一种离子响应型蒙花苷纳米粒子及其制备方法和应用与流程

本发明涉及药物制剂，具体涉及一种具有保护眼角膜上皮细胞及缓解眼角膜上皮细胞高渗应激反应的离子响应型蒙花苷纳米粒子及其制备方法和应用。

背景技术：

1、由于角膜等上皮细胞长期暴露于高渗介质诱导的环境会诱发一系列相关眼部疾病，例如干眼症(de)、干燥综合征(ss)、干燥综合征相关的干燥性角结膜炎(ss-kcs)，激光屈光手术-激光辅助原位角膜磨镶术(lasik)诱导的神经营养性上皮病(lne)也构成了与高渗应激相关的疾病。其中，de是一种影响全球数百万人的眼表疾病，是世界范围内一个严重的健康问题。根据国际tfos泪膜和眼表协会研讨会ii(tfosdews ii)，de被定义为“一种眼表多因素疾病，其特征是泪膜失去稳态并伴有眼部症状，其中泪膜不稳定和高渗、眼表炎症和损伤以及神经感觉异常起着病因作用”。de常见症状，如异物感、灼烧和刺痛，会影响患者的生产力并降低生活质量；如果不通过适当的治疗方法及时治疗，de所涉及的慢性炎症状态可能会导致视力下降或失明。

2、de的一个重要机制是泪液高渗与炎症严重程度之间的联系。该疾病的核心机制是蒸发诱导的泪液高渗，它在表面上皮细胞内引发无数信号事件和促炎介质的释放。高渗应激和炎症的联合作用被认为会导致角膜和结膜的上皮细胞损伤和屏障功能丧失。de随着年龄的增长而增加，女性受影响更大。事实上de在眼泪蒸发中复发，随后导致泪膜渗透压升高，表面上皮细胞的高渗压导致细胞内和细胞外隔间之间的水和电解质失衡，从而减少细胞体积。细胞的急剧收缩可能导致细胞存活改变、细胞膜和细胞骨架完整性变化以及胞浆蛋白的变性。

3、具有高渗性的泪液环境会产生大量的促炎标志物如肿瘤坏死因子和一些基质金属蛋白酶如mmp-9或mmp-7。因此长期暴露于泪膜高渗可能是这种疾病的基础。这种体内增加伴随着角膜上皮屏障功能的下降，增加了致病性浸润和炎症状况恶化的可能性。de症状与泪膜渗透压之间缺乏关联可能是由于泪膜渗透压浓度的时间依赖性变异性或获得可重现的泪膜渗透压值的技术限制。

4、需要寻找有效的渗透保护剂来管理de。渗透保护剂是一种具有渗透活性的生物相容性化合物，能够改变细胞的吸水能力。它们通常是小型、中性和亲水性物质，不会干扰细胞功能。每种渗透保护剂都以不同的方式发挥作用，具有各种各样的动力学和细胞内化。当高渗环境发生或高渗应激可能导致细胞损伤时，可以给予细胞渗透保护物质的摄取。此外，它们中的一些甚至在高渗环境之前就可以通过特异性介导的转运蛋白在细胞中内化。细胞可以保留的物质数量和时间对其有效性起着至关重要的作用。

5、蒙花苷(lin)，属于黄酮类化合物，是常用于治疗眼疾的中药密蒙花的代表性成分。据研究表明，密蒙花可用于目赤肿痛、眼生翳膜、肝虚目暗、视物昏花。其中蒙花苷具有抗菌、抗衰老、抗高渗、抗不良刺激、对机体双向调节、抗疲劳等多种生物活性作用。

6、然而，蒙花苷属于热敏性化合物，易受热降解，不溶于水，脂溶性差，导致其应用受到限制。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种离子响应型蒙花苷纳米粒子及其制备方法和应用，所述纳米粒子可对蒙花苷表现出更好的保护作用，提高蒙花苷的生物利用度和稳定性。

2、本发明通过以下技术方案实现：

3、一种离子响应型蒙花苷纳米粒子的制备方法，包括：

4、将乙二醇壳聚糖与聚乳酸-羟基乙酸共聚物通过纳米沉淀法制备得到gc-plga纳米粒子，将gc-plga纳米粒子与蒙花苷孵育，得到gc-plga-lin纳米粒子；

5、结冷胶与甲基丙烯酸酐反应，得到甲基化结冷胶；将甲基化结冷胶与精甘天冬氨酸肽反应，得到megg-rgd；将megg-rgd与透明质酸反应，得到megg-rgd-ha；

6、将megg-rgd-ha和gc-plga-lin纳米粒子混合复溶在水中，自组装，得到离子响应型蒙花苷纳米粒子mrh-gplnp。

7、优选的，所述将乙二醇壳聚糖与聚乳酸-羟基乙酸通过纳米沉淀法制备得到gc-plga纳米粒子，具体是：

8、将乙二醇壳聚糖和聚乳酸-羟基乙酸溶于有机溶剂中，得到混合溶液；将混合溶液加入水中，得到悬浮液，使悬浮液中有机溶剂蒸发，然后固液分离，得到gc-plga纳米粒子。

9、优选的，所述将gc-plga纳米粒子与蒙花苷孵育，得到gc-plga-lin纳米粒子，具体是：将gc-plga纳米粒子重悬于蒙花苷0.5-2.0mg/ml水溶液中，并在室温下孵育3-5h，然后将所得产物冻干，得到gc-plga-lin纳米粒子。

10、优选的，所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物、乙二醇壳聚糖的质量比为(50-100)mg:(15-50)mg。

11、优选的，所述结冷胶与甲基丙烯酸酐反应，得到甲基化结冷胶，具体是：

12、将结冷胶溶解于水中，向所得溶液中加入甲基丙烯酸酐，调节ph为8.0-8.2，反应6-10h，得到megg溶液；将megg溶液进行透析，冷冻干燥，得到甲基化结冷胶，其中，所述结冷胶与甲基丙烯酸酐的质量比为(1-1.5)g:(2-8)ml。

13、优选的，所述将甲基化结冷胶与精甘天冬氨酸肽反应，得到megg-rgd，具体是：将甲基化结冷胶溶解在2-(n-吗啉基)乙磺酸缓冲液中，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和n-羟基琥珀酰亚胺，反应2-4h；然后，加入精甘天冬氨酸肽溶液，反应，所得反应液透析，冷冻干燥，得到megg-rgd；其中，所述甲基化结冷胶、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、n-羟基琥珀酰亚胺和精甘天冬氨酸肽的比例为(100-150)mg:(88-100)mg:(0.2 -0.3)g:(35-75)μg。

14、优选的，所述megg-rgd与透明质酸反应，得到megg-rgd-ha，具体是：

15、将透明质酸溶解在水中，得到ha溶液；1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和n-羟基琥珀酰亚胺溶解在水中，得到edc/nhs溶液；将edc/nhs溶液加入到ha溶液中，搅拌反应1-2h，然后加入megg-rgd的nahco3溶液，发生酰胺反应，透析，冻干，得到megg-rgd-ha。

16、优选的，透明质酸和megg-rgd的质量比为(100-150)mg:(15-30)mg。

17、采用所述的制备方法得到的离子响应型蒙花苷纳米粒子。

18、所述的离子响应型蒙花苷纳米粒子在制备缓解眼角膜上皮细胞高渗应激药物中的应用。

19、与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：

20、本发明通过纳米沉淀、甲基修饰和自组装联合制备法对于类黄酮蒙花苷进行封装，对蒙花苷表现出更好的保护作用，提高对蒙花苷的利用率。其中，结冷胶(gg)由于二价阳离子与生理环境中以较高浓度存在的单价阳离子的交换，这些物理交联的水凝胶在植入后往往在体内失去稳定性。为了克服这一缺点，对结冷胶主链进行了甲基修饰。由于眼睛独特的生理和解剖结构，传统药物递送的第一个障碍是由于角膜前表面积有限，可用于眼表的滴眼液体积有限(约30μl)。经过修饰后的甲基结冷胶可以与眼表的(如角膜上皮细胞等)阳离子产生更好的离子结合作用而不失稳定性，具备了溶胶-凝胶的离子响应特性。缓解了传统滴眼液在第一次反射性眨眼过程中，由于泪液体积的突然增加，药液的大部分体积被消除。

21、壳聚糖(β-(1-4)-2-氨基-2-脱氧-d-葡聚糖)的生物和治疗特性包括抗菌和抗癌作用，以及生物降解性，无毒且免疫原性低。然而，它的缺点是它只溶于ph值低于6的酸性溶液中。为了克服这种溶解度限制，本发明引入了乙二醇壳聚糖(gc)，它具有壳聚糖的特性，并且在水溶液中具有良好的溶解度。

22、为了使药物输送过程中保护药物免受降解剂的影响，并促进其吸收，本发明引入了聚乳酸-羟基乙酸共聚物(plga)作为药物纳米载体，plga在体内水解时，降解为乳酸和乙醇酸两个单体单位，是天然代谢产物，容易以二氧化碳和水的形式排出体外，无毒性。

23、本发明将含有精甘天冬氨酸肽arg-gly-asp(rgd)的纳米颗粒靶向递送到眼睛，rgd能与在损伤后的角膜上皮中积累的纤维连接蛋白连接，纤维连接蛋白上的rgd基序与角膜上皮细胞表面αvβ1整合素结合，促进表皮生长因子(egf)释放，刺激细胞扩散和迁移，对治疗角膜上皮缺陷有重要作用。

24、在眼表，含透明质酸(ha)的泪膜的粘度会在眨眼间降低，从而使泪膜均匀分布。一旦静止，就会恢复更高的粘度，从而延长其在眼表的停留时间。透明质酸富含吸引水分子的羟基，从而使泪膜增稠和稳定，并通过润滑减少机械创伤对眼表的影响，并有助于再上皮化。

25、综上所述，本发明通过a.制备结冷胶的甲基化修饰，与rgd共价结合，与ha酰胺化；b.将乙二醇壳聚糖与聚乳酸-羟基乙酸通过纳米沉淀，再与蒙花苷共孵育，最后将a与b纳米粒子混合复溶自组装，设计了包含以上多功能特性的纳米粒子，使其对人sv40永生化角膜上皮细胞在高渗应激条件下具有促进增殖生长、恢复迁移、调整细胞大小等保护作用，调控细胞生长的内在模式以及其他细胞途径。载体由于其小尺寸效应，具有更大的比表面积。因此，蒙花苷纳米粒子具有更高的稳定性、生物相容性、更高的渗透保护性，具有保护眼角膜上皮细胞及缓解高渗应激反应等保健和治疗功效。