的药物递送方法，并且已经发现，当使用各种药物递送装置之中的超声雾化器时，可以将samirna有效地特异性地递送到肺而没有细胞毒性，同时显示出与贮料(雾化前的samirna)相同的浓度、分子量、纯度、纳米颗粒大小和摩尔渗透压浓度，并且保持其抑制靶基因的能力，从而完成了本发明。

17、[专利文献]

18、韩国专利号1224828

19、韩国专利号1862349

20、[非专利文献]

21、mindaugas rudokas,med.princ.pract.2016march；25:60

22、hasan uludag,front.bioeng.biotechnol.2020july；8:916

23、jessica,c.,j postdoc res.2016 4:35-50

24、ma behlke,molecular therapy.2006 13(4):664-670

25、akhtar s,j clin invest.2007december 3；117(12):3623-3632

26、sh kim,j control release 129(2):107-16,2008

27、francesco m.v.,drug discovery today(2005)10(21):1451-1458

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种用于将双链寡核苷酸结构特异性地且有效地递送到支气管和肺的药物组合物，所述双链寡核苷酸结构适合于预防或治疗呼吸道病毒感染、病毒性肺纤维化或呼吸道疾病。

2、为了实现以上目的，本发明提供了一种用于预防或治疗呼吸道病毒感染、病毒性肺纤维化或呼吸道疾病的包含双链寡核苷酸结构的药物组合物，所述双链寡核苷酸结构包含由以下结构式1表示的结构，其中将所述药物组合物使用雾化器施用：

3、[结构式1]

4、a-x-r-y-b

5、其中a表示亲水性化合物，b表示疏水性化合物，x和y各自独立地表示简单的共价键或接头介导的共价键，并且r表示双链寡核苷酸。