生物修复膜及其制备方法与流程

本发明涉及生物医用材料，尤其涉及一种生物修复膜及其制备方法。

背景技术：

1、口腔科临床治疗中使用的生物修复膜，其原理是利用膜的屏障作用，将病损区与周围组织隔离，创造一个相对封闭的组织环境，并诱导成骨细胞聚集分化，最终达到组织定向修复的目的的一种机械方法。生物修复膜可以与骨粉等骨修复材料合用，用于口腔手术后牙颌骨缺损或骨量不足的填充和修复，可使种植体更好地与周边牙槽骨质结合，解决患者由于牙周病或缺牙导致的生理性骨吸收或骨量不足，提升创口恢复效果。但是屏障膜和骨修复材料通常需要依次植入，加大了组织张力且加上组织缺损处出血导致膜偏移等因素，可能会导致组织缺损处的屏障膜关闭不严以及骨修复材料的流失，削弱治疗效果。骨膜是骨表面除关节外所被覆的坚固的双层结缔组织包膜，分为纤维层和生发层。纤维层主要为粗大的胶原纤维束彼此交织成网，起固定骨膜和韧带的作用。生发层紧邻骨外表面，其纤维成分少，排列疏松，有成骨能力，故又称成骨层。骨膜作为一种物理屏障，虽然自身不能诱导新骨形成，但它可以提供支持性微环境促进新骨组织再生，对骨折、骨缺损迅速愈合尤为重要。

2、目前，市面上优选的可生物降解的胶原类生物修复膜，产品多为冻干的具有不同孔径大小的生物支架膜片，作用机理为简单的物理屏障，生物活性和成骨性能差。而且大多数修复膜材料较薄、易撕裂，骨传导性和机械性能存在不足，不适合单独作为口腔缺损和骨缺损的修复材料。复合高分子膜的开发是一个重要方向。

3、目前也有部分专利公开了双层或多层口腔修复膜的制备技术，如公开号为cn109513046a的中国专利公开了一种可吸收口腔修复膜及其制备方法，其将明胶-聚己内酯-明胶进行压合得到三层结构口腔修复膜。但是其压合温度为55-65℃，压合温度较高，仅适用于温度耐受程度较高的材料，不适用于胶原膜压合。公开号为cn104922732 a的中国专利公开了一种口腔生物膜制备方法，将胶原与硫酸软骨素制备成浆液，通过真空冷冻干燥压制成胶原复合薄膜，再向两层胶原复合薄膜中喷涂胶原—硫酸软骨素浆液，再次真空冷冻干燥，得胶原—硫酸软骨素复合口腔生物膜。该专利的口腔生物膜的结构是通过配置成浆液制成，且压制成的双层结构没有提供给膜材料更优异的力学性能等，膜之间的结合力存在不足。且现有技术中的口腔膜临床应用时均需复水，已公开的方法制备的膜层间存在结合力不足，较易分层的缺陷。

4、因此，有必要提供一种新型的生物修复膜及其制备方法以解决现有技术中存在的上述问题。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种生物修复膜及其制备方法，通过构建脐带和羟基磷灰石复合的生物修复膜，以解决现有技术中的修复膜材料较薄、易撕裂，骨传导性和机械性能存在不足，不适合单独作为口腔缺损和骨缺损修复的问题。

2、为实现上述目的，本发明的所述生物修复膜，包括凝胶层和脐带层；所述凝胶层由羟基磷灰石、壳聚糖和海藻酸钠交联而成；所述脐带层粘附于所述凝胶层的一面，所述脐带层是由脐带组织组成的片状结构，所述脐带组织形成于通过机械方式去除血管细胞的脐带。

3、本发明的所述生物修复膜的有益效果在于：通过所述凝胶层由羟基磷灰石、壳聚糖和海藻酸钠交联而成，所述脐带层粘附于所述凝胶层的一面，所述脐带层是由脐带组织组成的片状结构，所述脐带组织形成于通过机械方式去除血管细胞的脐带，其中，所述脐带层所保留的多种天然活性成分能够提高伤口的愈合能力，同时还能够减少术后产生的瘢痕；所述羟基磷灰石与骨的成分和结构相似，具有高强度和韧性，能同时提高成骨细胞的生存率和成骨矿化量，引导骨缺损修复，海藻酸钠和壳聚糖属于天然高分子材料，来源广，与细胞外基质相似，在高分子水凝胶基体中可形成互穿或半互穿网络等优异特性，双网络结构的凝胶支架可以增强水凝胶的力学性能，使其紧贴组织缺损表面吸液溶胀后仍能保持完整性而不使膜变形移位，即该生物修复膜同时具备了脐带的天然生物活性成分、羟基磷灰石的高成骨性能和骨传导性，以及海藻酸钠和壳聚糖的优异力学性能，从而使得该生物修复膜包含的天然活性成分能够促进诱导细胞增殖分化，实现快速血管化和缺损区的修复和再生，且具有良好的生物活性、生物可降解性、组织贴合度、骨传导性和机械性能，生物相容性好、无细胞毒性，不会产生免疫原性；解决了现有技术中的修复膜材料较薄、易撕裂，骨传导性和机械性能存在不足，不适合单独作为口腔缺损和骨缺损修复的问题。

4、优选的，所述生物修复膜应用于骨组织修复和口腔软组织修复。其有益效果为：应用范围广，通用性强，所述生物修复膜放置于口腔软组织与骨缺损之间、或骨组织与骨缺损之间时，能创造一个相对封闭的骨再生环境，所述生物修复膜朝向口腔软组织或骨组织能够阻挡迁移速度较快的软组织细胞进入骨缺损区，从而使所述生物修复膜起到很好的屏障保护作用；另外所述生物修复膜的凝胶层中的羟基磷灰石，有利于使所述生物修复膜促进成骨，且能提高所述生物修复膜的机械性能，所述生物修复膜脐带层中的生物活性物质则能很好的促进软组织修复再生，使得该生物修复膜可应用于口腔软组织修复和骨组织修复。

5、优选的，当所述生物修复膜应用于口腔软组织修复时，所述壳聚糖与所述海藻酸钠的质量比为(1:1)～(1:3)，在所述壳聚糖与所述海藻酸钠构成的高分子水凝胶基体中所述羟基磷灰石的浓度为0.1％(w/v)～0.3％(w/v)。其有益效果在于：海藻酸钠和壳聚糖有较好的生物相容性、生物可降解性和抗菌性能，羟基磷灰石能够保证所述生物修复膜机械性能、成骨性能；在此比例范围内，交联充分，构成凝胶层的表面更加光滑、形状更加规则，且能使生物修复膜中的孔径分布均匀，形貌平整，羟基磷灰石含量过高，冻干的生物修复膜会变脆，形貌维持不佳。

6、优选的，当所述生物修复膜应用于骨组织修复时，所述壳聚糖与所述海藻酸钠的质量比为(1:1)～(1:3)，在所述壳聚糖与海藻酸钠构成的高分子水凝胶基体中所述羟基磷灰石的浓度为0.2％(w/v)～0.4％(w/v)。其有益效果在于：海藻酸钠和壳聚糖有较好的生物相容性、生物可降解性和抗菌性能，羟基磷灰石能够保证所述生物修复膜机械性能、成骨性能；在此比例范围内，交联充分，构成凝胶层的表面更加光滑、形状更加规则，且能使生物修复膜中的孔径分布均匀，形貌平整，羟基磷灰石含量过高，冻干的生物修复膜会变脆，形貌维持不佳。在较大面积骨缺损的情况，脐带层自身的机械性能不能够起到足够的支撑作用，且容易受到肌肉等软组织的挤压而发生变形，很难达到较好的治疗效果，因此在所述生物修复膜应用于骨组织修复时，所述羟基磷灰石的浓度较高，有利于提高所述生物修复膜的机械性能，以对骨修复能有更好的促进作用。

7、优选的，所述脐带层背向所述凝胶层的一面为平滑表面，所述凝胶层背向所述脐带层的一面为压痕表面，所述压痕表面设有凸起结构和凹陷结构。其有益效果在于：双面结构能够与待修复部位良好贴合，提供一个相对封闭的组织生长环境，为骨再生提供良好的空间及时间，促进组织修复及再生。其中，所述压痕表面的所述凸起结构和所述凹陷结构能够有效增加生物修复膜与待修复部位的贴合程度以及接触表面积，提高生物修复膜与组织缺损处的贴合度，改善临床使用以及治疗效果。使得所述生物修复膜具有压痕表面和平滑表面，该双面结构不仅与待修复处贴合度良好，可选择性引导细胞长入，且能随着新生组织的重建而同步降解。解决了现有技术中两面均是光滑表面的生物膜与组织缺损处之间存在间隙，造成生长迁移速率较快的成纤维细胞与上皮细胞进入骨缺损区，与生长迁移速率较慢的成骨细胞形成竞争性抑制，对骨组织的愈合产生不利影响的问题。

8、优选的，所述凝胶层和所述脐带层通过模具压制冻干而粘附固定，所述模具包括相对设置的第一表面和第二表面，所述第一表面为与所述压痕表面适配的压痕面，所述压痕面设有凸起结构和凹陷结构，所述第二表面为与所述平滑表面适配的平滑面。其有益效果在于：使得使用该模具可以将生物修复膜压制冻干成双面具有不同的结构；即设有所述凸起结构和所述凹陷结构的所述压痕面使得在压制冻干成的生物修复膜的一表面具有凸起结构和凹陷结构，从而能够有效增加生物膜与待修复部位的贴合程度以及接触表面积，提高生物膜医用材料与组织缺损处的贴合度，改善临床使用以及治疗效果。解决了现有技术中两面均是光滑平整的生物膜与组织缺损处之间存在间隙，造成生长迁移速率较快的成纤维细胞与上皮细胞进入骨缺损区，与生长迁移速率较慢的成骨细胞形成竞争性抑制，对骨组织的愈合产生不利影响的问题。

9、优选的，所述脐带为同种异体脐带。其有益效果在于：同种异体脐带拥有多孔的双层结构，一层胶原纤维排列致密，一层胶原纤维排列较为疏松；且含有多种生物活性成分，具有低免疫原性，促进细胞贴附和组织再生、愈合的独特生物特性，在临床应用中有着重要的意义。

10、进一步优选的，所述脐带组织来源于人体。其有益效果在于：选用人来源脐带组织作为基底层，打破了以动物源原料制备生物修复膜的限制，能够有效避免患者产生排异反应；脐带中包含地碱性成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子、血小板源性生长因子和转化生长因子等，可以作为生长因子的缓释载体，促进细胞的增殖和成骨活性；且人来源脐带具有低免疫原性，且天然活性成分主要由胶原、糖蛋白、粘多糖以及生长因子构成，不仅能为细胞提供一个仿生的三维支持载体，还能通过各种蛋白及生长因子与宿主相互作用来促进宿主细胞的迁移、增殖、分化来促进组织再生和修复。

11、优选的，所述脐带层为双层多孔结构，所述脐带层包括致密层和疏松层，所述致密层的孔径小于所述疏松层的孔径，所述疏松层与所述凝胶层粘附固定，所述致密层设置有所述平滑表面。其有益效果在于：生物修复膜是用于放置在口腔软组织或骨组织与骨缺损之间，以创造一个相对封闭的骨再生环境；因此孔径小的所述致密层朝向软组织能够阻挡迁移速度较快的成纤维细胞和上皮细胞进入骨缺损区，以起到屏障作用；相对于现有技术中双层膜结构中的两层不同的结构只是单纯通过压制固定，本发明中的所述疏松层与凝胶层粘合，通过反复冻融处理，使得凝胶层吸附到脐带层的疏松层的微孔内，使得增强了凝胶层和脐带层的粘合力，即大大提高了贴合界面之间的结合力，解决了现有技术中膜层间存在结合力不足，较易分层的问题。

12、优选的，所述疏松层的孔径为20μm～100μm。其有益效果在于：脐带本身为天然的双面结构，所述致密层保留了脐带天然的胶原纤维致密结构，用以朝向软组织，能有效防止成纤维细胞和上皮细胞长入骨缺损区内，支持软组织形成，防止软组织长入骨缺损区内；所述疏松层的胶原排列相对较稀疏，且有一定孔径，可与凝胶层在反复冻融过程中实现部分区域的紧密结合，本发明实现了复水后不分层的双层膜制备，从而在应用于组织缺损处时，能有效发挥致密层及疏松层的各自作用。

13、本发明所述的生物修复膜的制备方法，包括步骤：

14、提供原始脐带，通过机械方式去除所述原始脐带中的血管以形成待整形的脐带组织，将所述待整形的脐带组织修整为片状结构的脐带层；

15、分别制备海藻酸钠溶液、壳聚糖溶液和羟基磷灰石溶液，将所述壳聚糖溶液、所述海藻酸钠溶液和所述羟基磷灰石溶液混合均匀制得凝胶溶液后，再将所述凝胶溶液进行交联反应以制得凝胶层；

16、将所述脐带层粘附固定于所述凝胶层以制得所述生物修复膜。

17、本发明的所述生物修复膜的制备方法的有益效果在于：通过提供原始脐带，通过机械方式去除所述原始脐带中的血管以形成待整形的脐带组织，将所述待整形的脐带组织修整为片状结构的脐带层；分别制备海藻酸钠溶液、壳聚糖溶液和羟基磷灰石溶液，将所述壳聚糖溶液、所述海藻酸钠溶液和所述羟基磷灰石溶液混合均匀制得凝胶溶液后，再将所述凝胶溶液进行交联反应以制得凝胶层；将所述脐带层粘附固定于所述凝胶层以制得所述生物修复膜，其中，所述脐带层所保留的多种天然活性成分能够提高伤口的愈合能力，同时还能够减少术后产生的瘢痕；所述羟基磷灰石与骨的成分和结构相似，具有高强度和韧性，能同时提高成骨细胞的生存率和成骨矿化量，引导骨缺损修复，海藻酸钠和壳聚糖属于天然高分子材料，来源广，与细胞外基质相似，在高分子水凝胶基体中可形成互穿或半互穿网络等优异特性，双网络结构的凝胶支架可以增强水凝胶的力学性能，使其紧贴组织缺损表面吸液溶胀后仍能保持完整性而不使膜变形移位，从而使得制备得到的生物修复膜包含天然活性成分能够促进诱导细胞增殖分化，实现快速血管化和缺损区的修复和再生，且具有良好的生物活性、生物可降解性、组织贴合度和机械性能，生物相容性好，无细胞毒性，不会产生免疫原性。

18、优选的，所述将所述壳聚糖溶液、所述海藻酸钠溶液和所述羟基磷灰石溶液混合均匀制得凝胶溶液的步骤包括：将所述壳聚糖溶液按照滴注为1ml/min～2ml/min的速度滴加到所述海藻酸钠溶液中，并搅拌混合均匀制得高分子水凝胶基体；将所述羟基磷灰石溶液按照滴注为1ml/min～2ml/min的速度加入所述高分子水凝胶基体中，并搅拌混合均匀制得所述凝胶溶液。其有益效果在于：所述凝胶溶液的配置选择先配制海藻酸钠溶液，再向海藻酸钠溶液中缓慢滴加壳聚糖溶液，这种加入顺序能够避免材料内部孔相互粘结和连通性较差的问题，从而获得具有孔结构适宜、弹性和机械性能良好的多孔膜材料，且孔结构分布均匀，没有粘连，不存在大小分布不均的问题。

19、优选的，所述将所述凝胶溶液进行交联反应以制得凝胶层的步骤包括：超声去除所述凝胶溶液中的气泡后真空冷冻干燥12h～24h，以制得凝胶膜材料；将所述凝胶膜材料浸泡在的氯化钙溶液中交联0.1h～1h后，浸泡在交联剂溶液中1h～4h，再用去离子水浸泡清洗1～3次，且每次所述浸泡清洗的时间为5min～10min，以制得所述凝胶层。其有益效果在于：氯化钙溶液中的钙离子可以与海藻酸钠络合交联形成蛋盒结构，再经过基团堆积形成交联网络结构，使得凝胶溶液转变成水凝胶，从而使得制得的所述凝胶层具有最佳的稳定性和吸附量；而在交联剂中浸泡能进一步提高所述凝胶层的机械性能，用去离子水浸泡清洗1～3次，且每次所述浸泡清洗的时间为5min～10min，以清洗掉多余的交联剂。

20、优选的，所述将所述脐带层粘附固定于所述凝胶层以制得所述生物修复膜的步骤包括：在温度11℃～15℃的环境中，将所述脐带层中所述致密层的一面覆盖于所述模具的所述平滑面，将所述凝胶层的一面粘附于所述脐带层中所述疏松层的一面，再将另一所述模具的所述压痕面覆盖于所述凝胶层的另一面。其有益效果在于：脐带层的处理环境温度11℃～15℃，即在低温环境中快速处理能够最大程度保留脐带的天然活性成分；通过所述模具压制冻干处理后，所述生物修复膜呈具有压痕表面和平滑表面的双面结构，将片状脐带层的疏松层与凝胶层贴合，再通过后续的冻融循环、交联剂交联和真空冷冻干燥处理，能使所述疏松层与凝胶层结合程度更深，无明显分层，结构连续性良好；待修复部位表面通常情况下平整度是不佳的，所述压痕结构的存在能够有效增加修复膜与待修复的部位的贴合程度以及接触表面积，有利于促进组织愈合；而且带有羟基磷灰石的凝胶层朝向所述模具的所述压痕面覆盖，即使所述凝胶层具有压痕表面，从而使得带有羟基磷灰石的凝胶层的压痕表面朝向骨缺损处，能同时提高成骨细胞的生存率和成骨矿化量。

21、优选的，所述将所述脐带层粘附固定于所述凝胶层以制得所述生物修复膜的步骤还包括：将夹设有所述脐带层和所述凝胶层的所述模具在-10℃～-22℃温度下静置2h～6h后，再在0℃～10℃温度下静置2h～6h以进行冻融处理，且冻融循环1～3次后，依次在-20℃温度下冷冻2h，-80℃温度下冷冻4h，-70℃～-80℃的温度下冷冻2h～14h，-80±5℃温度下真空冷冻干燥4h～8h，以制得所述生物修复膜。其有益效果在于：其中在压制冻干处理过程中通过依次在-20℃温度下冷冻2h，-80℃温度下冷冻4h，-70℃～-80℃的温度下冷冻2h～14h，-80±5℃温度下真空冷冻干燥4h～8h，即进行梯度降温冷冻，可以避免温度下降过快而引起组织结构破坏，从而保留脐带组织双层多孔结构；且通过反复冻融处理，使得凝胶层吸附到脐带层的疏松层的微孔内，使得增强了凝胶层和脐带层的粘合力，即大大提高了贴合界面之间的结合力，解决了现有技术中膜层间存在结合力不足，较易分层的问题。

22、优选的，所述步骤将所述待整形的脐带组织修整为片状结构的脐带层的步骤包括：在温度11℃～15℃的环境中，将所述待整形的脐带组织采用清洗液清洗后，修剪为片状并用去离子水清洗1～3次，以制得所述脐带层，且所述清洗温度11℃～15℃，清洗时间15～20分钟。其有益效果在于：脐带组织采用清洗液清洗以洗去血污和破坏细胞，采用去离子水冲洗，以保持所述脐带层的湿润，以便于与凝胶层粘附，通过设置脐带层的处理环境温度11℃～15℃，清洗时间15～20分钟，即在低温环境中快速处理以便最大程度保留脐带的天然活性成分。

23、优选的，所述交联剂为1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺、n-羟基琥珀酰亚胺、京尼平和甲醛中的任意一种或两种。其有益效果在于：所述交联剂有利于进一步提高所述凝胶层的机械性能。

24、进一步优选的，所述交联剂为1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(edc)和n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)的混合溶液。其有益效果在于：有利于进一步提高所述凝胶层的机械性能，即能有效提高所述生物修复膜的机械性能。

25、优选的，所述氯化钙溶液的浓度为1％～5％。其有益效果在于：钙离子可实现海藻酸钠内部可控的凝胶化，随后在形成的该基质中加入壳聚糖溶液进行酸化以释放阳离子，从而更好地控制凝胶特性，并形成均质凝胶，钙离子浓度的增加，对多孔材料的交联效果越好，材料稳定性越高，但钙离子含量较高的凝胶层支架的脆性会更大，因此所述氯化钙溶液的浓度为1％～5％最适宜。

26、优选的，重复所述将所述脐带层中所述致密层的一面覆盖于所述模具的所述平滑面，将所述凝胶层的一面粘附于所述脐带层中所述疏松层的一面，再将另一所述模具的所述压痕面覆盖于所述凝胶层的另一面的步骤，按所述模具、所述脐带层、所述凝胶层、和另一所述模具的叠加顺序叠加2～6层的所述脐带层和所述凝胶层，以制得2～6层的所述生物修复膜。其有益效果在于：所述生物修复膜叠加层数一般为2～6层，避免模具的重量过大使得需冻干的所述生物修复膜被压变形，同时减少冻干所需能耗。压制冻干后得到的所述生物修复膜具有压痕面和平滑面两种结构，压痕面能够与组织缺损处紧密贴合，阻隔外界软组织细胞长入，达到良好治疗效果。

27、优选的，所述分别制备海藻酸钠溶液、壳聚糖溶液和羟基磷灰石溶液的步骤包括：称取海藻酸钠溶于去离子水中并搅拌1h～4h，以制得所述海藻酸钠溶液；称取壳聚糖溶于浓度为1wt％～2wt％的稀酸溶液中并搅拌1h～4h，以制得所述壳聚糖溶液；称取羟基磷灰石置于去离子水中，超声0.5h～2h混合均匀，以制得所述羟基磷灰石溶液。其有益效果在于：通过超声方式有利于使羟基磷灰石在后序工艺中与其他溶液的混合，能使所述羟基磷灰石均匀分散于所述高分子水凝胶基体中，即能够解决现有胶原修复膜存在的胶原粘度大或者胶原聚集形成的粘胶块导致羟基磷灰石分散不均、分散条件过于剧烈和严苛，从而对胶原的分子结构产生影响的问题，还可以在使用过程中起到缓释钙离子促进骨细胞的增殖与分化。

28、优选的，所述清洗液为无菌生理磷酸盐缓冲溶液、无菌氯化钠注射液和纯化水中的任意一种或多种。